Summary
यह प्रोटोकॉल अलगाव और मिश्रित murine छोटे आंतों की कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन है। ये प्राथमिक आंतों संस्कृतियों संकेत रास्ते अंतर्निहित पेट पेप्टाइड लिए कई तकनीकों का उपयोग करते हुए स्राव की जांच करने के लिए सक्षम।
Abstract
पेट शरीर का सबसे बड़ा अंग अंत: स्रावी, हार्मोन स्रावित enteroendocrine जठरांत्र उपकला की लंबाई के साथ स्थित कोशिकाओं के साथ है। उनकी शारीरिक महत्व के बावजूद, enteroendocrine कोशिकाओं केवल उपकला कोशिका जनसंख्या का एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं और अतीत में, उनके लक्षण वर्णन काफी चुनौती सेल लाइन मॉडल पर निर्भरता में जिसके परिणामस्वरूप प्रस्तुत किया है। यहाँ, हम अलगाव और मिश्रित murine छोटे आंतों की कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। ये प्राथमिक संस्कृतियों पोषक तत्वों और neuropeptides के एक नंबर के जवाब के साथ-साथ औषधीय एजेंटों में उत्तेजना और पेट पेप्टाइड स्राव के निषेध अंतर्निहित संकेत दे रास्ते की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों के उपयोग के साथ संयोजन में, हम दिखा दिया है कि इन प्राथमिक संस्कृतियों में से fluorescently टैग enteroendocrine कोशिकाओं की परीक्षा के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनतेtracellular स्तर, इस तरह के पैच clamping और एकल सेल कैल्शियम और शिविर झल्लाहट इमेजिंग के रूप में तरीकों का उपयोग कर।
Introduction
इस विधि के समग्र लक्ष्य को अलग करने और पेट पेप्टाइड स्राव और enteroendocrine कोशिकाओं के लाइव सेल इमेजिंग के अध्ययन को सक्षम करने के संस्कृति मिश्रित murine आंतों की कोशिकाओं के लिए है। इस प्रक्रिया का एक प्रारंभिक संस्करण मूल रूप से Reimann एट अल द्वारा 2008 में प्रकाशित हुआ था। 1 और के बाद से हमारे समूह से एक और आगे 20 प्रकाशनों का आधार बनाया गया है। इस पांडुलिपि के लिए, हम छोटे आंत्र संस्कृतियों पर ध्यान केंद्रित करने के रूप में वे अधिक colonic संस्कृतियों की तुलना में स्थापित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं चुना है।
Enteroendocrine कोशिकाओं ग्लूकागन-जैसे पेप्टाइड 1 (जीएलपी 1), ग्लूकोज पर निर्भर पेप्टाइड insulinotropic (GIP), cholecystokinin (CCK) और पेप्टाइड YY (पी वाई वाई) 2 सहित पेट पेप्टाइड्स की एक सरणी स्राव करते हैं। ये पेट पेप्टाइड्स इस तरह के पेट पारगमन, ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन जारी है और तृप्ति के शामिल होने की potentiation के धीमा के रूप में भोजन के बाद प्रतिक्रियाओं orchestrating में महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका है। जीएलपी -1 mimetics एकnd दवाओं जो इसके अपकर्ष रोकना वर्तमान में टाइप 2 मधुमेह के उपचार के लिए लाइसेंस प्राप्त कर रहे हैं और वहाँ इस पेप्टाइड 3 के अंतर्जात स्राव उत्तेजक की चिकित्सीय क्षमता के चल रहे आकलन है। enteroendocrine शरीर क्रिया विज्ञान का एक बेहतर समझ और तंत्र है जिसके द्वारा स्राव या तो उत्तेजित या रोके जाने पर महत्व का इसलिए है,।
गुट पेप्टाइड स्राव इन विट्रो और पूर्व vivo प्रयोगात्मक मॉडल, फायदे और नुकसान के साथ प्रत्येक की एक किस्म का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (यह भी इन विवो मॉडल के उपयोग को कवर एक व्यापक हाल की समीक्षा के लिए देख Svendsen एट अल। 4)। इस तरह अलग-थलग भरकर रखा आंत 5 और ussing कक्षों 6 के रूप में पूर्व vivo तकनीक वर्तमान में विभिन्न पदार्थों के जवाब में पेट पेप्टाइड स्राव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। इन तरीकों में से मुख्य लाभ यह है, के रूप मेंप्राथमिक संस्कृतियों की तुलना में, कि enteroendocrine कोशिकाओं के तत्काल पर्यावरण काफी हद तक बरकरार रहता है और महत्वपूर्ण बात, कोशिकाओं की विपरीतता संरक्षित है। इसलिए, यह के बारे में जो कोशिका की सतह एक secretagogue पर 6 काम कर रहा है जानकारी हासिल करना संभव है। हालांकि, इन आम तौर पर कम प्रवाह करने की तकनीक है और डेटा उन्हें से प्राप्त की गुणवत्ता अखंडता और आंतों ऊतक की व्यवहार्यता, जो अनिवार्य रूप से समय के साथ कम पर काफी निर्भर करता।
