Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Published: May 30, 2019 doi: 10.3791/55688
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 2, 2, 2
1Beykoz Institute of Life Sciences and Biotechnology, Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey, 2School of Public Health and Tropical Medicine, Department of Tropical Medicine, Tulane University

Summary

İnsan sıtma parazitlerine kemirgen sıtma parazitlerinin yaşam döngüsü ve biyolojisinin çarpıcı benzerlikleri nedeniyle, kemirgen sıtma modelleri sıtma araştırmaları için vazgeçilmez hale gelmiştir. Burada, vahşi tip ve transgenik kemirgen sıtma türlerinin fenotipeksi analizinde kullanılan en önemli tekniklerden bazılarını standardize ettik.

Abstract

Genetik ve sistem biyoloji teknolojilerinde yapılan son gelişmeler, sıtma parazitlerinin biyoloji anlayışımızı moleküler düzeyde teşvik etmiştir. Ancak, aşı ve kemoterapi gelişimi için etkili Sıtma paraziti hedefleri hala sınırlıdır. Bu büyük ölçüde insan Plasmodium türleri için ilgili ve pratik in vivo enfeksiyon modellerinin olmaması nedeniyle, en önemlisi p. falciparum ve p. vivaxiçin. Bu nedenle, kemirgen sıtma türleri yaygın olarak sıtma aşısı, ilaç hedefleme, bağışıklık tepkisi ve korumalı Plasmodiumspp. genes fonksiyonel karakterizasyon çalışmaları için pratik alternatif olarak vivo modeller olarak kullanılmıştır. Nitekim, kemirgen sıtma modelleri, özellikle sivrisinek iletim ve karaciğer sahne biyoloji keşfetmek için, paha biçilemez olduğu kanıtlanmıştır ve immünolojik çalışmalar için vazgeçilmez idi. Ancak, transgenik ve vahşi tip aseksüel ve cinsel kan aşamasında parazitlerin fenotipleri değerlendirmek için kullanılan yöntemlerle farklılıkları vardır. Bu tutarsızlıkları örnekleri kan-sahne parazitleri ve erkek gamet exflagellation değerlendirilmesi ile kemirgenler intravenöz vs intraperitoneal enfeksiyon seçimdir. Burada, haberci-geni veya vahşi tip kemirgen Sıtma paraziti türlerini ifade eden transgenik parazitlerin aseksüel ve cinsel kan aşamalarında fenotipleri değerlendirmek için standartlaştırılmış deneysel yöntemler ayrıntılarıyla. Ayrıca, Anopheles sivrisinek vektörler içinde Sıtma paraziti sivrisinek aşamalarının (gametes, ookinetes, oocysts ve sporozoites) fenotipleri değerlendirmek için yöntemler ayrıntılarıyla. Bu yöntemler ayrıntılı ve burada p. berghei ve p. yoelii ölümcül ve ölümcül olmayan suşları için Basitleştirilmiş ama aynı zamanda p. chabaudi ve p. vinckei kemirgen sıtma türleri bazı ayarlamalar ile uygulanabilir.

Introduction

Sıtma parazitleri insanlar dünya çapında sıtma enfeksiyonları yüzlerce milyonlarca neden, 600.000 ' den fazla ölüm her yıl1. İnsan enfeksiyonları beş Sıtma paraziti türünün neden olduğu, yani p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariae, ve p. knowlesi. Çoğu klinik sıtma mortaliteleri, Sahra-altı Afrika 'da P. falciparum 'dan kaynaklanır1. Sahra-altı Afrika dışında geniş dünya çapında morbiditelerin neden olduğu başka bir insan Sıtma paraziti türü P. vivax2' dir. Diğer üç tür daha coğrafik olarak sınırlıdır ve ölümcül P. knowlesi3hariç, benign sıtma enfeksiyonlarına neden olmaktadır. Enfeksiyonların ilgili ve pratik olmayan-insan içinde vivo modellerin bulunabilirliği her zaman olmuştur ve hala sıtma aşısı ve ilaç gelişimi için bir engeldir. Daha önce sıtma ilaç hedefleme ve metabolik çalışmalar, sırasıyla4tavuk ve ördek enfekte p. gallinaceum ve p. lophuraegibi kuş sıtma modellerinde kapsamlı olarak güvendi. Bundan sonra, kemirgen sıtma türleri kademeli olarak çeşitli aşılar ve ilaç hedefleme çalışmalarında in vivo modelleri olarak tanıtıldı. Yıllar içinde, biyoloji ve ev sahibi-parazit etkileşimlerini insan sıtma türleri için kemirgen sıtma modellerinin yaşam döngüsü aşamalarında benzerliklerin kanıtı birikmiştir.

Özellikle, kemirgen sıtma modelleri sivrisinek ve ön eritrositik aşamaların biyolojisini keşfetmek ve karakterize etmek için son derece önemliydi5. Ancak, dört kemirgen sıtma türü vardır (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, ve p. vinckei) farklı biyolojik özelliklere sahip, en önemli olan kan aşamalarında6. Kemirgen sıtma türleri kan aşamalarında eşzamanlılık farklıdır, p. chabaudi ve p. vinckei suşlarının kan aşamaları çoğunlukla senkron, p. berghei ve p. yoelii kan aşamaları6 değildir iken , 7. başka bir önemli fark, bazı suşları (örn., p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65 ve p. vinckei lentum) meydana gelen kan aşamalarının Self-boşluk, diğer kan enfeksiyonu ise aynı türlerin suşları (p. yoelii 17x-L, p. berghei Anka, ve p. chabaudi as) tedavi edilmemiş sol ölümcül olabilir. Dahası, p. yoelii 17x-nl strain ve p. berghei Anka gerinim tercihen retikülositler istila8,9,10,11, bu özellikleri rağmen P. yoelii ve P. berghei suşları sıkı bir büyüme gereksinimi12,13,14değildir. Bu nedenle, fareler, p. berghei Anka gerinim ve p. yoelii için bir sivrisinek enfeksiyonu için gerekli olan parasitemia ve gametocytemia artırmak için bu parazitlerin kan aşamaları ile enfeksiyondan önce fenilhidrazinsülfonik ile tedavi edilir 17x-nl15,16,17,18,19.

