Summary
私たちは、ミリ秒の時間分解能を有する膜ダイナミクスの可視化を可能にし、電子顕微鏡、「フラッシュおよび凍結、」における新規技術を開発しました。この技術は、高圧凍結とニューロンの光遺伝学的刺激を兼ね備えています。ここでは、手順を示し、詳細なプロトコルを記述します。
Abstract
細胞は、絶えず彼らの膜構造およびタンパク質分布を変更するが、それぞれ、MSおよびナノメートルのオーダーの時間および空間分解能でこれらのイベントを視覚化することは極めて困難です。私たちは、光遺伝学と細胞事象を誘導し、刺激後定義された時点で細胞を凍結することにより得られた膜の動態を可視化する時間分解電子顕微鏡技術、「フラッシュや凍結を」を開発しました。この技術を実証するために、我々は、マウスの海馬ニューロンにおけるチャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを発現しました。光のフラッシュは、ニューロン活動を刺激し、シナプス小胞の融合を介してシナプス終末からの神経伝達物質の放出を誘発します。ニューロンの光遺伝学的刺激は、シナプス伝達中の形態学的変化に追従して高圧凍結に連結されています。商業用器具を用いて、我々は、シナプス小胞の融合とSYNAの回復を捕獲しましたPTIC小胞膜。形態学的変化を時間をかけて別の細胞に続いていたので、一連のイベントを可視化するために、大規模なデータセットは、生成され、盲目的に分析しました。それにもかかわらず、フラッシュや凍結はミリ秒の時間分解能を持つ電子顕微鏡写真でメンブレンダイナミクスの可視化を可能にします。
Introduction
細胞内膜およびタンパク質動態を可視化することは、特定のプロセスの細胞生物学を理解することに向けた重要なステップです。ダイナミックな人身売買のイベントは、光や蛍光顕微鏡を用いて撮影することができます。細胞内構造は完全に色素または蛍光プローブにより「塗装」と空間的およびスペクトル1,2解決できないのでしかし、細胞内のコンテキストは、主にこのような画像に欠けています。電子顕微鏡は、絶妙な詳細に亜細胞アーキテクチャを描くことができながら、試料を撮像する前に固定しなければならないので、一方、それは、細胞ダイナミクスを捕捉することができません。したがって、典型的には、完全にのみ1つの撮像モダリティを使用して細胞のダイナミクスを理解するのに十分ではありません。
光と電子顕微鏡の限界を克服するために、相関顕微鏡技術が開発されています。相関光と電子顕微鏡（CLEM）は、光学顕微鏡と電子顕微鏡との根本的な細胞内構造を使用して細胞内動態を可視化します。 CLEMでは、そのような分裂およびエンドサイトーシス3、4、5、6のような様々なプロセス、に従事した細胞は、ライブ画像化され、その後、電子顕微鏡のために処理されます。 CLEMは、細胞内ダイナミクスの特定の側面をキャプチャしますが、このアプローチの有用性を制限する4つの要因があります。固定剤7の遅い拡散および反応による分-まず、時間分解能は、細胞は、典型的には、Sをとる、固定化することができる方法を迅速によって制限されます。第二に、細胞内のアーキテクチャは、8 事後観察されます。従って、動的形態学的変化は、このアプローチを使用してキャプチャすることができません。第三に、蛍光および電子顕微鏡写真は、正確に起因する組織SHに整列することはできません電子顕微鏡9、10のためのサンプル調製時の脱水によって引き起こさrinkage。第四に、細胞質分裂およびエンドサイトーシスなどのイベントは、すべてのセル5、11で同時に行われていない、ため、イベントに従事している特定の細胞は、細胞の大集団から識別されなければなりません。このプロセスは、多くの場合、面倒です。従って、新しい方法は、すべてのセル内の特定のイベントを誘発することと定義された時点での細胞の急速な固定化によって得られた細胞ダイナミクスを捕捉する必要があります。
最近、いくつかのツールは、光（光遺伝学）を使用して、特定の細胞動態を誘導するために開発されています。チャネルロドプシンは、 コナミドリムシ 12、13から単離された感光性、非選択的カチオンチャネルです。チャネルロドプシンはneuronaで発現された場合L膜は、光の短いフラッシュは、ニューロンへのナトリウムイオンの流入を誘導し、14、15の潜在的作用を誘発します。活動電位は、その後、シナプス小胞18はしたがって、チャネルロドプシンは、神経活動を誘導し、ミリ16、17内に融合シナプス末端へ伝播します。シナプス末端膜のダイナミクスを追跡するために、ニューロンはミリ秒精度での刺激後に定義された時点で固定化されなければなりません。
神経活動を誘導した後の膜のダイナミクスをキャプチャするために、我々は、高圧凍結17、18、19で光刺激を結合しました。高圧凍結を低減氷晶形成20を有する細胞のほぼ瞬間的固定化を可能にします。氷の結晶CAN膜を破裂させ、細胞内のアーキテクチャ21を混乱させる。刺激および凝固の間の時間間隔を変化させることにより、シナプス端末内膜輸送は、活動電位の誘導後に捕捉しました。