आंतों organoids अब तेजी से enteroendocrine सेल समारोह और विकास 7 के अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है। Organoids, जो दोनों murine और मानव ऊतक से प्राप्त किया जा सकता है, 3 डी 'तहखाने की तरह' संरचनाओं कि संस्कृति में सेल polarity बनाए रखने के गठन के लाभ के लिए है। हालांकि, organoid व्युत्पन्न enteroendocrine कोशिकाओं अभी तक पूरी तरह विशेषता किया जाना है और देशी एल सेल करने के लिए उनकी समानताls काफी हद तक अनजान बनी हुई है। enteroendocrine कोशिकाओं नहीं रखा जाता है के रूप में और समय की लंबे समय तक कृत्रिम परिस्थितियों में अलग-अलग प्राथमिक संस्कृतियों, एक कदम शारीरिक सेटिंग के करीब होने का लाभ है।
एक वैकल्पिक प्राथमिक संस्कृति विधि है जो पेट पेप्टाइड स्राव के मूल्यांकन के लिए नियोजित किया गया है भ्रूण चूहे आंतों की कोशिकाओं (FRICs) 8 के अलगाव है। हालांकि, वयस्क आंतों के ऊतकों की संस्कृति कम सफलता प्राप्त हुई है और कुछ मतभेद FRICs बनाम वयस्क murine आंतों की कोशिकाओं (जैसे ग्लूकोज 8) की जवाबदेही में मनाया गया है।
Enteroendocrine की तरह सेल लाइनों (जैसे GLUTag, एसटीसी -1 और NCI-H716) पारंपरिक बनाम प्रत्यक्ष भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। enteroendocrine कोशिकाओं पर और अंतर्निहित आणविक स्राव को प्रोत्साहन युग्मन तंत्र काटना अप्रत्यक्ष प्रभाव; देख Kuhre एट अल 9। यह enteroendocrine कोशिकाओं, जठरांत्र संबंधी मार्ग के किनारे बिखरे हुए आवश्यक के रूप में किया गया है, का गठन सिर्फ आंतों उपकला कोशिकाओं 10 और अनुसार क्रमबद्ध कोशिकाओं की 1% से कम, हमारे हाथों में, संस्कृति 1 में जीवित नहीं है। सेल लाइनों तथ्य है कि वे एक बड़े पैमाने पर सजातीय सेल आबादी जो इस तरह के जीन गुप्तता के रूप में आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए अनुकूल है कर रहे हैं के कारण उपयोगी उपकरणों रहते हैं। नतीजतन, यह प्रोटीन होता है जो औषधीय लक्ष्य नहीं बनाया जा सकता है, जब ट्रांसजेनिक चूहों उपलब्ध नहीं हैं की भूमिका की जांच करने के लिए आसान है। हालांकि, सेल लाइनों हमेशा प्राथमिक कोशिकाओं के वैध मॉडल नहीं हैं। जबकि वहाँ कई समानताएं हैं, प्राथमिक संस्कृतियों अवसर पर है GLUTag कोशिकाओं की तुलना में प्राथमिक एल कोशिकाओं में कुछ पोषक तत्वों से सक्रिय संकेत दे रास्ते में अंतर पर प्रकाश डाला से निष्कर्ष हैं, उदाहरण के लिए (जैसे। Peptones <sup वर्ग = "xref"> 11)। महत्वपूर्ण बात है, ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों के साथ संयोजन में, प्राथमिक संस्कृति मॉडल intracellular स्तर पर अलग-अलग प्राथमिक enteroendocrine कोशिकाओं की विस्तृत जांच के लिए सक्षम बनाता है। प्राथमिक संस्कृतियों के भीतर fluorescently टैग एल कोशिकाओं पैच क्लैम्पिंग 1, 12 अध्ययन, और एकल सेल कैल्शियम 11, 13 और चक्रीय adenosine monophosphate झल्लाहट इमेजिंग 14 अध्ययन, जो enteroendocrine के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति मिले हैं के लिए हमारे समूह द्वारा इस्तेमाल किया गया है शरीर क्रिया विज्ञान।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल, स्राव प्रयोग प्रदर्शन एक 24 अच्छी तरह से थाली प्रयोग करने के लिए या 16 इमेजिंग व्यंजनों की तैयारी के लिए अनुकूलित है, एक भी वयस्क माउस से छोटी आंत के एक 10 सेमी अनुभाग से। प्रोटोकॉल आसानी से पाचन बार और सह में वृद्धि से colonic कोशिकाओं के अध्ययन के लिए संशोधित किया जा सकताllagenase एकाग्रता।
