Summary
På grund af de slående ligheder i livscyklus og biologi af gnavere malaria parasitter til humane malaria parasitter, gnaver malaria modeller er blevet uundværlig for malaria forskning. Heri, vi standardiseret nogle af de vigtigste teknikker, der anvendes i fænotypiske analyse af vildtype og transgene gnaver malaria arter.
Abstract
Nylige fremskridt inden for Genetik og systemer biologi teknologier har fremmet vores forståelse af biologi malaria parasitter på molekyleniveau. Men, effektive malaria parasisite mål for vaccine og kemoterapi udvikling er stadig begrænset. Dette skyldes hovedsagelig, at der ikke findes relevante og praktiske in vivo -infektions modeller for humane Plasmodium arter, især for p. falciparum og p. vivax. Derfor, gnaver malaria arter er blevet flittigt anvendt som praktisk alternativ in vivo modeller for malariavaccine, Drug målretning, immunrespons, og funktionelle karakterisering undersøgelser af bevaret Plasmodiumspp. gener. Faktisk, gnaver malaria modeller har vist sig at være uvurderlig, især for at udforske myg transmission og leveren scenen biologi, og var uundværlige for immunologiske undersøgelser. Der er dog afvigelser i de metoder, der anvendes til at evaluere phenotyper af transgene og vildtype aseksuelle og seksuelle blod-scene parasitter. Eksempler på disse uoverensstemmelser er valget af en intravenøs vs. intraperitoneal infektion af gnavere med blod-fase parasitter og evaluering af mandlig gamet exflagellation. Heri, vi detaljeret standardiserede eksperimentelle metoder til at evaluere phenotyper af aseksuelle og seksuelle blod stadier i transgene parasitter udtrykker reporter-gen eller vild-type gnaven malaria parasitten arter. Vi også detaljer metoderne til at evaluere phenotyper af malaria parasitisk myg stadier (gametes, ookinetes, oocyster, og sporozoiter) inde Anopheles myg vektorer. Disse metoder er detaljeret og forenklet her for de dødbringende og ikke-dødelige stammer af p. berghei og p. yoelii men kan også anvendes med nogle justeringer af p. chabaudi og p. vinckei gnavere malaria arter.
Introduction
Malaria parasitter forårsager hundredvis af millioner af malaria infektioner hos mennesker over hele verden, med mere end 600.000 dødsfald hvert år1. Humane infektioner forårsages af fem malaria parasiter, nemlig p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaeog p. knowlesi. De fleste kliniske malaria MORTALITET er forårsaget af P. falciparum i Afrika syd for Sahara1. En anden Human malaria parasiter arter, der forårsager omfattende verdensomspændende morbiditeter uden for Afrika syd for Sahara er P. vivax2. De tre andre arter er alle mere geografisk begrænset og forårsage godartede malaria infektioner, undtagen den dødbringende P. knowlesi3. Den manglende adgang til relevante og praktiske ikke-humane in vivo-modeller af infektioner har altid været og er stadig en hindring for malariavaccine og lægemiddeludvikling. Tidligere malaria Drug målretning og metaboliske undersøgelser har påberåbt sig udførligt på aviær malaria modeller som p. gallinaceum og p. lophurae, inficere kyllinger og ænder, henholdsvis4. Derefter blev gnaver malaria arter gradvist introduceret i forskellige vacciner og stof målretning undersøgelser som in vivo-modeller. I årenes løb, beviser for ligheder i biologi og vært-parasisite interaktioner af livscyklus stadier af gnavere malaria modeller til menneskelige malaria arter har akkumuleret.
Især, gnaver malaria modeller var yderst vigtigt at udforske og karakterisere biologi af myg og præ-erythrocytiske stadier5. Men, der er fire gnaver malaria arter (p. berghei, p. yoelii, p. chabaudi, og p. vinckei), der har forskellige biologiske egenskaber, hvoraf den mest bemærkelsesværdige er i blodet faser6. Gnavere malaria arter adskiller sig i synkronicitet af blod stadier, hvor blod stadier af p. chabaudi og p. vinckei stammer er for det meste synkrone, mens blodets stadier af p. berghei og p. yoelii ikke er6 , 7. en anden bemærkelsesværdig forskel er den selvstændige clearance af blod stadier, der forekommer i nogle stammer (f. eks p. yoelii 17x-NL, p. berghei NK65, og p. vinckei lentum), mens blodinfektion af andre stammer af samme art kunne være dødelig, hvis venstre ubehandlet (p. yoelii 17x-L, p. berghei Anka, og p. chabaudi AS). Desuden, p. yoelii 17x-NL stamme og p. berghei Anka stamme fortrinsvis invadere reticulocytter8,9,10,11, selv om disse funktioner i P. yoelii og P. berghei stammer er ikke en streng vækst krav12,13,14. Derfor, mus er behandlet med phenylhydrazin før en infektion med blod stadier af disse parasitter til at øge parasitemia og gametocytemia nødvendig for en myg infektion for p. berghei Anka stamme og for p. yoelii 17x-NL15,16,17,18,19.
