Summary
这里，我们提出一种有效的水解和从镍席夫碱配合物中分离的氨基酸的后续的Fmoc保护。是必需的酸不稳定侧链保护基团的保留时这里介绍的水解条件是适合使用的。这种技术可以适用于各种非天然氨基酸的衬底。
Abstract
非天然氨基酸，含有侧链官能自然界中不常见的氨基酸，正越来越多地在合成的肽序列中发现。某些非天然氨基酸的合成通常包括使用由通过镍阳离子稳定化的席夫碱的前体。非天然侧链可以安装在在该席夫碱配合物中发现的氨基酸主链。将所得的非天然氨基酸可随后从所述席夫碱的这种复杂的使用水解分离，典型地通过采用回流在强酸性溶液中。这些高酸性条件可除去对酸不稳定的侧链保护基团所需的用于向微波辅助固相肽合成中使用的非天然氨基酸。在这项工作中，我们提出了一种有效的水解和从镍席夫碱配合物中分离的氨基酸的后续的Fmoc保护。在这项工作中提出水解条件适合于酸不稳定S的保持IDE-侧链保护基，并且可以是适于多种非天然氨基酸的衬底。
Introduction
非天然氨基酸（UAA的）轴承侧链从那些在自然界中发现的20个天然存在的氨基酸的变化已经在广泛的应用范围中找到效用。这些UAA的合成，但是，可以根据侧链的结构和氨基酸主链的立体化学是困难的。在镍席夫碱络合物的情况下甘氨酸克·邦德活化已被用来生产多种氨基酸衍生物，包括α，β二氨基酸1和UAA的轴承氟化2或杂环侧链。 3
另外的非天然侧链后，官能UAA的典型地由在盐酸4通过回流席夫碱配合物中取出，使用离子交换色谱法，随后分离。虽然通常是有效，该协议生成美浓酸，可能是不适合用于固相肽合成（SPPS）的使用。 SPPS的性质要求酸不稳定侧链保护基团的存在和的典型镍席夫碱分解条件强酸性性质防止UAA的隔离用这些保护基团完整。据我们所知，只有一个选择分解方法已经报道了：使用乙二胺四乙酸（EDTA）和肼的在升高的温度下，5个条件本身可能不适合于某些侧链保护基团，例如邻苯二甲酰亚胺。
图1：选自Ni 2+，PBP，和甘氨酸（GLY）的Ni-PBP -甘氨酸的合成。 请点击此处查看该图的放大版本。
在本文中，我们报道了镍席夫碱配合物的水解的方法，镍- PBP -甘氨酸（ 图1）。这种复杂的，选自Ni 2+，甘氨酸，和吡啶-2-羧酸（2-苯甲酰基苯基） -酰胺（PBP），6得出的已被证明是用于多种UAA的合成有用的平台，并容易访问使用两步合成路线。这种复杂的7种合成是文献先例的高收率。 6我们的研究结果如下所述证明利用EDTA中在温和的酸性至适合于与UAA的轴承酸不稳定侧链保护基团的使用中性pH条件的水解条件的适用性。水解之后，所得的水溶液可被分离，并立即进行标准Fmoc保护的条件，得到Fmoc-保护的氨基酸（ 图2）。
图2：水解和氨基酸选自Ni-PBP -甘氨酸隔离的的Fmoc保护。反应条件：一。 EDTA（12当量），pH值4.5; II。乙酸乙酯洗涤并调整至pH 7; III。将Fmoc-OSu的（1当量）， 碳酸氢钠 （2当量）。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Protocol
1.镍 - 席夫碱配合物的水解
- 在室温下在250mL圆底烧瓶中，搅拌溶解1毫摩尔的Ni PBP-席夫碱配合物在40mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）。
- 添加60mL的0.2M的EDTA水溶液，pH为4.5。
- 使用磁性搅拌棒，搅拌板，过夜搅拌该合并的溶液。作为席夫碱配合物被水解，颜色会从深红色转变为白色。
- 通过不存在任何红色着色的指示反应完成后，转移反应至250mL分液漏斗中。
- 加入50毫升二氯甲烷，帽分液漏斗，并混合。漏有机洗涤到废物烧杯中。重复此过程三次以去除PBP和任何残留的Ni-PBP-席夫碱配合物。收集在250mL圆底烧瓶中的剩余的水层。
2.水解氨基酸的Fmoc保护
- 添加168毫克碳酸氢钠（2.00毫摩尔，2当量）到该溶液中，并使用磁力搅拌棒搅拌并搅拌板。