Sivrisinek aşamaları gelişimi farklılıkları da farklı kemirgen sıtma türleri arasında var, en önemli sıcaklık ve zaman optimum sivrisinek aşamaları gelişimi ve sporozoit uzunluğu için gerekli olan5,6, 20' ye kadar. Kemirgen sıtma türlerinin ön eritrositik aşamalarında, farklılıklar bulaşıcı sporozoit aşı en duyarlı kemirgen türler ve gerinim dahil, duyarlı kemirgen gerinim içinde aşı için gerekli sporozoitler sayısı, In vitro karaciğer sahne gelişimi için gerekli olan memelinin hücre tipleri ve karaciğer sahne gelişimini tamamlama zamanı5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

Bu değişkenlere rağmen, kemirgen sıtma parazitleri ters genetik yaklaşımların uygulanması için erken olumlu modeller vardı, çünkü onlar daha az zaman-ve başarı yüksek bir olasılık ile kaynak tüketen31. Aslında, kemirgen sıtma modelleri en iyi modeller vardı, ve birçok durumda sadece modelleri, işlevsel bir şekilde genleri sivrisinek ve karaciğer aşamalarında ifade niteleştirmek için kullanılabilir.

Kemirgen sıtma modellerinde ters genetik yaklaşımlar popülerlik ve amenability ışığında, farklı metodolojileri bir dizi transgenik parazitin yaşam döngüsü aşamalarında fenotipleri analiz etmek için kullanılmıştır, özellikle kan aşamaları. Ancak, bu metodolojilerin bazıları tutarsız; Örneğin, bir IP enjeksiyonu sonrasında kan-aşama parazitlerinin enfeksiyonlarını karşılaştırarak (muhtemelen periton lenf nodlarına boşaltılır ve oradan kan dolaşımına girebilir; bu nedenle, enjekte edilen parazitler kan dolaşımında eşit olarak sona ermez) , farklı sayıda seri kan-aşama transferleri veya G numarası ile klonların sivrisinek iletimi karşılaştırarak (hangi gametocytogenesis32etkileyebilir,33), ya da doğrudan saf vahşi tip (WT) transjenik parazitler karşılaştırarak Elektroporasyon ve pozitif ilaç seçimi ve erkek gamet exflagellation çeşitli standartlaştırılmış değerlendirmeleri maruz asla parazitler. Bu nedenle, kan içinde transgenik veya WT kemirgen sıtma parazitleri her türlü fenotipik analizi için takip etmek basit protokolleri standartlaştırmak etmek için çok önemlidir ve sivrisinek içinde kemirgen sıtma biyolojik varyasyon için karşılamak için parazit türleri.

Bu belgede, transjenik veya vahşi tip p. yoelii ve p. berghei parazitlerinin kan ve sivrisinek yaşam döngüsü aşamalarının fenotipik analizi için standardize edilmiş, detaylı deneysel bir protokol bildiriyoruz. Bu protokoller de p. chabaudi ve p. vinckei parazitleri için geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Tulane Üniversitesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin (ıAYUC) onaylı protokollerine ve Bezmialem vakif Üniversitesi hayvanlar etik komitesine göre yürütülmüştür. Diğer tüm deneysel protokoller ve rekombinant DNA kullanımı Tulane Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (ıBC) onaylı protokollere göre yürütülmüştür.

1. kan ile fareler enfeksiyon-sahne parazitler için Parasitemia analiz ve sivrisinek enfeksiyonu Assays

  1. Gün-3: alıcı fareler içine fenilhidazin isteğe bağlı enjeksiyon
    1. Bir 26 G iğne kullanarak outbred SW veya CD1 alıcı fareler (sivrisinek enfeksiyonu ve sivrisinek enfeksiyonu assays için kullanılacak fareler) intraperitoneal (IP) ile 100 μL fenilhidazin (50 mg fenilhidrazinsülfonik 5 ml 1x fosfat-tamponlu tuz (PBS)) enjekte Şırınga.
      Not: P. berghei ve p. yoeliisağlam sivrisinek enfeksiyonları için, fenilhidrazinsülfonik alıcı farelerde retikülositoz neden kullanılır, hangi parasitemia artar ve, daha sonra, gametanosit yüzdesi, ve önemli ölçüde Erkek gamet (Şekil 5), hem p. berghei ve p. yoelii suşları için daha iyi bir sivrisinek aşamaları enfeksiyon yol açacaktır exflagellation artırır15,16,17, 18 yaşınakadar.
  2. Gün-2: donör fareler içine dondurulmuş parazit stokları enjeksiyon
    1. Hızlı bir şekilde dondurulmuş stokları çözüyor ve hemen her bağışçı fare enjekte (tipik iki fare genotip başına) IP ile ~ 200 μL stok 26 G iğne şırınga kullanarak.
      Not: Kontrollü Vivarium ayarlarında her kafes için beş fare daha fazla barındırılıyor.
    2. 24 h postenfeksiyon sonra Giemsa-lekeli ince kan smear üzerinde bir 100x mikroskop amacı altında parasitemia kontrol başlatın. Giemsa-lekeli ince kan smear protokolünün 2,1 bölümünü takip edin.
      Not: Hızlı bir şekilde Çözüleme ve mikrop bulaşmış kan enjekte sonra hayatta kalan uygun kan aşamalarını kesin olarak saymak için yetersizlik nedeniyle, donör fareler önce kriokonservirovannogo kan alırsınız. Donör fare enfekte eritrositler tam olarak nicelik ve daha sonra kullanılabilir.
  3. Gün 0: donör fareler kanama
    1. Donör fareler Bleed (Bölüm 3,1) ne zaman onların parasitemia arasında 0,1% ve 1%, genellikle elde edilir 2-3 gün sonrası dondurulmuş-stok-enfeksiyon p. yoelii 17X-nl ve p. berghei Anka suşları durumunda.
    2. Yüz ven delinmesi kullanın (200 ve 500 μL arasında almak için), ya da ölümcül kalp delinme ile hayvanları kanama (arasında almak için 600 μL ve 1,2 mL) enfekte kan. 3,1 bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, fareleri kalp delinmesi ile ölümcül bir şekilde kanama.
      Not: Yüz ven kanama uygulamak için çok daha zor olduğu gibi kan alma rutin bir yöntem değildir ve fareler için çok üzücü, Terminal kanama ile karşılaştırıldığında. Donör fareler kanama için optimum parasitemia arasında 0.1%-1% çünkü, bu parasitemia aralığında, çok az gametanosit vardır (hangi aseksüel kan aşamaları üretmek için çoğaltılamaz) ve daha az çift veya üçlü enfekte eritrositler (hangi daha az doğru hale getirir).
  4. Gün 0: enfekte kanın ölçülmesini seri dilüsyonlar tarafından enfekte eritrositler dozlarda hazırlamak için
    1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 100 μL kan ekleyerek (seyreltme tüpü 1), donör kanın seri dililmesini hazırlayın. 900 mg RPMı orta tüp 1 ekleyin ve aynı pipet ucu ile yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın, bir 1:10 seyreltme oluşturma.
    2. Tüp 1 ' den seyreltilmiş kan 100 μL alın ve yeni bir mikrosantrifüj tüp (seyreltme tüpü 2) ekleyin. 900, tüp 2 RPMı orta μL ekleyin ve aynı pipet ucu ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından iyi karıştırın, bir 1:100 seyreltme oluşturma.
    3. 1:1000 (seyreltme tüpü 3) ve 1:10000 dilüsyon (seyreltme tüpü 4) oluşturarak iki seri dilüsyon yapmak için 1.4.1 ve 1.4.2 arasındaki adımları yineleyin.
    4. Tüp 4 ' ten 12 μL 'den seyreltilmiş kanın 12 μL ' sini, bir hemokytometrenin farklı taraflarına, tüpden dört tanesine ve hemokytometrenin her bir tarafında ortalama eritrositlerin sayısını belirleyecek şekilde ekleyin. Bu sayıları 10 ' a kadar çarpın. Her bir seyreltme 1 μL 'de eritrosit sayısını belirlemek için, sırasıyla 1.000 veya 10.000, seyreltme faktörü ile bu sayıları çarpın.
    5. Enjeksiyon için gerekli seyreltilmiş donör kanın hacmini belirlemek üzere her bir seyreltme için 1 μL 'de eritrositlerin sayısı ile enjekte edilecek enfekte eritrositlerin istenen sayısını bölün. Enjeksiyon için en uygun hacim ile seyreltme seçin, yeni bir mikrosantrifüj tüp hacmi ekleyin ve RPMı orta ile 120 μL için tamamlayın.
  5. Gün 0: alıcı fareler İntravenöz enjeksiyon
    1. Enjeksiyon için damarlarını genişletmek için bir ısı kırmızı lamba altında alıcı fareler yerleştirin. Bir 27 G insülin şırıngasında parazitin dozlarını yükleyin ve alıcı fareyi bir kısıtlanabilir yere yerleştirin.
    2. 1.000.000 veya 10.000 enfekte eritrositler intravenöz enjekte (IV) sivrisinek enfeksiyonu için her alıcı fare 27 G insülin şırınga kullanarak veya aseksüel ve cinsel kan-aşama büyüme, sırasıyla gösteriyor. Standart gövde koşullarında fareler sürdürmek için devam edin.
      Not: Bir IP enjeksiyonu, parazitlenmiş eritrositlerin kanına ulaşmak için periton boşluğun drenaj lenf düğümlerinden geçmesi gerektiğinden, kan dolaşımına parazitleri tanıtmanın dolaylı bir yöntemidir. Bu, bir IP enjeksiyonunu kan dolaşımına kesin sayıda parazit enjekte etmek için dolaylı bir teslimat yolu yapar. Bu nedenle, Şekil 3 ' te gösterildiği gibi, doğrudan kan dolaşımına doğru parazit dozlarda teslim EDILDIĞI için IV yolu tercih edilir ve temsili sonuçlar'da açıklanmıştır.

