Blandede primærkulturer av Murine tynntarmen Beregnet for studier av Gut hormon og Live Cell Imaging av Enteroendocrine Cells

Summary

Denne protokollen beskriver isoleringen og kulturen av blandede murine små tarmcellene. Disse primære kulturene tarmmuliggjøre undersøkelse av signalveier som ligger til grunn gut peptid sekresjon ved hjelp av en rekke teknikker.

Abstract

Tarmen er den største endokrine organ i kroppen, med hormon-utskillende enteroendocrine celler som er lokalisert langs lengden av det gastrointestinale epitel. Til tross for deres fysiologisk betydning, enteroendocrine celler utgjør bare en liten brøkdel av de epiteliale cellepopulasjon, og i det siste, har deres karakterisering presentert en betydelig utfordring som resulterer i en avhengighet av cellelinje-modeller. Her gir vi en detaljert protokoll for isolering og kultur av blandet murine små tarmceller. Disse primære kulturer er blitt brukt for å identifisere de signalveier ligger til grunn for stimulering og inhibering av tarmen peptid sekresjon i respons til et antall av næringsstoffer og neuropeptider, så vel som farmakologiske midler. Videre i kombinasjon med bruk av transgene fluorescerende reporter mus, har vi vist at disse primærkulturer bli et kraftig verktøy for undersøkelse av fluorescently-merket enteroendocrine celler på itracellular nivå, ved anvendelse av metoder så som plaster klem- og encellede kalsium og cAMP-FRET avbildning.

Introduction

Det overordnede målet for denne fremgangsmåte er å isolere og kultur blandet murine tarmcellene for å muliggjøre studier av tarmen peptid sekresjon og levende celle avbildning av enteroendocrine celler. En tidlig versjon av denne prosedyren ble opprinnelig utgitt i 2008 av Reimann et al. ¹ og har siden dannet grunnlaget for en ytterligere 20 publikasjoner fra vår gruppe. For dette manuskriptet, valgte vi å fokusere på små tarm kulturer som de er mer utfordrende å etablere enn colonic kulturer.

Enteroendocrine cellene skiller ut en rekke tarmpeptider innbefattende glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1), glukoseavhengig insulinotropisk peptid (GIP), cholecystokinin (CCK) og peptid YY (PYY) ^2. Disse gut peptidene har viktige fysiologiske roller i dirigere postprandiale responser slik som demping av tarmen transitt, potensiering av glukosestimulert insulinfrigjøring eller induksjon av metthet. GLP-1 etterligninger and Legemidler som inhiberer nedbrytningen er for tiden godkjent for behandling av type 2 diabetes, og det er løpende vurdering av det terapeutiske potensialet til å stimulere den endogene sekresjon av dette peptid ^3. En bedre forståelse av enteroendocrine fysiologi og de mekanismer som sekresjon er enten stimulerte eller hemmes er derfor av kritisk viktighet.

Gut peptid sekresjon kan studeres ved hjelp av mange forskjellige in vitro- og ex vivo-forsøksmodeller, hver med fordeler og ulemper (for en nylig gjennomgang omfattende også dekker anvendelse av in vivo-modeller se Svendsen et al. ^4). Ex vivo teknikker, slik som de isolerte perfunderte tarm ⁵ og Ussing-kammere ⁶ er for tiden blir brukt for å oppdage gut peptid sekresjon i respons til ulike substanser. Hovedfordelen ved disse metoder, såi forhold til primærkulturer, er at den umiddelbare omgivelser av enteroendocrine cellene forblir stort sett intakte, og viktigere, er polariteten av cellene bevart. Derfor er det mulig å få frem informasjon med hensyn til hvilke celleoverflate et utskillelsesmiddel, opptrer på ^seks. Dette er imidlertid vanligvis lav-throughput-teknikker, og kvaliteten av de data som er avledet fra dem er veldig avhengig av integriteten og levedyktigheten av tarmvevet, noe som uunngåelig reduseres over tid.

