Summary
På grunn av den slående likheter i livssyklusen og biologi av gnager malariaparasitter til menneskelig malariaparasitter, gnager malaria modeller har blitt uunnværlig for malaria forskning. Her standardiserte vi noen av de viktigste teknikkene som brukes i fenotypiske analyse av vill-type og transgene gnager malaria arter.
Abstract
Nylige fremskritt innen genetikk og systemer biologi teknologi har fremmet vår forståelse av biologi av malariaparasitter på molekylnivå. Imidlertid er effektiv malaria parasitt mål for vaksine og kjemoterapi utvikling fortsatt begrenset. Dette skyldes i stor grad utilgjengelighet av relevante og praktiske in vivo infeksjon modeller for menneskelig Plasmodium arter, særlig for p. falciparum og p. vivax. Derfor gnager malaria arter har blitt mye brukt som praktisk alternativ in vivo-modeller for malaria vaksine, narkotika målretting, immunrespons, og funksjonell karakterisering studier av bevarte Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnager malaria modeller har vist seg å være uvurderlig, spesielt for å utforske mygg overføring og lever scenen biologi, og var uunnværlig for immunologiske studier. Det er imidlertid avvik i metodene som brukes til å evaluere fenotyper av transgene og vill-type aseksuell og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse avvikene er valget av en intravenøs vs. intraperitoneal infeksjon av gnagere med blod-scene parasitter og evalueringen av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Heri, vi detalj standardiserte eksperimentelle metoder for å evaluere fenotyper av aseksuell og seksuelle blod stadier i transgene parasitter uttrykker reporter-genet eller vill-type gnager malaria parasitt arter. Vi har også detalj metodene for å evaluere fenotyper av malaria parasitten mygg stadier (kjønnscellene, ookinetes, oocyster, og sporozoitter) inni Anopheles Mosquito vektorer. Disse metodene er detaljert og forenklet her for dødelige og ikke-dødelige stammer av p. berghei og p. yoelii men kan også brukes med noen justeringer til p. chabaudi og p. vinckei gnager malaria arter.
Introduction
Malaria parasitter forårsake hundrevis av millioner av malaria infeksjoner hos mennesker over hele verden, med mer enn 600 000 dødsfall hvert år1. Menneskelige infeksjoner er forårsaket av fem malaria parasitt arter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, og p. knowlesi. De fleste kliniske malaria dødelighet er forårsaket av P. falciparum i Afrika sør for Sahara1. En annen menneskelig malaria parasitt arter som forårsaker omfattende verdensomspennende morbidities utenfor Afrika sør for Sahara er P. vivax2. De tre andre artene er mer geografisk begrenset og forårsake godartet malaria infeksjoner, bortsett fra den dødelige P. knowlesi3. Utilgjengelighet av relevante og praktiske ikke-menneskelige in vivo modeller av infeksjoner har alltid vært og er fortsatt et hinder for malaria vaksine og narkotika utvikling. Tidligere malaria narkotika målretting og metabolske studier har støttet seg mye på avian malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, infiserer kyllinger og ender, henholdsvis4. Deretter ble gnagere malaria arter gradvis innført i ulike vaksiner og narkotika målretting studier som in vivo-modeller. Gjennom årene, bevis på likheter av biologi og Host-parasitt interaksjoner av livssyklus stadier av gnager malaria modeller for menneskelig malaria arter har akkumulert.
Spesielt gnager malaria modeller var svært viktig å utforske og karakterisere biologi av mygg og pre-erythrocytisk etapper5. Men det er fire gnager malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei) som har ulike biologiske egenskaper, den mest bemerkelsesverdige av dem er i blodprøvene6. Gnagere malaria arter varierer i synkron av blod stadier, der blod stadier av p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkron, mens blodprøvene av p. berghei og p. yoelii er ikke6 , 7. en annen merkbar forskjell er selv-clearance av blod stadier som oppstår i enkelte stammer (f. eks, p. Yoelii 17X-nl, P. berghei NK65, og P. vinckei lentum), mens blod smitte av andre stammer av samme art kan være dødelig hvis venstre ubehandlet (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, og P. chabaudi AS). Dess, p. yoelii 17X-nl belastning og P. berghei ANKA stamme fortrinnsvis invadere retikulocytter8,9,10,11, selv om disse funksjonene i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vekst krav12,13,14. Derfor er mus behandlet med phenylhydrazine før en infeksjon med blod stadier av disse parasitter for å øke parasitemia og gametocytemia nødvendig for en mygg infeksjon for p. berghei ANKA belastning og for p. yoelii 17X-nl15,16, 17,18,19.
Forskjeller i mygg stadier utvikling finnes også blant ulike gnager malaria arter, den mest bemerkelsesverdige er temperaturen og tiden som kreves for optimal mygg stadier utvikling og sporozoite lengde5,6, og 20. I pre-erythrocytisk stadier av gnager malaria arter, forskjellene inkluderer gnagerarter og belastning som er mest utsatt for smittsomme sporozoite inoculation, antall sporozoitter nødvendig for inoculation i en utsatt gnager belastning, pattedyr celletyper som trengs for in vitro Liver stadium utvikling analyser, og tid til å fullføre leveren stadium utvikling5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Til tross for disse variabilitet, gnager malariaparasitter var de gunstige modellene tidlig for anvendelsen av omvendte genetiske tilnærminger, fordi de var mindre tid-og ressurskrevende med en høy sannsynlighet for å lykkes31. Faktisk gnager malaria modeller var de beste modellene, og i mange tilfeller de eneste modellene, tilgjengelig for mange år til funksjonelt karakterisere gener uttrykt i mygg og lever etapper.