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं कैम्ब्रिज पशु कल्याण के विश्वविद्यालय और नैतिक समीक्षा निकाय द्वारा अनुमोदित और (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 में संशोधन विनियम (एसआई 2012/3039) पशु पुष्टि कर रहे थे।
1. एडवांस में तैयारी
- पिघलना बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक विभाज्य (BMM) (~ 200 μL) रखें।
नोट: BMM कमरे के तापमान (आर टी) में सशक्त बनाता। - पूर्व गर्म 50 मिलीलीटर बाँझ उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) (कोई परिवर्धन के साथ) और ~ 40 एमएल बाँझ संस्कृति मध्यम (उच्च ग्लूकोज DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस के साथ पूरक), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 37 ओ सी में 2 मिमी एल glutamine) एक जल स्नान में 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में
- पूर्व सर्द कैल्शियम और मैग्नीशियम युक्त फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)।
- 15 मिलीग्राम कोलैजिनेज़ (इलेवन कच्चे तेल) बाहर वजन, एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब को जोड़ने के लिए और बर्फ पर रखें।
2. ऊतक संग्रह
- एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब ~ 20 एमएल एल -15 माध्यम जोड़ें और बर्फ पर रखें।
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, या अन्य अनुमोदित अनुसूची 1 विधि द्वारा एक माउस euthanize।
नोट: आंतों ऊतक आम तौर पर एक C57BL6 पृष्ठभूमि पर चूहों से प्राप्त की है। हालांकि, अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि भी उदाहरण 129 / SvEv 15 इस्तेमाल किया गया है। इमेजिंग प्रयोगों GLU-वीनस 1 फ्लोरोसेंट संवाददाता चूहों के उपयोग जैसे की आवश्यकता है। ऊतक दोनों लिंगों के वयस्क चूहों (2-6 महीने) से प्राप्त होता है। चूहों individua में रखे जाते हैंlly हवादार पानी और नियमित रूप से चाओ को जी भरकर उपयोग के साथ पिंजरों। हालांकि, प्रयोगों एक उच्च वसा आहार के प्रभाव, उदाहरण के लिए, का परीक्षण करने के enteroendocrine सेल समारोह 16 पर यदि एक परियोजना लाइसेंस द्वारा समर्थित किया जा सकता है। - काटना और धीरे माउस आंत निकाल सकते हैं (जठरनिर्गम से मलाशय के शुरू करने के लिए) संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग कर। बर्फ पर एल 15 मध्यम में यह स्टोर का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक।
3. ऊतक तैयारी
- एक 10 सेमी पेट्री पर्याप्त पीबीएस युक्त ऊतक कवर करने के लिए डिश में आंतों ऊतक रखें। वांछित ऊतक के 10 सेमी (जैसे ऊपरी छोटी आंत, शीर्ष 10 सेमी, जठरनिर्गम को बाहर का) ले लो।
- एक प्लास्टिक पाश्चर विंदुक और ठंडा पीबीएस का उपयोग कर आंतों सामग्री बाहर फ्लश।
- संदंश आंतों खंड के एक छोर का उपयोग करना, नाजुक पकड़ और इसे में एक पाश्चर विंदुक की नोक जगह। ठंडा पीबीएस के साथ सामग्री बाहर फ्लश। majo जब तक दोनों सिरों से दोहराएँसामग्री की rity बाहर प्लावित किया गया है। ताजा ठंडा पीबीएस युक्त एक साफ पेट्री डिश के लिए स्थानांतरण।
- संदंश का प्रयोग,, वसा ऊतकों और अन्त्रपेशी हटाने देखभाल एक ही समय में मांसपेशियों की परत हटा नहीं है।
- पील मांसपेशी ठीक संदंश के दो सेट का उपयोग कर एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत "एक जुर्राब की तरह" बंद परत।
नोट: यह कदम आवश्यक नहीं है, लेकिन अत्यधिक की सिफारिश की है। यहाँ वर्णित एक करने के लिए मांसपेशियों की परत को हटाने के वैकल्पिक तरीके हैं। उदाहरण के लिए, आंत, अनुलंबीय पहले खुले काटा जा सकता है मांसपेशियों की परत को हटाने से पहले।- ऊतक के अधिक समीपस्थ अंत में एक प्रारंभिक बिंदु का पता लगाएं जहां पेशी के एक दृश्य फ्लैप है। धीरे आंत के आसपास सभी तरह मांसपेशियों की परत की एक छोटी राशि दूर खींचने।