Intestinal organoids er nå i økende grad anvendt som in vitro-modeller for studier av enteroendocrine cellefunksjon og utvikling ^7. Organoids, som kan være avledet fra både murine og humane vev, har fordelen av å danne 3D 'kryptlignende' strukturer som opprettholder celle polaritet i kultur. Imidlertid organoid-avledede enteroendocrine cellene er ennå ikke fullstendig karakterisert og deres likhet med naturlig forekommende L cells fortsatt i stor grad ukjent. Primære kulturer har fordelen av å være et skritt nærmere den fysiologiske omgivelser, som enteroendocrine celler ikke er opprettholdt og differensiert i kunstige over lengre tidsperioder.

En alternativ primærkultur fremgangsmåte som er blitt anvendt for vurdering av tarmen peptid sekresjon er isoleringen av rottefoster-tarmceller (FRICs) ^8. Imidlertid har kulturen av voksen tarmvev møtt med mindre suksess og noen forskjeller ble observert i respons av FRICs vs. voksne murine tarmceller (for eksempel glukose ^8).

Enteroendocrine-lignende cellelinjer (f.eks GLUTag, STC-1 og NCI-H716) har tradisjonelt blitt brukt for å skille mellom direkte vs. indirekte virkninger på enteroendocrine celler og for å dissekere underliggende molekylære mekanismer som kopler stimulus til sekresjon; se Kuhre m.fl. 9 for peptid produksjon og sekresjon av 'L-celle-lignende' udødeliggjorte cellelinjer. Dette har vært nødvendig som enteroendocrine celler, spredt langs mage- og tarmkanalen, utgjør i underkant av 1% av intestinale epitelceller ¹⁰ og sorterte celler, i våre hender, ikke overlever i kultur ^1. Cellelinjer forbli nyttige verktøy på grunn av det faktum at de er i en stort sett homogen cellepopulasjon som fremmer genetiske manipulasjoner, slik som gen-demping. Følgelig er det lett å undersøke rollen av proteiner som ikke kan målrettes farmakologisk, når transgene mus som ikke er tilgjengelige. Men cellelinjer er ikke alltid gyldige modeller av primære celler. Mens det er mange likheter, resultatene fra primærkulturer har av og til markert forskjell i signalveier aktiveres av visse næringsstoffer i primær L-celler sammenlignet med GLUTag-celler, for eksempel (f.eks. Peptoner <sup class = "ekstern referanse"> 11). Avgjørende, i kombinasjon med transgene mus fluorescerende rapportør, gjør det mulig for primærkulturmodell detaljert undersøkelse av individuelle primær enteroendocrine celler ved det intracellulære nivå. Fluorescens-merket L-celler i primærkulturer har vært brukt av vår gruppe for patch klem ^{1, 12-studier,} og enkeltcelle kalsium ^{11, 13} og cyklisk adenosinmonofosfat-FRET avbildning ¹⁴ studier som har resultert i betydelige fremskritt på området enteroendocrine fysiologi.

Følgende protokoll er optimalisert for å utføre sekrete forsøk, ved anvendelse av en 24-brønners plate, eller for fremstilling av opp til 16 bildedannende retter, fra en 10 cm del av tynntarmen fra en enkelt voksen mus. Protokollen kan enkelt endres for studiet av koloniske celler ved å øke oppslutningstider og collagenase konsentrasjon.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av University of Cambridge dyrevelferd og etisk Brødtekst og dannet de Dyr (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations (SI 2012/3039).

1. Fremstilling på forhånd

1. Plassere en prøve av basalmembran matrise (BMM) (~ 200 pl) på is for å tine.
   MERK: BMM stivner ved romtemperatur (RT).
2. Pre-varm 50 ml sterilt høy-glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) (uten tilsetninger) og ~ 40 ml sterilt kulturmedium (høy-glucose DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / mL penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin (P / S) og 2 mM L-glutamin) i 50 ml sentrifugerør i et vannbad ved 37 ^° C
3. Pre-kjøle kalsium og magnesium-inneholdende fosfatbufret saltoppløsning (PBS).
4. Vei ut 15 mg kollagenase (XI urent), legge til et 50 ml sentrifugerør og holde den på is.