ここでは、そのカップル、高圧凍結と光刺激のミリ秒時間的な制御を商品化し、高圧の冷凍庫を使用して実験手順を示しています。光刺激及び凝固を制御する外部装置を必要とする他の機器とは異なり、光刺激は完全にこのシステムに統合され、MSの精度19を適用することができます。このプロセスは複数のステップを必要とします。 1）マウスの海馬ニューロンは、サファイアディスク上で培養し、チャネルロドプシン18のための発現ベクターを保有するレンチウイルスに感染しています。 2）ニューロンが刺激され、刺激後定義された時点で凍結されています。 3）ガラス化水で代替され有機溶媒とD、脂質及びタンパク質は、細胞内のアーキテクチャを維持するために固定剤によって架橋されています。 4）サンプルをエポキシ樹脂に浸透し、埋め込まれています。 5）超薄切片をウルトラミクロトームを使用して収集されます。 6）薄切片を透過型電子顕微鏡で撮像されます。 7）画像取得及び分析は、時間点又は遺伝子型に対して盲目的に行われます。細胞動態は、時間分解画像17、18の再構成によって決定することができます。サンプル調製は、（2ステップ - 上記5）の週が必要ですが、その後の画像解析は、年に数ヶ月を要します。
Protocol
実験はすべて、国立衛生研究所による動物使用の規則および規制に従って行いました。プロトコルは、医学のジョンズホプキンス大学の動物実験委員会（IACUC）によって承認されました。
マウスの海馬ニューロンの単離および培養
- 2日目（P0 - - 2）マウス脳18生後0日から皮質を解剖。皮質からアストロサイトを分離します。
注：マウスの脳を断頭後に単離しました。星状細胞は、海馬ニューロンのためのフィーダー層として機能します。 - 星状細胞を解離するために37℃で15分間、0.05％トリプシン-EDTAの800μLと皮質を治療します。
- 培養10％ウシ胎児血清（FBS）および0.2％ペニシリン-ストレプトマイシン一週間37℃および5％CO 2を含有するDMEM中の13 mlのT-75フラスコ中アストロサイト。
- 1種の酸洗浄、滅菌の18mmガラスカバースリップPEを配置12ウェルプレートのRウェル。
- 簡潔には、70％エタノールで2 6mmの炭素被覆サファイアディスクを洗浄し、各カバーガラスの上に置きます。
- ラット尾コラーゲン1ミリリットルとPDLの1ミリリットル（1mg / ml）で17 nMの酢酸3mlを混合し、ポリ-D-リジン（PDL）溶液を調製します。 RTで5分間サファイアディスクとカバーガラスにPDL溶液200μLを適用します。
- PDL液と空気乾燥を削除します。使用前に、ステップ1.4で調製したプレートを滅菌 - 紫外光下で30分間1.6。
- 1.6 -ステップ1.4で調製したプレートに/ウェル5×10 4細胞の密度でDMEM 2mL中のステップ1.3からアストロサイトを播種。一週間のために37°Cでそれらを成長し、5％のCO 2。
- 神経細胞を培養する前に、少なくとも数時間、各ウェルに：フルオロデオキシウリジン（80μMの最終濃度）の20μLを加えます。
注：フルオロデオキシウリジンは、アストロサイトの分裂を停止します。 - 神経BASの1.5 mLの培地を変更1％のL-アラニル-L-グルタミン（ 材料の表を参照）、神経細胞のための2％無血清サプリメント（ 材料の表を参照）、および0.2％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するAl培地（ 材料の表を参照のこと） 。
- 酵素溶液5mL（1.65 mMのシステイン、1mMのCaCl 2を、そしてDMEM中の0.5mMのEDTA）にパパインの20単位を添加することによって、パパイン溶液を調製します。 20分間CO 2ガスを通過させることにより溶液を酸性化します。 0.22μmのフィルターで濾過滅菌し。
- 2マウス18 - P0から脳を収穫。直ちに氷冷Hanks'-バランス塩溶液（HBSS）に脳を転送します。 HBSS中に沈め組織を維持、実体顕微鏡の下で海馬を解剖。
- ステップ1.11で調製したパパイン溶液の1mlの二つ海馬を置き。 37℃、750rpmでサーモミキサー上で1時間インキュベートします。
- 含む溶液を不活性化する1 mLのパパインを置き換えますトリプシンインヒビター及びDMEM 1mL当たりアルブミン0.5mgの2.5mgの。 37°Cで5分間インキュベートします。不活化ソリューションを吸引除去。
- 単離された海馬の神経細胞基礎培地（ 材料の表を参照）の200μLを加えます。細胞を解離するために200μLピペットチップを用いて粉砕します。解離していない細胞が底に落ち着くまで待ってください。慎重に上から細胞を含む培地を除去します。