नोट: मांसपेशियों की परत या आंतों उपकला फाड़ से बचने के लिए एक बड़े सतह क्षेत्र क्लैम्पिंग बजाय टी का उपयोग करके तनाव बल को कमठीक संदंश की ips। - आंत और संभव के रूप में पेशी फ्लैप के रूप में ज्यादा क्लैंप, धीरे अलग खींचने और आंत भर से मांसपेशियों की परत बंद छीलने शुरू करते हैं। दोनों मांसपेशियों की परत और उपकला फाड़ से बचने के लिए संदंश की स्थिति के पुनः समायोजन उन्हें एक साथ बंद रखने के लिए रहते हैं। इस तरह, आंतों खंड और छोड़ें की पूरी लंबाई से मांसपेशियों की परत को हटा दें।
- ऊतक के अधिक समीपस्थ अंत में एक प्रारंभिक बिंदु का पता लगाएं जहां पेशी के एक दृश्य फ्लैप है। धीरे आंत के आसपास सभी तरह मांसपेशियों की परत की एक छोटी राशि दूर खींचने।
- अनुदैर्ध्य खुला आंत कट और ताजा ठंडा पीबीएस के साथ एक साफ पेट्री डिश में घूमता द्वारा धोएं। यदि आवश्यक हो तो दोहराएँ किसी भी शेष काइम या बलगम दूर करने के लिए।
- एक शल्य चिकित्सा स्केलपेल ब्लेड के साथ कीमा ऊतक ~ 1-2 मिमी 2 के वर्गों को प्राप्त करने और करने के लिए ~ 20 एमएल 50 एमएल अपकेंद्रित्र एक पाश्चर पिपेट का उपयोग ट्यूब में पीबीएस ठंडा इन्हें जोड़ने के लिए। पिपेट के लिए चिपके हुए ऊतक टुकड़े से बचने, टिप काट और पीबीएस के साथ triturating द्वारा पिपेट गीला करने के लिए।
- धीरे ट्यूब हिला आगे ऊतक टुकड़े को धोने के लिए। ऊतक व्यवस्थित और डालना या पी करने की अनुमति देंपीबीएस के बहुमत से दूर ipette और ताजा पीबीएस के साथ दोहराते रहें जब तक पीबीएस स्पष्ट लग रहा है।
4. BBM में लिपटे प्लेट / व्यंजन और पाचन माध्यम की तैयारी
नोट: निम्न चरणों के (37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान में ऊष्मायन चरणों के साथ) एक टिशू कल्चर हुड में किया जाना चाहिए।
- ठंडा DMEM में एक 2% BMM समाधान (कोई परिवर्धन के साथ) तैयार करें। काम करते हुए, बर्फ पर समाधान रखें। एक 2% समाधान के लिए, जोड़ने के 140 μL 7 एमएल DMEM (पर्याप्त एक एकल 24-अच्छी तरह से थाली तैयार करने के लिए) के लिए BMM thawed।
- 250 μL 2% BMM समाधान प्रति अच्छी तरह से (24-अच्छी तरह से थाली) या कांच नीचे इमेजिंग पकवान प्रति जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में कम से कम 30 मिनट के लिए लेपित प्लेटों / व्यंजन सेते BMM की पर्याप्त बहुलकीकरण के लिए अनुमति देने के लिए।
- 50 एमएल पूर्व गर्म DMEM (कोई परिवर्धन के साथ) 15 मिलीग्राम कोलैजिनेज़ (कदम 1.2 और 1.4 से) में जोड़ें 0.3 मिलीग्राम / एमएल समाधान के लिए फार्म और भंग करने के लिए को उलटने के लिए।
- परce पूरी तरह भंग, एक 20 एमएल सिरिंज का उपयोग कर, एक नया बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक 0.2 सुक्ष्ममापी बाँझ फिल्टर के माध्यम से कोलैजिनेज़ समाधान फ़िल्टर करें। पाचन माध्यम के रूप में इस लेबल करें।
5. ऊतक पाचन
- पीबीएस से ऊतक टुकड़े एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग कर निकालें और ठंडा बाँझ DMEM (कोई परिवर्धन के साथ) से युक्त एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब, ज़ुल्फ़ को जोड़ने और फिर DMEM हटाने।
नोट: सीरम वैज्ञानिक पिपेट के लिए चिपके हुए ऊतक से बचने के लिए trituration से यह गीला DMEM ऊतक के साथ संपर्क करने से पहले साथ। - डाइजेस्ट '1 और 2: सेल मलबे और एकल कोशिकाओं को हटाया
- ऊतक टुकड़े करने के लिए 7 एमएल पाचन माध्यम जोड़ें और ट्यूब एक ज़ुल्फ़ दे।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- धीरे (ज़ुल्फ़ नहीं) हिला ~ 3 रों के लिए ट्यूब।