I lys av populariteten og amenability av omvendte genetiske tilnærminger i gnagere malaria modeller, har en rekke ulike metoder blitt benyttet for å analysere fenotyper av transgene parasitten livssyklus stadier, spesielt blod stadier. Noen av disse metodene er imidlertid inkonsekvente. for eksempel, sammenligne infeksjoner av blod-scenen parasitter etter en IP-injeksjon (som er muligens drenert til bukhulen, og derfra kan gå inn i blodet; derfor er injisert parasitter ikke ende opp like i blodet) , sammenligner mygg overføring av kloner med et annet antall serie blod-scene overføringer eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naiv vill-type (WT) parasitter som aldri ble utsatt for electroporation og positivt legemiddel valg og de ulike unstandardized evalueringer av mannlig Kjønnscelle exflagellation. Derfor er det avgjørende å standardisere protokoller som er enkle å følge for fenotypiske analyse av enhver type transgene eller WT gnager malariaparasitter i blodet og i myggen å imøtekomme for biologisk variabilitet av gnager malaria parasitten arter.
Heri, rapporterer vi om en standardisert, detaljert eksperimentell protokoll for fenotypiske analyse av blod og mygg livssyklus stadier av transgene eller vill-type P. yoelii og P. berghei parasitter. Disse protokollene gjelder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr eksperimenter beskrevet her ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) av Tulane University og dyrene etikk komiteen Bezmialem Vakif University. Alle andre eksperimentelle protokoller og bruk av rekombinant DNA ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller av institusjonelle biosafety Committee (IBC) av Tulane University.
1. infeksjon av mus med blod-Stage parasitter for Parasitemia analyse og Mosquito infeksjon analyser
- Dag-3: valgfri injeksjon av phenylhydrazine i mottaker mus
- Injiser outbred SW eller CD1 mottaker mus (mus som skal brukes til mygg infeksjon og mygg infeksjon analyser) intraperitonealt (IP) med 100 μL av phenylhydrazine (50 mg phenylhydrazine i 5 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS)) ved hjelp av en 26 G nål Sprøyte.
Merk: For robuste mygg infeksjoner av p. berghei og p. yoelii, phenylhydrazine brukes til å indusere retikulocytose i mottaker mus, noe som øker parasitemia og, senere, prosentandelen av gametocytes, og betydelig øker exflagellationav mannlig kjønnscellene (figur 5), som vil føre til en bedre mygg stadier infeksjon for både p. berghei og p. yoelii stammer15,16,17, 18 i år.
- Injiser outbred SW eller CD1 mottaker mus (mus som skal brukes til mygg infeksjon og mygg infeksjon analyser) intraperitonealt (IP) med 100 μL av phenylhydrazine (50 mg phenylhydrazine i 5 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS)) ved hjelp av en 26 G nål Sprøyte.
- Dag-2: injeksjon av frosne parasitt bestander i giver mus
- Tin raskt embryo frosne aksjer og Injiser umiddelbart hver giver mus (vanligvis to mus per genotype) IP med ~ 200 μL av lager ved hjelp av en 26 G nål sprøyte.
Merk: Ikke mer enn fem mus er plassert per bur innenfor kontrollerte vivarium innstillinger. - Begynn å sjekke parasitemia under et mål med et 100-objektiv på Giemsa tynne blod flekker etter 24 h postinfection. Følg § 2,1 av protokollen for Giemsa-farget tynne blod flekker.
Merk: På grunn av manglende evne til å nøyaktig telle de overlevende levedyktige blodprøvene etter raskt tine og injisere embryo infisert blod, giver mus mottar embryo blod først. Den infiserte erytrocytter av donor musen kan være nøyaktig kvantifisert og brukes senere.
- Tin raskt embryo frosne aksjer og Injiser umiddelbart hver giver mus (vanligvis to mus per genotype) IP med ~ 200 μL av lager ved hjelp av en 26 G nål sprøyte.
- Dag 0: blødning fra donor mus
- Bleed donor mus (se avsnitt 3,1) når deres parasitemia er mellom 0,1% og 1%, som vanligvis oppnås 2-3 dager etter frosset-lager-smitte i tilfelle av P. yoelii 17X-nl og P. berghei ANKA stammer.
- Bruk ansikts vene punktering (for å komme mellom 200 og 500 μL), eller uhelbredelig blødning dyrene ved hjerte punktering (for å komme mellom 600 μL og 1,2 mL) av infisert blod. Uhelbredelig blødning musene ved hjerte punktering som beskrevet i detalj i § 3,1.
Merk: Facial vene blødning er ikke en rutinemessig metode for å skaffe blod som det er mye vanskeligere å bruke og er svært distressful til mus, sammenlignet med Terminal blødning. Den optimale parasitemia for blødning av giver mus er mellom 0,1%-1% fordi, på dette parasitemia området, er det svært få gametocytes (som ikke kan gjenskape å produsere aseksuell blod stadier) og det er mindre dobbelt-eller trippel-infiserte erytrocytter (som gjør kvantifisering mindre nøyaktig).
- Dag 0: kvantifisering av infisert blod for å forberede doser av infiserte erytrocytter ved seriell fortynninger
- Forbered seriell fortynninger av giver blod ved å tilsette 100 μL av blod til et mikrosentrifugen rør (fortynning tube 1). Tilsett 900 μL av RPMI medium til rør 1 og bland godt ved å pipettering opp og ned med den samme pipette spissen, og skaper en 1:10 fortynning.
- Ta 100 μL av det fortynnede blodet fra rør 1 og legg det til et nytt mikrosentrifugen rør (fortynning tube 2). Tilsett 900 μL av RPMI medium til rør 2 og bland godt ved å pipettering opp og ned med den samme pipette spissen, og skaper en 1:100 fortynning.