2. cinsel ve Asexual aşamaları için kan-sahne paraziti yükü belirlenmesi

Not: Bu bölümde Sıtma paraziti kan aşamalarının standartlaştırılmış fenotipik değerlendirme yöntemleri listelenmiştir. Bu yöntemler, yeni Antimalaryal veya aşı adaylarının değerlendirilmesi ve aynı deneysel fareler cinsel ve aseksüel aşamaları gelişimi üzerinde bile gen nakavt yararlıdır. Not, p. chabaudi ve p. vinckei de çok mantık ve önemli alternatif seçenekleri bu tür için, ilaç taraması özellikle.

  1. Aseksüel aşamaların parasitemisi ve erkek vs. kadın gametanositlerin Giemsa tarafından belirlenmesi-parazit büyümesi için lekelenmiş ince kan smear
    1. 26 G veya 27-G iğne kullanarak, fare kuyruğunu dikmek ve bir mikroskop slayt üzerinde kan damlacık toplamak. Başka bir mikroskop slaytı kısa kenarı kullanarak hızlı bir şekilde slayt boyunca kan smear.
    2. En az 1 dakika için 100% metanol ile slaytı düzeltin, yalnızca kan slaytta tamamen kurutulduktan sonra. 10-15 dk için% 10 Giemsa 'da leke. slaytı tek veya çift distile suyla yıkayın ve kurumasına izin verin.
    3. Işık mikroskobu altında 100x objektif ve yağ daldırma kullanarak slaytı okuyun. Doğru bir parasitemia ölçümü için, sırasıyla ızgara başına ortalama 200 veya 150 eritrositler (RBCs) sayısı ile en az 30 veya 40 mikroskopik ızgaralar sayılarak elde edilebilir en az 6.000 eritrositler, kontrol edin. Tüm Izgaralar için Ortalama kırmızı kan hücrelerinin sayısını belirlemek için ilk ve son ızgaralarda RBCs toplam sayısını saymak.
    4. Izgara başına enfekte eritrositlerin toplam sayısını say. Erkek ve kadın gametanositler gametocytemia belirlemek için ayrı olarak sayılabilir ama aynı zamanda toplam parasitemia sayısına dahil edilmelidir.
    5. Toplam parazit yüzdesini, toplam parazitlenmiş eritrosit sayısını, gözlenen toplam RBCs sayısına bölerek belirleyin. Parasitemia yüzdesini belirlemek için 100 tarafından bu sayıyı çarpın.
    6. Görülen toplam RBCs sayısına göre sayılan gametanosit toplam sayısını bölerek gametocytemia belirleyin. Fare başına gametocytemia yüzdesini belirlemek için 100 tarafından bu sayıyı çarpın.
      Not: Farklı aseksüel ve cinsel kan aşamaları arasındaki tek güvenilir farklılaşma yöntemi, her aşamada farklı morfoloji olduğu için, Giemsa-lekeli ince kan smear değerlendirmek için bir mikroskop kullanımı, olgunlaşmamış gametocytes dışında, hangi çoğunlukla aseksüel kan aşamalarından ayırt edilemez.
  2. Floresan muhabir protein-WT gibi parazit suşları ifade için akış sitometri tarafından kan-sahne parasitemia belirlenmesi
    1. Her fare örneği için iki mikrosantrifüjle boru etiket, 1:1000 seyreltme ve diğer 1 için bir tüp belirleme-2000 seyreltme. 1:1000 seyreltme tüpüne 1,5 μL 1x heparin ekleyin.
    2. 26 G veya 27 G iğne kullanarak, fare kuyruğunu iğneleme ve 1,5 μL kan 1,5 μL 1x heparin (1:1000 seyreltme tüpü) içeren tüp için transfer. Kan ve 1x heparin hafifçe birlikte yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
    3. Mikro Santrifüj tüpüne RPMı orta 1.497 μL ekleyin ve iyice karıştırın için yavaşça yukarı ve aşağı pipet atın.
    4. Transfer 500 μL 1:1000 seyreltme borusu 1:2000 seyreltme tüpü karışımı. 1:2000 tüpüne RPMı orta 500 μL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
    5. Akış cytometer için üreticinin uygun başlangıç protokolünü izleyin. Örnekleri yavaş bir akış hızında çalıştırın ve en az 20.000 olayları için algılaması ayarlayın.
      Not: Orada bir alternatif pratik assay triolor FACS sıralama yoluyla parasitemia ölçmek için, ister parazitler floresan işaretçileri veya34ifade değil. Ancak, tahlil burada açıklanan herhangi bir DNA-bağlayıcı boyalar ve FACS sıralama kullanımı ilavesi olmadan canlı parazitler içinde parasitemia doğru bir ölçmek sunuyor.
  3. Enfekte fare kanı mikrolitre başına erkek gamet exflagellation oranı belirlenmesi
    1. 1:10 seyreltme mikrosantrifüjlü tüp 40 μL tamamlanmamış ookinete Orta (RPMı + sodyum bikarbonat + hipoxanthine + xanthurenic asit) ve 5 μL 1x heparin hazırlayın.
    2. 26 G veya 27 G iğne kullanarak, farenin kuyruğunu dikmek ve 5 μL kan (bir mikropipet kullanarak) hızlı bir şekilde tamamlanmamış ookinete medya + heparin içeren tüp aktarmak. Yavaşça karıştırın ve 1:10 kan seyreltme tüpünün 12 μL 'i hemokytometer üzerine yükleyin ve oda sıcaklığında (20-24 °C) bırakın.
    3. 1:10 seyreltme hazırladıktan sonra 9-10 dk exflagellation olayları sayma başlayın. 40X büyütme ile faz kontrast ışık mikroskop kullanın.
    4. 10 tarafından sayılan exflagellation olayların ortalama sayısını çarpın ve sonra seyreltme faktörü ile çarpın (10) enfekte kan mikrolitre başına exflagellation ortalama sayısını belirlemek için.
      Not: Bu tahlil, bir hemokytometer kullanılarak nicelendirme yapılabilir kan 1 μL hacimde erkek gamet exflagellation olayların sayısını ölçer. Tamamlanmamış bir ookinete orta18 kan, kısa bir süre sonra bir kan yemekten sonra sivrisinek midgut içinde oluşur hangi exflagellation sırasında koşulları yakından taklit etmek ile karıştırılır.

