Summary
Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar.
Abstract
bağırsak mide-bağırsak epiteli boyunca yer alan hormon salgılayan enteroendokrin hücreleri ile vücudun en büyük endokrin organdır. fizyolojik önemine rağmen, enteroendokrin hücreler epitel hücre popülasyonunun yalnızca küçük bir bölümünü temsil eden ve geçmişte, kendi karakterizasyon hücre hattı modellerinde bir güven sonuçlanan önemli bir meydan okuma sundu. Burada, karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu birincil kültürleri besin ve bir çok nöropeptid yanıt olarak farmakolojik ajanlar olarak uyarılması ve bağırsak peptidi salgısının engellenmesini temel sinyal yollarını tespit etmek için kullanılmıştır. Ayrıca transgenik flüoresan raportör farelerin kullanılması ile kombinasyon halinde, bu birincil kültürde en floresan etiketli enteroendokrin hücre elde edilmesi için güçlü bir araç haline olduğunu göstermiştiryama sıkıştırma ve tek hücre kalsiyum ve cAMP FRET görüntüleme gibi yöntemler kullanılarak ekstrasellüler seviyesi.
Introduction
Bu yöntemin genel hedefi bağırsak peptid salgısı ve enteroendokrin hücrelerinin canlı hücre görüntüleme çalışması sağlamak için izole etmek ve kültür karışık fare bağırsak hücreleri etmektir. Bu prosedürün erken bir versiyonu orijinal olarak Reimann ve arkadaşları tarafından 2008 yılında yayımlandı. 1 ve yana gruptan ilave 20 yayın temelini oluşturmuştur. Bu yazının için, onlar kolon kültürlere daha kurmak daha zor olduğu gibi küçük bağırsak kültürlerin odaklanmayı seçti.
Enteroendokrin hücreler, glukagon-benzeri peptid 1 (GLP-1), glukoza bağımlı (GIP) insülinotropik peptid, kolesistokinin (CCK) ve peptid YY (PYY) 2 dahil olmak üzere bağırsak peptidlerin bir dizi salgılar. Bu bağırsak peptidleri gibi bağırsak geçiş, glikoz ile uyarılan insülin salımı ve tokluğun potansiye yavaşlaması olarak tokluk tepkileri düzenlenmesinde önemli fizyolojik rolleri vardır. GLP-1 mimetikleri birND olarak bozulmasını engelleyen ilaçlar tip 2 diyabet tedavisi için lisanslıdır ve bu peptidin 3 endojen salgılanmasını uyarıcı tedavi edici potansiyelinin bir sürekli değerlendirme vardır. enteroendokrin fizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve sekresyon stimüle ya da inhibe edilir, ya hangi mekanizma ile kritik bir öneme sahip, bu nedenle,.
Peptid salgısı, in vitro ve ex vivo deneysel model, avantajları ve dezavantajları olan, her bir çeşidi kullanılarak incelenebilir Gut (aynı zamanda in vivo modellerin kullanılmasını kapsayan geniş kapsamlı bir güncel bir değerlendirme için Svendsen et al. 4). Bu tür izole edilmiş perfüze bağırsak 5 ve Ussing odası 6 Ex vivo teknikleri halen çeşitli maddelere tepki olarak bağırsak peptidi salınımını keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin başlıca avantajı olarakBirincil kültürler ile karşılaştırıldığında, enteroendokrin hücrelerinin anlık çevre büyük ölçüde sağlam kalır ve daha önemlisi, hücre polarite korunmuş olmasıdır. Nedenle, bir salgı 6 üzerine etki eden olan hücre yüzeyi ile ilgili bilgiyi elde etmek mümkündür. Bununla birlikte, bu, genellikle düşük verimli teknikleri ve bunlardan türetilen verilerin kalitesi kaçınılmaz zaman içinde azalma bağırsak dokularının bütünlüğünün ve canlılığı, dayanır.