Forskelle i myg stadier udvikling også findes blandt forskellige gnavere malaria arter, den mest bemærkelsesværdige er den temperatur og tid, der kræves for optimale myg faser udvikling og sporozoite længde5,6, 20. I præ-erythrocytiske stadier af gnavere malaria arter, forskelle omfatter gnaverarter og stamme, der er mest modtagelige for infektiøs sporozoit inokulation, antallet af sporozoiter nødvendig for inokulation i en modtagelig gnaver stamme, pattedyrscelle typer, der er nødvendige til in vitro-udvikling af lever stadiet, og tid til at fuldføre udviklingen af lever stadiet5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
På trods af disse variabilitet, gnaver malaria parasitter var de gunstige modeller tidligt for anvendelsen af omvendte genetiske tilgange, fordi de var mindre tid-og ressourcekrævende med en høj sandsynlighed for succes31. Faktisk, gnaver malaria modeller var de bedste modeller, og i mange tilfælde de eneste modeller, der er tilgængelige i mange år til funktionelt karakterisere gener udtrykt i myg og leveren stadier.
I lyset af den popularitet og modtagelighed af omvendte genetiske tilgange i gnavere malaria modeller, en række forskellige metoder er blevet udnyttet til at analysere fænotyper af transgene parasitiske livscyklus stadier, især blod stadier. Nogle af disse metoder er imidlertid inkonsekvente; for eksempel, sammenligne infektioner i blod-fase parasitter efter en IP injektion (som muligvis drænet til peritonealdialyse lymfeknuder og, derfra, kan komme ind i blodbanen; derfor, de injicerede parasitter ikke ender lige i blodbanen) , sammenligne myg transmission af kloner med et andet antal serielle blod-Stage overførsler eller G-nummer (som kan påvirke gametocytogenesis32,33), eller sammenligne transgene parasitter direkte til naive vildtype (WT) parasitter, der aldrig blev udsat for elektroporation og positive Drug udvælgelse og de forskellige ustandardiserede evalueringer af mandlig gamet exflagellation. Derfor er det afgørende at standardisere protokoller, der er enkle at følge for fænotypiske analyse af enhver form for transgene eller WT gnavere malaria parasitter i blodet og i myg til at rumme for de biologiske intra af gnavere malaria parasiter.
Heri, rapporterer vi om en standardiseret, detaljeret forsøgsprotokol for fænotypisk analyse af blod og myg livscyklus stadier af transgene eller vild-type p. yoelii og p. berghei parasitter. Disse protokoller gælder også for p. chabaudi og p. vinckei parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg, der er beskrevet her, blev udført i henhold til de godkendte protokoller fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Tulane University og dyrenes etiske komité for Bezmialem Vakif Universitet. Alle andre forsøgsprotokoller og brugen af rekombinant DNA blev udført i henhold til de godkendte protokoller fra det institutionelle biosikkerheds udvalg (IBC) på Tulane University.
1. infektion af mus med blod-fase parasitter for Parasitemia analyse og myg infektion assays
- Dag-3: valgfri injektion af phenylhydrazin i modtager-mus
- Injicér outbred SW-eller CD1-modtager-mus (mus, der vil blive brugt til mygge infektion og mygge infektion) intraperitonealt (IP) med 100 μL phenylhydrazin (50 mg phenylhydrazin i 5 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS)) med en 26 G kanyle Sprøjte.
Bemærk: For robuste myg infektioner af p. berghei og p. yoelii, phenylhydrazin anvendes til at inducere reticulocytose i recipient mus, hvilket øger parasitemia og, efterfølgende, procentdelen af gametocytter, og signifikant øger exflagellation af mandlige kønsceller (figur 5), hvilket vil føre til en bedre myg stadier infektion for både p. berghei og p. yoelii stammer15,16,17, 18.
- Injicér outbred SW-eller CD1-modtager-mus (mus, der vil blive brugt til mygge infektion og mygge infektion) intraperitonealt (IP) med 100 μL phenylhydrazin (50 mg phenylhydrazin i 5 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS)) med en 26 G kanyle Sprøjte.
- Dag-2: injektion af frosne parasiske bestande i donor-mus
- Hurtigt tø kryopræserverede frosne bestande og straks injicere hver donor mus (typisk to mus per genotype) IP med ~ 200 μl af bestanden ved hjælp af en 26 G nål sprøjte.