3. enfekte eritrositler ve dondurulmuş stok hazırlama kan-sahne parazitleri yalıtım ve Işleme

  1. Kalp delinme ile enfekte kemirgenler Terminal kanama
    1. Donör farenin kanını kalp delinerek toplamak için yaklaşık ≤ 20 μL 1x heparin (200 birim/mL) içeren 26 G iğne şırıngasını hazırlayın.
    2. Kanamadan önce fareyi ötenize etmek için CO2 ' nin yavaş akışını kullanın. Alternatif olarak, Isoflurane (önce ve kalp açığa çıkarmak için cilt kesi sırasında muhafaza edilmelidir) ile fareyi anestezize.
    3. Onun arka üzerine fare Lay ve onun uzantıları aşağı pin. Forseps ile cildi çekerek ve makas ile kesme sternum tabanına yakın cilt küçük bir kesi olun. Diyaframı ve karın boşluğunun üst kısmına maruz bırakmak için, kesi yerinde cildi ayrı çekin.
    4. Kaburga kafesi tabanı forseps ile tutun ve torasik boşluğa girmek için diyaframdan kesilmiş; kalp veya akciğerlere zarar vermemek için dikkatli olun. Kalbi ortaya çıkarmak için kaburga kafesi geri pin.
    5. Yavaşça kalp delinme ve yavaşça şırınga piston üzerinde ~ 1 mL kan toplamak için çekin ve bir mikrosantrifüj tüp aktarmak.
  2. Enfekte kandan dondurulmuş stokların hazırlanması
    1. Kan parasitemias ile yaklaşık 2% ve% 5, halka aşamaları önemli miktarda ve pek çok gametanosit değil, fareler Bleed (Bölüm 3,1 bakın).
    2. Donma çözeltisi ile kan istenilen kısmını karıştırın (10% alsever çözeltisi gliserol) bir 1:2 oranı ve kriyojenik şişeler içinde depolar. Sıvı nitrojen içinde dondur.
  3. DNA, RNA ve proteinlerin çıkarılması için kan aşaması parazitlerinin izolasyonu ve arıtılması
    1. Bleed fareler (bkz: Bölüm 3,1)% 0,5 daha yüksek kan parasitemias ile.
    2. 10 mL şırıngayı, pistonu kaldırarak ve küçük bir pamuklu çubuk takarak hazırlayın. Pamuğun altına, şırıngayı topla. Selüloz seviyesine kadar Selüloz ile doldurun 3 mL işareti ulaşır ama şırınga üzerinde 4 mL işareti aşmaz.
    3. Şırınga bir yüzük standı bir klip içine güvenli ve altında bir atık toplama tüpü yerleştirin. Şırıngaya 5 mL PBS ekleyin ve atık tüpüne akmasına izin verin.
    4. Gerekirse dondurulmuş stokları hazırlayın, sadece 100-300 μL kan kullanarak. Virüslü kanın geri kalanını (400-700 μL) sütuna ekleyin. Damlacıklar kırmızı açmak için başlayıncaya kadar bir atık tüp ile akış toplayın. Damlacıklar kırmızı açmak için başladıktan sonra, akışı toplamak için şırınga altında yeni bir 14 mL toplama tüpü yerleştirin.
    5. Akış yavaşlamaya başladıktan sonra, şırınga için PBS ekleyin ve toplam hacmi 14 mL 'ye ulaşıncaya kadar 15 mL tüpte akışı toplayın. Kalan akışı bir atık tüpü ile toplayın.
    6. 14 mL 'Lik tüp ile 250 x g 'de 8 dakika boyunca kan/PBS karışımı ile frensiz santrifüj yapın. Süpernatant çıkarın ve 14 ml soğutulmuş saponin ekleyin (50 mg PBS 50 ml içinde saponin). Pellet bırakmak için, tüp birden çok kez ve girdap gerekirse ters çevirin.
    7. 1.217 x g 'de frenler olmadan 8 dakika boyunca tüpü santrifüjün. Supernatant çıkarın, yaklaşık 0,5 mL üzerindeki çözeltinin Pellet üzerinde bırakarak.
    8. Bir mikropipet kullanarak çözelti içinde Pelet resuspend ve bir mikrosantrifüj tüp aktarın. Tüp içinde kalan tüm parazitleri yıkamak için 14 mL tüpüne 500 μL PBS ekleyin. Bunu aynı mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
    9. 6.010 x g'de 2 dakika boyunca tüpün santrifüjünü yapın. Süpernatant ve pelletini kaldırın 1 ml PBS. 9.391 x g'de 2 dakika Santrifüjü.
    10. Genomik DNA, toplam RNA ve protein ayıklamak için devam edin.
      1. Genomik DNA ekstraksiyoniçin, süpernatant çıkarın ve PBS 200 μL içinde Pelet pelletini, ve sonra gdna ekstraksiyon herhangi bir uygun protokol izleyin.
      2. Toplam RNA ekstraksiyoniçin, supernatant kaldırmak, pelletini ve herhangi bir fenol-ve guanidin isothiocyanate tabanlı çözüm veya diğer uygun reaktif 1 ml Pelet Vortex ve, daha sonra, toplam RNA ekstraksiyon herhangi bir uygun protokol izleyin.
      3. Toplam protein ekstraksiyoniçin, supernatant çıkarmak, uygun bir hacim içinde Pelet pelletini 6x sodyum Dodesil sülfat (SDS)-yükleme boya veya diğer uygun reaktif ve, daha sonra, toplam protein işleme herhangi bir uygun protokol izleyin.