Bağırsak organoids artık giderek enteroendokrin hücre fonksiyonu ve gelişimi 7 çalışma için in vitro model olarak kullanılmaktadır. Kemirgen ve insan dokusu hem de türetilebilir Organoids, kültür içinde hücre polarite muhafaza 3D 'kript benzeri yapıları oluşturan bir yararı vardır. Bununla birlikte, organoid türetilmiş enteroendokrin hücreleri henüz tam olarak karakterize edilmesi için olan ve doğal L cel kendi benzerlikls büyük ölçüde bilinmemektedir. enteroendokrin hücrelerinin üretimi muhafaza ve uzun zaman süreleri için yapay koşullar ayırt edilmez olarak birincil kültürleri, bir adım daha yakın fizyolojik ayarına olma avantajına sahiptir.
Bağırsak peptidi salgısının değerlendirilmesi için kullanılan edilmiş Alternatif bir birincil kültür metodu cenin sıçan barsak hücreleri (FRICS) 8 izolasyondur. Bununla birlikte, yetişkin bağırsak doku kültürü az bir başarı elde etmiştir ve bazı farklılıklar FRICS genel yetişkin fare bağırsak hücrelerinin (örneğin glikoz 8) yanıt verme gözlenmiştir.
Enteroendokrin-benzeri hücre hatları (örn GLUTag STC-1 ve NCI-H716), geleneksel olarak karşı doğrudan ayırmak için kullanılmıştır. dolaylı etkiler entero- hücrelerde ve salgılama için uyaran bağlanması altında yatan moleküler mekanizmaların tahlil edilmesi; bakınız Kuhre ve ark 9. Bu gastrointestinal sistem boyunca dağınık enteroendokrin hücreler, gerekli olmuştur sadece bağırsak epitel hücreleri 10 ve sıralanmış hücrelerin% 1 altında, bizim elimizde, kültür 1'de hayatta yoktur oluşturmaktadır. Hücre hatları bunlar gen sessizleştirme olarak genetik manipülasyonlar için elverişli olan bir büyük ölçüde homojen bir hücre popülasyonu olmasından dolayı yararlı araçlar kalır. Sonuç olarak, transgenik fare, mevcut olmadığında, farmakolojik olarak hedeflenen edilemez proteinlerin rolünü araştırmak için kolaydır. Ancak, hücre hatları her zaman birincil hücrelerin geçerli modeller değildir. Birçok benzerlikler vesileyle GLUTag hücrelere kıyasla birincil L hücrelerinde belirli besinlerin aktive sinyal yollarının farklılıkları sermiştir birincil kültürlerden bulgular varken, örneğin (örn. Peptonlar <sup class = "xref"> 11). En önemlisi, transgenik flüoresan raportör fareler ile kombinasyon halinde, primer kültürü modeli, hücre içi düzeyde bireysel birincil enteroendokrin hücrelerinin detaylı inceleme sağlar. Birincil kültürler içinde floresan-etiketli L hücreleri yama kalsiyum 11, 13 ve siklik adenosin monofosfat-FRET görüntüleme enteroendokrin alanında önemli gelişmeler vermiştir 14 çalışmalar, 1, 12 çalışmalar ve tek hücreli sıkma için bir grup tarafından kullanılmaktadır fizyoloji.
Aşağıdaki protokol, tek bir yetişkin fare ince bağırsağın, 10 cm bölümünden, salgılama deneyler bir 24-çukurlu plaka kullanılarak ya da 16 adete kadar görüntüleme yemeklerin hazırlanması için optimize edilmiştir. protokol kolayca sindirim süreleri ve işbirliği artırarak kolon hücrelerinin çalışma için değiştirilebilirllagenase konsantrasyonu.
Protocol
Bütün hayvan prosedürleri Cambridge Hayvan Refahı Üniversitesi ve Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylanan ve (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 Değişiklik Yönetmelikleri (SI 2012/3039) Hayvanlar uymakta bulundu.
