Summary
Dette papir beskriver en metode til fremstilling af kardiovaskulære vævsprøver til MS-analyse, der giver mulighed for (1) analyse af ECM proteinsammensætning, (2) identifikation af glycosyleringssteder, og (3) sammensætningen karakterisering af glycan former. Denne metode kan anvendes, med mindre modifikationer, til studiet af ECM i andre væv.
Abstract
Fibrose er kendetegnende for mange cardiovaskulære sygdomme og er forbundet med den forværret sekretion og aflejring af den ekstracellulære matrix (ECM). Anvender proteomik, har vi tidligere identificeret mere end 150 ECM og ECM-associerede proteiner i cardiovaskulære væv. Især er mange ECM-proteiner glycosyleret. Denne post-translationel modifikation påvirker proteinfoldning, opløselighed, binding og nedbrydning. Vi har udviklet en sekventiel ekstraktion og berigelse fremgangsmåde til ECM-proteiner, der er forenelig med den efterfølgende væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS / MS) analyse af intakte glycopeptider. Strategien er baseret på sekventielle inkubationer med NaCl, SDS for væv decellulering, og guanidinhydrochlorid til opløseliggørelse af ECM-proteiner. Nylige fremskridt i LC-MS / MS omfatter fragmenteringsmetoder, såsom kombinationer af højere energi kollision dissociation (HCD) og elektronoverførselsmiddel dissociation (ETD), der muliggørden direkte analyse af sammensætningen af glycopeptider af ECM-proteiner. I det foreliggende papir beskriver vi en fremgangsmåde til fremstilling af ECM fra vævsprøver. Fremgangsmåden ikke kun mulighed for proteinprofilering men også vurdering og karakterisering af glycosylering af MS-analyse.
Introduction
Fibrose er kendetegnende for mange sygdomme. Fibroblaster prolifererer og differentierer imod stærkt syntetiske fænotyper, som er forbundet med den forværret sekretion og aflejring af ekstracellulær matrix (ECM) 1. Overdreven ECM deposition kan fortsætte, selv efter den initiale skade er aftaget, hvilket fører til funktionel svækkelse. Anvender proteomik, har vi tidligere identificeret mere end 150 ECM og ECM-associerede proteiner i hjertevæv 2, 3. De er ikke kun strukturelle proteiner, men også matricellular proteiner og proteaser, der bidrager til den fortsatte ombygning og dynamisk tilpasning af hjertet. Især er mange ECM-proteiner glycosylerede 4. Denne post-translationel modifikation (PTM) indebærer tilsætning af sukkerrester til visse aminosyrepositioner, og den påvirker proteinfoldning, opløselighed, binding og nedbrydning 5
Der er to primære glycosylerings typer, der forekommer i pattedyr. (1) N-glycosylering optræder ved carboxamido nitrogen asparaginrester (Asn) i konsensussekvensen Asn-Xaa-Thr / Ser, hvor Xaa er en vilkårlig aminosyre bortset fra prolin. (2) I O-glycosylering, sukkerrester tillægger serin- og threoninrester (Ser, Thr) eller, i meget mindre grad, hydroxyprolin og hydroxylysin. Mens O-glycosylering kan forekomme i en række forskellige proteingrupper, er N-glycosylering begrænset til secernerede proteiner eller ekstracellulære domæner af membranproteiner 5. Dette gør N-glycosylering et attraktivt mål, når man studerer ECM.
Proteomics sætter en ny standard til analyse af protein-ændringer i sygdom. Hidtil har de fleste proteomics undersøgelser været fokuseret på intracellulære proteiner 6. Dette skyldes primært følgende årsager. Første, rigelige intracellulære proteiner hæmmer identikation af knappe ECM komponenter. Dette er især afgørende i hjertevæv, hvori mitokondrielle og myofilament proteiner udgør en stor andel af proteinindholdet 7. Sekund, integrale ECM-proteiner er stærkt tværbundne og vanskelige at solubilisere. Endelig tilstedeværelsen af rigelige PTMS (dvs. glycosylering) ændrer den molekylære masse, ladning og elektroforetiske egenskaber af peptider, der påvirker både adskillelse og identifikation ved væskekromatografi-tandem-massespektrometri (LC-MS / MS). I de senere år har vi udviklet og forbedret en sekventiel ekstraktion og berigelse fremgangsmåde til ECM-proteiner, der er kompatibel med efterfølgende massespektrometri (MS) analyse. Strategien er baseret på sekventielle inkubationer.
Det første trin udføres med NaCl, en ionisk buffer, der letter ekstraktionen af ECM-associeret og løst bundet ECM-proteiner, såvel som nyligt syntetiserede ECM-proteiner. Det jegs vaskemiddel fri, ikke-denaturerende, ikke-nedbrydende af cellemembraner, og medgørlige til yderligere biokemiske analyser 8. Derpå decellulering opnås med natriumdodecylsulfat (SDS). På dette trin, en lav SDS-koncentration sikrer membrandestabilisering og frigivelsen af intracellulære proteiner samtidig forhindre afbrydelse af de mere opløselige ikke-integrerede ECM komponenter. Endelig er ECM-proteiner ekstraheret med en guanidinhydrochlorid buffer (GuHCI). GuHCI er effektivt til at ekstrahere stærkt tværbundne proteiner og proteoglycaner fra væv, såsom sener 9, brusk 10, fartøjer 11, 12, 13 og hjertet 2, 3. Vi anvendte denne biokemiske fraktionering, i kombination med LC-MS / MS, at udforske ECM remodellering i kardiovaskulær sygdom 2
Her beskriver vi en metode til fremstilling af ECM for MS-analyse, der giver mulighed for analyse af protein sammensætning, identifikation af glycosyleringssteder, og karakterisering af glycan former. Sammenlignet med tidligere analyser af ECM glycosylering 16, denne metode giver mulighed for direkte vurdering af sammensætningsmæssige ændringer i glycosylerings profiler i en stedspecifik måde ved anvendelse af MS. Vi har anvendt denne metode til hjerte-kar-væv. Men det kan alså anvendes, med mindre modifikationer, til studiet af ECM i andre vævsprøver og kan give hidtil usete indsigt i ECM biologi.