4. sivrisinek enfeksiyonu Assays

Not: Sivrisinek cinsel üreme gerçekleşir sıtma parazitlerin birincil ev sahibidir. Fareler, sıtma parazitleri sivrisinekler iletmek için enfeksiyon en az 1.000.000 kan aşamaları bir IV enjeksiyon tarafından gerçekleştirilir, bir enfekte fare besleyerek takip (en yüksek erkek gamet exflagellation oranı görüntüler her genotipten) Günde bir kafeste Anopheles sivrisinekler 3 Post-fare-enfeksiyon. Phenylhydrazine tedavi fareler 1.000.000 kan-aşama parazitleri ile IV enjeksiyon daha hızlı ve daha yüksek oranda erkek ve dişi gametocyte gelişimini sağlayacaktır. P. yoelii ve p. berghei ile enfekte sivrisinekler, mümkün olan en iyi sivrisinek aşamaları gelişimi için izin vermek için sırasıyla 24 °c ve 20-21 °c ' de inkübe edilir6.

  1. Sivrisinek besleme ve sivrisinek başına ookinetes sayısının belirlenmesi
    1. Açlık yetişkin kadın Anopheles stephensi veya A. Gambiae sivrisinekler (4-7 gün eski) için 8-12 h önce beslenme. Yetişkin sivrisinekler, en az 15 dk enfekte anestezik fareler için beslemek için izin (ketamin/xylazine uygun bir doz ile enjekte) yüksek exflagellation oranı ile (Bölüm 2,3 ölçülür).
      Not: Ketamin/xylazine çalışma çözeltisi, 1:5 tuz ve IP enjeksiyon 100 μL her fare için stok solüsyonunun seyreltme tarafından hazırlanmıştır. 10 mL stok çözeltisi için 1 mL xylazine (100 mg/mL), 9 mL ketamin (100 mg/mL) eklenir.
    2. Bir ağız Aspiratörü ile beslenmemiş kadın sivrisinekler ve erkek sivrisinekler çıkarın.
    3. At 18-20 h postbeslenme, 20-30 sivrisinekler toplamak ve ölüm sağlamak için az 10 dakika dondurucuya yerleştirin. Bir binoküler diseksiyon kapsamı kullanarak, 2 26 G veya 27 G iğneler veya RPMı veya PBS diseksiyon orta bir iğne ve forseps ile kan dolu Mid, 20-30 dışarı çıkarmak ve bir mikrosantrifüjlü tüp içeren bir mikro santrifüj boru aktarmak 200 μL RPMı veya PBS (diseksiyon yöntemi Için Lütfen 4,3 bölümüne bakın).
    4. 700 x g'de 1 dakika boyunca toplama tüpünü santrifüjün. Bir pestle kullanarak pelleted orta cesaret grind. Bu adımı yineleyin.
    5. 50 μL 'i, zemin orta bezinden yeni bir mikrosantrifüjü tüpüne aktarın. 1:5 seyreltme oluşturmak için RPMı veya PBS 200 μL ekleyin.
    6. 12 μL 'i hemokytometreye aktarın ve içeriğin yerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
    7. Faz kontrast ve 40X büyütme ile hafif mikroskop kullanarak ortalama ookinetes sayısını belirleyin.
    8. Olgun ookinetes ortalama sayısı 10 ile çarpın ve sonra seyreltme faktörü 5 ookinetes ortalama toplam sayısını belirlemek için.
    9. Kan beslenen sivrisinek başına ookinetes sayısını belirlemek için disseke kan beslenen sivrisinekler sayısına göre ookinetes ortalama sayısını bölmek.
  2. Floresan muhabir protein-WT gibi parazit suşları için erken Ookistlerinin sayısının belirlenmesi
    Not: Bu tahlil amacı yeşil floresan protein ifade canlı parazitlerin sayısını belirlemek için (GFP) bu sivrisinek Mid, tam bir enfeksiyon kurdu ve erken küresel ositler oluşturuldu. Bu tahlil belirleyen Eğer ookinetes (onların gelişimi önceki tahlil tahmini) sivrisinek midgut epitelyal hücreler ve midgut bazal lamina tarafında erken ositlere dönüşümü ile geçişi tarafından işlevlerini tamamladı epitelia ya da değil. Bu, Gfp ifade parazitlerin büyük kullanımı yapar başka bir tahlil olduğunu, bu aşamada erken Ookistlerinin sayma gibi sıkıcı immünostasyonu olmadan neredeyse imkansız olacaktır.
    1. 20-30 kan beslenen sivrisinekler, (bkz. Bölüm 4,1) orta organlarını incelemek, gün 3 veya 4 p. yoelii 17X-nl için sivrisinek besleme (PMF) ve gün 6 veya 7 PMF p. berghei Anka için, 2 26 g veya 27 g iğne veya RPMI veya PBS diseksiyon m bir iğne ve forseps ile edium (diseksiyon yöntemi Için lütfen Bölüm 4,3 bakın).
    2. Cam kaydırağın uzun kenarının yatay orta çizgisinde 40-50 μL diseksiyon ortamını yayın. Bu satıra, bir kerede, diseksiyon sırasında, orta bağırsakları aktarın ve kuruma önlemek için, gerekirse, Mid, daha fazla orta ekleyin.
    3. Bir lamel magazini hafifçe disseke Mid, üzerine yerleştirin ve oje ile mühürleyin.
    4. Floresans mikroskobu, yeşil floresan filtre ile 10X veya 20X amacı kullanarak, her midgut erken Ookistlerinin sayısı, en az 20 midcesaret olarak saymak.
  3. Sivrisinek başına ookist sporozoitler sayısının belirlenmesi
    1. 2 26-g veya 27-g iğne veya RPMI veya PBS diseksiyon orta bir iğne ve forseps ile en az 20-30 sivrisinekler orta bağırsakları incelemek ve RPMI 200 μL içinde disseke Mid, toplamak.
    2. Alt karın segmentlerini bir iğne (veya forseps) ile sıkıca yerine koyun ve toraks ile karın arasındaki kavşakta diğer iğneleri hafifçe yukarı yönde itin. Toraks karından ayrılıncaya kadar dikkatle kısa iter olun. Ayrılık başlar başlamaz beyaz midgut gergin görünecektir, ve sonra midgut toraks ayırmak için kullanılan aynı iğne kullanarak özofagus sonundan kesilecektir. Hala karın bağlı ise, aynı iğne karın uzak midgut çekmek için kullanılabilir. Bir iğne ile orta onları toplayarak toplama tüpü tüm sivrisinekler Mid, Transfer, bir defada bir.
    3. Toplama tüpünü santrifüjle 1 dakika içinde 700x g 'ye kadar orta bağırsakları toplama tüpünün altına oturt ve onları bir böcek ile eziyet et. Bu adımı yineleyin.
    4. 12 μL 'ye hemokytometer aktarın ve içeriğinin yerleşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye yapın.
    5. Bir ışık mikroskobu 40X amacı kullanarak ookist sporozoites saymak. Kullanım 1:5 ve/veya 1:10 seyreltme sivrisinek enkaz sporozoites kesin sayma engeller veya sporozoites sayısı çok doğru saymak için yüksek ise.
    6. Ookist sporozoitlerin ortalama toplam sayısını 10 ile ortalama sporozoites sayısını çarpıtarak hesaplayın ve daha sonra, eğer varsa ve toplam hacim (200 μL) ile bu sayıyı seyreltme faktörü ile çarpın.