Peşin 1. Hazırlık
- çözülmesi için buz üzerine taban membran matrisi bir kısım (BMM) (yaklaşık 200 uL) yerleştirin.
Not: BMM oda sıcaklığında (RT) katılaşır. - Pre-sıcak 50 ml steril, yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) (herhangi bir ilave ile) ve ~% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS ile takviye edilmiş 40 mL steril kültür ortamı (yüksek glikoz DMEM), 100 U / ml penisilin ve 0.1 mg / mL streptomisin (P / S) ve 37 o C'de bir su banyosu içinde 50 ml lik santrifüj tüpleri içinde, 2 mM L-glutamin)
- Ön-soğutma, kalsiyum ve magnezyum ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS).
- 15 mg kolajenaz (XI ham) tartın, bir 50 mL santrifüj tüpüne ekleyin ve buz üzerinde tutun.
2. Doku Koleksiyonu
- 50 ml bir santrifüj tüpüne ~ 20 ml L-15 ortamı ilave edin ve buz üzerine yerleştirin.
- servikal dislokasyon veya diğer onaylanmış planı 1 yöntemi ile bir fare öldürülür.
Not: intestinal doku tipik olarak bir C57BL6 arka farelerden elde edilir. Ancak, diğer genetik kökenden de 129 / SvEv 15 örn kullanılmıştır. Görüntüleme deneyleri örneğin flüoresan raportör farelerin kullanılması GLU-Venüs 1 gerektirir. Doku, her iki cinsiyetten yetişkin farelerin (2-6 ay) elde edilir. farenin individua yerleştirilmiştirSu ve düzenli mamasına erişimi olan kafesleri Lly havalandırılmış. Bir proje lisansı destekliyorsa Ancak deneyler enteroendokrin hücre fonksiyonu 16, örneğin, bir yüksek yağ diyetin etkisini test etmek yapılabilir. - Ayır ve yavaşça forseps ve diseksiyon makas kullanılarak (rektum başlatmak için pilordan) fare bağırsak çıkarın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde L-15 ortamında saklayın.
3. Doku Hazırlanması
- doku karşılamak için yeterli PBS içeren 10 cm'lik bir petri tabağına intestinal doku yerleştirin. (Pilor distal örneğin, üst ince bağırsak, ilk 10 cm), arzu edilen doku içinde 10 cm al.
- Plastik bir Pastör pipet ve soğutulmuş PBS kullanarak bağırsak içeriği çalkalayın.
- incelikle kavrama, bağırsak segmenti bir ucunu forseps kullanma ve içine bir Pasteur pipet ucu yerleştirin. Soğutulmuş PBS ile içindekileri dışarı yıkayın. majo kadar her iki ucundan da tekrarlayınİçindekiler rity dışarı atılır edilmiştir. taze soğutulmuş PBS içeren bir petri kutusuna aktarın.
- forseps kullanarak, aynı anda kas tabakası koparmak değil dikkat ederek adipoz doku ve mezenteri çıkarın.
- Peel kas ince forseps iki set kullanılarak bir mikroskop altında "bir çorap gibi" kapalı katman.
NOT: Bu adım gerekli değildir, ancak şiddetle tavsiye edilir. Burada anlatılan birine kas tabakasını kaldırarak alternatif yolları vardır. Örneğin, bağırsak önce kas tabakasının çıkarılması için, uzunlamasına birinci açık kesilebilir.- kas görünür bir yakanın bulunduğu doku daha yakın uçta bir başlangıç noktası bulun. Yavaşça bağırsak etrafında tüm yol kas tabakasının az miktarda uzağa çekin.