Bemærk: Der er ikke mere end fem mus anbragt pr. bur inden for kontrollerede vivarium-indstillinger. - Begynd at kontrollere parasitemia under en 100x mikroskopet mål på Giemsa-farvede tynde blod smøre efter 24 h post infektion. Følg afsnit 2,1 i protokollen for Giemsa-farvede tynde blod udstrygninger.
Bemærk: På grund af den manglende evne til præcist at tælle de overlevende levedygtige blod stadier efter hurtigt optøning og injektion af kryopræserverede inficeret blod, modtager donor mus først den kryopreserverede blod. De inficerede erythrocytter af donor musen kan præcist kvantificeres og anvendes efterfølgende.
- Hurtigt tø kryopræserverede frosne bestande og straks injicere hver donor mus (typisk to mus per genotype) IP med ~ 200 μl af bestanden ved hjælp af en 26 G nål sprøjte.
- Dag 0: blødning fra donor-mus
- Bløder donor musene (Se afsnit 3,1), når deres parasitemia er mellem 0,1% og 1%, hvilket sædvanligvis opnås 2-3 dage efter frossen-Stock-infektion i tilfælde af p. yoelii 17X-NL og p. berghei Anka stammer.
- Brug ansigtet vene punktering (at komme mellem 200 og 500 μL), eller terminalt blødte dyrene ved hjerte punktering (for at komme mellem 600 μL og 1,2 mL) af inficeret blod. Dræder terminalt ved hjerte punktering som beskrevet i detaljer i afsnit 3,1.
Bemærk: Facial vene blødning er ikke en rutinemæssig metode til at opnå blod, da det er meget vanskeligere at anvende og er meget smertefuldt for mus, sammenlignet med Terminal blødning. Den optimale parasitemia til blødning af donor mus er mellem 0,1%-1%, fordi, på dette parasitemia område, der er meget få gametocytter (som ikke kan replikere til at producere aseksuelle blod faser) og der er mindre dobbelt-eller tredobbelt-inficerede erythrocytter (som gør kvantificeringen mindre nøjagtig).
- Dag 0: kvantificering af inficeret blod for at forberede doser af inficerede erythrocytter ved serielle fortyndinger
- Forbered seriefortyndinger af donorblod ved at tilsætte 100 μL blod til et mikrocentrifuge glas (fortyndings røret 1). Tilsæt 900 μL RPMI medium til tube 1 og bland godt ved pipettering op og ned med samme pipettespids, hvilket skaber en 1:10 fortynding.
- Tag 100 μL af det fortyndede blod fra tube 1, og tilsæt det til et nyt mikrocentrifuge glas (fortyndings røret 2). Tilsæt 900 μL RPMI medium til tube 2 og bland godt ved pipettering op og ned med samme pipettespids, hvilket skaber en 1:100 fortynding.
- Gentag trin 1.4.1 og 1.4.2 for at foretage yderligere to serielle fortyndinger, hvilket skaber 1:1000 (fortyndings slange 3) og 1:10000 fortyndinger (fortyndings slange 4).
- Tilsæt 12 μL fortyndet blod fra tube 3 og 12 μL fortyndet blod fra Tube 4 til forskellige sider af et hemocytometer og bestemme det gennemsnitlige antal erythrocytter på hver side af hemocytometer. Multiplicer disse tal med 10. Disse tal multipliceres med henholdsvis fortyndingsfaktoren 1.000 eller 10.000 for at bestemme antallet af erytrocytter i 1 μL af hver fortynding.
- Del det ønskede antal inficerede erythrocytter, som skal injiceres med antallet af erythrocytter i 1 μL af hver fortynding for at bestemme mængden af fortyndet donorblod, der er nødvendigt til injektion. Vælg fortyndingen med den mest passende mængde til injektion, tilsæt lydstyrken til et nyt mikrocentrifuge glas, og Fuldfør den til 120 μL med RPMI medium.
- Dag 0: intravenøs injektion af modtager-mus
- Placer modtager musene under en varme rød lampe for at dilatere deres vener til injektion. Læg parasi-doserne i en 27 G insulin sprøjte og Placer modtager musen i en fastholdelses.
- Injicer 1.000.000 eller 10.000 inficerede erythrocytter intravenøst (IV) ved hjælp af 27 G insulinsprøjten i hver modtager mus for myg infektion assays eller for aseksuelle og seksuelle blod-fase vækst assays, hhv. Fortsæt med at vedligeholde musene under normale boligforhold.