    7. Sivrisinek başına ortalama ookist sporozoitler sayısını hesaplamak için disseke sivrisinekler sayısı ile sporozoites ortalama toplam sayısını bölmek.
      Not: Sivrisinek aşamaları enfeksiyonunun başarısını veya üretkenliğini ölçmek için yaygın bir hata, ookist gelişiminin daha sonraki aşamalarında ositlerin sayısının sayılması. Bunun nedeni, daha sonra ookist gelişiminin daha sonra zaman noktalarında vakum yapılarak, diğerleri aynı midgut üzerinde bile sporozoitler geliştiremeyecektir. Sivrisinek aşamaları enfeksiyonunun verimliliğini belirlemek için en iyi ve en güvenilir yöntem gün 10-12 sonrası sivrisinek-enfeksiyon P. yoelii ve gün içinde ortalama midgut ookist sporozoites sayısı saymak 12-14 P. bergheiiçin sivrisinek sonrası enfeksiyon.
  4. Sivrisinek başına tükürük bezi sporozoites sayısının belirlenmesi
    Not:Sivrisinek aşamaları gelişiminin tam olarak tamamlanması, omurgalara karşı kabul edilebilir ve bulaşıcı aşamalar olan tükürük bezini işgal eden sporozoitlerin sayısını tahmin ederek gerçekleştirilir. Tükürük bezinin istilası, ookist sporozoit gelişimi tamamlandıktan sonra, hemolymph içine çıkış, tükürük bezi asiner hücrelerinin bazal lamina eki ve tükürük bezlerine ulaşmak için asiner hücrelerinin geçişi olarak kurulmuştur. Kanal5. Bu nedenle, bu tahlil de bu süreçlerin tüm başarısını bir değerlendirmesidir. Bununla birlikte, hemolymph sporozoit numaralarının bir tahmini, tükürük bezlerinin istilasına ait ositer ve kusurlardan gelen çıkış kusurları arasındaki farklılaşma sağlar35. Tükürük bezi sporozoitlerin arıtılması, sporozoit motilitesi ve invazif phenotypes üzerinde birden fazla fonksiyonel deney yapmasını sağlar. Tükürük bezi sporozoitler de fare ve immünizasyon çalışmaları In vivo enfeksiyon için kullanılabilir36,37. Dahası, en tekrarlanabilir aşamaları bir in vitro karaciğer aşaması invazyonu veya geliştirme tahlil kurmak için kullanılabilir tükürük bezi sporozoites kullanımı ile.
    1. 50-100 kadın sivrisinekler, gün 14-16 PMF için p. yoelii ve günde 17-20 PMF p. berghei, tercihen ile 2 26 g veya 27 g iğneler, RPMı veya dmem orta buz üzerinde tutulan ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye tükürük bezleri incelemek veya/sığır serum albümin (BSA) p. yoelii sporozoites için veya 3% FBS/BSA için p. berghei sporozoites. Eğer sporozoitler hepatoma in vitro olarak kullanılırsa, diseksiyon ortamına 1% penisilin/streptomisin ekleyin. Genellikle tükürük bezlerinin diseksiyonu için iki yöntem vardır. İlk yöntem zaman alıcı ama çok az veya hiçbir kontamine dokularla tükürük bezlerinin diseksiyonu yol açar. İkinci yöntem daha az zaman alıcı ama kirletici dokularda önemli miktarda koleksiyona yol açar. İlk yöntem burada ayrıntılı.
    2. Bir iğne eğimli tarafı ile yerinde üst karın segmentleri tutun ve dikkatle baş ve toraks arasındaki kavşakta dikkatli bir şekilde baş ve göğüs arasında bir yukarı yönde bas (çok kısa iter) kafa dikkatle toraks ayrılır olmadan Cam tükürük bezlerini yırtmak, maruz tükürük bezleri daha sonra başını yukarı itti aynı iğne ile kafasından ayrılır.
    3. Kesitli tükürük bezi, kısa cam Pasteur pipet kullanarak diseksiyon ortamından yükseltilecektir.
    4. Tüm tükürük bezleri disseke ve hasat edildiğinde, yetenek santrifüjin içine Mid, içeren tüp yerleştirecek (1min, 700 x g).
    5. Faz 2 kontrast ve 40X büyütme ayarlamak ışık mikroskop altında bir hemasitometre kullanarak sporozoites saymak. Sivrisinek sayısı ≥ 40 disseke ise, 1:5 veya 1:10 için tükürük bezleri seyreltici, beklenen infenit verim bağlı (daha önce saptanmıştır) belirlenir.
    6. Sporozoites ortalama sayısını 10 ve seyreltme faktörü (varsa) ile çarpın. Tükürük bezi sporozoites ortalama sayısını belirlemek için toplam hacmi ile çarpın. Sivrisinek başına ortalama tükürük bezi sporozoites belirlemek için disseke kadın sivrisinekler sayısına göre Böl.
      Not: Tükürük bezlerinin diseksiyonu ile ilgili sorun, küçük boyutu ve cam şeffaf bir görünümdür. Böylece, bu tükürük bezlerini izole etmek çok zordur ve bu nedenle, genellikle toraks frontal kısmından diğer dokularla bir şişlik olarak dışarı disseke, aynı zamanda koleksiyon sırasında rüptürü tükürük bezleri korumak için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sıtma parazitlerine ters genetik araçlar ve teknikler uyguladığınız başarı, sıtma araştırmaları alanında devrim yaratıyor, çeşitli Plasmodium türlerinin39belirli genomik segmentlerini ekleme, silme veya değiştirme yeteneği ile. Önemlisi, vazgeçilebilir genomik loci tespit edilmiş ve başarılı bir şekilde tüm yaşam döngüsü aşamalarında istikrarlı bir ifade sağlamak için, Çift Homolog rekombinasyon tarafından kemirgen ve insan sıtma parazitleri floresan protein işaretçileri tanıtmak için kullanılan40 ,41,42. Bu WT benzeri transjenik parazitlerin bir örneği, laboratuvarımızda oluşturulan Py230p (-) parazitlerdir ve kan ve sivrisinek yaşam döngüsü aşamalarının gelişiminde hiçbir belirgin kusur gösterdi15,16, 17. bu transgenik muhabir parazitleri EGFP, PyHSP70güçlü ve kurucu Organizatör kontrolü altında, kan aşamalarında (Şekil 1a) ookinetes (Şekil 1B), Genç Ookistlerinin ifade (şekil1C ) üzerinde Anopheles stephensi Mid, ve sporozoites Anopheles salıary bezlerinden Izole Stephensi kadın (Şekil 1D). Böylece, eGFP-ifade kan parazitleri çok daha kolay ve daha az zaman tüketen kan-aşama parazitemi farklı genotürleri arasında transgenik parazitler veya ilaç-tedavi ve ilaç-hedefleme içinde tedavi edilmemiş arasında akış sitometri kullanarak değerlendirmek için yaptı transgenik muhabir parazitleri kullanarak yazıyor.