2. Tissue Collection

1. Legg ~ 20 ml L-15 medium til et 50 ml sentrifugerør og plassere den på is.
2. Avlive en mus ved cervikal dislokasjon, eller andre godkjente planen en metode.
   MERK: tarmvevet blir typisk oppnådd fra mus på en C57BL6 bakgrunn. Imidlertid har andre genetiske bakgrunner også blitt brukt for eksempel 129 / SvEv ^15. Bildebehandling eksperimenter krever bruk av fluorescerende rapportør mus f.eks GLU-Venus ^1. Vevet blir oppnådd fra voksne mus (2-6 måneder) av begge kjønn. Musene blir plassert i individually ventilert bur med ad libitum adgang til vann og med vanlig mat. Men eksperimenter for å teste effekten av en fettrik diett, for eksempel på enteroendocrine celle funksjon ¹⁶ kan utføres hvis dette støttes av et prosjekt lisens.
3. Dissekere og fjern forsiktig mus tarmen (fra pylorus til start av rectum) ved å anvende pinsett og disseksjon saks. Oppbevar den i L-15 medium på is inntil den er klar til bruk.

3. Vevspreparering

1. Plasser tarmvevet i en 10 cm petriskål inneholdende nok PBS for å dekke vevet. Ta 10 cm ønskede vev (for eksempel øvre del av tynntarmen, topp 10 cm distalt for pylorus).
2. Skylle ut tarminnholdet ved hjelp av et plastisk Pasteur-pipette og kjølt PBS.
   1. Ved hjelp av pinsett, delikat gripe den ene ende av tarmsegmentet og plassere spissen på en Pasteur-pipette inn i den. Spyle ut innholdet med avkjølt PBS. Gjenta fra begge ender til majority av innholdet har blitt skylt ut. Overfør til en ren petriskål som inneholdt frisk avkjølt PBS.
3. Ved hjelp av pinsett, fjern fettvev og mesenteriet, ved å ta vare på ikke trekke av muskellaget samtidig.
4. Peel muskelen laget av "som en sokk" under et disseksjonsmikroskop ved hjelp av to sett av fin pinsett.
   MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig, men er sterkt anbefalt. Det finnes alternative metoder for fjerning av muskellaget til det som er beskrevet her. For eksempel, kan tarmen skjæres opp i lengderetningen først, før fjerningen av muskelen laget.
   1. Finne et startpunkt på den mer proksimale enden av vevet hvor det er en synlig klaff av muskel. Forsiktig trekke bort en liten mengde av muskellaget hele veien rundt tarmen.
      NB: For å unngå oppriving av muskellaget eller det intestinale epitel, redusere den strekkraft ved å klemme fast et større overflateareal stedet for å bruke tips av de fine tang.
   2. Klem tarmen og så mye av muskelen klaff som mulig, trekk forsiktig fra hverandre og begynner å trekke av muskellaget fra rundt tarmen. For å unngå å rive både muskellaget og epitel, beholde å justere posisjonen av tang for å holde dem tett sammen. På denne måten fjerner muskellaget fra hele lengden av tarmsegmentet og kast den.
5. Skjær tarmen åpen i lengderetningen, og vask ved hvirvling i en ren petriskål med frisk avkjølt PBS. Gjenta om nødvendig for å fjerne eventuelle gjenværende kymus eller slim.
6. Kjøttdeig vev med en kirurgisk skalpell blad for å oppnå kvadrater av ca. 1-2 mm ² og legge disse til ~ 20 ml PBS avkjølt i et 50 ml sentrifugerør ved hjelp av en Pasteur-pipette. For å unngå vevsstykkene kleber til pipetten, avskåret spiss og våt pipetten ved triturering med PBS.
7. Rist røret for å vaske vevsstykkene ytterligere. Tillat vevet for å bunnfelle og helle eller p-ipette av flertallet av PBS og gjenta med frisk PBS til PBS ser klart.

4. Fremstilling av BBM-belagt plate / tallerkner og fordøyelse Medium
MERK: De følgende trinn skal utføres i en vevskultur hette (med tnkuberingsthnn i 37 ° C vannbad).

1. Fremstill en 2% løsning i BMM avkjølt DMEM (uten tilsetninger). Mens han jobbet, holde løsningen på is. For en 2% løsning, tilsett 140 ul opptint BMM til 7 ml DMEM (nok til å fremstille en enkelt 24-brønners plate).
   1. Tilsett 250 ul 2% BMM-løsning per brønn (24-brønnsplate) eller per glass bunnavbildning fatet.
   2. Inkuber belagte plater / tallerkner i minst 30 minutter i en inkubator ved 37 ° C for å muliggjøre tilfredsstillende polymerisering av BMM.
2. Tilsett 50 ml forvarmet DMEM (uten tilsetninger) til 15 mg kollagenase (fra trinn 1,2 og 1,4) for å danne en 0,3 mg / ml oppløsning og invertere for å oppløse.
   1. Påce fullstendig oppløst, ved anvendelse av en 20 ml sprøyte, filtrere den kollagenase løsningen gjennom et 0,2 pm sterilt filter inn i en ny sterilt 50 mL sentrifugerør. Merke dette som fordøyelsen medium.