Protocol
Undersøgelsen blev godkendt af Wandsworth Lokale Research Ethics Committee (referencenummer: 06 / Q0803 / 37) og modtog institutionelle godkendelse fra forskning og udvikling kontor. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke.
1. Ekstraktion af ekstracellulære matrixproteiner
BEMÆRK: De humane atriale væv anvendt til disse eksperimenter blev opnået fra de atrielle vedhæng under kardiopulmonær bypass, lige efter kardioplegisk standsning af hjertet. Alle prøver blev indsamlet på St Georges Hospital, London, UK. Alle vævsprøver skal fryses ved -80 ° C. Brug ikke prøver konserveret med fikseringsmidler, såsom paraformaldehyd, at tværbinde proteiner.
- Forberede alle ekstraktionsbuffere forud for eksperimenter, som pr tabel 1, for at minimere tiden mellem ekstraktions- trin. Udføre alle inkubationer ved stuetemperatur (RT) i et temperaturstyret miljø(Dvs. -20 ° C) for at sikre overensstemmelse mellem ekstraktioner.
- Afvej 20-50 mg væv. Hvis flere prøver skal ekstraheres, skæres og vejes én efter én for at undgå fuldstændig optøning af vævet. Under anvendelse af en skalpel, tern væv ind 3-4 mindre stykker (dvs. 2-3 mm) og placere dem sammen i 1,5 ml-rør.
- Tilsæt 500 pi iskold phosphatbufret saltvand (PBS; se tabel 1 og tabel of Materials) og udfører fem vaske for at minimere forurening blod.
- Ekstraktion Trin 1: Inkubation med NaCl puffer
- Efter vask med PBS placere prøverne i 1,5 ml rør med skruelåg. Tilføj NaCI-buffer (se tabel 1) ved 10 gange (v: w) vævet vægt. Vortex rørene ved stuetemperatur i 1 time ved minimumshastighed (dvs. 600 rpm).
BEMÆRK: En lav vortex hastighed er kritisk at undgå mekanisk afbrydelse af vævet under dette trin.Brug en skum adapter til at placere alle rør under ekstraktionen. - Overfør ekstrakterne til nye rør og centrifugeres ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C. Ekstrakterne opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. Kort fortalt vaskes de resterende Vævspelleterne med frisk NaCI-buffer. Brug den samme type buffer (dvs. 100 pi NaCl puffer) til vask for at forhindre ekstraktion af andre proteiner med forskellige opløseligheder (dvs. proteiner ikke kan ekstraheres med NaCl).
- Efter vask sikre fuldstændig fjernelse af bufferen for at minimere overlapning i proteinindhold med efterfølgende ekstraktionstrin. Kassér NaCI-buffer anvendes til vask.
BEMÆRK: Forholdet mellem buffervolumenet og vævsvægt er vigtigt for en reproducerbar ekstraktion. A 10: 1-forhold (volumen: vægt) for NaCl og SDS ekstraktioner og 5: 1 for GuHCI trin give tilstrækkelige mængder af protein uden at mætte puffer. Proteinkoncentrationer er cirka 1-2 ng / nl efter ext-fraktion.
- Efter vask med PBS placere prøverne i 1,5 ml rør med skruelåg. Tilføj NaCI-buffer (se tabel 1) ved 10 gange (v: w) vævet vægt. Vortex rørene ved stuetemperatur i 1 time ved minimumshastighed (dvs. 600 rpm).
- Ekstraktion Trin 2: decellulering med SDS puffer
- Tilføje SDS-buffer (Tabel 1) ved ti gange (v: v) vævet vægt; anvendelsen af lave SDS-koncentrationer (dvs. 0,1%) er afgørende for at undgå tab af ECM-proteiner under decellulering. Vortex rørene ved stuetemperatur i 16 timer ved minimumshastighed (dvs. 600 rpm).
BEMÆRK: En lav vortex hastighed minimerer mekanisk forstyrrelse af ECM. - Overfør ekstrakterne til nye rør. Centrifuge ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C; opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. Kort fortalt vaskes de resterende Vævspelleterne med dd H2O til fjernelse af SDS. Sikre fuldstændig fjernelse af væsken efter vask.
- Tilføje SDS-buffer (Tabel 1) ved ti gange (v: v) vævet vægt; anvendelsen af lave SDS-koncentrationer (dvs. 0,1%) er afgørende for at undgå tab af ECM-proteiner under decellulering. Vortex rørene ved stuetemperatur i 16 timer ved minimumshastighed (dvs. 600 rpm).
- Udvinding Trin 3: Inkubation med GuHCI Buffer
- Tilføj GuHCI buffer (tabel 1) ved fem gange (v: w) vævet vægt. Vortex rørene ved stuetemperatur i 72 timer ved maksimal hastighed (dvs.,
- Overfør ekstrakterne til nye rør. Centrifuge ved 16.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
2. Protein Kvantificering og nedbør
BEMÆRK: På grund af tilstedeværelsen af detergenter, SDS puffer er uforenelig med direkte protein kvantificering baseret på målinger af absorbans ved 280 nm. At sikre reproducerbar kvantificering, anvender kolorimetriske assays for alle proteinekstrakter 17.
- Kvantificering.
- Forberede standarder for en kalibreringskurve under anvendelse af bovint serumalbumin (BSA) seriefortyndet i den relevante ekstraktionsbuffer (dvs. NaCl, SDS, eller GuHCI) 17. I løbet af denne tid, tø prøveekstrakterne.