Akış sitometrisi ve mikroskobik tarafından daha sıkıcı parasitemia tahmini kullanımı arasında nicel bir fark olmadığını onaylamak için, eGFP-ifade Pyp230p (-) tarafından parazitlenmiş eritrositlerin yüzdesini tahmin etmek için kullanıldı akış sitometri ve Giemsa tarafından-Isviçre Webster fareler IV-enfekte 10.000 parazitleştirilmiş eritrositler bir grup lekeli ince kan smear. Akış sitometri parasitemia% değerleri, iki uzman bilim adamı tarafından tahmin edilen Giemsa-lekeli ince kan smear izleme tarafından tahmini parasitemia% doğrudan karşılık gelmektedir (Şekil 2). Bu, kan aşamasının parazitlerinin büyüme oranının belirlenmesi sırasında mikroskopi sıkıcı ve eğilimli-to-insan-hata yöntemine daha doğru bir alternatif temsil eder.

Sıtma parazitleri kan aşamaları ile kemirgenler enfeksiyonu ile ilişkili önemli bir tutarsızlık enfeksiyon rota seçimi, infeksiyon IV yolu ile karşılaştırıldığında IP için literatürde güçlü bir tercih ile, daha az zaman alıcı olduğu gibi. Enfeksiyon bu iki rota karşılaştırmak için, beş BALB/c fareler iki grup 1.000 ile enfekte edildi eGFP-ifade Pyp230p (-) fare başına parazitlenmiş eritrositler, ya IV veya IP yolları üzerinden. Parasitemia, günlük olarak 4 gün süreyle Akış sitometrisi kullanılarak izleniyor. IV enfekte gruba kıyasla IP enfekte grup parasitemia% istatistiksel olarak önemli bir azalma test tüm günlerde (Şekil 3) kaydetti. Bu, IV enfeksiyon rotasının, Sıtma paraziti kan aşamaları ile ilgili olarak daha fazla niceli enfeksiyon yolu olduğunu kanıtlar sağlar.

Yine de, kan-aşama parasitemi değerlendirmek için akış sitometri kullanımı için bir sınırlama cinsel ve aseksüel aşamaları ve erkek ve dişi gametanosit arasında farklılaşma olduğunu. Bu nedenle, farklı aseksüel ve cinsel aşamaları (Şekil 4) her birinin yüzdeleri tahmin Giemsa-lekeli ince kan smear bir morfoloji değerlendirilmesi bağlı olması gerekir. Olgun erkek ve dişi gametanositlerin belirgin farklı morfolojisine rağmen (Şekil 4), olgunlaşmamış cinsel aşamaları genellikle aseksüel aşamalardan ayırt edilemez.

Sivrisinek midgut erkek gametocyte ortaya çıkması üzerine erkek gamet bir temel işlevi, çok kısa bir süre içinde gerçekleşmesi gereken iletim çok kritik bir adımdır erkek gamet exflagellation olduğunu. Birçok farklı sistemlerde bunu değerlendirmek için kullanılan değişken yöntemler açıklanmıştır. Burada, herhangi bir basit laboratuar ayarında tekrarlanabilir standartlaştırılmış bir yöntem gösteriyoruz. Biz alıcı fareler içine fenilhidrazinsülfonik enjeksiyon veya olmadan erkek gamet exflagellation değerlendirildi (Şekil 5). Biz, fenilhidrazinsülfonik tedavisi önemli ölçüde (dört kat) erkek gamet exflagellation oranını artırdığı gösterebilir, hangi sırayla fertilizasyon oranı ve tüm sonraki sivrisinek aşamalarının sayısını artacak.