Not: kas tabakası veya bağırsak epitel yırtılmasını önlemek için, daha büyük bir yüzey alanı sıkıştırma yerine t kullanarak germe kuvvetini azaltmakince forseps ips. - bağırsak ve mümkün olduğunca kas flep kadar kelepçe yavaşça birbirinden çekin ve bağırsak yerinden kas tabakası soyulması başlayın. kas tabakası ve epiteli hem yırtılmasını önlemek için onları birbirine yakın tutmak için forseps konumunu yeniden ayarlamayı tutun. Bu şekilde, bağırsak segmenti ve artıklar, tüm uzunluğu kas tabakası çıkarın.
- kas görünür bir yakanın bulunduğu doku daha yakın uçta bir başlangıç noktası bulun. Yavaşça bağırsak etrafında tüm yol kas tabakasının az miktarda uzağa çekin.
- açık uzunlamasına bağırsak kesin ve taze soğutulmuş PBS ile temin bir petri kutusuna içinde dönen ile yıkayın. Gerekirse kalan chyme ya da mukus kaldırmak için tekrarlayın.
- Cerrahi bir bıçak yardımı ile kıyma doku -1-2 mm2'lik kareler elde etmek ve 20 ml Pasteur pipet kullanılarak 50 ml santrifüj tüpüne PBS soğutulmuş ~ bu ekleyin. Pipet yapışmasını doku parçaları önlemek ucu kesilmiş ve PBS ile ezilip karıştırılarak pipet ıslak.
- Yavaşça ayrıca doku parçaları yıkamak için tüp sallayın. Doku yerleşmek ve dökmek veya p izin verPBS çoğunluğunu kapalı ipette ve PBS berrak görünene kadar taze PBS ile tekrarlayın.
BBM kaplı levhalar / kaplar ve Sindirim Orta 4. hazırlanması
Not: Aşağıdaki adımlar (37 ° C su banyosu içinde kuluçka kademeli) bir doku kültürü kaputu yapılmalıdır.
- (Hiçbir ekleme) ile soğutulmuş, DMEM içinde% 2 BMM çözeltisi hazırlayın. Çalışırken, buz üzerinde çözüm tutmak. % 2'lik bir çözelti için, ekleme 140 uL 7 ml DMEM (yeterli bir tek 24-yuvalı plakanın hazırlanması için) BMM eritilmiştir.
- 250 ul% 2 BMM çözeltisi, oyuk başına (24-iyi levha) veya cam alt görüntüleme tabak başına ekleyin.
- BMM yeterli polimerizasyonu için izin vermek üzere, 37 ° C'de bir inkübatör içinde en az 30 dakika boyunca kaplı plakalar / tabaklar inkübe edin.
- Bir 0.3 mg / ml çözelti oluşturmak ve eritmek için tersine çevrilmesi için (Adım 1.2 ve 1.4 ila) 15 mg kolajenaz (hiçbir eklemelerle), 50 mL önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.
- üzerindece tamamen 20 ml'lik bir şırınga kullanılarak, eritilmiş, yeni bir steril 50 ml santrifüj tüpüne 0.2 um steril filtre içinden kolajenaz çözeltisi filtre edin. sindirim ortamı olarak etiketleyin.
5. Doku sindirimi
- 10 ml serolojik bir pipet kullanarak PBS doku parçasını çıkarın ve steril bir 50-ml santrifüj (bir eklemelerle) soğutulmuş steril DMEM içeren tüp, girdap ekleyin ve sonra DMEM çıkarın.
NOT: serolojik pipet yapışmasını doku önlemek doku ile temas ettirilmeden önce DMEM ile ezilerek ıslatın için. - 'Digest' 1 ve 2: hücre artıkları ve tek hücrelerin çıkarılması
- Doku parçaları 7 ml sindirim ortamı ilave edin ve tüpü bir girdap verir.
- 37 ° C'de bir su banyosu içinde 5 dakika süreyle inkübe edilir.
- Yavaşça (girdap yok) ~ 3 s tüp çalkalayın.
- Bir ayırma, doku sindirim ortamı yerleşmek ve atmak için izin verKüçük hacimli mikroskop altında bakmak için.