- Fortynd prøverne i ekstraktionsbuffer til opnåelse af koncentrationer indendet lineære område af absorbans; en 1:10 fortynding (vol: vol) giver tilfredsstillende resultater. Fortynde GuHCI prøver med en tilsvarende mængde ddH2O til kvantificering, som kolorimetrisk assay er ikke kompatibel med koncentrationer på> 4 M GuHCI.
- Brug en bicinchoninsyre (BCA) -baseret kolorimetrisk assay 17 (se tabellen of Materials), ved at følge producentens instruktioner for assays i plader med 96 brønde; det anbefales at udføre mindst to målinger.
- Efter inkubering i 30 min, tage absorbanslæsninger ved en bølgelængde på 570 nm for at beregne proteinkoncentrationen ved anvendelse af BSA standardkalibreringskurve 17.
- Protein Nedbør
- Thaw GuHCI ekstrakter ved stuetemperatur. Portion 10 ug protein for hver prøve i nye rør. For en direkte glycopeptid analyse portion 50 ug. Tilføj 10 gange mængden af ethanol og INCUbate natten over ved -20 ° C.
BEMÆRK: GuHCI er ikke kompatibel med yderligere enzymatiske reaktioner og de fleste elektroforetiske anvendelser. Fjernelsen af GuHCI er nødvendig, før deglycosylering og trypsin fordøjelse. Opløseligheden af GuHCI i ethanol, og omvendt, den lave opløselighed af proteiner bliver mulighed for effektiv fjernelse af GuHCI mens gav omtrent en 98% genvinding af proteiner 18. - Centrifuger prøverne ved 16.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C og aspireres supernatanten. Pas på ikke at forstyrre det udfældede pellet. Tør pellets i 15 minutter under anvendelse af en vakuumkoncentrator (se tabellen of Materials) ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her, og de tørrede pellets opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse. - Eventuelt køre en gelelektroforese som kvalitetskontrol (QC, se de Supplerende fremgangsmåder).
- Thaw GuHCI ekstrakter ved stuetemperatur. Portion 10 ug protein for hver prøve i nye rør. For en direkte glycopeptid analyse portion 50 ug. Tilføj 10 gange mængden af ethanol og INCUbate natten over ved -20 ° C.
3. Sekventiel Deglycosylering forVurdering af N-glycosyleringssite Belægning
- Under prøven tørring (se trin 2.2.2), forberede deglycosylering buffer indeholdende afgrening deglycosyleringsforsøg enzymer, som pr tabel 1. Se tabel for Materialer til produktoplysninger.
- Der tilsættes 10 pi af deglycosylering puffer indeholdende enzymer til hver prøve. Sørg for passende pille resuspension ved at udføre en hurtig vortex og spin-ned af prøver.
BEMÆRK: Fjernelse af sukker monomerer under anvendelse afgreningsenzymer er afgørende for den efterfølgende og fuldstændig fjernelse af O-bundne komplekse saccharider og letter senere spaltning af N-bundne sukkere ved PNGase-F. - Inkuber i 2 timer ved 25 ° C for at muliggøre fjernelse af heparansulfat ved heparinase II.Increase temperaturen til 37 ° C og inkuberes i 36 timer med forsigtig omrøring.
BEMÆRK: I betragtning af de lave reaktionsvolumener og langvarig inkubationstider, brug incubator shakers og stramt pakke multiple 1,5 ml badekares inde i en 50-ml konisk rør hælder inde inkubatoren ved ca. 45 °. - Efter 36 timer, centrifugeres prøverne i 1 minut ved 16.000 xg og afdamp H2O fra prøverne ved anvendelse af et vakuum koncentrator ved RT i ca. 45 min.
- Resuspendere tørrede prøver med 10 pi H 2 18 O indeholdende 50 U / ml PNGase-F, som spalter alle asparaginbundne Glykanernes i en deamideringsreaktionen.
BEMÆRK: resulterende asparaginsyre bærer en overskydende masse på 2,98 Da, indikerer tilstedeværelsen af N-glycosylering i MS-analyse. - Inkuber i 36 timer ved 37 ° C under konstant omrøring i inkubatorrysteren.
4. I-opløsning trypsinfordøjelse
BEMÆRK: Dette trin bør udføres for både ikke-deglycosylerede (dvs. anvendes til direkte glycopeptid analyse) og deglycosylerede prøver (dvs. anvendes til vurdering af glycan occupancy).
- Bruge 10 ug totalt protein for vurdering af N-glycosyleringssted belægning (som angivet i det foregående trin). For prøver er bestemt til direkte glycopeptid analysen må 50 ug protein som udgangsmængden.
BEMÆRK: De følgende trin beskrevet for 10 ug protein. Opskalering th evolumes (dvs. 5 gange til 50 ug) efter behov. - Denaturere proteinerne på hver prøve alikvot anvendelse af 9 M urinstof og 3 M thiourinstof med slutkoncentrationer på 6 M urinstof og 2 M thiourinstof, henholdsvis (fx til en prøve 10 pi, 20 pi urinstof / thiourinstof).
- Reducere proteinerne ved tilsætning af 100 mM dithiotreitol (DTT, 3,33 pi, slutkoncentration: 10 mM). Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time med omrøring ved 240 omdr./min.
- Afkøle prøverne til RT før udførelse af alkyleringen ved tilsætning af 0,5 M iodacetamid (3,7 pi, slutkoncentration: 50 mM). Inkuber i mørke i 1 time.
- Anvende præ-afkølet (-20° C) acetone (6 gange volumenet af prøven) at inkubere prøverne natten over ved -20 ° C. Udfælde ved centrifugering ved 14.000 xg i 25 minutter ved 4 ° C.