- Gjenta trinn 1.4.1 og 1.4.2 for å lage to serielle fortynninger, opprette 1:1000 (fortynning tube 3) og 1:10000 fortynninger (fortynning tube 4).
- Tilsett 12 μL av fortynnet blod fra rør 3 og 12 μL av fortynnet blod fra rør 4 til forskjellige sider av en hemocytometer og Bestem gjennomsnittlig antall erytrocytter på hver side av hemocytometer. Multipliser disse tallene med 10. Multiplisere disse tallene med fortynning faktor, 1 000 eller 10 000, henholdsvis for å bestemme antall erytrocytter i 1 μL av hver fortynning.
- Del det ønskede antall infiserte erytrocytter som skal injiseres av antall erytrocytter i 1 μL av hver fortynning for å bestemme volumet av fortynnet donorblod som er nødvendig for injeksjon. Velg fortynning med det mest passende injeksjonsvolumet, Legg volumet til et nytt mikrosentrifugen rør, og Fullfør det til 120 μL med RPMI medium.
- Dag 0: intravenøs injeksjon av mottakeren mus
- Plasser mottakeren mus under en varme rød lampe for å dilate sine årer for injeksjon. Last inn parasitten doser i en 27 G insulinsprøyte og plasser mottakeren musen i en restrainer.
- Injiser 1 000 000 eller 10 000 infiserte erytrocytter intravenøst (IV) ved hjelp av 27 G insulinsprøyte i hver mottaker mus for mygg infeksjon analyser eller for aseksuell og seksuelle blod-scene vekst analyser, henholdsvis. Fortsett å opprettholde musene under standard bolig forhold.
Merk: En IP-injeksjon er en indirekte metode for å innføre parasitter i blodet, som parasitter erytrocytter må passere gjennom drenering lymfeknuter i bukhulen å nå blodet. Dette gjør en IP-injeksjon en indirekte levering rute for å injisere et nøyaktig antall parasitter i blodet. Derfor foretrekkes IV-ruten, siden den leverer nøyaktige parasitt doser direkte inn i blodbanen, som vist i Figur 3 og beskrevet i representative resultater.
2. fastsettelse av blod-stadium parasitt Load for seksuelle og aseksuell stadier
Merk: I denne delen, standardisert fenotypiske evalueringsmetoder for malaria parasitten blod stadier er oppført. Disse metodene er nyttige i evalueringen av romanen antimalariamidler eller vaksine kandidater eller til og med Gen knockout på seksuelle og aseksuell stadier utvikling i samme eksperimentelle mus. Av notatet, p. chabaudi og P. vinckei er også svært rasjonelle og viktige alternative alternativer for disse typer analyser, spesielt i narkotika screening.
- Bestemmelse av parasitemia av aseksuell stadier og mannlige vs. kvinnelige Gametocytes av Giemsa-farget tynne blod flekker for parasitt vekst analyser
- Bruk en 26 G eller 27-G nål, stikk musen hale og samle blod dråpe på et mikroskop lysbilde. Bruk den korte kanten av et annet mikroskop lysbilde til raskt å smøre blodet over hele lysbildet.
- Fest lysbildet med 100% metanol i minst 1 min, først etter at blodet har tørket helt på lysbildet. Beis i 10% Giemsa for 10-15 min. vask lysbildet med enkelt-eller dobbelt destillert vann og la det tørke.
- Les lysbildet ved hjelp av et 100-mål og olje nedsenking under et lett mikroskop. For en nøyaktig parasitemia måling, sjekk minst totalt 6 000 erytrocytter, som kan fås ved å telle minst 30 eller 40 mikroskopiske nett med et gjennomsnittlig antall 200 eller 150 erytrocytter (RBC) per rutenett, henholdsvis. Tell det totale antallet RBC i det første og siste rutenettet for å bestemme det gjennomsnittlige antallet røde blodceller for alle rutenett.
- Tell totalt antall infiserte erytrocytter per rutenett. Mannlige og kvinnelige gametocytes kan telles separat for å bestemme gametocytemia, men bør også inkluderes i det totale antallet parasitemia.
- Bestem den totale parasitemia prosenten ved å dele det totale antallet parasitter erytrocytter på det totale antallet RBC observert. Multipliser dette tallet med 100 for å bestemme parasitemia prosenten.
- Bestem gametocytemia ved å dele det totale antallet gametocytes som telles med det totale antallet RBC observert. Multipliser dette tallet med 100 for å bestemme gametocytemia prosenten per mus.
Merk: Den eneste pålitelige metoden for differensiering mellom ulike aseksuell og seksuelle blod stadier er bruken av et mikroskop for å evaluere Giemsa-farget tynt blod flekker, som hver av stadiene har forskjellige morfologi, med unntak av umodne gametocytes, som er for det meste skilles fra aseksuell blod etapper.
- Bestemmelse av blod-trinns parasitemia ved flyt flowcytometri for fluorescerende reporter protein-uttrykker WT-lignende parasitt stammer
- Merk to mikrosentrifugen rør for hver muse prøve, og angi ett rør for en 1:1000-fortynning og den andre for en fortynning på 1:2000. Tilsett 1,5 μL av 1x heparin til 1:1000 fortynning tube.
- Bruk en 26 G eller 27 G nål, stikk musen hale og overføre 1,5 μL av blod til røret som inneholder 1,5 μL av 1x heparin (1:1000 fortynning tube). Bland blodet og 1x heparin forsiktig sammen ved pipettering opp og ned.
- Tilsett 1 497 μL av RPMI medium til mikrosentrifugen røret, og Pipetter opp og ned for å blandes godt.
- Overføring 500 μL av blandingen fra 1:1000 fortynning tube til 1:2000 fortynning tube. Tilsett 500 μL av RPMI medium til 1:2000 rør og bland forsiktig ved å pipettering opp og ned.