- एक आरक्षित ऊतक व्यवस्थित और पाचन मध्यम त्यागने के लिए अनुमति दें,छोटी मात्रा खुर्दबीन के नीचे को देखने के लिए।
नोट: खासकर जब शुरू, यह अत्यधिक खुर्दबीन के नीचे प्रत्येक 'डाइजेस्ट' (~ 30 μL) की एक छोटी मात्रा का निरीक्षण करने के पाचन प्रक्रिया की प्रगति का आकलन करने की सिफारिश की है। कई तहखाने इस स्तर पर मनाया जाता है, तो झटकों भी जोरदार हो सकता है। क्या अलग 'डाइजेस्ट' चरणों आम तौर पर की तरह लग रही के प्रतिनिधि के चित्रों के लिए, 1 चित्र को देखें। - दोहराएँ कदम 5.2.-5.2.4 (ताजा पाचन माध्यम के साथ)।
- 'हज़म' 3 से 5: तहखाने टुकड़े का संग्रह
- ऊतकों को 7 एमएल पाचन माध्यम जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- ऊष्मायन के दौरान, 10-12 रों के लिए हर 5 मिनट हिला।
नोट: झटकों अधिक जोरदार है के लिए झटकों से 'डाइजेस्ट' 1 और 2।
- ऊष्मायन के दौरान, 10-12 रों के लिए हर 5 मिनट हिला।
- पचाया ऊतक एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में बसने और पाचन मध्यम एकत्रित करने दें। अगरऊतक गलती से इकट्ठा किया जाता है मध्यम के साथ-साथ, यह व्यवस्थित एक 10 एमएल सीरम वैज्ञानिक विंदुक उपयोग करके उसे निकालने और 50 एमएल अपकेंद्रित्र पचाया ऊतक युक्त ट्यूब को इसे वापस हस्तांतरण करने के लिए अनुमति देते हैं।
- अपकेंद्रित्र 100 x जी पर 3 मिनट के लिए आरटी पर मध्यम / सतह पर तैरनेवाला एकत्र।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सौम्य विचूर्णन और अलग सेट से 5 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम में सेल गोली फिर से रोक देते हैं।
- खुर्दबीन के नीचे सेल निलंबन की एक छोटी मात्रा का निरीक्षण (चरण 5.2.4 से नोट देखें)।
नोट: आदर्श रूप में, तहखाने टुकड़े सेल मलबे और एकल कोशिकाओं के साथ 3 'डाइजेस्ट' में प्रदर्शित करने शुरू करते हैं। 'हज़म' 4 और 5 कम सेल मलबे से तहखाने टुकड़े के एक काफी अधिक से अधिक संख्या में होते हैं (चित्रा 1)। आवश्यक यानी के रूप में तीव्रता के झटकों अगर ऊतक पचा नहीं है और तहखाने टुकड़े दिखाई नहीं दे रहे हैं, और अधिक सख्ती से हिला समायोजित करें। - चरणों को दोहराएँ 5.3.1-5.3.6 5 जब तक 'हज़म' कर दिया गया हैपूरा या जब तक ऊतक के बहुमत पचा किया गया है (एक 6 वीं डाइजेस्ट आवश्यकता हो सकती है)।
- एक बार 'डाइजेस्ट' 3-5 (या 3-6) एकत्र किया गया है, अपकेंद्रित्र से सभी supernatants 100 x जी पर 3 मिनट के लिए आरटी पर supernatants पचाने।
- स्राव प्रयोगों के लिए, 'डाइजेस्ट' 3-5 (या 3-6) centrifugation से पहले से supernatants गठबंधन।
नोट: कम ऊतक इमेजिंग प्रयोगों के लिए की जरूरत है, इसलिए डाइजेस्ट सतह पर तैरनेवाला साफ तहखाने टुकड़े की अधिक से अधिक संख्या के साथ (सेल मलबे और एकल कोशिकाओं के अभाव) है कि चुनें। यह आमतौर पर है 4 या 5 'डाइजेस्ट'। - सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे triturating तक कोई गुच्छों दिखाई दे रहे हैं द्वारा गोली फिर से रोक देते हैं। फिर से निलंबित पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम 10 माइक्रोन वाई 27,632 dihydrochloride के साथ पूरक में गोली (anoikis 17 को रोकने के लिए)। स्राव प्रयोगों और इमेजिंग प्रयोगों के लिए 2 एमएल संस्कृति माध्यम के लिए 5 एमएल का प्रयोग करें।
- फ़िल्टरएक 100 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन (किसी भी पचाया ऊतक को हटाने के लिए)। (:, स्राव और इमेजिंग के लिए 7 एमएल और 4 एमएल क्रमशः कुल मात्रा) को धोने के लिए फिल्टर के माध्यम से पूर्व गर्म संवर्धन माध्यम का एक और 2 एमएल चलाएँ।
ध्यान दें: छनन आवश्यक नहीं है, तथापि, बड़ा ऊतकों के टुकड़े प्लेट / व्यंजन का पालन करने के लिए नहीं करते हैं।