- Aspirere supernatanten. Pas på ikke at forstyrre det udfældede pellet. Tør proteinpellets bruger vakuumkoncentrator i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender i 20 pi 0,1 M triethylammoniumbicarbonat (TEAB), pH 8,2, indeholdende trypsin (0,01 ug / uL) og fordøje natten over ved 37 ° C og 240 rpm.
- Stoppe fordøjelsen ved forsuring prøverne med 10% trifluoreddikesyre (TFA, 2 pi til en slutkoncentration på 1% TFA).
5. Peptid Cleanup Brug af C18 kolonner
BEMÆRK: Fjernelse af interfererende forureninger fra peptidblandingen efter fordøjelse reducerer ionsuppression og forbedrer signal-til-støj-forhold og sekvensdækning. Dette trin bør udføres for både ikke-deglycosylerede og deglycosyleret samples.
- Aktivere harpiks på C18 spin-pladen (se tabellen of Materials) under anvendelse af 200 pi methanol per brønd og der centrifugeres ved 1000 xg i 1 min.
- Vask ved tilsætning af 200 pi per brønd af 80% acetonitril (ACN) og 0,1% TFA i H2O Centrifuger ved 1.000 xg i 1 min.
- Ækvilibrere ved tilsætning af 200 pi pr brønd af 1% ACN og 0,1% TFA i H2O Centrifuger ved 1.000 xg i 1 min. Gentag dette trin to gange mere.
- Indlæse prøver (hele volumen) fra trin 4 i brøndene indeholdende harpiksen og centrifugeres ved 1500 xg i 1 min. Genindlæse gennemløbet en gang og gentag centrifugeringen.
- Vask ved tilsætning af 200 pi pr brønd af 1% ACN og 0,1% TFA i H2O Centrifuger ved 1.500 xg i 1 min. Gentag dette trin to gange mere.
- Eluere prøverne med 170 pi per brønd af 50% ACN, 0,1% TFA i H2O Centrifuger ved 1.500 xg i 1 min. Gentag det forrige trinog kombinere den indsamlede eluat.
- Tør eluatet ved anvendelse af en vakuumkoncentrator i 2 timer ved stuetemperatur. Hvis den ikke bliver brugt med det samme, holde de tørrede prøver ved -80 ° C indtil anvendelse.
BEMÆRK: deglycosylerede Prøver til proteinidentifikation kun er klar til brug til LC-MS / MS efter dette trin. Trin 6 og 7 er ikke påkrævet for disse prøver. - Optø og resuspender deglycosylerede prøver i 2% ACN og 0,05% TFA i H2O til en endelig proteinkoncentration på 0,5 ng / nl. Fortsæt med trin 6 til direkte glycopeptid analyse af ikke-deglycosylerede prøver.
- Eventuelt filtrere peptider forud for mærkning med tandem mass tags (TMT); se de Supplerende Fremgangsmåder til peptid filtrering skal.
6. Mærkning med TMT (til Direct glycopeptid Analyse Only)
- Thaw og resuspender tørrede pellets i 50 pi 50 mM TEAB at opnå en koncentration på 1 pg / pi.
- Resusped 0,8-mg hætteglas TMT Zero (TMT 0, se tabellen of Materials) reagens i 41 pi ACN. Følg producentens recommendantions til resuspension.
- Mærke peptidet prøver i et forhold på 50 ug peptider til 0,4 mg TMT 0 (dvs. 50 pi af peptider til 20,5 pi TMT 0). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
- Stands reaktionen mærkning ved tilsætning af 5% hydroxylamin i et forhold 6: 100 (dvs. 4,23 pi af 5% hydroxylamin). Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Tør de TMT 0 -mærkede peptid prøver i 1 time ved stuetemperatur under anvendelse af en vakuumkoncentrator. Resuspender i 10 pi af Hedeselskabet 2 O.
BEMÆRK: På grund af glycan rester, glycopeptider vise en højere molekylmasse end ikke-glycosylerede peptider. TMT 0 forøger ladningstilstanden af glycopeptider. Dette reducerer deres relative masse og ladning (m / z) -forhold og letter ETD fragmentering.
7. glycopeptidgruppen Berigelse
- Bruge reaktionspuffere leveret i kittet (se tabellen of Materials).
- Der tilsættes 50 pi bindingsbuffer til hver prøve 10 pi fra trin 6.5. Vortexes glycocapture harpiksopløsning, indtil den bliver homogen. Brug en zwitterionisk hydrofil interaktion væskekromatografi (ZIC-HILIC) -baseret fange 15.
- Portion 50 pi af harpiksen suspensionen til nye 1,5 ml-rør. Spin i 1 min ved 2.500 xg og fjern supernatanten. Tilføje 60 pi af prøven (dvs. prøven med bindingsbuffer) til rørene indeholdende resinpelleterne. Bland med en pipette og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter i omrøring ved 1200 omdr./min.
- Centrifugeres i 2 min ved 2.000 xg og overføre supernatanten til nye rør. Hold rørene. Tilsæt 150 pi vaskebuffer til harpiksen rør. Bland med en pipette og inkuber ved stuetemperatur i 10 min i omrøring ved 1200 omdr./min.
- Spin i 2 minutter ved 2.500 x g. Overførselsupernatanten til de samme rør (fra trin 7.4). Gentag vask trin to gange.
- Tilføje 75 pi elueringsbuffer og blandes med en pipette. Agitere ved 1200 rpm i 5 minutter ved stuetemperatur og centrifugeres rørene i 2 minutter ved 2.500 x g. Supernatanterne overføres til nye 1,5 ml-rør. Gentag vasketrinnene og derefter overføre eluatet supernatant til det samme rør.