Not: başlayan Özellikle, son derece sindirim sürecinin ilerlemesini ölçmek için bir mikroskop altında her 'digest' (~ 30 ul) bir küçük hacimli kontrol edilmesi önerilir. Birçok kriptler bu aşamada gözlenirse, sarsıntı çok kuvvetli olabilir. Farklı 'özet' aşamalar genellikle nasıl göründüğünü temsili görüntüler için, Şekil 1'e bakınız. - (Taze sindirim ortamı ile) tekrar Adım 5.2.-5.2.4.
- 'Sindirir' 3 ila 5 XXXII parçaların toplanması
- dokuya 7 ml sindirim orta ekleyin.
- 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
- İnkübasyon sırasında, 10-12 saniye süre ile her 5 dakikada sallayın.
NOT: sarsıntı daha dinç olduğu için sallayarak daha 'çözünüklerinin' 1 ve 2.
- İnkübasyon sırasında, 10-12 saniye süre ile her 5 dakikada sallayın.
- sindirilmemiş doku 15 ml santrifüj tüpüne sindirim ortamı yerleşmek ve toplamak için izin verin. EğerDoku yanlışlıkla bir ortamla birlikte, bu yerleşmek 10 ml serolojik pipet kullanılarak çıkarın ve sindirilmemiş doku içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne geri transfer etmek için toplanır.
- Santrifüj, 100 x g'de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında orta / süpernatan toplandı.
- Süpernatant atılır ve dikkatlice toz haline getirilerek ve bir kenara göre 5 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamında, hücre pelet yeniden askıya.
- mikroskop altında hücre süspansiyonu küçük bir hacim kontrol edin (Kademe 5.2.4 notu bakınız).
Not: İdeal olarak, kript fragmanları hücre artıkları ve tek hücreler ile birlikte 3 'sindirimi' de ortaya çıkmaya başlar. 'Dijest 4 ve 5 düşük artıklar ile kript parçalarının önemli ölçüde daha fazla sayıda ihtiva eder (Şekil 1). Doku sindirilmesi değildir ve kript fragmanları daha kuvvetli bir şekilde çalkalanır, görünen değilse, yani gerektiğinde yoğunluğu çalkalama ayarlayın. - Adımları tekrarlayın 5.3.1-5.3.6 5'e kadar 'sindirir' olmuşturtamamlanmış veya doku çoğunluğu sindirilmiş kadar (bir 6. sindirimi gerekli olabilir).
- Bir kez 'dijest 3-5 (ya da 3-6) elde edilmiştir, santrifüj tüm üst fazlar 100 x g'de 3 dakika boyunca oda sıcaklığında süpernatantlar sindirimi.
- salgılama deneyleri için, 'dijest 3-5 (ya da 3-6) santrifüj leme öncesinde alınan üst fazlar bir araya getirir.
Not: Daha az mendil kript parçalarının daha fazla sayıda temiz (hücre artıkları ve tek hücre olmaması) olan sindirimi süpernatant seçin görüntüleme deneyleri için gereklidir. Bu tipik olarak, 4 ya da 5 'digest'. - Süpernatant atılır ve yavaşça bir kümeleri görünür olana kadar öğütülerek pelet yeniden askıya. Yeniden askıya 10 uM, Y-27632 dihidroklorid ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış bir kültür ortamında pelet (anoikisi 17 önlemek için). salgılama deneyleri ve görüntüleme deneyleri için 2 ml kültür ortamı için 5 mL kullanın.
- filtre100 um filtre ile bir hücre süspansiyonu (herhangi bir sindirilmemiş doku çıkarmak için). (Sırasıyla, sekresyon ve görüntüleme için 7 mL, 4 mL toplam hacim) yıkamak için filtre boyunca önceden ısıtılmış kültür ortamında bir başka 2 mL çalıştırın.