- 手順を繰り返し1.15の3倍。プールの新しい1.5 mLの遠心チューブ内のすべての解離細胞。
- 血球計数器を用いて細胞数をカウントします。プレート6.5×10 4細胞の密度でニューロン/ウェルにステップ1.1で調製したアストロサイト層の上部- 1.10。
- レンチウイルスは、DIV 3（ インビトロでの 3 D）18でチャネルロドプシンを発現するニューロンを感染。
- 以下2.5、 - ステップ2.1に記載されているように、DIV 14にフラッシュ及び凍結を行います。
2.フラッシュ-AND-フリーズ
- 固定液の調製
- グルタルアルデヒド2.5mLの（アセトン中の10％のストック）、四酸化オスミウム0.25gを、水0.25mLの、無水アセトン22.25 mLを化学フード下で、固定液を調製するための円錐チューブに以下の物質を加えます。
注：各成分の最終濃度は、アセトン中1％であるべきです。グルタルアルデヒドは、凍結置換時のタンパク質構造を維持するために追加されます。注意：四酸化オスミウムの急性毒性が高いです。蒸気への暴露は、眼の角膜を損傷する恐れがあります。これは、認定された化学フード内でのみ扱われるべきです。 - アリコート番号極低温バイアル（2 mL）に固定1mLの。使用するまで液体窒素中で凍結固定をしてください。
注：四酸化オスミウム及びグルタルアルデヒド交差反応すると沈殿します。従って、一度混合し、アリコートを直ちに、管をキャップし、固定液を凍結するために液体窒素中でクリオチューブを沈めます。クライオに番号を付けるために鉛筆を使ってアセトン以来ジェニックバイアルは、マーカーを洗い流すことができます。
- グルタルアルデヒド2.5mLの（アセトン中の10％のストック）、四酸化オスミウム0.25gを、水0.25mLの、無水アセトン22.25 mLを化学フード下で、固定液を調製するための円錐チューブに以下の物質を加えます。
- 生理食塩水の調製
- ヘペス（10mMの、pH7.5）で、塩化ナトリウム（140mMの）、塩化カリウム（2.4ミリモル）、およびグルコース（10 mm）を混合することにより、生理食塩水を作ります。
注：これらの値は、最終的な濃度です。クライオ保護剤は、単層培養のために使用されていません。しかし、適切な凍結保護は、5ミクロンよりも厚い標本のために必要です。 20％BSAを使用することが一般的に推奨されます。酵母ペーストと大腸菌OP50はまた、ハエ幼虫またはC.エレガンスのための凍結保護剤として使用することができます。 - 1mMの最終濃度で4mMのおよびMgCl 2でのCaCl 2を加えます。
注：のCaCl 2およびMgCl 2の濃度は、実験によって異なります。エキソサイトーシス中間体の捕捉を確実にするために、4 mMのカルシウムは、小胞18の放出確率を高めるためにこれらの特定の実験のために使用されます。 - チェック浸透圧計を使用して浸透圧。それは300±5のmOsmであることを確認してください。
- 30μMの最終濃度まで3μMおよびGABA受容体拮抗薬（ビククリン）の最終濃度までAMPA受容体拮抗薬（NBQX）を加えます。
注：神経伝達物質受容体アンタゴニストは、神経刺激の18以下のリカレントネットワーク活動を避けるために添加されます。 - 使用のために37°Cに生理食塩水を温めます。
- ヘペス（10mMの、pH7.5）で、塩化ナトリウム（140mMの）、塩化カリウム（2.4ミリモル）、およびグルコース（10 mm）を混合することにより、生理食塩水を作ります。
- 専門高圧フリーザーと自動フリーズ置換部の調製
- 高圧凍結前に、液体窒素でタンクを充填して-90℃に自動化された凍結置換ユニットを冷却。
- 試料室の内側に置くことにより-90℃に小さなカップでアセトンを冷却します。
- 液体ニトロで（ 材料の表を参照）高圧フリーザーの液体窒素デュワーとストレージデュワーを充填GEN。
- タッチスクリーンモニタを使用して光刺激プロトコルを設定します。
- 光の刺激ウィンドウ上の次の「プログラム名」を「編集」をクリックしてプログラムに名前を付けます。別のウィンドウがポップアップ表示されます。
- 10の単一刺激は、「期間の数」の中の「15,000 MS」「暗期」、「期間」に「100ミリ秒」に「10秒」、「パルス」、および「1」を入力してプログラムを設定ミズ。 90ミリ秒後に細胞（ 図1C）フリーズ。
注：「暗期」は、細胞がサンプルローディング中に露光から回復することを可能にします。 「時代は」刺激周波数を定義します。刺激が20Hzで適用されるべきである場合、例えば、この列には50ミリ秒に設定されるべきです。 「パルス」光刺激の持続時間を定義します。最後に、「期間の数」が適用された刺激の合計数を定義します。高頻度刺激を設定するために、参照してください。