Bemærk: En IP injektion er en indirekte metode til at indføre parasitter i blodbanen, som parasitiserede erythrocytter nødt til at passere gennem de drænende lymfeknuder i bughulen for at nå blodet. Dette gør en IP injektion en indirekte levering rute for indsprøjtning af et præcist antal parasitter i blodbanen. Derfor foretrækkes IV-ruten, da den leverer nøjagtige parasi-doser direkte ind i blodbanen, som vist i figur 3 og beskrevet i de repræsentative resultater.
2. bestemmelse af den blod-Stadium Parasisite belastning for seksuelle og aseksuelle stadier
Bemærk: I dette afsnit, er standardiseret fænotypiske evalueringsmetoder af malaria parasitter blod stadier opført. Disse metoder er nyttige i evalueringen af nye malaria-eller vaccinekandidater eller endda gen knockout på seksuelle og aseksuelle stadier udvikling i de samme eksperimentelle mus. Af note, p. chabaudi og p. vinckei er også meget rationelle og vigtige alternative muligheder for disse typer af assays, især i Drug screening.
- Bestemmelse af parasitemia af aseksuelle stadier og mandlige vs kvindelige gametocytter af Giemsa-farvede tynde blod udstrygninger for parasitære vækst assays
- Ved hjælp af en 26 G eller 27-G nål, prik musens hale og indsamle blodet dråbe på en mikroskop slide. Brug den korte kant af et andet mikroskop slide til hurtigt at smøre blodet hen over diaset.
- Fastgør diaset med 100% methanol i mindst 1 min, først efter at blodet er helt tørret på sliden. Pletten i 10% Giemsa i 10-15 min. vask sliden med enkelt-eller dobbeltdestilleret vand, og lad den tørre.
- Læs diaset ved hjælp af en 100x mål og olie nedsænkning under et let mikroskop. For en nøjagtig parasitemia måling, kontrollere mindst i alt 6.000 erythrocytter, som kan opnås ved at tælle mindst 30 eller 40 mikroskopiske gitre med et gennemsnitligt antal af 200 eller 150 erythrocytter (RBCs) per gitter, hhv. Tæl det samlede antal RBCs i det første og sidste gitter for at bestemme det gennemsnitlige antal røde blodlegemer for alle gitre.
- Tæl det samlede antal inficerede erythrocytter pr. gitter. Mandlig og kvindelig gametocytter kan tælles separat for at bestemme gametocytemia, men bør også indgå i den totale parasitemia tælle.
- Bestem den totale parasitemia procent ved at dividere det samlede antal parasitære erythrocytter med det samlede antal RBCs observeret. Multiplicer dette tal med 100 for at bestemme parasitemia procenten.
- Bestemme gametocytemia ved at dividere det samlede antal gametocytter tælles med det samlede antal RBCs observeret. Multiplicer dette tal med 100 for at bestemme gametocytemia procent pr. mus.
Bemærk: Den eneste pålidelige metode til differentiering mellem forskellige aseksuelle og seksuelle blod stadier er brugen af et mikroskop til at evaluere Giemsa-farvede tynde blod udstrygninger, da hver af faserne har forskellige morfologi, med undtagelse af umodne gametocytter, som er for det meste umulig at skelne fra aseksuelle blod stadier.
- Bestemmelse af blod stadiet parasitemia ved flow cytometri for fluorescerende reporter protein-ekspression WT-lignende parasitære stammer
- Der udtages to mikrocentrifuge glas til hver muse prøve, som udpeger et rør til en 1:1000 fortynding og den anden til en fortynding på 1:2000. Tilsæt 1,5 μL 1x heparin til 1:1000 fortyndings røret.
- Ved hjælp af en 26 G eller 27 G nål, prik musens hale og Overfør 1,5 μL blod til røret indeholdende 1,5 μL 1x heparin (1:1000 fortyndings røret). Bland blodet og 1x heparin forsigtigt sammen ved pipettering op og ned.
- Tilsæt 1.497 μL RPMI-medium til mikrocentrifuge røret, og pipér forsigtigt op og ned for at blande det godt.
- 500 μL af blandingen overføres fra fortyndings røret 1:1000 til fortyndings røret 1:2000. Tilsæt 500 μL RPMI-medium til 1:2000-røret, og bland forsigtigt ved pipettering op og ned.
- Følg producentens relevante opstarts protokol for flow cytometer. Kør prøverne med en langsom strømningshastighed, og Indstil detektionsværdien til mindst 20.000 hændelser.
Bemærk: Der er en alternativ praktisk analyse til at måle parasitemia via TRICOLOR FACS sortering, uanset om parasitter Express fluorescerende markører eller ikke34. Men den analyse, der er beskrevet her, giver en nøjagtig måling af parasitemia i levende parasitter uden tilsætning af DNA-bindende farvestoffer og brug af FACS sortering.