- 在10mL小瓶最小量的二恶烷（大约4或5毫升）中溶解337毫克的Fmoc N-羟基酯（1.00毫摩尔，1当量）。转移该溶液到水溶液中并搅拌过夜。
- 使反应搅拌过夜后，酸化，用1M盐酸将得到的溶液至pH为2。检查pH值周期性地用pH试纸。
- 将反应转移到250mL分液漏斗，并添加50mL的乙酸乙酯中。帽分液漏斗中，充分混合，并收集在250mL锥形瓶中有机层。重复此过程，另外两次，结合的有机萃取物。干燥合并的有机萃取物用约3克镁sulfat的即
- 集中使用旋转蒸发器，得到粗的Fmoc保护的氨基酸将合并的有机萃取物。
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Representative Results
我们假设，除去从镍PBP -甘氨酸络合物在Ni 2+的可允许的席夫碱的有效水溶液水解，而不需要苛刻的pH条件。如EDTA是一种廉价的和充分研究的螯合剂，10我们推测，加入EDTA至镍PBP-Gly的溶液将促进的Ni 2+离子的螯合，从而促进复合物的水解。
为了测试我们的理论，即单独EDTA能有效促进复合物的水解，我们在室温下进行的Ni-PBP-Gly的溶液在DMF中增加EDTA的等同物在pH为4.5的水溶液，含水的EDTA二钠盐溶液的未经调整的pH值。水解反应的进程可通过溶液的观察颜色的被监测;未反应的镍PBP - 甘氨酸溶液中显示深红色而PBP分离从这个复杂的是白色的。我们通过监测溶液的颜色变化从红色到白色（ 表1）跟踪水解反应的进程。涉及少于八个当量反应显示从红色着色为白色的一些过渡，但反应在每种情况下不完全的。没有颜色变化的无EDTA的条件是显而易见的。
pH对水解的效果类似地进行评估。在Ni-PBP - 甘氨酸络合物，使用12个当量的EDTA的在室温下改变pH过夜水解条件的隶属表明复合物的成功的水解pH条件范围从4.5至7.5下进行。这表明EDTA水解的灵活性; pH值可以提高到占更多的酸敏感的侧链保护基团。
| 条件 | EDTA溶液pH | 隔夜完成 | |
| 1 | 0 | 4.5 | 没有 |
| 2 | 2 | 4.5 | 局部 |
| 3 | 4 | 4.5 | 局部 |
| 4 | 6 | 4.5 | 局部 |
| 五 | 8 | 4.5 | 充分 |
| 6 | 10 | 4.5 | 充分 |
| 7 | 12 | 4.5 | 充分 |
| 8 | 12 | 5 | 充分 |
| 9 | 12 | 5.5 | 充分 |
| 10 | 12 | 6 | 充分 |
| 11 | 12 | 6.5 | 充分 |
| 12 | 12 | 7 | 充分 |
| 13 | 12 | 7.5 | 充分 |
| 14 | 12 | 8 | 局部 |
表1：镍PBP-甘氨酸水解条件。
为了验证能使用的最有效的条件下，7，其水解完成，我们提取反应用二氯甲烷三次，合并并干燥有机层，并使用核磁共振波谱法（NMR）进行分析所得到的残余物。 NMR谱表明该样品中没有镍PBP - 甘氨酸的证据;在光谱中发现的唯一共振匹配PBP的文献报告，表明复合物的完全水解。
我们检查了我们的最佳水解条件下与氨基酸的可行性包含荷兰国际集团的范围内的侧链保护基团。的样品的Fmoc-L-谷氨酸5- 叔丁基酯（将Fmoc-GLU（ 吨丁基）-OH），将Fmoc- -O - 叔丁基-L-苏氨酸（将Fmoc-THR（ 吨丁基）-OH），FMOC - O - 叔丁基-L-酪氨酸（的Fmoc-Tyr（ 吨丁基）-OH），和N（在）-Boc- Nα-Fmoc-L-色氨酸（将Fmoc-色氨酸（BOC）-OH）溶解在DMF中，并在使用12个当量的EDTA在pH 4.5室温下进行水解。被允许搅拌过夜后，将溶液用二氯甲烷萃取，并通过NMR进行分析。代表性NMR被包括用于将Fmoc-GLU（TBU）-OH（ 图3）。在每种情况下，光谱的数据显示的侧链保护基团的完全保留。 11，12，13
图3：将Fmoc-单体轴承酸不稳定侧链屈从于水解条件后保护基团的代表性的NMR。
酸不稳定侧链保护基团被突出显示与蓝色框。对于该化合物的质子信号圆形积分值都包括在括号中。 请点击此处查看该图的放大版本。
水解和有机萃取后，将剩余的水层中含有游离氨基酸残余EDTA和Ni 2+离子一起。为了确保这些物质的存在不会与游离氨基酸的后续的Fmoc保护干扰，我们通过在含有EDTA和Ni 2+离子浓度与类似于水解条目7 W上的水性溶液中溶解甘氨酸执行测试反应È然后进行该溶液的标准水性的Fmoc保护。 8反应完成和工作后，我们确定，得到Fmoc-保护的甘氨酸的产率为25％的反应。这个百分比产率并不令人惊讶考虑反应的稀释浓度，并建议的Ni 2+离子和EDTA的存在不与一个标准的Fmoc保护干扰反应。
证据支持了我们的方法（水解，游离氨基酸的分离，和Fmoc保护）的每个单独的部件是可行的，我们进行了使用Ni-PBP - 甘氨酸证明的概念实验。我们评估的上述和使用标准方案8，得到在合理产率的Fmoc保护的氨基酸的Fmoc之后保护所描述的水解条件的可行性。到的镍PBP - 甘氨酸在40mL DMF中，在室温下的搅拌的溶液（404毫克，0.971毫摩尔，1个当量）erature在pH 4.5加入0.2M的EDTA溶液（65毫升，13毫摩尔，13当量）。将反应物搅拌过夜，然后用二氯甲烷洗涤4次。然后将水层用固体碳酸氢钠调节至pH 7。向溶解于二恶烷中的最小量添加水层碳酸氢钠（163毫克，1.93毫摩尔，2当量）和Fmoc-OSu的（327毫克，0.971毫摩尔，1个当量）。允许该反应，用乙酸乙酯搅拌过夜，然后用1M盐酸酸化，并萃取三次。将有机萃取物合并，用盐水洗涤六次，浓缩，用硫酸镁干燥，并在真空下干燥，得到未反应的Fmoc-OSu的和使Fmoc-Gly-OH（160毫克，0.540毫摩尔，产率54％）的混合物中。光谱数据进行匹配先前公布的光谱使Fmoc-Gly-OH。 9这最后的实验表明，它是可行的从镍PBP -甘氨酸络合物隔离自由甘氨酸和发扬，其将Fmoc-PROTected形式。
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Discussion
上述方案是在其通过两个关键步骤，以便于从温和的pH条件和此分离的氨基酸的后续的Fmoc保护下的Ni席夫碱配合物的氨基酸主链的隔离能力是有用的。第一步包括搅拌含有EDTA以促进从复合物中的氨基酸的释放的DMF /水的溶液。残余络合物或有机副产物可以容易地与萃取除去。本协议的第二步骤包括在第一步骤中通过萃取水层中的发现在分离后的氨基酸的Fmoc基保护。我们已经证明修改的pH范围4.5-7.5此过程的能力，允许其可以对某些pH敏感的侧链保护基团是必要的显著灵活性。
这种技术的一个潜在的限制是分离的氨基酸的Fmoc基保护的低反应浓度。作为促进èfficient水解需要几个当量的EDTA相对于底物，反应条件要求显著量EDTA水溶液（60毫升对于1毫摩尔规模的反应）。在试剂的相对低的（〜0.015 M）浓度在使用被Fmoc保护的结果这个体积的溶剂中。虽然使用这些条件中一个有希望的产率，尽管稀的反应条件为55％，得到产物证明的概念的反应，可能有必要利用具有相对nucleophilicty减少到甘氨酸从增加的空间体积导致氨基酸时，以增加该浓度。
总之，我们已经证明了EDTA的效用，以促进通常用于UAA的合成的Ni席夫碱配合物的水解。这些水解条件不需要强酸性条件典型这些水解，从而允许酸不稳定侧链保护基团的保持。今后的实验中应注重运用ŧ他的一般策略多种非天然氨基酸的衬底。为此工作正在进行中。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
通过滑岩大学提供资助。我们要感谢T·博龙III（滑岩大学）和C·哈尼（宾夕法尼亚大学），他们的见解。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
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