- 光の中で「NO刺激」制御、タイプ「15秒」「暗期」、「周期数」の「0における期間」中の「MS」、「1ミリ秒」、「パルス」、および「0」のためにステップ2.3.4で説明したように刺激設定画面、。
注：デフォルトでは、「パルス」は、少なくとも1ミリ秒である必要があります。 - メイン画面では、光刺激用のボックスがチェックされていることを確認してください。
- メイン画面の「試料保管」をクリックすることでストレージプロトコルを設定します。クリックして「編集。」 「 - 」（合計3チャネル）を各チャンネルに2枚のディスクを格納するために「2」を選択するために、次のウィンドウで、「+」または使用。チェック「ストレージLN2が有効になっています。」
- サンプルのロードと高圧冷凍庫で凍結
注：すべてのサンプルアセンブリとロードの手順は7.5-60X倍率範囲で実体顕微鏡下で行われています。 tweez標本を操作する2.4.4 - ERはステップ2.4.1で使用されています。実験は、生理的温度で行われなければなりません。- 黒、ミドルプレート（ 図1B）のウェルに、上向き1枚のサファイアディスク、細胞側を置き。
- サファイアディスク（ 図1B）上に100μmのスペーサーリングを置き。
- ステップ2.2から予め温め食塩水でディスクの片面を浸漬した後、スペーサリング（ 図1B）上ブランクサファイアディスクを置き。無気泡が2枚のサファイアディスクの間に閉じ込められていないことを確認してください。
- 別の100μmのスペーサリングと400μmのスペーサリング（ 図1B）を置きます。ろ紙を使用して、余分な液体を削除します。
- 二つの透明半シリンダ（ 図1A）との間のステップ2.4.3からのアセンブリを配置。凍結プロセスを開始するために、トップ赤いカバーを閉じます。
注：カバーが閉じられた後にプリセットプロトコルが自動的に実行されます。サンプルは、冷凍室に同じ向きに留まり、光のフラッシュは、サンプルアセンブリの頂部から印加されます。凍結プロセスが完了すると赤いカバーが自動的にポップアップ表示されます。 - ストレージデュワーで標本を保管してください。
注：凍結した後、試料は自動的に液体窒素を充填し、さらに処理するまでそこに格納された記憶デュワー内に滴下します。ストレージデュワーは、3つのチャンバを有し、各チャンバは、最大で3個のサンプルまで保持することができます。典型的には、2つの標本が同一の刺激条件の下で凍結され、そして高圧フリーザーは、同じチャンバ内で両方を記憶するようにプログラムされています。 - 各試験片について2.4.6 - を繰り返して、2.4.1を繰り返します。
- すべての部屋がいっぱいになったら、2.5に進みます。
注：デバイスを一度に収納デュワー中6検体まで保存するように設定しました。したがって、すべての6 番目のサンプルの後に、ステップ2.5が行われなければなりません。 2.4.6 - アンロードされると、繰り返しは2.4.1ステップ。
- 自動凍結置換部へのサンプル採取と転送
- 高圧フリーザーのテーブルの下に配置されているストレージデュワーへの扉を開きます。ストレージデュワーを取り外し、ベンチトップの上に置きます。
- 手を使用して、デュワーから試料室を削除し、液体窒素で満たされた特殊なサンプルトレイにそれを転送します。試料カップを解放するために、ノブのロックを解除します。
- 液体窒素をピンセットの先端を予冷した後にピンセットを用いて、試料カップから透明な半円筒を削除（〜-196℃）。慎重に液体窒素を含む小さなカップに中間、黒色プレートを転送します。
注：ピンセットの先端は、液体窒素の温度に予備冷却されなければなりません。サンプルは、氷の結晶の形成を防止するために、すべての回で、液体窒素下に保持しなければなりません。
金3.凍結交代tomated凍結置換部
- 予冷ピンセット（〜-196℃のヒント）を使用して、迅速に（-90°C）予冷アセトンステップ2.5.3からミドルプレートを転送します。
- 軽く振っまたはタップすることで、中間プレートからサファイアディスクを分離します。
注：時々、それは中間プレートからサファイアディスクを分離することは困難です。このような状況では、予冷アセトン中間プレートを残す（-90℃）で数分間。ピンセットでジェントルタップも中間プレートからサファイアを分離するのに役立ちます。 - 置換部の試料室内部固定剤（ステップ2.1）を含有する極低温バイアルを置きます。極低温バイアルにサファイアディスクを移し、バイアルのキャップを置きます。
- 30時間、（II）-90 - - 5ため℃〜-90（I）-20°Cで14時間（5°C /時間）、（III）-20°C以下のように凍結置換プログラムを設定20°Cで4時間（10°C / H） - 12時間、および（iv）-20°Cのために。