- Centrifuger rørene indeholdende eluatet (dvs., glycopeptider) i 2 minutter ved 2.500 x g. Supernatanten overføres til nye rør for at sikre fjernelse af eventuelt tilbageværende harpiks fra de foregående trin.
- Tør de samlede 150 pi eluat bruger vakuumkoncentrator i ca. 2 timer ved stuetemperatur. Resuspendere tørret-down glycopeptider i 15 pi 2% ACN og 0,05% TFA i Hedeselskabet 2 O.
- Fortsæt til udføre LC-MS / MS ved anvendelse HCD fragmentering at analysere ECM proteinsammensætningen, og LC-MS / MS ved anvendelse HCD og ETD fragmentering for glycopeptid karakterisering. Se afsnit 8. 8. massespektrometrianalyse
- Udføre LC-MS / MS ved anvendelse HCD fragmentering at analysere ECM proteinpræparat; se de Supplerende Metoder for detaljer.
- Udføre LC-MS / MS ved anvendelse HCD og ETD fragmentering for glycopeptid karakterisering (se de Supplerende Metoder for detaljer); det berigede prøve bør sammenlignes med den ikke-berigede råmateriale 15.
BEMÆRK: Detaljerede beskrivelser af LC-MS / MS-metoder til indirekte glycopeptid analyse, direkte glycopeptid analyse, og databasesøgning er tilvejebragt i de Supplerende Methods. Forskere interesseret i at karakterisere ECM protein og glycan sammensætning under anvendelse af massespektrometri opfordres til at henvise til tidligere publikationer 3, 11, 15.
Representative Results
En skematisk arbejdsgang af protokollen er tilvejebragt i figur 1.
ECM ekstraktionsprotokol
Effektiviteten af ekstraktionen kan overvåges ved at køre prøver danne hvert ekstrakt på Bis-Tris acrylamidgeler og ved anvendelse af sølvfarvning til synliggørelse. Figur 2A viser komplementariteten af NaCl, SDS og GuHCI ekstrakter efter sekventiel ekstraktion. Denne QC muliggør identifikation af potentielle problemer med prøve kvalitet såsom overdreven nedbrydning protein. Efter ekstraktion ECM glycoproteiner er rigelige i GuHCI ekstrakter (figur 2B).
deglycosylering
For at vurdere effektiviteten af deglycosylering bør en ikke-deglycosyleret kontrol køres i parallel. Deglycosyleringsteknikker gange nødt til at være egnet til at opnå en fuldstændig og homogen fjernelse af sukkerrester, som eksemplificeret i figur 3A. Figur 3B viser et repræsentativt eksempel på prøver effektivt deglycosylerede ved tilsætning af enzymer til GAG fjernelse og deglycosyleringsforsøg enzymer, der er målrettet mindre N- og O-bundne oligosaccharider.
Glycoproteomics
Protokollen for vurdering af belægning af NXT / S sequons forbedrer proteinsekvens dækning for ECM glycoproteiner efter MS (figur 3C) og giver mulighed for en indledende screening for tilstedeværelsen af glycoproteiner. Dette medvirker til at reducere søgetiden for glycopeptider, som databaser kan tilpasses til at indeholde tidligere identificerede glycoproteiner. HCD-ETD fragmentering anvendes til identifikation og sammensætningen karakterisering af oligosaccharider bundet til ECM g lycoproteins. Figur 4A viser en repræsentativ spektrum opnået for et peptid mærket med 18 O efter deglycosylering (indirekte glycopeptid analyse). Figur 4B er et repræsentativt eksempel på et spektrum opnået efter analyse af intakte glycopeptider fra ECM ekstrakter (direkte glycopeptid analyse).
Figur 1: Metode Oversigt. (A) Efter sekventiel berigelse for ECM-proteiner, er LC-MS / MS analyser udført på de deglycosylerede ekstrakter. (B) Alternativt ikke deglycosylerede ECM ekstrakter beriges yderligere til glycopeptider. Klik her for at se en større version af dette tal.
2" src = "/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg" />
Figur 2: Ekstraktion af ECM-proteiner. (A) De 3 forskellige ekstrakter fra den sekventielle ekstraktionsprocedure ( "engelsk Quickstep") er komplementære i deres proteinindhold. Mens SDS ekstrakter beriget med intracellulære proteiner, GuHCI ekstrakter indeholder størstedelen af ECM-proteiner. Vellykket fraktionering visualiseres ved de forskellige sølvfarvning mønster. (B) ECM-proteiner, såsom den lille leucinrig proteoglycaner decorin, biglycan og mimecan overvejende fundet i GuHCI ekstrakterne med lille tilstedeværelse i SDS og NaCl ekstrakter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Analyse af Glycosylation. (A) Egnede inkubationstider er nødvendig til fuldstændig deglycosylering. Eksemplet viser virkningen af inkubationstiden under fjernelse af glycosaminoglycankæder fra glycoproteinet decorin. (B) ECM glycoproteiner er dekoreret med store og gentagne glycosaminoglycan kæder og korte og forskelligartet N- og O-bundne oligosaccharider. Bane 1 på hver af immunoblots repræsenterer ubehandlede kardiale ekstrakter. Bane 2 indeholder ekstrakter behandles med enzymer, der nedbryder glycosaminoglycaner. Prøver i bane 3 indeholder desuden enzymer til fjernelse af N- og O-bundne oligossacharides. Galectin-1 er ikke glycosyleret, derfor er der ingen ændring i protein størrelse. Tilpasset fra Lynch M, et al. 4 (C) I LC-MS / MS analyse, prøver behandlet med PNGase-F i nærvær af H2 18 O opnå bedre sekvensdækning (%, på højre side) sammenlignet med ikke-deglycosylerede prøver. Dark grønne områder repræsenterer sekvensdækning ved LC-MS / MS. De røde, stiplede linjer repræsenterer glycosites, med tal, der angiver deres aminosyreposition. Påvisning af glycosylering af decorin i position Asn 211 (N, fremhævet med fed) er vist i detaljer som et eksempel i figur 4. venligst klik her for en større version af denne figur.