- Følg produsentens aktuelle oppstarts protokoll for strømnings flowcytometer. Kjør prøvene på en langsom strømningshastighet og angi deteksjon for minst 20 000 hendelser.
Merk: Det er et alternativ praktisk analyse for å måle parasitemia via tricolor FACS sortering, om parasitter uttrykke fluorescerende markører eller ikke34. Men analysen beskrevet her tilbyr et nøyaktig mål på parasitemia i live parasitter uten tilsetning av DNA-bindende fargestoffer og bruk av FACS sortering.
- Bestemmelse av exflagellation rate av mannlig kjønnscellene per mikroliter av infisert musen blod
- Forbered en 1:10 fortynning mikrosentrifugen rør med 40 μL av ufullstendige ookinete medium (RPMI + natrium bikarbonat + hypoxanthine + xanthurenic syre) og 5 μL av 1x heparin.
- Bruk en 26 G eller 27 G nål, stikk musen hale og overføre 5 μL av blod (ved hjelp av en micropipette) raskt til røret som inneholder ufullstendige ookinete Media + heparin. Bland forsiktig og Last 12 μL av 1:10 blod fortynnings rør på en hemocytometer og la den ligge ved romtemperatur (20-24 ° c).
- Start telling av exflagellation hendelser 9-10 min etter utarbeidelse av 1:10 fortynning. Bruk en fase kontrast lys mikroskop med 40x forstørrelse.
- Multipliser gjennomsnittlig antall exflagellation hendelser telles med 10 og deretter multiplisere med fortynning faktor (10) for å bestemme gjennomsnittlig antall exflagellation per mikroliter av infisert blod.
Merk: Denne analysen måler antall mannlige Kjønnscelle exflagellation hendelser i et 1 μL volum av blod, som kan kvantifisert ved hjelp av en hemocytometer. En ufullstendig ookinete medium18 er blandet med blodet for å tett etterligne forholdene der exflagellation oppstår inne i mygg midttarm kort tid etter en blod måltid.
3. isolering og bearbeiding av blod-Stage parasitter fra infiserte erytrocytter og Frozen lager forberedelse
- Terminal blødning av infiserte gnagere ved hjerte punktering
- Forbered en 26 G nål sprøyte som inneholder ca ≤ 20 μL av 1x heparin (200 enheter/mL) for å samle blodet til giver musen ved hjerte punktering.
- Bruk en langsom strøm av CO2 til euthanize musen før blødning. Alternativt, bedøve musa med isoflurane (som må opprettholdes før og under huden snitt for å avdekke hjertet).
- Lay musa på ryggen og PIN ned sin vedheng. Lag et lite snitt i huden nær bunnen av brystbenet ved å trekke opp huden med pinsett og klippe den med saks. Trekk huden fra hverandre på stedet av snittet for å avdekke membranen og toppen av bukhulen.
- Hold bunnen av ribbeinet buret med tang og skjære gjennom membranen for å gå inn i bryst hulen; Vær forsiktig så du ikke skader hjertet eller lungene. PIN tilbake ribbeinet buret for å avdekke hjertet.
- Forsiktig punktering av hjertet og sakte trekke opp på sprøyten stempelet å samle ~ 1 mL blod og overføre den til en mikrosentrifugen tube.
- Utarbeidelse av frosne aksjer fra infisert blod
- Bleed musene (se avsnitt 3,1) med blod parasitemias som er mellom ca 2% og 5%, med en betydelig mengde ring stadier og ikke så mange gametocytes.
- Bland den ønskede delen av blod med frysing løsning (10% glyserol i Alsever ' s løsning) i en 1:2 ratio og lagre i kryogene hetteglass. Frys i flytende nitrogen.
- Isolering og rensing av blod-scene parasitter for utvinning av DNA, RNA, og proteiner
- Bleed mus (se avsnitt 3,1) med blod parasitemias som er høyere enn 0,5%.
- Klargjør en 10 mL sprøyte ved å fjerne stempelet og sette inn en liten bomullspinne. Pakk ned bomull til bunnen av sprøyten. Fyll den med cellulose til nivået av cellulose når 3 mL-merket, men ikke overstiger 4 mL-merket på sprøyten.
- Fest sprøyten i et klips på et ringstativ, og Plasser et avfalls innsamlings rør under. Tilsett 5 mL PBS i sprøyten og la den strømme gjennom i avfalls røret.
- Forbered frosne aksjer ved behov, med bare 100-300 μL av blod. Tilsett resten av det infiserte blodet (400-700 μL) til kolonnen. Samle flyte gjennom med et avløpsrør til dråpene begynner å bli rød. Når dråpene begynner å bli røde, Plasser en ny 14-mL samling rør under sprøyten for å samle strømmen gjennom.
- Når flyten begynner å avta, Legg PBS til sprøyten og samle strømmen gjennom i 15 mL røret til et totalt volum på 14 mL er nådd. Samle de resterende strømme gjennom med et avfalls rør.
- Sentrifuger 14 mL rør med blod/PBS blanding for 8 min ved 250 x g uten bremser. Fjern supernatanten og tilsett 14 mL kjølt saponin (50 mg saponin i 50 mL PBS). For å løsne pellet, invertere røret flere ganger og Vortex om nødvendig.
- Sentrifuger røret i 8 min ved 1 217 x g uten bremser. Fjern supernatanten, etterlot ca 0,5 mL av løsningen over pellet.
- Resuspend pellet i løsningen ved hjelp av en micropipette og overføre den til en mikrosentrifugen tube. Tilsett 500 μL av PBS til 14 mL rør for å vaske eventuelle rester av parasitter som er igjen i slangen. Legg dette til det samme mikrosentrifugen røret.