5. Tissue Fordøyelse

1. Fjern vevsstykkene fra PBS ved anvendelse av en 10 ml serologisk pipette og legge til et sterilt 50 ml sentrifugerør inneholdende avkjølt sterilt DMEM (uten tilsetninger), virvel og deretter fjerne DMEM.
   NB: For å unngå vevet fester seg til den serologisk pipette våt den ved triturering med DMEM før kontakt med vevet.
2. 'Digest' 1 og 2: Fjerning av cellerester og enkeltceller
   1. Legg 7 ml fordøyelse medium til vevsstykkene og gi røret en virvel.
   2. Inkuber i 5 min i et vannbad ved 37 ° C.
   3. Rist (ikke virvel) i røret for ~ 3 s.
   4. Tillat vevet for å bunnfelle og forkaste fordøyelse medium, reservere enlite volum til å se på under mikroskopet.
      MERK: Spesielt når man starter ut, er det sterkt anbefalt å inspisere et lite volum av hver 'digest' (~ 30 mL) under mikroskop for å måle utviklingen av fordøyelsesprosessen. Hvis mange krypter er observert på dette stadiet, kan risting være for kraftig. For representative bilder av hva de forskjellige 'fordøye' stadier vanligvis ser ut, se figur 1.
   5. Gjenta trinn 5.2.-5.2.4 (med frisk fordøyelse medium).
3. 'Fordøyer' 3-5: Innsamling av krypten fragmenter
   1. Legg 7 ml fordøyelse medium til vevet.
   2. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
      1. Under inkubasjon, riste hvert 5 min for 10-12 s.
         MERK: risting er mer energisk enn risting for 'fordøyer' 1 og 2.
   3. Tillat ufordøyd vev til å slå seg ned og samle fordøyelse medium i et 15 ml sentrifugerør. Hvisvev ved et uhell blir samlet opp sammen med mediet, tillater det å avgjøre, fjernes den ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette og overføre den tilbake til den 50 ml sentrifugerør inneholdende ufordøyd vev.
   4. Sentrifuger samlet medium / supernatant ved RT i 3 minutter ved 100 x g.
   5. Kast supernatanten og re-suspen celle-pelleten i 5 ml forvarmet kulturmedium ved forsiktig triturering og satt til side.
   6. Inspisere et lite volum av cellesuspensjonen under mikroskop (se Note fra trinn 5.2.4).
      MERK: Ideelt sett krypt fragmenter begynner å vises i 'digest' 3 sammen med cellerester og enkeltceller. 'Fordøyer' 4 og 5 inneholder et betydelig større antall av krypten fragmenter med redusert celleavfall (figur 1). Juster risting intensitet som nødvendig, dvs. hvis den ikke vevet er fordøyer og krypt fragmentene som ikke vises, rist mer kraftig.
   7. Gjenta trinn 5.3.1-5.3.6 inntil 5 'fordøyer' har værtfullført eller inntil mesteparten av vevet er fordøyet (6 ^th sammendrag kan være nødvendig).
   8. Når alle supernatanter fra 'fordøyer' 3-5 (eller 3-6) er blitt samlet, sentrifuger fordøye supernatanter ved RT i 3 minutter ved 100 x g.
   9. For utskillelse eksperimenter, kombiner de supernatantene fra 'nedbrytninger' 3-5 (eller 3-6) forut for sentrifugering.
      MERK: Mindre vev er nødvendig for bildebehandling eksperimenter, velger derfor spaltningen supernatanten som er den reneste (fravær av cellerester og enkeltceller) med det større antall krypt fragmenter. Dette er vanligvis 'sammendrag' 4 eller 5.
   10. Kast supernatanten og forsiktig resuspendere pelleten ved triturering inntil ingen klumper er synlige. Re-suspendere pelleten i forvarmet dyrkingsmedium supplert med 10 uM Y-27632 dihydroklorid (for å forhindre anoikis ^17). Bruk av 5 ml for sekrete eksperimenter og 2 ml dyrkningsmedium for bildebehandling eksperimenter.
   11. Filtercellesuspensjonen gjennom et 100 pm filter (for å fjerne eventuelle ufordøyd vev). Kjør en ytterligere 2 ml forvarmet kulturmedium gjennom filteret for å vaske (totalt volum: 7 ml og 4 ml for sekresjon og billeddannelse, henholdsvis).
       MERK: Filtrering er ikke avgjørende, men større vev fragmenter pleier ikke å forholde seg til plate / tallerkner.