注：デュ-90℃での最初のステップの比率を変化させることができました。凍結置換の総所要時間は、後続のステップは昼間に実行することができるように、プログラムは午前8時の周りの朝（〜1.5 Dのpostexperiment）で終わるように設定されています。
エポキシ樹脂4.浸透し、プラスチック製の埋め込み
- プログラムが終了したら、化学フードに置換ユニットの試料室からサファイアディスクを含む極低温バイアルを転送するために手袋をはめた手を使用します。
- ピペットを用いて、各極低温バイアルにアセトン（室温）に追加し、各サファイアディスク4洗浄 - 2時間 - 1のための6Xを。
- 余分なコントラストが必要な場合、任意に、1時間、0.1％酢酸ウラニルで試料をインキュベートします。 2時間 - 1かけてアセトンで6X - 4を洗浄します。
注：注意：上気道の炎症の原因となる酢酸ウラニル、の吸入後内部被ばくに伴うリスクがあります。高い露出がdamagすることができますEの血液細胞。酢酸ウラニルとの仕事は、排気換気の下で行われるべきです。防護服をお勧めします。 - グリセロールポリグリシジルエーテル、ビスフェノールA型エポキシ樹脂4.4gの、およびドデセニル無水コハク酸（DDSA）の12.2グラムの6.2グラムを秤量することにより液状エポキシ樹脂培地を調製。十分に混合し、混合しながら、ベンジルジメチルアミン（BDMA）の800μLを加えます。 10分間脱ガス。
- ステップ4.4で調製した100％のエポキシ樹脂からアセトンに30、70、及び90％のエポキシ樹脂を準備します。
- サファイアディスクを含む極低温バイアルに30％のエポキシ樹脂を添加し、2インキュベート - 120 rpmでオービタルシェーカーでRTで3時間。
- ピペッティングにより70％のエポキシ樹脂を30％のエポキシ樹脂を交換し、3インキュベート - オービタルシェーカーでRTで4時間。
- ピンセットを使用して、埋め込みカプセルのキャップに、各サファイアディスク、細胞側を上向きにして転送します。キャップ90％のエポキシ樹脂を加えます。 4℃でO / Nインキュベートします。
- 翌日、工程4と同様に、新鮮なエポキシ樹脂媒体を作ります0.4。
- 埋め込みカプセルのキャップに、上向き各サファイアディスク、細胞側を転送します。新たに調製した100％のエポキシ樹脂とキャップを埋めます。三回繰り返し、新鮮な100％のエポキシ樹脂を2時間毎に変更します。
- 48時間が重合する60℃のオーブン中でサンプルを置き。
5.取り付けサンプル
- サファイアディスクは、樹脂ブロックの先頭に位置するように実体顕微鏡上のサンプル逆さまに置きます。かみそりの刃でこれを引っ掻くことにより、上からエポキシ樹脂の薄層を除去します。
- カミソリの刃を使用して、サファイアディスクの縁に沿って浅い線を切断。この行は、ステップ5.3において、エポキシ樹脂からサファイアディスクを分離するのに役立ちます。
- 約10秒間液体窒素に浸漬することにより、エポキシ樹脂からサファイアディスクを分離します。
注：細胞は、エポキシ樹脂に滞在します。 - サファイアディスクを除去した後、（細胞を有する領域を見つけるために、解剖スコープを使用4-10X倍率）。カミソリの刃（両刃）を使用して、関心領域（〜2×2 mm）の周りを切断します。標本を顕微鏡の表面にテープで固定されている間所定の位置に試料を保持するために、このステップを実行します。
- エポキシ樹脂からなる円筒状のダミーブロックにエチルシアノアクリレートを含む接着剤を用いて細胞を含有するプラスチックの小片（約2×2×5 mm）を取り付けます。 1時間60℃でブロックをインキュベートします。
6.セクショニング
- セクションにウルトラサンプルを使用してください。
- 3ミリメートル/秒の速度でガラスナイフから200nm /部分の厚さを有するプラスチック包埋標本の表面をトリミング。アストロサイトが置かれている表面から5セクション - 4を切りました。
- 0.8ミリメートル/秒から40nm /セクションの厚さの速度でダイヤモンドナイフとセクションに切り替えます。 25節 - 20をカット。
- （参照0.7％ポリ酢酸ビニルで覆われたシングルスロット銅グリッド上のセクションのリボンを集めます材料の表 ）。
透過電子顕微鏡（TEM）を使用して7イメージング
- イメージングをTEMの前に、5分間、メタノール中2.5％酢酸ウラニルセクションを染色。
- 50％メタノールのグリッド15Xを洗います。その後、各洗浄は30秒持続し、超純水15Xで洗います。
- 簡潔にはセクションを空気乾燥し、TEMの試料ホルダにグリッドを配置します。
- 93,000Xの倍率で画像。
- 画像を取得します。
注：イメージングは通常時点または遺伝子型にブラインドで行われ、一般的に〜200の画像は/時刻を集めています。