चित्र 1: प्राथमिक छोटे आंत्र संस्कृति विधि से 'डाइजेस्ट' के प्रतिनिधि छवियों। (ए) 1 'डाइजेस्ट' और 2 मुख्य रूप से एकल कोशिकाओं और सेल मलबे युक्त से विशिष्ट सामग्री। (बी) से काले तीर 3. 'डाइजेस्ट' उत्पादों का एक उदाहरण पचाने सामग्री में प्रदर्शित होने के तहखाने टुकड़े संकेत मिलता है। (सी) के विशिष्ट 'डाइजेस्ट' 4 या 5 पैनल (डी) से सामग्री को पचाने जमा दर्शाता है'डाइजेस्ट' 3-5 एक 100 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया में (सी) देखा बड़ा अवांछित ऊतकों के टुकड़े को दूर करने के। सभी छवियों एक 20X उद्देश्य के साथ एक डिजिटल औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। स्केल सलाखों = 100 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
6. प्लेटिंग आंतों संस्कृतियों (क्रिप्ट कोशिकाओं के लिए समृद्ध)
- थाली या बर्तन से अतिरिक्त BMM समाधान निकालें, और अच्छी तरह से स्राव प्रति 250 μL पूर्व गर्म संवर्धन माध्यम जोड़ें।
नोट: इमेजिंग व्यंजन मध्यम बिना छोड़ दिया जाता है, ताकि तेजी से अगले चरण पर बाहर सूखने से पकवान को रोकने के लिए। - प्लेट 250 μL सेल निलंबन प्रति अच्छी तरह से (24-अच्छी तरह से थाली) या कांच नीचे पकवान प्रति।
- प्लेट बूंद के लिहाज से अच्छी तरह से भर में एक धीमी गति से 'zig-zag' गति में। तहखाने टुकड़े प्लेट th में जाने से पहले ~ 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देंई इनक्यूबेटर।
नोट: यह एक और भी अच्छी तरह से अंदर तहखाने / कोशिकाओं के वितरण को प्रोत्साहित करना चाहिए।
- प्लेट बूंद के लिहाज से अच्छी तरह से भर में एक धीमी गति से 'zig-zag' गति में। तहखाने टुकड़े प्लेट th में जाने से पहले ~ 5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देंई इनक्यूबेटर।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली या बर्तन में रात भर और 5% सीओ 2 सेते हैं।
ध्यान दें: 'विचित्र' monolayer का गठन किया जाना चाहिए था। तीन धोने निम्नलिखित संस्कृतियों के एक प्रतिनिधि छवि के लिए, चित्रा 2A देखें। - पकवान प्रति 2 एमएल पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम के साथ 'बाढ़' इमेजिंग व्यंजन।
नोट: ~ 72 घंटे के लिए ऊपर निम्नलिखित चढ़ाना के लिए ये व्यंजन इमेजिंग के लिए उपयुक्त हो जाएगा। Colonic संस्कृतियों आम तौर पर 7 दिन के लिए, लंबे समय तक ऊपर। कोशिकाओं जो पालन नहीं किया है एक धोने कदम से हटाया जा सकता है। प्राथमिक संस्कृतियों अब प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
Representative Results
धारावाहिक पाचन चरणों के उपयोग के तहखाने टुकड़े की एक अपेक्षाकृत स्वच्छ तैयारी के संग्रह प्रयोगों के लिए प्लेटेड जा सकता है। पहले दो डाइजेस्ट पचा सामग्री (चित्रा 1 ए) से मुख्य रूप से एकल कोशिकाओं और सेल मलबे को हटा दें। तीसरे डाइजेस्ट के दौरान, तहखाने टुकड़े पचा सामग्री (चित्रा 1 बी) में दिखाई देते हैं। 4 और 5 उपज कम एकल कोशिकाओं (चित्रा 1C) के साथ तहखाने टुकड़े की एक बड़ी संख्या हज़म। डाइजेस्ट से जमा सामग्री 3-5 पचाया ऊतक के बड़े टुकड़े, जो संस्कृति के लिए हानिकारक हो सकता है, एक साफ तहखाने टुकड़ा तैयारी (चित्रा 1 डी) के उत्पादन को हटा फ़िल्टर करना।
संस्कृति के 18-24 घंटे के बाद, प्राथमिक छोटे आंतों की कोशिकाओं के monolayers मनाया जाता है (चित्रा 2A)। ट्रांसजेनिक चूहों से उत्पन्न संस्कृतियों विशेष रूप से कैलोरी व्यक्त का उपयोग करनाCium फ्लोरोसेंट सेंसर, GCaMP3, proglucagon प्रमोटर 11 के नियंत्रण में, एल कोशिकाओं आसानी से पहचाने और संस्कृति (चित्रा 2 बी) के भीतर फैले हुए हैं। प्राथमिक छोटे आंत्र संस्कृतियों में, यौगिकों जी क्ष -Ca को लक्षित 2 + मैं और शिविर मैं रास्ते जीएलपी -1 का स्राव को प्रेरित किया निर्भर (स्राव प्रयोग कार्यप्रणाली के लिए देख Reimann एट अल। 1)। Bombesin (बीबीएस, 100 एनएम) और forskolin और 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) के सह-आवेदन (एफ / मैं, 10 माइक्रोन प्रत्येक) के जीएलपी -1 रिहाई सापेक्ष एक 2 और 11 गुना, उत्तेजना शुरू हो रहा बेसल, क्रमशः (चित्रा 2C)। GCaMP3 के विशिष्ट एल सेल अभिव्यक्ति की पहचान और व्यक्तिगत एल कोशिकाओं में कैल्शियम जुटाना की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। दोनों 100 एनएम bombesin (बीबीएस) और 30 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl) में जाना जाता है जी क्ष का संकेत intracellular कैल्शियम में क्षणिक बढ़ जाती है को प्रेरित किया </ sub> - और प्राथमिक एल कोशिकाओं (चित्रा 2 डी) में electrogenic युग्मित रास्ते।
चित्र 2: प्रतिनिधि डेटा प्राथमिक छोटे आंत्र संस्कृतियों से ली गई। के लिए (ए) के स्राव और (बी) इमेजिंग प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया मिश्रित प्राथमिक छोटे आंत्र संस्कृतियों का उदाहरण छवियां पोस्ट 24 घंटे चढ़ाना। (ए) छवि एक 24 अच्छी तरह से थाली से लिया, एक 4 एक्स उद्देश्य के साथ एक डिजिटल औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर। स्केल बार = 500 सुक्ष्ममापी। (बी) GLU-Cre का उपयोग x ROSA26 GCamP3 चूहों, दृश्य (हरी कोशिकाओं) के क्षेत्र में एल कोशिकाओं GCaMP3 के प्रतिदीप्ति द्वारा पहचान की गई। स्केल बार 50 सुक्ष्ममापी प्रतिनिधित्व करता है। (सी) जीएलपी -1 स्राव जवाब में मापा जाता bombesin को (बीबीएस, 100 एनएम) और forskolin / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (एफ / मैं, 10 माइक्रोन प्रत्येक) किया गया था। प्रतिशत जीएलपी -1 स्राव गणना की गई थीsupernatants और सेल lysates में जीएलपी -1 के स्तर को मापने के द्वारा। डाटा n = 3 प्रत्येक शर्त के लिए की SEM ± साधन प्रतिनिधित्व करते हैं। (डी) दो कोशिकाओं (बी) में उल्लिखित पोटेशियम क्लोराइड (KCl, 30 मिमी) और बी बी एस (100 एनएम) के जवाब में वास्तविक समय में नजर रखी की GCaMP3 प्रतिदीप्ति (साइटोसोलिक कैल्शियम को दर्शाती है)। एकल कक्ष इमेजिंग एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया गया था। GCaMP3 475/10 एनएम पर उत्साहित थे, एक 75 W क्सीनन आर्क लैम्प और एक मोनोक्रोमेटर प्रतिदीप्ति इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित का उपयोग कर। उत्सर्जन एक उच्च संकल्प डिजिटल प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा एक dichroic दर्पण और एक 510-560 एनएम बैंडविड्थ फिल्टर का उपयोग कर के साथ दर्ज की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
यह प्रोटोकॉल अलगाव और मिश्रित murine छोटे आंतों की कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन करता है पेट पेप्टाइड स्राव और लेबल enteroendocrine कोशिकाओं के एकल कक्ष इमेजिंग के अध्ययन कर सकें।
छोटे आंत्र संस्कृतियों सफल होने की संभावना में वृद्धि करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल किया जाता है के रूप में तेजी से संभव के रूप में (आदर्श, ऊतक कटाई के 3 घंटे के भीतर) और ऊतक ठंडा मध्यम में रखा जाता है कि या पूर्व बफ़र पाचन प्रक्रिया को, कोशिका मृत्यु को सीमित करने के। हालांकि यह जरूरी नहीं, विशेष रूप से colonic संस्कृतियों के लिए है, छोटी आंत से मांसपेशियों की परत को हटाने की जोरदार प्रोत्साहित किया जाता है। छोटे आंत्र संस्कृति प्रोटोकॉल जितना संभव हो उतना मानकीकृत किया गया है। हालांकि, यह ध्यान रखें कि कोई पाचन प्रक्रिया समान है महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल के दौरान कई कदम जहां परिवर्तनशीलता मांसपेशी को हटाने की डिग्री जैसे एक दिन के लिए दिन के आधार पर पेश किया जा सकता, टी के आकार के होते हैंवह कीमा बनाया हुआ 'ऊतक टुकड़े, मिलाते हुए की ताकत, कोलैजिनेज़ आदि की एक विशेष बैच की शक्ति। यह खुर्दबीन के नीचे अलग 'हज़म' में से प्रत्येक की aliquots निरीक्षण करने के लिए पाचन प्रक्रिया और दर्जी झटकों की प्रगति और 'डाइजेस्ट' के हिसाब से की संख्या का आकलन करने के महत्व सर्वोपरि है, इसलिए है। यह अधिक धीरे हिला के साथ शुरू की सिफारिश की है और अगर तहखाने टुकड़े से स्पष्ट नहीं हैं 3 'डाइजेस्ट' के बाद से, और अधिक तेजी से मिलाते हुए शुरू करने के लिए।