Figur 1: Representative bilder av 'nedbrytninger' fra primærtynntarmdyrkningsmetode. (A) typisk materiale fra 'fordøyer' 1 og 2, inneholdende i hovedsak enkle celler og celleavfall. (B) Et eksempel på produkter fra 'digest' 3. De svarte piler indikerer krypt fragmenter som fremkommer i den fordøye materiale. (C) Typisk for 'sammendrag' 4 eller 5. Panel (D) representerer slått sammen fordøye materiale fra'spaltninger' 3-5 ført gjennom et 100 um filter for å fjerne de større uønskede vevsfragmentene sett i (C). Alle bildene ble tatt med et digitalt invertert mikroskop med en 20X objektiv. Skala Stolper = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. Plette Intestinal kulturer (Beriket for Crypt Cells)

1. Fjern overskudd av BMM løsning av plate- eller retter, og tilsett 250 ul forvarmet kulturmedium pr sekresjon brønn.
   MERK: Imaging retter igjen uten medium så fortsette til neste trinn raskt for å hindre at retten tørker ut.
2. Plate 250 ul cellesuspensjon per brønn (24-brønnsplate) eller per glassbunn fatet.
   1. Plate dråpevis i en langsom 'sikk-sakk' bevegelse tvers over brønnen. Tillat krypt fragmenter sedimentere i ~ 5 min før å bevege platen til the inkubator.
      MERK: Dette bør oppmuntre en jevn fordeling av Crypts / celler i brønnen.
3. Inkuber plate eller retter over natten ved 37 ° C og 5% _CO2.
   MERK: En usammenhengende enkeltlag skulle ha dannet. For et representativt bilde av kulturer etter tre vaskinger, se figur 2A.
4. 'flom' avbildnings retter med 2 ml forvarmet kulturmedium pr skål.
   MERK: Disse rettene vil være egnet for bildebehandling for opp til ~ 72 timer etter plating. Colonic kulturer vanligvis vare lenger, opptil 7 dager. Celler som ikke har adhert kan fjernes ved et vasketrinn. Primære kulturer er nå klar til å bli brukt til eksperimenter.

Representative Results

Bruken av en rekke trinn fordøyelses tillater innsamling av et forholdsvis rent preparat av krypten fragmenter som skal belegges for eksperimenter. De to første fordøyer fjerne i hovedsak enkle celler og celleavfall fra forråtnelsesmaterialet (figur 1A). Under den tredje digest, krypt fragmenter vises i det fordøyde materiale (figur 1B). Digests 4 og 5 utbytte et større antall krypt fragmenter med færre enkeltceller (figur 1C). Filtrering av det sammenslåtte materialet fra spaltningene 3-5 fjerner større biter av ufordøyd vev, noe som kan være skadelig for kultur, produserer en ren krypt Fragmentpreparatet (figur 1D).

Etter 18-24 timers kultur-monolag av primære tynntarms celler observert (figur 2A). Ved bruk av kulturer som er generert fra transgene mus som spesifikt uttrykker calCium fluorescerende sensor, GCaMP3, under kontroll av promoteren proglukagon ^11, L-celler kan lett identifiseres og utblandet i kulturen (figur 2B). I primærtynntarmskulturer, forbindelser rettet mot den _Gq -CA ^{2 +} _i og cAMP _i -avhengig trasé stimulert sekresjon av GLP-1 (for sekresjon eksperiment metodikk se Reimann et al. ^1). Bombesin (BBS, 100 nM) og samtidig anvendelse av forskolin og 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / l, 10 pM av hver) utløses en 2- og 11-fold, stimulering av GLP-1-frigjøring i forhold til basal, henholdsvis (figur 2C). Spesifikk L celleekspresjon av GCaMP3 muliggjør identifisering av og sanntids overvåkning av kalsium-mobilisering i enkelt L-cellene. Begge 100 nM bombesin (BBS) og 30 mM kaliumklorid (KCl) stimulert forbigående økninger i intracellulært kalsium som angir den kjente _{Gq <}/ sub> - og elektrogen koplet baner i primær L-celler (figur 2D).

Figur 2: Representative data som er avledet fra primære tynntarms kulturer. Eksempel bilder av blandede primære tynntarmskulturer som benyttes for (A) sekresjon og (B) bildebehandling eksperimenter legge 24 timer plettering. (A) bilde som er tatt fra en 24-brønners plate, ved hjelp av et digitalt invertert mikroskop med en 4x objektiv. Skala bar = 500 pm. (B) Ved å bruke GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 mus L-celler i synsfeltet (grønne celler) ble identifisert ved fluorescensen av GCaMP3. Skala bar utgjør 50 pm. (C) GLP-1-sekresjon ble målt som respons på bombesin (BBS, 100 nM) og forskolin / 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / l, 10 pM av hver). Prosentvis GLP-1-sekresjon ble beregnetved måling av GLP-1-nivåer i supernatantene og cellelysatene. Data representerer middelverdi ± SEM av n = 3 for hver betingelse. (D) GCaMP3 fluorescens (som reflekterer cytosolisk kalsium) av de to cellene som er beskrevet i (B) overvåket i sann tid i forhold til kaliumklorid (KCl, 30 mM) og BBS (100 nM). Enkelt celle avbildning ble utført ved bruk av et invertert mikroskop fluorescens med et 40X objektiv olje-nedsenking. GCaMP3 ble eksitert ved 475/10 nm, ved hjelp av en 75 W xenon-buelampe og en monokromator som styres av fluorescens bildebehandling. Misjon ble målt med et høyoppløselig digitalt charge-coupled device (CCD) kamera ved bruk av et dikroisk speil og et 510-560 nm filter båndbredde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen beskriver isoleringen og kulturen av blandede murine små tarmcellene for å muliggjøre studier av tarmen peptid sekresjon og enkeltcelle-avbildning av merkede enteroendocrine celler.

For å øke sannsynligheten av tynntarmen kulturene være vellykket, er det viktig at protokollen blir utført så hurtig som mulig (ideelt sett, innenfor 3 timer for høsting av vev), og at vevet holdes i iskaldt medium eller buffer før til fordøyelsen, for å begrense celledød. Selv om det ikke er viktig, spesielt for colonic kulturer, er fjerning av muskelen laget fra tynntarmen sterkt oppmuntret. Den lille intestinal kultur protokollen er standardisert så mye som mulig. Det er imidlertid viktig å merke seg at ingen fordøyelsen prosessen er identisk. Det er mange trinn i denne protokollen hvor variasjonen kan innføres på en dag-til-dag basis for eksempel graden av muskelfjerning, størrelsen på than 'kvernet' vevsstykkene, styrken av risting, styrken av en bestemt sats av kollagenase etc. Det er derfor av avgjørende betydning å inspisere prøver av hver av de forskjellige 'fordøyer' under mikroskop for å vurdere fremdriften i fordøyelsesprosessen og skreddersy risting og antall 'fordøyer' tilsvarende. Det anbefales å riste mer forsiktig til å begynne med, og hvis krypten fragmenter er ikke opplagt fra 'fordøye' tre og utover, for å begynne å riste mer kraftig.

Fra vår erfaring, enteroendocrine cellene ikke sprer i kultur og er vanligvis tapt fra tynntarms kulturer innen 4 dager. Ikke desto mindre gir dette tilstrekkelig tid til å utføre tarmen peptid sekrete eksperimenter (typisk utført i løpet av 2 h, 18-24 h etter plettering) for å undersøke fysiologiske stimuli og / eller farmakologiske midler. Eksperimenter som krever en inkubasjon over natten forut for sekresjon eksperimentet er også mulig f.eksi tilfellet av for-behandling med pertussis toksin ^15.

Den primære dyrkningsteknikk som presenteres her er en veletablert metode, som gjenspeiles av volumet av forskning utgang den har produsert i løpet av årene. Den primære kulturmodell har blitt anvendt for å studere sekresjon av en rekke gut peptider, inkludert GLP-1 ^1, GIP ¹⁸ og PYY ^19, som svar på diverse nærings og ikke-nærings ^{14, 20} stimuli og inhibitorer. Videre har den samme teknikk blitt brukt til kultur av humane tarmceller ^21. Ofte er en kombinasjon av den primære cellekultur-metoden sammen med en ekstra eksperimentell modell f.eks. ex vivo eller in vivo kan tilveiebringe den mest innsikt ^6. Spesielt, og i motsetning til andre metoder, har denne teknikken imtig anvendelser enn målingen av tarmen peptid frigivelse. Vi har vist at primærtynntarmskulturer som stammer fra transgene rapportør mus er kraftige verktøy for utspørring av intracellulære signalveier som er koplet til gut peptid sekresjon, ved hjelp av for eksempel Ca2 ⁺ og cAMP-sensorer, GCaMP3 ^{11, 13} og Epac2camps ^14, henholdsvis, så vel som elektrofysiologiske teknikker ^12.

Som med alle in vitro-modeller, den primære tarm kulturer har visse iboende begrensninger, inkludert tap av polariteten av de epiteliale celler i kultur, så vel som tap av blodtilførsel og innervasjon. Det er vanskelig å anslå de potensielle virkningene av disse kunstige forhold på enteroendocrine celle funksjon. Imidlertid data oppnådd fra primære kulturer har ofte vært oversettbare i in vivo setting (f.eks effektene av kortkjedede fettsyrer på GLP-1-sekresjon ^15).

De primære intestinal kulturer er en allsidig teknikk med mange potensielle anvendelser. De har allerede gitt viktig mekanistisk innsikt i reguleringen av tarmen peptid sekresjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Costar	3524	For secretion experiments
Bombesin	Sigma-Aldrich	B4272	Positive control (calcium imaging experiment)
Centrifuge tubes, 15 mL, sterile	Greiner bio-one	188261	For tissue preperation/digestion
Centrifuge tubes, 50 mL, sterile	Corning	430828	For tissue preperation/ digestion
Collagenase XI (Crude)	Sigma-Aldrich	C9407	For making up digestion medium
Dichroic mirror	Cairn Research	-	For imaging experiments
DMEM High glucose (4500 mg)	Sigma-Aldrich	D6546	For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C.
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)	Cairn Research	-	For imaging experiments
Foetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	For making up culture medium
Forceps/Tweezers	Agar Scientific	AGT520	For dissection/removal of intestine
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886	Positive control (secretion experiment)
Glass-bottomed dishes (35 mm)	MatTek	P35G-0-14-C	For imaging experiments
High precision tweezer (110 mm)	IDEAL-TEK	3480641 (5 SA)	For removing muscle layer
High resolution digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-ER	For imaging experiments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Positive control (secretion experiment)
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L1518	For collecting tissue, keep on ice
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For making up culture medium
Matrigel	Corning	354234	Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes
MetaFluor	Molecular Devices (supplied by Cairn Research)	-	Fluorescence ratio imaging software
Mice (C57BL6)	Charles River Laboratories	C57BL/6J	Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)	in house	-	For calcium imaging and secretion experiments
Microscope (EVOS XL Core)	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000	For photomicrographs of cultures
Microscope	Olympus	IX71	Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments
Monochromator	Cairn Research	-	For imaging experiments
Pasteur pipettes	Alpha Laboratories	LW4234	For cleaning tissue
PBS containing Ca2+ and Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662	For washing tissue, keep on ice
Penicillin & Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	For making up culture medium
Petri dishes (100 mm x 20 mm)	Corning	CLS430167	For cleaning tissue and removing muscle layer
Potassium chloride	Fisher Scientific	P/4280/53	Positive control (calcium imaging experiment)
Scissors	Agar Scientific	AGT554	For dissection/removal of intestine
Sterile cell strainer 100 µm	Fisher Scientific	22363549	For filtering crypt cell suspension prior to plating
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)	Swann Morton	0308	For dicing tissue
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size)	Sartorius	16534-K	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip	BD	300613	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Xenon arc lamp 75W	Cairn Research	-	For imaging experiments
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)