8.画像解析
- カスタムマクロ（未発表渡辺、デイビス、とヨルゲンセン、）とソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用して画像を分析します。
注：X / Y座標が小胞から記録され、原形質膜、アクティブゾーン膜、及びシナプスにおける全ての他の膜結合オルガネラ。テキストFIL情報を含むESは、別のソフトウェア（ 例えば、Matlabの）に輸出されています。データは、さらにカスタムプログラムを用いて分析しています。
Representative Results
上記のプロトコルを使用して、我々は、チャネルロドプシンを発現するマウス海馬神経細胞に「フラッシュおよび凍結」の実験を行いました。これらのニューロンは、光発症後15ミリ秒または100ミリ秒のいずれかを凍結しました。我々は以前に18それぞれ、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、15ミリ秒と100ミリ秒の時点でシナプス末端で起こることを示しています。これらのイベントは、正常にフラッシュおよび凍結実験がうまく選択を行うことができることを示唆し、適切な時間（ 図2）で撮影した（ 材料の表を参照）高圧フリーザーを専門。
高圧冷凍庫図1.サンプル・ロードとプログラミング。高PのA）サンプルローディングテーブルressure冷凍庫。構造の詳細は、挿入図に示す中間プレートは、サンプルローディング用クレム・ホルダー内に配置されます。半円筒の一つは、試料載置台の底部に配置され、他方はトップカバーにクリップで取り付けられています。サンプルがロードされると、中間プレートは、底部半円筒に前方に押され、カバーが凍結を開始するために閉じられます。 B）試料のアセンブリ。ニューロンを含むサファイアディスクは、細胞側を上に向けて、中間プレートのウェル内に配置されます。 100μmの環が直接ウェル内部サファイアディスクの上方に配置されています。その後、生理食塩水に浸漬空サファイアディスクは溶液側と下方に配置されます。気泡は避けなければなりません。最後に、100μmのリングと400μmのリングがぴったりと上方に配置されています。余分な液体を濾紙で除去されます。 C）エポキシ樹脂に浸漬サファイアディスクと埋め込みカプセルの断面図。 SAPP雇うディスクは、細胞側を上に向けて、カプセルの底に配置され、浸潤および埋め込み用エポキシ樹脂で覆われています。単一、10ミリ秒の刺激のための高圧フリーザープログラミングD）。標本は、90ミリ秒の光パルスの後に凍結されています。 E）20 Hzで10の刺激のための高圧フリーザーのプログラミング。標本は5ミリ秒、最後の光パルスの後に凍結されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウスの海馬神経細胞におけるエキソサイトーシスとエンドサイトーシスの2可視化図。海馬の神経細胞は一度刺激され、示された時間で凍結されています。電子顕微鏡写真は、シナプス小胞Aのエキソサイトーシス）及び超高速エンドサイトーシスを表示します
Discussion
「フラッシュおよび凍結」のアプローチは、光遺伝学で、特定の細胞事象を誘導することにより刺激19の後に定義された時点で細胞を凍結することにより、膜のダイナミクスを可視化します。このデモでは、我々は、神経細胞を刺激するために、チャネルロドプシン、感光性陽イオンチャネルを使用し、シナプス末端で融合し、シナプス小胞の回復を捕獲しました。近年では、多くの光遺伝学的ツールは、フラッシュおよび凍結と互換性があるすべては、23、22を開発されています。例えば、オルガネラ輸送はクリプトとCIB1 24の光誘起ヘテロを用いて誘導することができます。同様に、原形質膜の脂質組成は、原形質膜25ホスホイノシチドホスファターゼの光誘起転座によって変化させることができます。また、アゾベンゼンCHような小さな、光感受性化合物照明波長に応じアンジュコンホメーション。このコンホメーション変化は、リガンド依存性チャネルを活性化するか、または膜26,27における脂質組成を変更するために使用することができます。ケージド化合物はまた、細胞活性を誘導するために使用することができます。しかし、現在のセットアップに使用されるLEDはアンケージングのために十分なエネルギーを生成しないことができます。このように、システムのさらなる最適化はおそらく必要です。それにもかかわらず、これらの光活性化ツールの用途は柔軟-多くの細胞事象は、光のフラッシュによって誘導することができるしています。 「フラッシュと凍結は、」得られた膜のダイナミクスをキャプチャすることができます。