Figure 1
Şekil 1 : Gelişim P. yoelii p230p (-) parazitler EGFP 'i kan ve sivrisinek aşamalarında ifade ediyor. (A) karışık kan aşaması parazitlerinin görüntüsü (1, 000x büyütme). (B) ookinete (400x büyütme) görüntüsü. (C) görüntü bir Anopheles stephensi Mosquito midgut enfekte gün 4 PMF erken Ookistlerinin canlı p230p (-) parazit ifade EGFP (100x büyütme). (D) Bu panel bir P. yoelii p230p (-) tükürük bezi sporozoite canlı bir görüntü gösterir, gün 15 PMF dışarı disseke, EGFP ifade (400x büyütme). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Akış sitometri ve mikroskobik değerlendirmeler, ortalama kan-aşama parasitemi P. yoelii p230p (-) parazitler önemli ölçüde farklı değildir. Dört Isviçre Webster fareler bir grup intravenöz 10.000 ile enfeksiyonlu eritrositler bulaşmış Pyp230p (-) fare başına ve ortalama kan-sahne parasitemias% günlük 7 gün boyunca akış sitometri tarafından kaydedildi ve mikroskobik değerlendirme Giemsa-lekeli ince kan smear toplam 20.000 ve ~ 6.000 eritrosit, sırasıyla. Gösterilen mikroskobik muayene sonuçları, slayt başına iki uzman bilim adamı tarafından iki okumanın ortalamasıdır ve her bir slaytın parasitemeni değerlendirmek için zaman her bilim adamı tarafından en az 10 dakikadır. Burada gösterilen günlerin herhangi birinde önemli farklar algılanamaz. Tüm parazitler için Ortalama değerler iki kuyruklu t-testi ile analiz edildi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : İntravenöz bir enjeksiyon P. yoelii p230p (-) parazitler intraperitoneal enjeksiyonu ile önemli ölçüde farklı kan-aşama parasitemi verir. Beş BALB/c fareler iki grup 1.000 ile enfekte edildi Pyp230p parazitleştirilmiş eritrositler (-) fare başına, intravenöz veya intraperitoneal rota yoluyla, ve ortalama kan-sahne parasitemias% günlük kaydedildi 4 gün boyunca akış 20.000 eritrositler toplam sitometri. İntravenöz rota grubuna kıyasla intraperitoneal rota grubunda test edilen tüm gün boyunca kan aşaması paraziteminin istatistiksel olarak önemli bir azalma (yıldız işareti ile) tespit edilebilir. Tüm parazitler için Ortalama değerler iki kuyruklu t-testi ile analiz edildi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Morfoloji P. yoelii gametocytes bir Giemsa-lekeli ince kan smear. WT P. yoelii 17X-nl gerinim ile enfekte bir İsviçre Webster fare bir Giemsa-lekeli ince kan smear (1, 000x büyütme) bir görüntü sol tarafta tipik mavimsi renkli kadın gametocyte gösterir (bir ok ile) ve pembemsi renkli erkek ( bir yıldız işareti ile gösterilir) görüntünün sağ tarafındaki gametocyte. Gösterilen diğer aşamaları aseksüel kan aşamaları vardır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Fenilhidrazinsülfonik erkek gamet exflagellation etkisi. Alıcı fareler enjekte fenilhidrazinsülfonik etkisi 5 P. yoeliierkek gamet exflagellation oranı tahmini önce gün. Phenylhydrazine önemli ölçüde erkek gamet exflagellation oranını artırır, hangi daha yüksek bir sivrisinek aşamaları enfeksiyon sonrası-sivrisinek besleme yol açar. Tüm parazitler için Ortalama değerler iki kuyruklu t-testi ile analiz edildi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan sıtma parazitleri onların yaşam döngüleri Genel Biyoloji benzerlik rağmen, fare sıtma modelleri de güvenilir in vivo modelleri olarak kullanımını sınırlamak olacak ınsan Plasmodium türleri için pek çok benzerlik vardır. Örneğin, aşılar olarak canlı zayıflatılmış parazitlerin dışında, altbirim ve DNA ve diğer aşılar ile tüm aşı çalışmaları fare modelinde mükemmel sonuçlar verdi, ancak endemik bölgelerde yaşayan insanlarda, sonuçlar tatmin edici değildi.

Başka bir sorun, bir fare gerinliği diğerine yaşam döngüsü sahne bulaşma farkı ve bazen bir hayvan satıcısından diğerine aynı fare gerinim için. Dahası, yaygın olarak tercih edilen in vivo sıtma modelleri, p. Berghei ve p. yoeliiolarak kullanılan ana iki kemirgen sıtma türleri, herhangi bir insan sıtma tamamen farklı bir senkron kan aşaması döngüsü, sergiler yok Parazit. Ancak, in vivo modelleri gibi fare sıtma parazitleri kullanmanın faydaları da bu sınırlamaların moleküler sürücüler daha derinlemesine analizler tarafından üstesinden gelebilir çok bu benzerlik, tarafından ağır tartmak. Yine de, bu sınırlamalar çoğunlukla kemirgen sıtma kan-sahne parazitleri tarafından görüntülenir, ancak Sıtma paraziti diğer yaşam döngüsü aşamaları için çok değil.

Kan aşamaları çeşitli aşı, ilaç hedefleme, immünoloji ve fonksiyonel genomik çalışmalar için önemli olmasına rağmen, orada standartlaştırılmış yöntemler ve protokollerin fenofonal analiz ve fonksiyonel asder üzerinde konsantre bir kıtlık vardır kemirgen Sıtma paraziti kan-sahne parazitleri, sivrisinek iletim ve transfeksiyon protokolleri daha fazla odaklanmak. Bu nedenle, bu makaledeki Yöntemler, kemirgen sıtma parazitlerinin patojenik aşamalarını incelemek için standartlaştırılmış ve Basitleştirilmiş protokoller sağlamaya yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Ahmed aly, Türkiye Kalkınma Bakanlığı Grant 2015BSV036 ' dan Bezmialem vakif Üniversitesi 'ne finansman sağlayarak ve Tulane Üniversitesi Kamu Sağlığı ve tropikal Tıp Fakültesi tarafından sağlanan finansman ve R21Grant için NIH-NIAID ' e fon vererek desteklenmektedir. 1R21Aı111058-01A1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
  2. Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
  3. Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
  4. Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
  5. Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
  6. Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
  7. Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
  8. Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
  9. Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
  10. Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
  11. Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
  12. Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
  13. Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
  14. Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
  15. Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
  16. Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
  17. Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
  18. Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
  19. Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
  20. Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
  21. Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
  22. Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
  23. Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
  24. House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
  25. Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
  26. Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
  27. Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
  28. Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
  29. Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
  30. Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
  31. Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
  32. Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
  33. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
  34. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
  35. Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
  36. Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
  37. Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
  38. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
  39. de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
  40. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
  41. Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
  42. Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı 147 sıtma Plasmodium berghei Plasmodium yoelii Anopheles kan aşamaları gametanosit exflagellation ookinetes oocysts sporozoites karaciğer aşamaları
Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz,… More

Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter