Summary
Hier stellen wir eine effiziente Hydrolyse und anschließender Fmoc Schutz einer Aminosäure isoliert aus einer Ni-Schiff-Base-Komplex. Hydrolysebedingungen hier vorgestellten sind geeignet für die Verwendung bei der Beibehaltung der säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen erforderlich ist. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Substraten unnatürlicher Aminosäuren anpassbar sein.
Abstract
Unnatürliche Aminosäuren, Aminosäuren Seitenkettenfunktionalitäten, die nicht üblicherweise in der Natur gesehen, wird zunehmend in der synthetischen Peptidsequenzen gefunden. Synthese einiger unnatürliche Aminosäuren beinhaltet oft die Verwendung eines Vorläufers, bestehend aus einer Schiff-Base durch einen Nickelkation stabilisiert. Unnatürliche Seitenketten können in diesem Schiff-Base-Komplex gefunden auf einem Aminosäurerückgrat eingebaut werden. Die resultierenden unnatürlichen Aminosäure können dann aus dieser Komplex unter Verwendung von Hydrolyse der Schiffschen-Base isoliert werden, typischerweise durch Rückfluss in stark saurer Lösung einsetzt. Diese stark sauren Bedingungen können säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen, die für die nicht natürlichen Aminosäuren verwendet werden in Mikrowellen-unterstützten Festphasen-Peptidsynthese entfernt werden. In dieser Arbeit präsentieren wir eine effiziente Hydrolyse und anschließender Fmoc Schutz eines aus einer Ni-Schiff-Base-Komplex isoliert Aminosäure. Hydrolysebedingungen in dieser Arbeit vorgestellten eignen sich zur Aufbewahrung von säurelabilen side Ketten-Schutzgruppen und kann auf eine Vielzahl von Substraten unnatürlicher Aminosäuren anpassbar sein.
Introduction
Unnatürliche Aminosäuren (UAA'S) Lagerseitenketten, die sich von denen der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren, die in der Natur gefunden variieren haben einen Nutzen in einer breiten Palette von Anwendungen zu finden. Synthese dieser UAA ist, kann jedoch schwierig sein, in Abhängigkeit von der Struktur der Seitenketten und der Stereochemie des Aminosäure-Rückgrats. CH - Bindungsaktivierung von Glycin in Zusammenhang mit einer Nickel Schiff-Base - Komplex wird verwendet, um 2 fluoriert oder heterocyclischen Seitenketten , die eine Vielzahl von Aminosäurederivaten einschließlich α, β-Diaminosäuren 1 und UAA des Lager zu erzeugen. 3
Nach Zugabe von unnatürlichen Seitenketten funktionalisiertes UAA der typischerweise aus dem Schiffschen-Base - Komplex , der durch Rückfluss in Salzsäure entfernt werden und anschließend 4 Ionenaustauschchromatographie isoliert werden. Während im Allgemeinen effizient, erzeugt dieses Protokoll einmino Säuren, die zur Verwendung in der Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) ungeeignet sein können. Die Art der SPPS erfordert die Anwesenheit von säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen und die starken sauren Natur von typischen Ni-Schiff-Basen-Zersetzungsbedingungen verhindert Isolierung der UAA des mit diesen Schutzgruppen intakt. Nach unserer Kenntnis hat nur eine alternative Zersetzungsverfahren berichtet worden: Die Verwendung von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Hydrazin bei erhöhten Temperaturen, 5 Bedingungen , die sich nicht für alle Seitenketten - Schutzgruppen, wie Phthalimide geeignet sein können.