- Sentrifuger røret i 2 min ved 6 010 x g. Fjern supernatanten og resuspend 1 mL PBS. Sentrifuger for 2 min ved 9 391 x g.
- Fortsett å trekke ut genomisk DNA, total RNA og protein.
- For GENOMISK DNA-ekstraksjonmå du fjerne supernatanten og resuspend pellet i 200 ΜL av PBS, og deretter følge enhver passende protokoll for gDNA-ekstraksjon.
- For Total RNA-ekstraksjon, Fjern supernatanten, resuspend og Vortex pellets i 1 ml av en hvilken som helst fenol-og guaniniumtiocyanat isothiocyanate løsning eller annen egnet reagens, og følg deretter enhver passende protokoll for total RNA-ekstraksjon.
- For Total protein ekstraksjon, Fjern supernatanten, resuspend pellet i et passende volum på 6 ganger natrium natriumdodecylsulfat SULFAT (SDS)-loading fargestoff eller andre egnede reagens og, deretter følger enhver passende protokoll av total protein behandling.
4. Mosquito infeksjon analyser
Merk: Myggen er den primære vert for malariaparasitter der seksuell reproduksjon finner sted. Infeksjonen av mus å overføre malariaparasitter til mygg er utført av en IV injeksjon av minst 1 000 000 blodprøver, etterfulgt av fôring en infisert mus (fra hver genotype som viser den høyeste mannlige Kjønnscelle exflagellation rate) til Anopheles mygg i bur på dag 3 etter mus-infeksjon. INTRAVENØS injeksjon med 1 000 000 blod-trinns parasitter i phenylhydrazine mus vil sikre utviklingen av mannlige og kvinnelige gametocyte på en raskere og høyere hastighet. Mygg infisert med p. yoelii og p. berghei er inkubert ved 24 ° c og 20-21 ° c, henholdsvis for å muliggjøre best mulig mygg stadier utvikling6.
- Mosquito fôring og bestemmelse av antall ookinetes per mygg
- Sulte voksen hunn Anopheles stephensi eller A. gambiae mygg (4-7 dager gammel) for 8-12 h før fôring. Tillat voksen mygg å mate i minst 15 minutter på den infiserte anesthetized mus (injisert med en passende dose av ketamin/xylazine) med høyest exflagellation rate (målt i avsnitt 2,3).
Merk: Ketamin/xylazine arbeids løsning er utarbeidet av 1:5 fortynning av lager løsningen i saltvann og IP sprøytebruk 100 μL per mus. For en 10 mL lagerløsning tilsettes 1 mL xylazine (100 mg/mL) til 9 mL ketamin (100 mg/mL). - Fjern unfed kvinnelige mygg og mannlig mygg med munnen aspirator.
- På 18-20 h postfeeding, samle 20-30 mygg og legg dem i fryseren for ikke mindre enn 10 min for å sikre døden. Benytter en kikkert disseksjon omfang, analysere ut 20-30 blod-fylte midguts med 2 26 G eller 27 G nål eller en nål og tang inne RPMI eller PBS disseksjon medium og forflytning det midguts å en mikrosentrifugen rør inneholder 200 μL av RPMI eller PBS (for disseksjon metoden Vennligst se avsnitt 4,3).
- Sentrifuger oppsamlings røret i 1 min ved 700 x g. Grind pelleted midguts ved hjelp av en morter. Gjenta dette trinnet.
- Overfør 50 til en ny mikrosentrifugen tube fra midguts til et nytt rør. Tilsett 200 μL av RPMI eller PBS for å lage en 1:5 fortynning.
- Overfør 12 μL til en hemocytometer og ruge den ved romtemperatur i 5 min for å tillate at innholdet blir avgjort.
- Bestem gjennomsnittlig antall ookinetes ved å bruke et lett mikroskop med en fase kontrast og 40x forstørrelse.
- Multipliser gjennomsnittlig antall modne ookinetes med 10 og deretter av fortynning faktor på 5 for å bestemme gjennomsnittlig totalt antall ookinetes.
- Dividere gjennomsnittlig antall ookinetes med antall blod-matet mygg dissekert å bestemme antall ookinetes per blod-matet mygg.
- Sulte voksen hunn Anopheles stephensi eller A. gambiae mygg (4-7 dager gammel) for 8-12 h før fôring. Tillat voksen mygg å mate i minst 15 minutter på den infiserte anesthetized mus (injisert med en passende dose av ketamin/xylazine) med høyest exflagellation rate (målt i avsnitt 2,3).
- Bestemmelse av antall tidlige oocyster for fluorescerende reporter protein-uttrykker WT-lignende parasitt stammer
Merk: Målet med denne analysen er å bestemme antall levende parasitter uttrykker grønne fluorescerende protein (GFP) som etablerte en full infeksjon av mygg midguts og dannet tidlig sfærisk oocyster. Denne analysen avgjør om ookinetes (deres utvikling anslått i forrige analysen) fullførte sine funksjoner ved traversering gjennom mygg midttarm epitelceller og transformasjon til tidlig oocyster på basal lamina siden av midttarm prolifererende eller ikke. Dette er en annen analysen som gjør stor bruk av parasitter uttrykker GFP, som teller tidlig oocyster på dette stadiet vil være nesten umulig uten kjedelige immunostaining.- Analysere midguts (se Seksjon 4,1) av 20-30 blod-matet mygg, på dag 3 eller 4 post-mygg-mating (PMF) for P. yoelii 17X-nl, og på dag 6 eller 7 PMF for P. berghei ANKA, med 2 26 G eller 27 G nåler eller en NÅL og tang i RPMI eller PBS disseksjon m edium (for disseksjon-metoden kan du se avsnitt 4,3).