- Bestemmelse af exflagellationsprocenten for mandlige gameter pr. mikroliter inficeret muse blod
- Klargør et 1:10 fortyndings mikrocentrifuge glas med 40 μL ufuldstændigt ookinete medium (RPMI + natriumbicarbonat + hypoxanthin + xanthurensyre) og 5 μL 1x heparin.
- Ved hjælp af en 26 G eller 27 G nål, prik musens hale og overføre 5 μL blod (ved hjælp af en mikropipette) hurtigt til røret, der indeholder den ufuldstændige ookinete Media + heparin. Bland forsigtigt og læg 12 μL af 1:10 blod fortyndingsrøret på et hemocytometer, og lad det ligge ved stuetemperatur (20-24 °C).
- Begynd at tælle exflagellations hændelserne 9-10 min efter klargøring af 1:10 fortyndingen. Brug en fasekontrast lys mikroskop med 40x forstørrelse.
- Multiplicer det gennemsnitlige antal exflagellation hændelser tælles med 10 og derefter multipliceres med fortyndingsfaktoren (10) for at bestemme det gennemsnitlige antal exflagellation pr. mikroliter inficeret blod.
Bemærk: Denne analyse måler antallet af mandlige gamet exflagellation hændelser i en 1 μl volumen af blod, som kan kvantificeres ved hjælp af en hemocytometer. En ufuldstændig ookinete medium18 blandes med blodet til nøje at efterligne de betingelser, hvorunder exflagellation forekommer inde i myg ileum kort tid After et blodmåltid.
3. isolering og behandling af blod-fase parasitter fra inficerede erythrocytter og frosne bestand forberedelse
- Terminal blødning af inficerede gnavere ved hjerte punktering
- Forbered en 26 G nål sprøjte, der indeholder ca. ≤ 20 μL 1x heparin (200 enheder/mL) til at indsamle blod fra donor musen ved hjerte punktering.
- Brug en langsom strøm af co2 til at aflive musen før blødning. Alternativt, bedøve musen med isofluran (som skal opretholdes før og under huden indsnit at udsætte hjertet).
- Læg musen på ryggen og fastgør dens vedhæng. Lav et lille snit i huden nær bunden af brystbenet ved at trække op i huden med pincet og skære det med en saks. Træk huden fra hinanden på stedet af snittet for at udsætte membranen og toppen af bughulen.
- Hold bunden af ribburet med tang og skåret gennem membranen for at komme ind i brysthulen; Pas på ikke at beskadige hjertet eller lungerne. Fastgør ribburet tilbage for at udsætte hjertet.
- Forsigtigt punktere hjertet og langsomt trække op på sprøjtens stempel for at indsamle ~ 1 mL blod og overføre det til et mikrocentrifuge glas.
- Fremstilling af frosne bestande af inficeret blod
- Dræd musene (Se afsnit 3,1) med blodparasitære, der er mellem ca. 2% og 5%, med en betydelig mængde ring stadier og ikke så mange gametocytter.
- Bland den ønskede portion blod med fryse opløsning (10% glycerol i Alsever opløsning) i et 1:2-forhold, og opbevar det i kryogene hætteglas. Fryse i flydende nitrogen.
- Isolering og rensning af blod-fase parasitter til udvinding af DNA, RNA, og proteiner
- (Se pkt. 3,1) med parasitære blod, der er højere end 0,5%.
- Tilbered en 10 mL sprøjte ved at fjerne stemplet og indsætte en lille vatpind. Pak bomulden ned i bunden af sprøjten. Den fyldes med cellulose, indtil cellulose niveauet når 3 mL-mærket, men ikke overskrider 4 mL-mærket på sprøjten.
- Fastgør sprøjten til et klip på en ring stander og Anbring et affalds opsamlings rør under det. Tilsæt 5 mL PBS til sprøjten, og lad den flyde igennem ind i affalds røret.
- Forbered frosne bestande, hvis det er nødvendigt, ved hjælp af kun 100-300 μL blod. Tilsæt resten af det inficerede blod (400-700 μL) til kolonnen. Saml strømmen igennem med et spild rør, indtil dråberne begynder at blive røde. Når dråberne begynder at blive røde, skal du placere en ny 14-mL-opsamlings slange under sprøjten for at indsamle strømmen igennem.
- Når strømmen begynder at løbe langsomt, tilsættes PBS til sprøjten, og strømmen opsamles i 15 mL-røret, indtil der er nået et samlet volumen på 14 mL. Saml det resterende flow igennem med et affalds rør.