Abbildung 1: Synthese von Ni-PBP-Gly aus Ni 2+, PBP und Glycin (Gly). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hydrolyse eines Ni-Schiff-Base - Komplexes, Ni-PBP-Gly (Abbildung 1). Dieser Komplex, abgeleitet von Ni 2+, Glycin und Pyridin-2-carbonsäure (2-benzoyl-phenyl) -amid (PBP), 6 ist gezeigt worden , eine nützliche Plattform für die Synthese einer Vielzahl von UAA des sein und ist einfach zugänglich unter Verwendung eines zweistufigen Syntheseweg. 7 Synthese dieses Komplexes ist literatur dagewesene in hohen Ausbeute. 6 Unsere Ergebnisse unten beschrieben zeigen die Anwendbarkeit der Bedingungen der Hydrolyse EDTA bei schwach sauren bis neutralen pH - Bedingungen , die für die Verwendung mit UAA des Lagersäurelabilen Seitenkettenschutzgruppen verwendet. Nach der Hydrolyse kann die resultierende wässrige Lösung getrennt und sofort auf Standard - Fmoc - Schutzbedingungen unterzogen werden , um ein Fmoc-geschützte Aminosäure (Abbildung 2) zu ergeben.
Abbildung 2: Hydrolyse und Fmoc-Schutz einer Aminosäure isoliert aus Ni-PBP-Gly. Reaktionsbedingungen: i. EDTA (12 Äquiv), pH 4,5; ii. Ethylacetat Waschen und Einstellung auf pH 7; iii. Fmoc-OSu (1 Äquiv), NaHCO 3 (2 Äquivalente). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Protocol
1. Hydrolyse von Ni-Schiff-Base-Komplex
- Man löst 1 mmol des Ni-PBP-Schiff-Base - Komplexes in 40 ml N, N - Dimethylformamid (DMF) mit in einem 250 ml Rundkolben bei Raumtemperatur gerührt wird.
- 60 ml von 0,2 M wässrigen EDTA-Lösung, pH 4,5.
- Unter Verwendung eines magnetischen Rührstabs und Platte rühren, über Nacht rühren die kombinierte Lösung. Da der Schiff-Base-Komplex hydrolysiert wird, wird die Farbe von einem tiefen Rot nach Weiß verschieben.
- Nach Beendigung der Reaktion, wie durch das Fehlen jeglicher Rotfärbung angegeben, übertragen, um die Reaktion in einen 250 ml Scheidetrichter.
- In 50 ml Dichlormethan, die Kappe des Trenntrichter und mischen. Lassen Sie das organische Wasch in einen Abfallbecher. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal PBP und jegliches restlichen Ni-PBP-Schiff-Base-Komplex zu entfernen. Sammeln der verbleibenden wässrigen Schicht in einem 250 ml Rundkolben.
2. Fmoc Schutz von Hydrolyzed Aminosäure
- Hinzufügen 168 mg Natriumbicarbonat (2,00 mmol, 2 Äquivalente) zu der Lösung und Rühren eines magnetischen Rührstabs und unter Verwendung Rührplatte.
- Man löst 337 mg Fmoc - N - hydroxysuccinimidester (1,00 mmol, 1 equiv) in einer minimalen Menge von Dioxan (ca. 4 oder 5 ml) in einem 10 ml Glasfläschchen. Diese Lösung in der wässrigen Lösung und rühre über Nacht.
- Nachdem man über Nacht rührt die Reaktion, säuert die erhaltene Lösung auf pH 2 mit 1 M Salzsäure. Überprüfen Sie pH pH-Teststreifen regelmäßig verwenden.
- Übertragen, um die Reaktion in einen 250 ml Scheidetrichter überführt und mit 50 ml Ethylacetat. Kappe der Trenntrichter, gut mischte, und sammeln die organische Schicht in einer 250 ml-Erlenmeyerkolben. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, die organischen Extrakte kombiniert. Die vereinigten organischen Extrakte werden mit ca. 3 g Magnesium sulfate.
- Konzentrieren der vereinigten organischen Extrakte mit einem Rotationsverdampfer der rohen Fmoc-geschützten Aminosäure zu ergeben.
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Representative Results
Wir nahmen an, dass die Entfernung des Ni 2+ aus der Ni-PBP-Gly - Komplex könnte eine effiziente wässrige Hydrolyse der Schiffschen-Base , ohne die Notwendigkeit für raue pH - Bedingungen ermöglichen. Als EDTA eine kostengünstige und gut untersuchten Chelatbildner ist, 10 die Hypothese aufgestellt , dass wir die Zugabe von EDTA zu einer Lösung von Ni-PBP-Gly Chelatisierung von Ni 2+ -Ionen erleichtern würde, wodurch die Hydrolyse des Komplexes fördern.
Um unsere Theorie zu testen, daß EDTA allein wirksam Hydrolyse des Komplexes fördern könnte, haben wir eine Lösung von Ni-PBP-Gly in DMF bei Raumtemperatur zur Erhöhung der Äquivalente von EDTA in pH 4,5 wässrige Lösung, die nicht eingestellten pH-Wertes von wässrigem EDTA-Dinatriumsalz Lösung unterworfen . Der Fortschritt der Hydrolysereaktion kann durch die Beobachtung der Farbe der Lösung überwacht werden; nicht umgesetzte Ni-PBP-Gly in Lösung zeigt eine tiefrote Farbe, während PBP isoliertdiese Anlage ist weiß. Wir verfolgen den Fortschritt der Hydrolysereaktion durch die Änderung von Rot Lösungsfarbüberwachung zu Weiß (Tabelle 1). Reaktionen weniger als acht Äquivalente die zeigten einigen Übergang von rot nach weißer Färbung, aber die Reaktion war jeweils nicht vollständig. Keine Farbänderung war offensichtlich für Bedingungen ohne EDTA.
Die Wirkung des pH auf die Hydrolyse wurde in ähnlicher Weise bewertet. Unterwerfung des Ni-PBP-Gly-Komplexes, um Bedingungen der Hydrolyse 12 Äquivalenten EDTA über Nacht mit variierenden pH-Wert bei Raumtemperatur zeigte erfolgreiche Hydrolyse des Komplexes erfolgt unter 4,5 bis 7,5 reich pH Bedingungen. Dies zeigt die Flexibilität von EDTA Hydrolyse; pH-Wert kann für mehr säureempfindlichen Seitenkettenschutzgruppen erhöht werden, zu berücksichtigen.
| Bedingung | pH-Wert von EDTA-Lösung | Über Nacht Completion | |
| 1 | 0 | 4.5 | Keiner |
| 2 | 2 | 4.5 | Teilweise |
| 3 | 4 | 4.5 | Teilweise |
| 4 | 6 | 4.5 | Teilweise |
| 5 | 8 | 4.5 | Voll |
| 6 | 10 | 4.5 | Voll |
| 7 | 12 | 4.5 | Voll |
| 8 | 12 | 5.0 | Voll |
| 9 | 12 | 5.5 | Voll |
| 10 | 12 | 6.0 | Voll |
| 11 | 12 | 6.5 | Voll |
| 12 | 12 | 7.0 | Voll |
| 13 | 12 | 7.5 | Voll |
| 14 | 12 | 8.0 | Teilweise |
Tabelle 1: Ni-PBP-Gly Hydrolysebedingungen.
Um zu überprüfen, dass die Hydrolyse vollständig war die effizienteste Verwendung Zustand, 7, extrahierten wir die Reaktion dreimal mit Dichlormethan, vereinigt und getrocknet, um die organischen Schichten und analysiert, um die sich ergebende Rückstand unter Verwendung von Kernspinresonanzspektroskopie (NMR). Das NMR-Spektrum zeigte keine Anzeichen von Ni-PBP-Gly in der Probe; die einzigen Resonanzen im Spektrum abgestimmt Literaturberichten von PBP, was darauf hindeutet, eine vollständige Hydrolyse des Komplexes.