- Spre 40-50 μL av disseksjon medium på den horisontale midtlinjen av den lengre kanten av glass raset. Overfør midguts til denne linjen, én om gangen, under disseksjon, og Legg til mer medium i midguts, hvis nødvendig, for å unngå uttørking.
- Plasser en dekkglass forsiktig på dissekert midguts, og forsegle den med neglelakk.
- Ved bruk av 10x eller 20x mål for fluorescens mikroskop med det grønne fluorescens filteret, telle antall tidlige oocyster på hver midttarm, i minst 20 midguts.
- Fastsettelse av antall oocyst sporozoitter per mygg
- Analysere midguts på minst 20-30 mygg med 2 26-G eller 27-G nåler eller en nål og tang i RPMI eller PBS disseksjon medium og samle dissekert midguts i 200 μL av RPMI.
- Hold de nedre mage segmentene godt på plass med en nål (eller pinsett) og skyv thorax forsiktig oppover med den andre nålen i krysset mellom thorax og buken. Gjør nøye korte presser til thorax skiller fra magen. Så snart separasjon starter den hvite midttarm vises strukket, og deretter midttarm vil bli kuttet fra spiserøret slutt ved hjelp av den samme nålen som ble brukt til å skille thorax. Hvis den fortsatt er festet til magen, kan den samme nålen brukes til å trekke midttarm bort fra magen. Overfør midguts av alle mygg til samlingen røret ved å samle dem fra mediet med en nål, en om gangen.
- Sentrifuger samlingen røret i 1 min ved 700x g å bosette midguts til bunnen av samlingen røret og male dem med en morter. Gjenta dette trinnet.
- Overfør 12 μL til en hemocytometer og ruge den ved romtemperatur i 5 min for å la innholdet bosette seg.
- Tell oocyst sporozoitter med et 40X mål om et lett mikroskop. Bruk 1:5 og/eller 1:10 fortynninger hvis mygg rusk hindrer nøyaktig telling av sporozoitter eller hvis antall sporozoitter er for høy til å telle nøyaktig.
- Beregn gjennomsnittlig totalt antall oocyst sporozoitter ved å multiplisere gjennomsnittlig antall sporozoitter med 10 og deretter multiplisere dette tallet med den fortynningsfaktoren, om noen, og av det totale volumet (200 μL).
- Dividere gjennomsnittlig totalt antall sporozoitter med antall mygg dissekert å beregne gjennomsnittlig antall oocyst sporozoitter per mygg.
Merk: En vanlig feil for å måle suksess eller produktivitet av mygg stadier infeksjon er telling av antall oocyster på senere stadier av oocyst utvikling. Dette er på grunn av noen oocyster blir vacuolated på senere tidspunkt poeng av oocyst utvikling, og andre unnlater å utvikle sporozoitter, selv på samme midttarm. Den beste og mest pålitelige metoden for å bestemme produktiviteten av mygg stadier infeksjon er telling av gjennomsnittlig antall midttarm oocyst sporozoitter på dager 10-12 post-mygg-infeksjon for P. yoelii og på dager 12-14 post-mygg-infeksjon for P. berghei.
- Fastsettelse av antall spyttkjertel sporozoitter per mygg
Merk:Den ultimate evalueringen av full gjennomføring av mygg stadier utvikling oppnås ved å estimere antall sporozoitter som invaderte spyttkjertel, som er smittsomme og smittsomme stadier for å virveldyr. Invasjonen av spyttkjertelen er etablert etter ferdigstillelse av oocyst sporozoite utvikling, utgående inn i hemolymph, vedlegg til basal lamina av spyttkjertel acinar celler, og traversering av acinar celler for å nå spyttkjertler Kanaler5. Derfor er denne analysen også en evaluering av suksessen til alle disse prosessene eller ikke. Likevel, en estimering av hemolymph sporozoite tall ville tillate differensiering mellom defekter i utgående fra oocyster og defekter i invasjonen av spyttkjertler35. Rensing av spyttkjertel sporozoitter gjør det mulig å gjennomføre flere funksjonelle analyser på sporozoite motilitet og invasjon fenotyper. Spyttkjertel sporozoitter kan også brukes til in vivo infeksjon av mus og i immunisering studier36,37. Videre er de mest reproduserbar stadier tilgjengelig for å etablere en in vitro lever scene invasjon eller en utvikling analysen er ved bruk av spyttkjertel sporozoitter.- Analysere spyttkjertler 50-100 kvinnelige mygg, på dager 14-16 PMF for p. yoelii og ved dager 17-20 PMF for p. berghei, fortrinnsvis med 2 26 g eller 27 g nåler, i RPMI eller DMEM medium holdt på isen og supplert med 5% FOSTERETS storfe serum (FBS) eller/storfe serum albumin (BSA) for p. yoelii sporozoitter eller 3% FBS/BSA for p. berghei sporozoitter. Hvis sporozoitter skal brukes i hepatosarkom in vitro-analyser, tilsett 1% penicillin/Streptomycin til det disseksjon mediet. Det er generelt to metoder for Disseksjon av Spyttkjertlene. Den første metoden er tidkrevende, men fører til Disseksjon av spyttkjertler med svært lite eller ingen forurensende vev. Den andre metoden er mindre tidkrevende, men fører til innsamling av en betydelig mengde forurensende vev. Den første metoden er beskrevet her.
- Hold øvre magen segmenter på plass med den skrå siden av en nål og forsiktig Skyv hodet veldig lett (i svært korte skyver) i krysset mellom hodet og thorax i en oppadgående retning til hodet er nøye adskilt fra thorax uten rive opp glassaktig spyttkjertler, er eksponert spyttkjertler deretter skilt fra hodet med den samme nålen som dyttet hodet oppover.
- Den dissekert spyttkjertel vil bli hevet fra disseksjon medium ved hjelp av et kort glass Pasteur pipette.