NOT: Filtreleme gerekli değildir, ancak, büyük doku parçaları plaka / yemekler uymak değil eğilimindedir.
Şekil 1: Primer ince bağırsak kültür yönteminden 'sindirmelerinde' temsili görüntüler. (A) 'dijest 1 ve 2, esas olarak tek hücreleri ve hücre kalıntısını içeren Tipik malzeme. (B), siyah oklar 3 'digest' ürünlerin bir örneği, sindirimi malzeme görünen kript parçalarını gösterir. Tipik (C) 4 ya da 5 Paneli (D) malzeme sindirimi toplanmış temsil 'digest''dijest 3-5 (C)' de görüldüğü daha büyük bir istenmeyen doku parçaları çıkarmak için bir 100 um filtreden geçirildi. Tüm resimler 20X amacı ile dijital invert mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları 100 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
6. Kaplama bağırsak Kültürleri (kriptik hücreleri için zenginleştirilmiştir)
- plaka ya da bulaşıklar için aşırı BMM çözeltisini çıkarın ve bunu salgılama başına 250 uL önceden ısıtılmış kültür ortamı ilave edin.
NOT: Görüntüleme yemekler kadar çabuk sonraki adıma geçin kurumasını yemeğin önlemek için orta olmadan bırakılır. - Levha 250 uL hücre süspansiyonu oyuk başına (24-iyi levha) veya cam alt tabak başına.
- Plaka damla damla iyi boyunca yavaş 'zig-zag' hareket. kript fragmanları inci plâkasını önce ~ 5 dakika boyunca çökmesine izin verilmektedirE inkübatör.
NOT: Bu kuyu içinde kriptler / hücrelerin eşit dağıtıldığını teşvik etmelidir.
- Plaka damla damla iyi boyunca yavaş 'zig-zag' hareket. kript fragmanları inci plâkasını önce ~ 5 dakika boyunca çökmesine izin verilmektedirE inkübatör.
- Plaka ya da yemekler, gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübe edin.
NOT: A 'yamalı' tek tabaka oluşturmuş olmalıdır. Üç yıkama aşağıdaki kültürler temsil eden bir görüntü için, Şekil 2A 'ya bakınız. - tabak başına 2 ml önceden ısıtılmış bir kültür ortamı ile 'Flood' görüntüleme yemekler.
NOT: ~ 72 saate kadar kaplama aşağıdakiler için bu yemekleri görüntüleme için uygun olacaktır. Kolon kültürler genellikle 7 gün öncesine kadar, daha uzun ömürlü. yapışmış olan hücreler için bir yıkama adımı ile çıkarılabilir. Primer kültürler şimdi deneyler için kullanılacak hazırdır.
Representative Results
Seri sindirim aşamasının kullanılması kript parçalarının nispeten temiz bir preparasyon toplanması deneyleri için kaplama sağlar. İlk iki dijestleri sindirerek malzeme (Şekil 1A) öncelikle tek hücreler ve hücre kalıntısını uzaklaştırmak. Üçüncü sindirmek sırasında, kript fragmanları sindirilmiş malzeme (Şekil 1B) görünür. Daha az tek hücreleri (Şekil 1C) kript fragmanlarının 4 ve 5, verimi daha fazla sayıda sindirir. 3-5 temiz bir kript fragmanı hazırlanması (Şekil 1D) üretilmesi için kültür için zarar verici olabilir sindirilmemiş doku büyük parçaları, kaldırır sindirimleri toplanmış materyal filtre.