- Centrifuger 14 mL røret med blod/PBS-blanding i 8 min ved 250 x g uden bremser. Supernatanten fjernes og tilsættes 14 mL kølet saponin (50 mg saponin i 50 mL PBS). For at opløse pellet, invertere røret flere gange og vortex hvis det er nødvendigt.
- Centrifuger røret i 8 minutter ved 1.217 x g uden bremser. Fjern supernatanten, og efterlader ca. 0,5 mL af opløsningen over pellet.
- Resuspension af pellet i opløsningen ved hjælp af en mikropipette og overfør den til et mikrocentrifuge glas. Tilsæt 500 μL PBS til 14 mL røret for at vaske eventuelle resterende parasitter, der er tilbage i røret. Tilsæt dette til det samme mikrocentrifuge glas.
- Centrifuger røret i 2 min. ved 6.010 x g. Supernatanten fjernes, og 1 mL PBS opblandes. Centrifuger i 2 min. ved 9.391 x g.
- Fortsæt med at udtrække genomisk DNA, total RNA og protein.
- For genomisk DNA-ekstraktionfjernes supernatanten og resuspension af pellet i 200 μl PBS, og derefter følger en passende protokol af gDNA udvinding.
- For Total RNA-ekstraktionskal du fjerne supernatanten, resuspendere og vortex pellet i 1 ml af enhver phenol-og guanidin isothiocyanatbaseret opløsning eller et andet egnet reagens og derefter følge en passende protokol med total RNA-ekstraktion.
- For Total proteinekstraktionfjernes supernatanten, resuspension af pellet i et passende volumen af 6x natriumdodecyl sulfat (SDS)-loading Dye eller enhver anden egnet reagens og derefter følge enhver passende protokol af samlede protein behandling.
4. myg infektion assays
Bemærk: Myg er den primære vært for malaria parasitter, hvor seksuel reproduktion finder sted. Infektionen af mus til at overføre malaria parasitter til myg udføres ved en i.v. injektion af mindst 1.000.000 blod stadier, efterfulgt af fodring af en inficeret mus (fra hver genotype, der viser den højeste mandlige gamet exflagellation Rate) til Anopheles myg i et bur på dag 3 post-mus-infektion. IV injektion med 1.000.000 blod-fase parasitter i phenylhydrazin-behandlede mus vil sikre udviklingen af mandlig og kvindelig gametocyte i en hurtigere og højere sats. Myg inficeret med p. yoelii og p. berghei inkuberet ved 24 °c og 20-21 °c, henholdsvis for at give mulighed for den bedst mulige myg faser udvikling6.
- Myg fodring og bestemmelse af antallet af ookinetes per myg
- Starve voksne kvindelige Anopheles stephensi eller A. malariamyg myg (4-7 dage gammel) for 8-12 h før fodring. Lad voksne myg til at fodre i mindst 15 min på de inficerede bedøvet mus (injiceres med en passende dosis af ketamin/xylazine) med den højeste exflagellation sats (målt i punkt 2,3).
Bemærk: Ketamin/xylazin arbejdsopløsning er fremstillet ved 1:5 fortynding af stamopløsningen i saltvand og IP indsprøjtning 100 μL per mus. For en 10 mL stamopløsning tilsættes 1 mL xylazin (100 mg/mL) til 9 mL ketamin (100 mg/mL). - Fjern mad kvindelig myg og mandlige myg med en mund aspirator.
- Ved 18-20 h postfeeding, indsamle 20-30 myg og placere dem i fryseren for ikke mindre end 10 min for at sikre døden. Ved hjælp af et Binokulært dissektions område dissekerer 20-30 blod fyldte midguter med 2 26 g eller 27 g nåle eller en nål og tang i rpmi eller PBS dissektions medium og overfører midguterne til et mikrocentrifuge glas, der indeholder 200 μl rpmi eller PBS (for dissektion-metode Se venligst afsnit 4,3).
- Centrifuger opsamlingsrøret i 1 min. ved 700 x g. Grind de pelleteret midguts ved hjælp af en Pestle. Gentag dette trin.
- Overfør 50 μL fra røret af jord midguts til et nyt mikrocentrifuge glas. Der tilsættes 200 μL RPMI eller PBS for at skabe en 1:5 fortynding.
- Overfør 12 μL til et hemocytometer, og Inkuber det ved stuetemperatur i 5 minutter for at tillade, at indholdet afregnes.
- Bestem det gennemsnitlige antal ookinetes ved hjælp af et let mikroskop med en fasekontrast og 40x forstørrelse.
- Det gennemsnitlige antal modne ookinetes multipliceres med 10 og derefter med fortyndingsfaktoren 5 for at bestemme det gennemsnitlige samlede antal ookinetes.