- Når alle Spyttkjertlene har blitt dissekert og høstet, vil talentet plassere røret som inneholder midguts inn i sentrifuge (1min, 700 x g).
- Tell sporozoitter ved hjelp av en hemocytometer under et lys mikroskop satt til fase 2 kontrast og 40x forstørrelse. Hvis nummeret på mygg dissekert ≥ 40, fortynne Spyttkjertlene til 1:5 eller 1:10, avhengig av forventet infectivity yield (bestemmes i tidligere analyser).
- Multipliser gjennomsnittlig antall sporozoitter med 10 og fortynning faktor (hvis noen). Multipliser med det totale volumet for å bestemme gjennomsnittlig antall spyttkjertel sporozoitter. Dividere med antall dissekert kvinnelige mygg for å bestemme gjennomsnittlig spyttkjertel sporozoitter per mygg.
Merk: Problemet med Disseksjon av Spyttkjertlene er deres lille størrelse og glassaktig transparent utseende. Dermed er det svært vanskelig å isolere spyttkjertler og derfor er de vanligvis dissekert ut som et engangsbeløp med andre vev fra frontal delen av thorax, som også er viktig å beskytte Spyttkjertlene fra brudd under samlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen med å anvende omvendt genetiske verktøy og teknikker for å malariaparasitter har revolusjonert feltet av malaria forskning, med mulighet til å legge til, slette eller endre bestemte genomisk segmenter av flere Plasmodium arter39. Viktigere, unnværlig genomisk Loci har blitt identifisert og brukt med hell å innføre fluorescens protein markører i gnager og menneskelig malariaparasitter ved dobbel homologe rekombinasjon, for å sikre et stabilt uttrykk i alle livssyklus stadier40 ,41,42. Et eksempel på disse WT-lignende transgene parasitter er Py230p (-) parasitter, som har blitt generert i laboratoriet vårt, og viste ingen åpenbar feil i utviklingen av blod og mygg livssyklus etapper15,16, 17. disse transgene reporter parasitter uttrykt eGFP, under kontroll av den sterke og konstituerende formidler av PyHSP70, i blod stadier (figur 1a) ookinetes (figur 1B), unge oocyster (figur 1C ) på Anopheles stephensi midguts, og i sporozoitter isolert fra Spyttkjertlene i Anopheles Stephensi kvinner (figur 1d). Dermed gjorde eGFP-uttrykker blod parasitter det mye enklere og mindre tidkrevende å evaluere blod trinns parasitemia ved hjelp av strømnings flowcytometri mellom ulike genotyper av transgene parasitter eller mellom narkotika-behandlet og-ubehandlet i narkotika-målretting analyser ved hjelp av transgene reporter parasitter.
For å bekrefte at det ikke er noen kvantitativ forskjell mellom bruk av strømnings flowcytometri og den mer kjedelige parasitemia estimering av mikroskopi, ble eGFP-uttrykker Pyp230p (-) brukt til å estimere prosentandelen av parasitter erytrocytter ved Flow flowcytometri og av Giemsa-farget tynt blod flekker i en gruppe av sveitsiske Webster mus IV-smittet med 10 000 parasitter erytrocytter. Strømnings flowcytometri parasitemia% verdier tilsvarte direkte den estimerte parasitemia% ved å overvåke Giemsa tynne blod flekker, som ble estimert av to ekspert forskere (figur 2). Dette representerer et mer nøyaktig alternativ til den kjedelige og utsatt-til-menneske-feil metode for mikroskopi i fastsettelse av vekstraten av blod-scenen parasitter.
Et viktig avvik knyttet til infeksjon av gnagere med malariaparasitter blodprøver er valg av ruten for smitte, med en sterk preferanse i litteraturen for IP i forhold til IV ruten av smitte, som det er mindre tidkrevende. For å sammenligne disse to veiene av smitte, to grupper på fem BALB/c mus ble smittet med 1 000 eGFP-uttrykker Pyp230p (-) parasitter erytrocytter per mus, enten gjennom IV eller IP ruter. Parasitemia ble overvåket daglig ved bruk av strømnings flowcytometri i en periode på 4 dager. En statistisk signifikant reduksjon i den IP-infiserte gruppen parasitemia% sammenlignet med den IV-infiserte gruppen ble notert på alle dager som ble testet (Figur 3). Dette gir bevis for at IV-smitte rute er en mer kvantitativt nøyaktig ruten av smitte for analyser med malaria parasitten blod stadier.
Likevel, en begrensning til bruk av Flow flowcytometri å evaluere blod-scenen parasitemia er differensiering mellom seksuelle og aseksuell stadier og mellom mannlige og kvinnelige gametocytes. Derfor er estimering av prosenter av hver av de ulike aseksuell og seksuelle stadier (Figur 4) å avhenge av en morfologi evaluering av Giemsa-farget tynne blod flekker. Til tross for den tilsynelatende forskjellige morfologi av modne mannlige og kvinnelige gametocytes (Figur 4), umodne seksuelle stadier er ofte umulig å skille fra aseksuell stadier.
En viktig funksjon av den mannlige kjønnscellene upon fremveksten av mannlige gametocyte i mygg midttarm er den mannlige Kjønnscelle exflagellation, som er et svært kritisk skritt i overføringen som må skje i løpet av en svært kort tidsperiode. Variable metoder som brukes til å evaluere dette i mange forskjellige systemer har blitt beskrevet. Heri, viser vi en standardisert metode som kan gjentas i noen enkel Lab innstilling. Vi evaluerte mannlig Kjønnscelle exflagellation med eller uten injeksjon av phenylhydrazine til mottaker mus (figur 5). Vi kan vise at phenylhydrazine behandling betydelig (fire fold) økte frekvensen av mannlige Kjønnscelle exflagellation, som igjen vil øke befruktning rate og antall alle etterfølgende mygg etapper.