Kültürün 18-24 saat sonra, birincil, ince bağırsak hücrelerinin tek tabakaları (Şekil 2A) gözlenir. özellikle cal eksprese eden transgenik farelerde elde edilen kültürlerin kullanılmasıkalsiyum veya magnezyum floresan sensörü, GCaMP3, proglukagon promotör 11 kontrolü altında, L hücreleri kolayca tanımlanabilir ve kültür (Şekil 2B) içinde dağılmış olan. Birincil ince bağırsak kültürlerde, bileşikler Gq -Ca hedefleme 2 + ı ve cAMP i yollar GLP-1 sekresyonunu stimüle bağımlı (salgı deney yöntemi için Reimann ve arkadaşları. 1 e bakınız). Bombesin (BBS, 100 nM) ve forskolin ve 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX), eş-başvuru (F / I, 10 uM her) GLP-1 salma nisbetle bir 2 ve 11-kat, stimülasyon tetiklenen bazal sırasıyla (Şekil 2C). GCaMP3 spesifik L hücre sentezleme belirlenmesini ve bireysel L hücrelerinde kalsiyum mobilizasyonu, gerçek zamanlı izleme sağlar. Her ikisi de, 100 nM bombesin (BBS) ve 30 mM potasyum klorür (KCl) bilinen G q gösteren hücre içi kalsiyum geçici bir artış ile uyarılmış </ alt> - ve primer L hücreleri (Şekil 2D) elektrojenik çiftli yollar.
Şekil 2: Primer, ince bağırsak kültürlerinden türetilen Örnek verileri. (A), sekresyon ve (B) 'görüntüleme deneyleri için kullanılan karma primer küçük bağırsak kültürlerin Örnek görüntüleri 24 saat kaplama sonrası. (A), görüntü bir 4x objektif ile dijital ters mikroskop kullanılarak, bir 24-kuyucuklu plakada. Ölçü bar = 500 um. GLU-Cre kullanılarak ve (b) (yeşil hücreler) alanında ROSA26 GCamP3 fareler, L hücreleri x GCaMP3 floresanı ile tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 50 um temsil eder. (F / I, 10 uM her biri) (C), GLP-1 sekresyonu (BBS, 100 nM), bombesin yanıt olarak ölçüldü ve forskolin / 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX). Yüzde, GLP-1 sekresyonu hesaplanmıştıryüzer bölümler ve hücre lizatları, GLP-1 seviyeleri ölçülerek. Veriler her bir durum için, n = 3, ortalamalar ± SEM temsil eder. (D), potasyum klorür (KCl, 30 mM) ve BBS (100 nM) 'ye tepki olarak, gerçek zamanlı olarak izlenir (B)' de tarif iki hücre (sitozolik kalsiyum yansıtan) GCaMP3 floresan. Tek hücre görüntüleme 40X yağa batırılmış objektif ile bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak gerçekleştirilmiştir. GCaMP3 75 W ksenon ark lambası ve fluoresans görüntü yazılımı tarafından kontrol edilen bir monokromatörü kullanılarak, 475/10 nm uyarılmıştır. Emisyon bir dikroik aynayı ve 510-560 nm bant genişliği filtre kullanılarak bir yüksek çözünürlüklü şarjla bağlanmış cihaz (CCD) kamera ile kaydedildi. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol bağırsak peptid salgısı ve etiketli enteroendokrin hücrelerinin tek bir hücre görüntüleme çalışması sağlamak için karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır.
ince bağırsak kültürler başarılı olma olasılığını artırmak amacıyla, protokolü (doku hasat 3 saat içinde, ideal olarak) mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilir bu ve doku buz soğukluğunda bir ortamda tutulur ya da önceki tampon önemlidir sindirim işlemine hücre ölümlerini sınırlayabilir. özellikle kolon kültürlerin değil, şart iken, ince bağırsak kas tabakasının uzaklaştırılması kuvvetle teşvik edilir. ince bağırsak kültür protokolü mümkün olduğunca standardize edilmiştir. Ancak, hiçbir sindirim süreci özdeş olduğuna dikkat etmek önemlidir. Değişkenlik kas atılma derecesiyle mesela bir gün-gün bazında sokulabilir Bu protokol sırasında birçok adımlar, t boyutu vardırO, çalkalama gücünü, kolajenaz vb belirli bir yığınının gücünü doku parçaları 'kıyılmış'. Sindirim işlemi ve isteğe uydurmak için çalkalanarak ilerlemesini ve "dijest buna göre sayısını belirlemek için mikroskop altında 'dijest farklı her bir hacimde incelemek için büyük önem taşımaktadır, bu nedenle. kript fragmanları gelen belirgin değildir eğer, başlamak için daha nazikçe sallamak için tavsiye edilir ve daha kuvvetli sallayarak başlatmak için, itibaren 3 'sindirmek'.