- Dividerer det gennemsnitlige antal ookinetes med antallet af blod fodret myg, som er dissekeret for at bestemme antallet af ookineter pr. blod fodret myg.
- Starve voksne kvindelige Anopheles stephensi eller A. malariamyg myg (4-7 dage gammel) for 8-12 h før fodring. Lad voksne myg til at fodre i mindst 15 min på de inficerede bedøvet mus (injiceres med en passende dosis af ketamin/xylazine) med den højeste exflagellation sats (målt i punkt 2,3).
- Bestemmelse af antallet af tidlige oocyster for fluorescerende reporter protein-ekspression WT-lignende parasitisk stammer
Bemærk: Formålet med denne analyse er at bestemme antallet af levende parasitter, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP), som etablerede en fuld infektion af myg midguts og dannede tidlige sfæriske oocyster. Denne analyse afgør, om ookinetes (deres udvikling anslået i den foregående analyse) færdiggjorde deres funktioner af Traversal gennem myg ileum epiteliale celler og omdannelsen til tidlige oocyster på basal lamina side af ileum epitel eller ej. Dette er en anden analyse, der gør stor brug af parasitter udtrykker GFP, som tælle tidlige oocyster på dette stadium vil være næsten umuligt uden kedelig immun farvning.- Dissekere midguterne (Se afsnit 4,1) af 20-30 blod-fodret myg, på dag 3 eller 4 efter myg-fodring (PMF) for p. yoelii 17x-NL, og på dag 6 eller 7 PMF for p. berghei Anka, med 2 26 G eller 27 g nåle eller en NÅL og tang i rpmi eller PBS dissektion m meget (for dissektion-metode henvises til afsnit 4,3).
- Spred 40-50 μL dissektions medium på den vandrette midterlinje i den længere kant af glas diaset. Overfør midguts til denne linje, en ad gangen, under dissektion, og tilsæt mere medium til midterguts, hvis det er nødvendigt, for at undgå udtørring.
- Placer en dækseddel forsigtigt på de dissekterede midguts, og forsegle den med neglelak.
- Ved hjælp af 10x-eller 20x-målsætningen for fluorescens mikroskop med det grønne fluorescens filter tælles antallet af tidlige oocyster på hver midgut i mindst 20 midtarter.
- Bestemmelse af antallet af oocystiske sporozoiter pr. myg
- Dissekerer midguterne på mindst 20-30 myg med 2 26-G eller 27-G nåle eller en nål og tang i RPMI eller PBS dissektions medium og samler de dissekterede midguts i 200 μL RPMI.
- Hold de nedre underliv segmenter fast på plads med en nål (eller pincet) og let skubbe thorax i en opadgående retning med den anden nål i krydset mellem brystkassen og maven. Gør omhyggeligt korte skubber indtil thorax adskiller fra maven. Så snart adskillelsen starter den hvide ileum vises strakt, og derefter ileum vil blive skåret fra spiserøret ende ved hjælp af den samme nål, der blev brugt til at adskille brystkassen. Hvis der stadig er fastgjort til maven, kan den samme nål bruges til at trække midt tarmen væk fra maven. Overfør midguts af alle myg til opsamlingsrøret ved at samle dem fra mediet med en nål, en ad gangen.
- Centrifuger opsamlingsrøret i 1 min ved 700x g for at udligne midterguterne til bunden af opsamlingsrøret og slibe dem med en Pestle. Gentag dette trin.
- Overfør 12 μL til et hemocytometer, og Inkuber det ved stuetemperatur i 5 minutter for at tillade, at indholdet afregnes.
- Tæl de oocystiske sporozoiter ved hjælp af en 40X mål af et let mikroskop. Brug 1:5 og/eller 1:10 fortyndinger hvis myg snavs forhindrer præcis optælling af sporozoiter eller hvis antallet af sporozoiter er for høj til at tælle nøjagtigt.
- Beregn det gennemsnitlige samlede antal oocystiske sporozoiter ved at multiplicere det gennemsnitlige antal sporozoiter med 10 og derefter multiplicere dette tal med fortyndingsfaktoren, hvis der er nogen, og med det samlede volumen (200 μL).
- Dividerer det gennemsnitlige samlede antal sporozoiter med antallet af myg dissekeret for at beregne det gennemsnitlige antal oocystiske sporozoiter pr. myg.