Figur 4. glycopeptid Analyse ved MS. (A) Under anvendelse af en shotgun proteomics tilgang til ECM berigede ekstrakter kan glycopeptider identificeres ved tilstedeværelsen af deamiderede asparaginer inden NXT / S sequons og mærket med 18 O. Eksemplet viser en HCD MS / MS-spektrum for et peptid af decorin indeholdende tidligere glycosyleret Asn 211. De opnåede data kan anvendesat skabe en skræddersyet database over ECM glycoproteiner. (B) HCD-ETD fragmentering anvendes til at analysere glycopeptidet beriget ECM ekstrakt. EBD MS / MS-spektrum tillader karakterisering af glycan præparat. Klik her for at se en større version af dette tal.
| A. Stamopløsninger | |
| DTT (dithiotreitol, C4 H 10 O 2 S 2) | 100 mM DTT i Hedeselskabet 2 O. 1 |
| EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre, C 10 H 16 N 2 O 8) | 250 mM EDTA i ddH2O, pH 8,0. |
| GuHCI (Guanidinhydrochlorid, CH 6 ClN 3) | 8 M GuHCI iHedeselskabet 2 O. |
| IAA (Iodacetamid, C2 H4 INO) | 500 mM IAA i Hedeselskabet 2 O. 1,2 |
| Na-acetat (Natriumacetat, C2 H3 NaO 2) | 1 M Na-acetat i ddH2O, pH 5,8. |
| NaCl (natriumchlorid, NaCl) | 1 M NaCl i Hedeselskabet 2 O. |
| Na-phosphat dibasisk (Dinatriumphosphat, Na 2 H 2 PO 4) | 1 M Na-phosphat dibasisk dd H2O, pH 6,8. |
| SDS (Natriumdodecylsulfat NAC 12 H 25 SO4) | 1% SDS (35 mM) i Hedeselskabet 2 O. 3 |
| TFA (Trifluoreddikesyre, C2 HF 3 O 2) | 10% TFA (1,2 M) i Hedeselskabet 2 O. |
| TEAB (triethylammoniumbicarbonat, C7 H 17 NO3) | 1M TEAB i i ddH2O, pH 8,5 |
| Thiourinstof (thiourinstof, CH4 N 2S) | 3 M thiourinstof i Hedeselskabet 2 O. |
| Tris-HCI (tris-hydrochlorid (NH 11C 4 O 3 [HCl]) | 100 mM Tris-HCI i ddH2O, pH 7,5. |
| Urinstof (urea, CH4 N2 O) | 9 M urinstof i Hedeselskabet 2 O. |
| B. Reaktionsbuffere | |
| C18 oprydning ækvilibreringspuffer | 1% ACN, 0,1% TFA i ddH2O |
| C18 oprydning kolonne vaskebuffer | 80% ACN, 0,1% TFA i H2O |
| C18 oprydning elueringsbuffer | 50% acetonitril, 0,1% TFA i ddH2O |
| Deglycosylering Buffer (4x) | 600 mM NaCl og 200 mM Na-phosphat i ddH2O, pH 6,8. |
| GuHCI buffer 4 | 4 M guanidinhydrochlorid, 50 mM Na-acetat og 25 mM EDTA i ddH2O, pH 5,8. Tilsæt 1: 100 (vol: vol) af cocktail af proteinaseinhibitorer før brug. |
| NaCl puffer 4 | 0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCI og 25 mM EDTA i ddH2O, pH 7,5. Tilsæt 1: 100 (vol: vol) af cocktail af proteinaseinhibitorer før brug. |
| PBS (1x) | 1,7 mM KH 2PO 4, 5 mM Na2HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Tilsæt 25 mM EDTA og 1: 100 (vol: vol) af cocktail af proteinaseinhibitorer før brug. |
| Prøvebuffer (4x) | 100 mM Tris, 2% SDS, 40% glycerol, 0,02% bromphenolblåt i ddH2O, pH 6,8. Tilsæt 10% ß-mercaptoethanol før brug. |
| SDS-buffer 4 | 0,1% SDS og 25 mM EDTA i Hedeselskabet 2 O. Tilsæt 1: 100 (vol: vol) af cocktail af proteinaseinhibitorer befmalm brug. |
| C. Enzymer | |
| Chondroitinase ABC 5 | 0,5 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| keratanase 5 | 0,1 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| Heparinase II 5 | 0,1 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| α2-3,6,8,9-Neuraminidase (sialidase) 5 | 0,025 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| β1,4-galactosidase 5 | 0,015 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| P-N-acetylglucosaminidase 5 | 0,25 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) 5 | 0,013 U / ml i deglycosylering puffer (1x) |
| PNGase-F (N-glycosidase-F) 6 | 50 U / ml i H 2 18 O |
| Trypsin | 0,01 ng / nl i TEAB puffer |
| Tabel noter. | |
| 1 Hold stamopløsning frosset ved -20 ° C. | |
| 2 IAA bør holdes beskyttet mod lys. | |
| 3 SDS let krystalliserer ved <20 ° C. For at lette solubilisering af 1% SDS (stamopløsning), opvarme bufferen under varmt vand fra vandhanen. | |
| 4 Ekstraktion buffere kan opbevares ved stuetemperatur. Tilføje bredspektret cocktail af proteinaseinhibitorer som indikeret før brug. | |
| 5 Disse enzymer skal tilsættes under første deglycosylering trin. | |
| 6 PNGase-F bør kun tilføjes under det andet deglycosylering trin. | |
Tabel 1: Stock Solutions, reaktionspuffere og enzymer. Denne tabel viser sammensætningen af hver stamopløsning og reaktionspuffer kræves til udvinding og efterfølgende behandling (herunder enzymatiske fordøjelser) af kardiale ECM-proteiner forud for MS-analyse.