Wir untersuchten die Durchführbarkeit unserer optimalen Hydrolysebedingungen mit Aminosäuren enthaltening eine Reihe von Seitenkettenschutzgruppen. Proben von Fmoc-L-glutaminsäure-5 - tert-butylester (Fmoc-Glu (tBu) -OH), Fmoc- O - tert -butyl-L-Threonin (Fmoc-Thr (t Bu) -OH), Fmoc - O - tert -butyl-L-tyrosin (Fmoc-Tyr (t Bu) -OH) und N (in) Boc- N α -Fmoc-L-tryptophan (Fmoc-Trp (Boc) -OH) gelöst in DMF und Hydrolyse bei Raumtemperatur unter Verwendung von 12 Äquivalenten von EDTA bei pH 4,5. Nachdem sie über Nacht rühren gelassen wurden die Lösungen mit Dichlormethan und analysiert mit NMR extrahiert. Eine repräsentative NMR für Fmoc-Glu (tBu) -OH (3) enthalten. In jedem Fall zeigte Spektraldaten vollständige Retention der Seitenkettenschutzgruppen. 11, 12, 13
3: Repräsentative NMR eineine Fmoc-Monomer Lager eine säurelabilen Seitenkettenschutzgruppe nach der Unterwerfung unter den Hydrolysebedingungen.
Die säurelabilen Seitenkettenschutzgruppe wird mit einem blauen Box hervorgehoben. Abgerundete Integrationswerte für die Protonensignale dieser Verbindung sind in Klammern angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Nach Hydrolyse und organischer Extraktion, enthält die verbleibende wässrige Schicht , die die freien Aminosäuren zusammen mit restlichem EDTA und Ni 2+ -Ionen. Um sicherzustellen , dass die Gegenwart dieser Substanzen nicht mit anschließendem Fmoc Schutz des freien Aminosäure stören würde, führten wir eine Testreaktion durch Glycin in einer wässrigen Lösung , die EDTA und Ni 2+ -Ionen mit Konzentrationen ähnlich wie Hydrolyse Eintritt Auflösen 7.en We dann diese Lösung zu einem wässrigen Standard Fmoc-Schutz unterworfen. 8. Nach Beendigung der Reaktion und Aufarbeitung wir festgestellt , die Reaktion eine 25% Ausbeute von Fmoc-geschütztem Glycin liefert. Diese prozentuale Ausbeute ist nicht überraschend , die verdünnte Konzentration der Reaktions Berücksichtigung und legt nahe , dass die Gegenwart von Ni 2+ -Ionen und EDTA interferieren nicht mit einer Standard - Fmoc - Schutzreaktion.
Unter Nachweis, dass jede einzelne Komponente unserer Methode (Hydrolyse, Isolierung des freien Aminosäure und Fmoc-Schutz) durchführbar ist, führten wir ein proof-of-concept-Experiment unter Verwendung von Ni-PBP-Gly. Wir untersuchten die Lebensfähigkeit der Hydrolysebedingungen obige und nachfolgenden Fmoc - Schutz beschrieben ein Standardprotokolls unter Verwendung von 8 ein Fmoc-geschützten Aminosäure in angemessener Ausbeute erhalten wird . Zu einer gerührten Lösung von Ni-PBP-Gly (404 mg, 0,971 mmol, 1 Äquiv) in 40 mL DMF bei Raumtemperatur wurde 0,2 M EDTA-Lösung bei pH 4,5 (65 ml, 13 mmol, 13 Äquiv) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht rühren gelassen und dann viermal gewaschen mit Dichlormethan. Die wässrige Schicht wurde dann 7 unter Verwendung von festem Natriumbicarbonat auf pH-Wert eingestellt. Zu der wässrigen Schicht zugegeben, Natriumbicarbonat (163 mg, 1,93 mmol, 2 Äquivalente) und Fmoc-OSu (327 mg, 0,971 mmol, 1 equiv) in einer minimalen Menge an Dioxan gelöst. Die Reaktion wurde über Nacht und dann angesäuert und mit 1 M Salzsäure rühren gelassen und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, gewaschen sechsmal mit Salzlösung gewaschen, eingeengt, mit Magnesiumsulfat getrocknet und unter Vakuum getrocknet, um eine Mischung aus nicht umgesetztem Fmoc-OSu und Fmoc-Gly-OH (160 mg, 0,540 mmol, 54% Ausbeute) zu ergeben. Die Spektraldaten stimmten mit zuvor veröffentlichten Spektren für Fmoc-Gly-OH. 9 Dieses letzte Experiment zeigt , dass es möglich ist , frei Glycin aus dem Ni-PBP-Gly - Komplex und trägt es nach vorne zu seinem Fmoc-Prot zu isolieren ,ektiert Form.