「フラッシュおよび凍結」方法には2つの主な制限があります。まず、それは別の細胞から特定のイベントの「スナップショット」をキャプチャします。言い換えれば、時間をかけて一つのセル内膜のダイナミクスを追跡することはできません。このように、あらゆる細胞の再構築のためにもT、一つは各試料から、各時点で多数の画像を取得し、分析しなければなりません。マウス海馬ニューロンにおけるシナプスの30％の18、28 -シナプス小胞の融合がわずか20に場所を取るので、ニューロンにおいて、画像のより大きな数が必要です。このような大規模なデータセットの分析は、時間の膨大な量を必要とします。将来的には、画像取得と解析が29、30のアプローチは、より効率的にするために自動化する必要があります。
第2の制限は、高圧凍結技術の性質によって課されます。細胞が凍結するとき、細胞水が凍結速度は100 K / sの21未満である場合に氷結晶を形成するために再配置します。これらの氷晶は、膜を貫通または膜の破裂をもたらす、局所浸透圧を変えるための溶質を濃縮することができます。氷の結晶を避けるために、HIGH圧力（約2,000気圧）試料に適用されます。過冷却効果により、100 K /秒の凍結速度は、この圧力21で氷晶の形成から水を防止するのに十分です。理論的には、試験片として厚さ500μmの氷結晶なしで凍結することができるが、氷の立方体の形態が形態を損なう、厚い組織に形成される傾向があるように200μm程度は、おそらく実用的限界です。 5ミクロンより厚い試料を処理するときに、BSAなどの適切な凍結保護剤の使用は、必要です。しかし、BSAは、溶液の浸透圧を変化させると、細胞の生理学的応答に影響を及ぼし得ます。したがって、広範囲の対照実験は、特定のシステムにおけるBSAの使用を検証するために必要とされます。試料は誤っ液体窒素浴から除去された場合に氷結晶はまた、高圧凍結後に形成することができます。このように、すべての回で、液体窒素中に標本を維持するとの予冷した鉗子を使用することが重要ですそれらを操作。
実験を計画する場合は、以下の3点を考慮する必要があります。 8.0ミリワット/ mm 2で-まず、光の最大強度（460 nmのライン）が5.5です。この強度は活性を誘導するのに十分であるかどうかをフラッシュし、凍結実験に先立って、蛍光顕微鏡でのライブセルイメージングを用いて検証する必要があります。第二に、実験は、生理的な温度で行われなければなりません。高圧フリーザーの段階は、マウス海馬ニューロン31との実験のために37℃まで加温します。最後に、時間ポイントは慎重にメンブレンダイナミクスをキャプチャするために選択されなければなりません。初期の研究は、エンドサイトーシスが刺激の100ミリ秒後に完了していることが示されました。したがって、三つの追加の時点（15、30、および50ミリ秒）は、膜ダイナミクス17、18に従うように調べました。これらの時点は膜輸送のイベントを可視化するために必要でしたシナプス伝達中の。しかしながら、時間点の数のための要件は、各細胞事象で異なります。そのため、いくつかの時点では大規模なデータセットの収集を開始する前にサンプリングする必要があります。
Disclosures
この記事のオープンアクセス出版は、ライカMikrosysteme社が主催ました。
Acknowledgments
この作品は、ジョンズホプキンス大学（SW）からの資金によってサポートされていました。私たちは、彼らの技術支援のための医学顕微鏡施設のジョンズホプキンス大学に感謝します。私たちは、エリックヨルゲンセンとクリスチャン・ローズンマンドと技術の発展のために自分の研究室のメンバーに感謝します。私たちは、最初のデバイスの設計のためのM. ウェイン・デイビス感謝します。私たちは、彼らの技術支援のためにポール・ワージンガー、クベータ・トモバ、およびDelgermaa Luvsanjavに感謝します。また、原稿の彼らの重要な読書のためにナタリー・R.ハミルトンとグラント・F・クジック感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-substitution and Low-temperature Embedding System for Light and Electron Microscopy -AFS II | Leica | ||
| High Pressure Freezer - EM-ICE | Leica | EM ICE is a specialized high pressure freezer that allows precise control of light stimulation and freezing. | |
| Osmometer | Gonotec | ||
| Ultramicrotome UC7 | Leica | ||
| Oven | Blue M | ||
| Razor blade | Personna | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16530 | |