Discussion
Denne proteomics protokol er blevet optimeret i løbet af de sidste par år i vores laboratorium. Her anvendte vi hjertevæv, men kan være påkrævet kun mindre justeringer for dens anvendelse til andre væv. For eksempel ekstraktionsprotokollen må udnytte de cellularitet af vævet i betragtning. Hjertevæv er stærkt cellulære forhold til karvæv. Når der anvendes vaskulært væv, kan SDS-koncentrationen være lavere (dvs. 0,08%) og decellulering er kortere (dvs. 4 timer) 11, 12, 13. Anvendelsen af deglycosylering enzymer er afgørende for LC-MS / MS-analyse af ECM sammensætning. Imidlertid behøver inkubationstider, kan tilpasses for forskellige vævstyper. For eksempel heparinase II nødvendige udvidede inkubationstider ved 25 ° C ved anvendelse af prøver, såsom hud, der er rige på basalmembranproteiner (f.eks agrin, perlecan) (data ikke vist). Direkte glycopeptid analyse kan udføres på konditionerede medier fra celler i kultur 15. kan ikke kræves Berigelse trin til analyse af denne forenklede subproteome. Svarende til GuHCI ekstrakter, NaCl ekstrakter er også modtagelig for glycoproteomics analyse med mindre modifikationer. Andre ekstraktionsprotokoller til berigelse af ECM-proteiner kan tilpasses til at karakterisere ECM glycopeptider 19, 20.
Glycosylering er den mest komplekse PTM 5. Indirekte identifikation af glycopeptider opnås ved påvisning af deamideret Asn med taget 18 O ved en NXT / S sequon. Deamideret Asn i andre positioner kan repræsentere falske positiver. Ligeledes må N-glycosylering overvejes i sammenhæng med protein- ontologier: intracellulære proteiner indeholdende en NXT / S sequon vil ikke blive glycosyleret, men kunne give anledning til falske positive. Som aktuel Search algoritmer giver ikke mulighed for screening af PTMS på forudbestemte sekvenser alene (dvs. Asn ved NXT / S), er manuel filtrering af dataene kræves. Identifikation af tilstedeværelse / fravær af glycosylering i disse positioner kan sammenlignes mellem sygdom og kontrolprøver. Der er intet enzym svarende til PNGase F for O-deglycosylering (fx indføre en masseskift på threonin eller serin). Derfor er identifikationen af O-glycosylering begrænset til direkte glycopeptid analyse. Direkte glycopeptid analyse anvendes til at opnå information om sammensætningen af sukkerarter knyttet til proteiner, men indeholder ikke strukturel information af glycan. Desuden glycan sammensætning er resultatet af glycansyntese og forarbejdning efter sekretion.
Vores 3-trins ekstraktion fremgangsmåde til ECM-proteiner ( "engelsk Quickstep") 6 har tilladt kendetegner ECM i en række cardiovaskulære væv. Fraktionering af væveti flere ekstrakter kræves for at opnå en forenklet ECM proteom som diskuteret andetsteds 6. Intracellulære proteiner ellers ville bidrage til en stor dynamik af protein forekomster inden for de ekstrakter, der ville hindre identifikation af mindre rigelige ECM-proteiner. Desuden intracellulære proteiner bærer O-glycosyleringer 5, der ville komplicere ECM glycopeptid berigelse og efterfølgende MS-analyse. Andre forfattere anvendte lignende ekstraktionsmidler metoder til at karakterisere f.eks lunge 21 og bruskvæv 10, men de ikke foretage analysen af glycosylering. Tidligere analyse af glycosylering fokuseret på identifikation af kun glycosites, kræver fjernelse af glycan fra proteinet kerne, og kan ikke vurdere O-glycosylering 22, 23. Lectin arrays og kemisk berigelse er tilgængelige for vurdering af glycan types af biologiske prøver baseret på deres bindingsspecificitet, men disse teknikker kan ikke tildele glycan typer til specifikke proteiner 24 de kan heller vurdere glycosyleringssteder.
Oprindeligt anvendte vi gelelektroforese før LC-MS / MS af ECM-proteiner. Selvom gelseparation er egnet til opnåelse forenklede proteinfraktioner modtagelige for LC-MS / MS-analyse, de nyeste instrumenter giver hurtigere skanningshastigheder. Således kan den elektroforetiske separation trin udelades. Dette tilvejebringer en yderligere fordel som store ECM-proteiner, som de bevarer toppen af gelen, analyseres mere effektivt. Imidlertid oplysninger om Mw af de intakte proteiner tabt. Fordampningstrinnet før PNGase F deglycosylering sikrer fuldstændig fjernelse af regelmæssig H2O for at minimere falsk negative. Sukkerrester (dvs. variable glycan masses) interfererer med separation ved LC og kompromittere efterfølgende peptid identifikation ved MS / MS. En pen-deglycosylering protokol anbefales også til proteomics analyse af ECM-proteiner ikke fokuseret på glycosylering.