Bizim deneyim, enteroendokrin hücreler kültürde çoğalmadığı ve genellikle 4 gün içinde ince bağırsak kültürlerden kaybolur. Bununla birlikte, bu bağırsak peptidi salgılama deneyleri için yeterli zaman fizyolojik uyaranlara ve / veya farmakolojik maddelerin test edilmesi için (tipik olarak 2 saat, 18-24 saat sonra kaplama üzerinde gerçekleştirilen) sağlar. Salgılama deneyden önce bir gece boyunca inkübasyon gerektiren deneyler de yapılabilir, örneğin vardırboğmaca toksini 15 ile ön muamele durumunda.
Yıllar boyunca üretti araştırma üretim hacminde ile kanıtlandığı gibi burada sunulan primer kültürü tekniği, iyi kurulmuş bir yöntemdir. Birincil kültürü modeli, çeşitli besin ve besin olmayan 14, 20, uyaranlara ve inhibitörlerine tepki olarak, GLP-1 1, GIP 18 ve PYY 19 de dahil olmak üzere bağırsak peptidleri, çeşitli salgılanmasını incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, aynı teknik başarılı bir insan bağırsak hücrelerine 21 kültür uygulanmıştır. Çoğu zaman, ilave bir deneysel model, örneğin birlikte, birincil hücre kültür metodu bir kombinasyonu olabilir. ex vivo veya in vivo olarak en kavrayış 6 sağlayabilir. Özellikle ve diğer yöntemlerle tersine, bu teknik im varbağırsak peptid salınımı ölçümü ötesinde nem li uygulamalar. Biz, sırasıyla örneğin kullanılarak Ca2 + ve cAMP sensörleri, GCaMP3 11, 13 ve Epac2camps 14 transgenik raportör farelerden türetilen primer küçük bağırsak kültürleri peptit salınımını gut bağlanmış hücre içi sinyal yollarının sorgulama için güçlü araçlardır olduğunu göstermiştir hem elektrofizyolojik teknikler 12 olarak gösterilmektedir.
Genel olarak in vitro modellerde olduğu gibi, primer intestinal kültürleri kültür epitel hücreler polarite kaybı, hem de kan akımı ve innervasyon kaybı da dahil olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Enteroendokrin hücre fonksiyonu üzerine bu yapay koşulların olası etkilerini tahmin etmek zordur. Bununla birlikte, primer kültürlerden elde edilen veriler, genellikle in-vivo setti, dönüştürülebilir olmuşturng (GLP-1 sekresyonu 15 kısa zincirli yağlı asitlerin, örneğin etkisi).
Birincil bağırsak kültürleri birçok potansiyel uygulamalar ile çok yönlü bir tekniktir. Zaten bağırsak peptid sekresyonunun düzenlenmesi hakkında önemli mekanik önem kazanmasını sağlamıştır.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
GLP-1 immuno-deneyler Addenbrooke Hastanesi Çekirdek Biyokimyasal Deneyi Laboratory tarafından gerçekleştirildi.
Bu çalışma, yıllar içinde, Wellcome Trust tarafından desteklenmiştir (şu anda aktif hibe 106.262 / Z / 14 / Z ve 106.263 / Z / 14 / Z) ve Tıbbi Araştırma Konseyi (MRC) (hibe MRC_MC_UU_12012 / 3 ve MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