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Discussion
Das oben beschriebene Protokoll ist nützlich in seiner Fähigkeit, die Isolierung aus einer Aminosäurerückgrat aus einem Ni-Schiff-Base-Komplex unter milden pH-Bedingungen und anschließenden Fmoc-Schutz dieses isolierten Aminosäure durch zwei kritische Schritte zu erleichtern. Der erste Schritt beinhaltet Rühren eine DMF / Wasser-Lösung, enthaltend EDTA Freisetzung der Aminosäure aus dem Komplex zu erleichtern. Residual-Komplex oder organische Nebenprodukte können leicht mit der Extraktion entfernt werden. Der zweite Schritt dieses Protokolls beinhaltet einen Fmoc Schutz der in der wßrigen Schicht nach der Isolierung durch Extraktion in der ersten Stufe gefunden Aminosäure. Wir haben die Fähigkeit gezeigt, dieses Verfahren in einem pH-Bereich von 4,5-7,5, wodurch eine erhebliche Flexibilität zu modifizieren, die für einige pH-empfindlichen Seitenkettenschutzgruppen erforderlich sein können.
Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist die geringe Konzentration des Reaktions Fmoc Schutz der isolierten Aminosäure. Wie erleichtert effizient Hydrolyse erfordert mehrere Äquivalente von EDTA, bezogen auf Substrat, wobei die Reaktionsbedingungen erfordern eine erhebliche Menge wässriger EDTA-Lösung (60 ml einer 1 mmol-Maßstab Reaktion). Unter Verwendung dieses Lösungsmittelvolumens in einer Fmoc-Schutz führt zu einer relativ niedrigen (~ 0,015 M) Konzentration der Reagenzien. Während ein Proof-of-concept-Reaktion, diese Bedingungen lieferte das Produkt in einer vielversprechenden 55% Ausbeute trotz der verdünnten Reaktionsbedingungen verwendet wird, kann es notwendig sein, diese Konzentration zu erhöhen, wenn Aminosäuren mit reduziertem nucleophilicty relativ zu Glycin unter Verwendung von erhöhten sterischen Masse resultiert.
Zusammenfassend haben wir die Nützlichkeit von EDTA zu fördern Hydrolyse eines Ni-Schiff'sche Base-Komplexes demonstrierten typischerweise zur Synthese von UAA Jahren verwendet. Diese Hydrolysebedingungen erfordern nicht die stark sauren Bedingungen typisch für diese Hydrolysen, was eine Beibehaltung von säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen. Zukünftige Experimente sollten sich auf t Anwendungseine allgemeine Strategie zu einer Vielzahl von nichtnatürlichen Aminosäure Substraten. Arbeit zu diesem Zweck ist im Gange.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Finanzierung durch Slippery Rock University. Wir möchten, dass T. Boron III (Slippery Rock University) und C. Haney (University of Pennsylvania) für ihre Erkenntnisse danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-PBP-Gly | Synthesized from published protocol | ||
| DMF | Fisher | D119-4 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| Dichloromethane | Acros | AC610050040 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233-500 | |
| Fmoc-OSu | Chem-Impex | "00147" | |
| Dioxane | Fisher | D111-500 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A144-500 | |
| Ethyl Acetate | Acros | AC610060040 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| ZEOPrep 60ECO Silica Gel | ZEOChem | ||
| Hexanes | Fisher | 3200250.650.443 | |
| Chromatography Column | |||
| pH Test Strips | |||
| Rotary Evaporator | |||
| 250 mL Separatory Funnel | |||
| 250 mL Round Bottom Flask | |||
| Stir Bar | |||
| Stir Plate |
References
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