Proteomics kan give hidtil usete indsigt i ECM. Beyond strukturel støtte, glycaner knyttet til ECM er afgørende for vært-patogen interaktion, celle-celle-kommunikation og immunresponset 25, dvs. afstødelse efter organtransplantation. Glycoproteomics vil være et vigtigt redskab i Glycobiology.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
JBB er en karriere Etablering Fellow i Kongens British Heart Foundation Centre. MM er en Senior Fellow af British Heart Foundation (FS / 13/2/29892). Undersøgelsen blev støttet af et fremragende initiativ (kompetencecentre for Excellent Technologies - COMET) af den østrigske Research Promotion Agency FFG: "Research Center of Excellence i vaskulær Aging - Tyrol, VASCage" (K-Projekt nummer 843.536) og NIHR Biomedical Research Centre baseret på Guys og St. Thomas' National Health service Foundation Trust og Kings College London i partnerskab med Kings College Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Chemicals | |||
| Acetonitrile, MS-grade (ACN, C2H3N) | Thermo Scientific | 51101 | 5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4 |
| Cocktail of proteinase inhibitors | Sigma-Aldrich | P8340 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
| Disodium phosphate (Na2H2PO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | 3.1 |
| Dithiotreitol (DTT, C4H10O2S2) | Sigma-Aldrich | D0632 | 4.3 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C10H16N2O8) | Sigma-Aldrich | E9884 | 1.3, 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1 |
| Ethanol (C2H6O) | VWR | 437433T | 2.2.1 |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH6ClN3) | Sigma-Aldrich | G3272 | 1.6.1 |
| Glycerol (C3H8O3) | Acros organics | 158920025 | Suppl 1.1 |
| H2O LC-MS Cromasolv | Sigma-Aldrich | 39253-1L-R | Throughout the protocol |
| H218O | Taiyo Nippon Sanso | FO3-0027 | 3.5 |
| Hydroxylamine (HA, H3NO) | Sigma-Aldrich | 467804 | 6.4 |
| Iodoacetamide (IAA, C2H4INO) | Sigma-Aldrich | A3221 | 4.4 |
| Phosphate-buffered Saline (PBS), 10x | Lonza | 51226 | 1.3 |
| Sodium acetate (C2H3NaO2) | Sigma-Aldrich | S7545 | 1.6.1 |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 1.4.1, 3.2 |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC12H25SO4) | Sigma-Aldrich | 466143 | 1.5.1 |
| Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C7H17NO3) | Sigma-Aldrich | 11268 | 4.7, 6.1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Sigma-Aldrich | T62200 | 4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3 |
| Thiourea (CH4N2S) | Sigma-Aldrich | T8656 | 4.2 |
| Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl]) | Sigma-Aldrich | T3253 | 1.4.1, Suppl 1. |
| Urea (CH4N2O) | Sigma-Aldrich | U1250 | 4.2 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. Enzymes | |||
| α2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0012) | 3.1 |
| β1,4-Galactosidase | EDM Millipore | 362280 (KP0004) | 3.1 |
| β-N-Acetylglucosaminidase | EDM Millipore | 362280 (KP0013) | 3.1 |
| Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C3667 | 3.1 |
| Endo-α-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase) | EDM Millipore | 362280 (KP0011) | 3.1 |
| Heparinase II | Sigma-Aldrich | H6512 | 3.1 |
| Keratanase | Sigma-Aldrich | G6920 | 3.1 |
| PNGase-F (N-Glycosidase F) | EDM Millipore | 362280 (KP0001) | 3.5 |
| Trypsin | Thermo Scientific | 90057 | 4.7 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. Reagent kits | |||
| 30 kDa MWCO spin filters | Amicon, Millipore | 10256744 | 5.9, Suppl 2 |
| Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate | Harvard Apparatus | 74-5657 | 5.1 |
| NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels | Thermo-Scientific | NP0322PK2 | Suppl 1 |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | 2.1.3 |
| ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit | Merk Millipore | 72103 | 7 |
| Tandem mass tag 0 (TMT0) | Thermo Scientific | 900067 | 6.2, 6.3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D. Equipment and software | |||
| Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5 mm x 300 µm, 5 µm, 100 Å | Thermo Scientific | 160454 | Suppl 3, 4 |
| Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 µm, 3 µm, 100 Å | Thermo Scientific | 164570 | Suppl 3 |
| Byonic Search Engine | Protein Metrics | Version 2.9.30 | Suppl 5 |
| Dionex UltiMate 3000 RSLCnano | Thermo Scientific | n/a | Suppl 3, 4 |
| EASY-Spray Ion Source | Thermo Scientific | ES081 | Suppl 4 |
| EASY-Spray PepMap RSLC C18, 50 cm x 75 µm, 2 μm, 100 Å | Thermo Scientific | ES803 | Suppl 4 |
| Mascot Search Engine | Matrix Science | Version 2.3.01 | Suppl 3 |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | Suppl 4 |
| Proteome Discoverer Software | Thermo Scientific | Version 2.1.1.21 | Suppl 3, 5 |
| Picoview Nanospray Source | New Objective | 550 | Suppl 3 |
| Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBFZ | Suppl 3 |
| Savant SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | SPD131DDA | 2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11 |
| Scaffold Software | Proteome Software | Version 4.3.2 | Suppl 3 |
References
- Porter, K. E., Turner, N. A. Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling. Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury. Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation. Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).
- Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases. J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).
- Varki, A., Lowe, J. B., et al. Biological Roles of Glycans. Essentials of glycobiology. 2nd ed. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor NY. (2009).
- Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix. Cardiovasc. Res. , (2016).
- Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure. Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).
- Mason, R. M., Mayes, R. W. Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions. Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).
- Vogel, K. G., Peters, J. A. Isolation of proteoglycans from tendon. Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).
- Wilson, R., et al. Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).
- Barallobre-Barreiro, J., et al. Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins. Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).
- Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta. Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).
- Didangelos, A., et al. Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
- Grandoch, M., et al. Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).
- Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells. Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).
- Parker, B. L., et al. Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment. Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Pepinsky, R. B. Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol. Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).
- de Castro-Brás, L. E., et al. Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix. J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).
- Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis. J Vis Exp. (101), e53057 (2015).
- Decaris, M. L., et al. Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).
- Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).
- Parker, B. L., et al. Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity. J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).
- Li, Y., et al. Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues. Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity. Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).