| Osmium tetroxide | EMS | RT19132 | Toxic, open only under certified chemical hood |
| Acetone | EMS | RT10016 | |
| HEPES | Emdmillipore | 391340-250GM | |
| Glucose | Sigma | 49159-1KG | |
| KCl | Sigma | 746436-1KG | |
| NaCl | Sigma | S7653-1KG | |
| CaCl2 | Sigma | 21115-250ML | |
| MgCl2 | J.T.Baker | 2444-01 | |
| Liquid epoxy resin Eponate 12 | Ted Pella | 18028 | |
| Bisphenol A epoxy resin Araldite 502 | Ted Pella | 18028 | |
| Dodecenyl succinic anhydride (DDSA) | Ted Pella | 18028 | |
| Benzyl dimethyl amine (BDMA) | Ted Pella | 18241 | |
| Special embedding (BEEM) capsule | EMS | 70021 | |
| Copper Grid | Ted Pella | 1GC12H | |
| Polyvinyl acetate (Pioloform F) | Ted Pella | 19244 | |
| Uranyl acetate | Polysciences | 21447-25 | |
| Ethyl cyanoacrylate (Super glue) | Scotch | 170497 | |
| Trypsin-EDTA | Themo scientific | 25300-120 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Thermo scientific | 10569-044 | Should be warmed to 37 °C before use |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Thermo scientific | 26140-079 | |
| Pen-Strep | Thermo scientific | 15140-122 | |
| Fluoro-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | |
| Glass cover slip | Fisher | S175223 | Should be acid-washed |
| Sapphire disc | Technotrade | 616-100 | |
| Acetic acid | Emdmillipore | 1000631011 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Thermo scientific | A10483-01 | |
| Neurobasal A | Fisher | 10888022 | Should be warmed to 37 °C before use |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Fisher | 35050-079 | |
| Seraum free supplement (B-27) | Fisher | 17504044 | |
| Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific | 24020117 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | Active Unit should be calculated for each batch |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T9253 | |
| NBQX | Tocris | 03-731-0 | |
| Bicculine | Tocris | 01-091-0 | |
| Whatman I filter paper | GE | ||
| Transmission Electron Microscope | Philips CM20 |
References
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