हमारे अनुभव से, enteroendocrine कोशिकाओं संस्कृति में पैदा करना नहीं है और आमतौर पर 4 दिनों के भीतर छोटे आंत्र संस्कृतियों से खो जाते हैं। फिर भी, यह पेट पेप्टाइड स्राव प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त समय शारीरिक उत्तेजनाओं और / या औषधीय एजेंटों परीक्षण करने के लिए (आमतौर पर 2 घंटे, 18-24 घंटे के बाद चढ़ाना से अधिक किया जाता) की अनुमति देता है। स्राव प्रयोग करने से पहले एक रात ऊष्मायन की आवश्यकता होती है प्रयोगों भी संभव उदाकाली खांसी विष 15 के साथ पहले से उपचार के मामले में।
के रूप में अनुसंधान उत्पादन यह पिछले कुछ वर्षों में उत्पादन किया गया है की मात्रा इसका सबूत प्राथमिक संस्कृति यहाँ प्रस्तुत तकनीक, एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। प्राथमिक संस्कृति मॉडल जीएलपी -1 1, जीआईपी 18 और पी वाई वाई 19 सहित पेट पेप्टाइड्स की एक किस्म, के स्राव को अध्ययन करने के लिए, विविध पोषक तत्व और गैर पोषक तत्व 14, 20 उत्तेजनाओं और अवरोधकों के जवाब में इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, उसी तकनीक का सफलतापूर्वक मानव आंतों की कोशिकाओं 21 की संस्कृति के लिए लागू किया गया है। अक्सर, एक अतिरिक्त प्रयोगात्मक मॉडल जैसे के साथ-साथ प्राथमिक सेल संस्कृति विधि का एक संयोजन। पूर्व vivo या विवो में सबसे अंतर्दृष्टि 6 प्रदान कर सकते हैं। विशेष रूप से और अन्य तरीकों के विपरीत, इस तकनीक im हैपेट पेप्टाइड रिहाई की माप से परे portant अनुप्रयोगों। हम दिखा दिया है कि प्राथमिक छोटे आंत्र ट्रांसजेनिक संवाददाता चूहों से ली गई संस्कृतियों पेप्टाइड स्राव आंत के लिए युग्मित intracellular संकेत दे रास्ते की पूछताछ के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, क्रमशः उदाहरण के लिए का उपयोग कर सीए 2 + और शिविर सेंसर, GCaMP3 11, 13 और Epac2camps 14, साथ ही electrophysiological तकनीकों 12 के रूप में।
सभी इन विट्रो मॉडल के साथ के रूप में, प्राथमिक आंतों संस्कृतियों संस्कृति में उपकला कोशिकाओं की विपरीतता के नुकसान, साथ ही रक्त की आपूर्ति और विन्यास के नुकसान सहित कुछ मूलभूत सीमाएं हैं। यह enteroendocrine सेल समारोह पर इन कृत्रिम स्थिति के संभावित प्रभावों का अनुमान लगाना मुश्किल है। हालांकि, प्राथमिक संस्कृतियों से प्राप्त डेटा अक्सर इन विवो setti में अनुवाद किया गया हैएनजी (जीएलपी -1 स्राव 15 पर शॉर्ट चेन फैटी एसिड की जैसे प्रभाव)।
प्राथमिक आंतों संस्कृतियों कई संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक बहुमुखी तकनीक है। वे पहले से ही पेट पेप्टाइड स्राव के नियमन में महत्वपूर्ण यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान की है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
जीएलपी -1 इम्युनो assays Addenbrooke अस्पताल में कोर जैव रासायनिक परख प्रयोगशाला द्वारा प्रदर्शन किया गया।
यह काम करते हैं, पिछले कुछ वर्षों में, वेलकम ट्रस्ट द्वारा समर्थित किया गया है (वर्तमान में सक्रिय अनुदान 106,262 / Z / 14 / Z और 106,263 / Z / 14 / Z) और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एमआरसी) (अनुदान MRC_MC_UU_12012 / 3 और MRC_MC_UU_12012 / 5)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
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