Figur 1 : Utviklingen av P. yoelii p230p (-) parasitter constitutively uttrykker eGFP i blod og mygg stadier. (A) bilde av blandet blod-scene parasitter (1, 000X forstørrelse). (B) bilde av Ookinete (400X forstørrelse). (C) bilde av en Anopheles stephensi Mosquito midttarm smittet med dag 4 PMF tidlig oocyster av Live p230p (-) parasitter uttrykker eGFP (100-forstørrelse). (D) dette panelet viser et levende bilde av en P. yoelii p230p (-) spyttkjertel sporozoite, dissekert ut på dag 15 PMF, uttrykker eGFP (400X forstørrelse). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flow flowcytometri og mikroskopi evalueringer av gjennomsnittlig blod-Stage parasitemia av P. yoelii p230p (-) parasitter er ikke signifikant forskjellig. En gruppe på fire sveitsiske Webster-mus ble intravenøst smittet med 10 000 parasitter erytrocytter av Pyp230p (-) per mus og den gjennomsnittlige blod-scenen parasitemias% ble registrert daglig i 7 dager ved flyt flowcytometri og ved mikroskopisk evaluering av Giemsa-farget tynt blod flekker fra totalt 20 000 og ~ 6 000 erytrocytter, henholdsvis. Den mikroskopiske undersøkelse resultatene som vises er gjennomsnittet av to målinger av to ekspert forskere per lysbilde, og tiden for evaluering av parasitemia av hvert lysbilde var minst 10 minutter av hver forsker. Ingen vesentlige forskjeller kan oppdages på noen av dagene som vises her. Middelverdiene for alle parasitt stammer ble analysert med den tosidige t-testen. Feilfeltene representerer standardavviket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : En intravenøs injeksjon av P. yoelii p230p (-) parasitter gir signifikant forskjellig blod-Stage parasitemia fra en intraperitoneal injeksjon. To grupper på fem BALB/c mus ble smittet med 1 000 parasitter erytrocytter av Pyp230p (-) per mus, enten gjennom intravenøs eller intraperitoneal rute, og den gjennomsnittlige blod-scenen parasitemias% ble registrert daglig for 4 dager ved flyt flowcytometri fra totalt 20 000 erytrocytter. En statistisk signifikant reduksjon (merket med en stjerne) av blod-trinns parasitemia kan oppdages for alle dager som testes i intraperitoneal rutegruppe sammenlignet med den intravenøse rutegruppen. Middelverdiene for alle parasitt stammer ble analysert med den tosidige t-testen. Feilfeltene representerer standardavviket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Morfologi av P. yoelii Gametocytes i en Giemsa-farget tynn blodprøve. Et bilde av en Giemsa-farget tynn blodprøve (1, 000X forstørrelse) av en sveitsisk Webster mus infisert med WT P. yoelii 17X-nl belastning viser de typiske blåaktig fargede kvinnelige gametocyte på venstre side (betegnet med en pil) og rosa fargede mannlige ( merket med en stjerne) gametocyte på høyre side av bildet. De andre stadiene som vises er aseksuell blodprøver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Effekten av phenylhydrazine på mannlig Kjønnscelle exflagellation. Effekten av phenylhydrazine injiseres i mottaker mus 5 dager før den mannlige Kjønnscelle exflagellation rate estimering av P. yoelii. Phenylhydrazine signifikant øker frekvensen av mannlige Kjønnscelle exflagellation, noe som fører til en høyere mygg stadier infeksjon etter mygg-fôring. Middelverdiene for alle parasitt stammer ble analysert med den tosidige t-testen. Feilfeltene representerer standardavviket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for likheten i den generelle biologi av deres liv sykluser til at av menneskelig malariaparasitter, mus malaria modeller har også mange dissimilarities til menneskelige Plasmodium arter som ville begrense bruken som pålitelig in vivo -modeller. For eksempel, med unntak av Live-dempes parasitter som vaksiner, alle vaksine studier med delenhet og DNA og andre vaksiner ga gode resultater i muse modellen, men hos mennesker som bor i endemiske områder, resultatene var langt fra tilfredsstillende.
En annen problem er forskjellen av livet syklus scene infectivity fra ettall musen belastning å en annen, og en gang imellom fra ettall dyr Vendor å en annen for det likt musen belastning. Videre er de viktigste to gnager malaria arter som er mye brukt som foretrukket in vivo malaria modeller, p. berghei og p. yoelii, ikke viser en synkron blod-scene syklus, som er helt forskjellig fra alle menneskelige malaria parasitten. Men fordelene ved å bruke musen malariaparasitter som in vivo -modeller oppveier langt disse dissimilarities, som også kan overvinnes ved mer dyptgående analyser av molekylære stasjoner av disse begrensningene. Likevel, disse begrensningene er for det meste vises av gnager malaria blod-scenen parasitter, men ikke så mye for de andre livssyklus stadier av malaria parasitten.
Selv om blodprøvene er viktige for ulike vaksine, narkotika målretting, immunologi og funksjonelle genomisk studier, er det en knapphet på standardiserte metoder og protokoller som konsentrerer seg om phenotypical analyse og funksjonelle analyser som involverer gnager malaria parasitt blod-scene parasitter, med mer fokus på mygg overføring og transfeksjoner protokoller. Derfor metodene i denne artikkelen vil bidra til å gi standardiserte og forenklede protokoller for å studere de patogene stadiene av gnager malariaparasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Ahmed ALY er støttet av midler til Bezmialem Vakif University fra den tyrkiske departementet for utvikling stipend 2015BSV036, og ved finansiering gitt av Tulane University School of Public Health og Tropical Medicine, og ved finansiering fra NIH-NIAID for R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