Bemærk: En almindelig fejl til måling af succes eller produktivitet i myg stadier infektion er optælling af antallet af oocyster i senere stadier af oocysttal udvikling. Dette skyldes, at nogle oocyster bliver vakuoliseret på senere tidspunkter af oocysttal udvikling, og andre undlader at udvikle sporozoiter, selv på samme midgut. Den bedste og mest pålidelige metode til at bestemme produktiviteten af myg stadier infektion er optælling af det gennemsnitlige antal ileum oocysttal sporozoiter på dage 10-12 post-Mosquito-infektion for P. yoelii og på dage 12-14 post-myg-infektion for P. berghei.
- Bestemmelse af antallet af spytkirtel sporozoiter per myg
Bemærk:Den ultimative evaluering af den fulde færdiggørelse af myg faser udvikling opnås ved at anslå antallet af sporozoiter, der invaderede spytkirtel, som er de overførbare og infektiøse stadier til hvirveldyr. Invasionen af spytkirtel er etableret efter færdiggørelsen af oocysttal sporozoite udvikling, udgang i hemolymph, fastgørelse til basal lamina af spytkirtel acinic celler, og Traversal af acinic celler til at nå spytkirtlerne Kanaler5. Derfor er denne analyse også en evaluering af succesen af alle disse processer eller ej. Ikke desto mindre, en vurdering af hemolymph sporozoite numre ville tillade differentiering mellem defekter i udgangs fra oocyster og defekter i invasionen af spytkirtler35. Oprensning af spytkirtel sporozoiter gør det muligt at gennemføre flere funktionelle assays på sporozoit motilitet og invasion fænotyper. Den spytkirtel sporozoiter kan også bruges til in vivo infektion af mus og i immunisering undersøgelser36,37. Desuden, de mest reproducerbare stadier til rådighed til at etablere en in vitro-lever fase invasion eller en udvikling assay er ved brug af spytkirtel sporozoiter.- Dissekere spytkirtlerne af 50-100 kvindelige myg, på dage 14-16 PMF for p. yoelii og på dage 17-20 PMF for p. berghei, fortrinsvis med 2 26 g eller 27 g nåle, i RPMI eller DMEM medium holdes på is og suppleret med 5% føtal kvægserum (FBS) eller/kvægserum albumin (BSA) for p. yoelii sporozoiter eller 3% FBS/BSA for p. berghei sporozoiter. Hvis sporozoitterne skal anvendes i hepatoma in vitro-assays, tilsættes 1% penicillin/streptomycin til dissektions mediet. Der er generelt to metoder til dissektion af spytkirtlerne. Den første metode er tidskrævende, men fører til dissektion af spytkirtler med meget lidt eller ingen kontaminerende væv. Den anden metode er mindre tidskrævende, men fører til indsamling af en betydelig mængde kontaminerende væv. Den første metode er beskrevet her.
- Hold de øvre abdomen segmenter på plads med den skrå side af den ene nål og forsigtigt skubbe hovedet meget let (i meget korte skubber) ved krydset mellem hovedet og thorax i en opadgående retning, indtil hovedet er omhyggeligt adskilt fra thorax uden rive op de glasagtig spytkirtler, de eksponerede spytkirtler adskilles derefter fra hovedet med den samme nål, der skubbede hovedet opad.
- Den dissekeret spytkirtel vil blive hævet fra dissektions mediet ved hjælp af en kort glas Pasteur-pipette.
- Når alle spytkirtler er blevet dissekeret og høstet, vil talent placere røret, der indeholder midguts, i centrifugen (1min, 700 x g).
- Tæl sporozoiter ved hjælp af en hemocytometer under en lys mikroskop sat til fase 2 kontrast og 40x forstørrelse. Hvis antallet af myg dissekeret ≥ 40, fortyndes spytkirtlerne til 1:5 eller 1:10, afhængigt af den forventede infektivitet udbytte (bestemt i tidligere assays).
- Multiplicere det gennemsnitlige antal sporozoiter med 10 og fortyndingsfaktoren (hvis nogen). Multipliceres med det samlede volumen for at bestemme det gennemsnitlige antal spytkirtel sporozoiter. Divideres med antallet af dissekeret kvindelig myg for at bestemme den gennemsnitlige spytkirtel sporozoiter per myg.
Bemærk: Problemet med dissektion af spytkirtlerne er deres lille størrelse og glasagtig transparent udseende. Således er det meget vanskeligt at isolere spytkirtlerne, og derfor er de normalt dissekeret som et engangsbeløb med andre væv fra den forreste del af thorax, hvilket også er vigtigt at beskytte spytkirtlerne fra ruptur under samlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesen med at anvende omvendte genetiske værktøjer og teknikker til malaria parasitter har revolutioneret området for malaria forskning, med evnen til at tilføje, slette eller ændre specifikke genomiske segmenter af flere Plasmodium arter39. Vigtigere er, at undværes genomloci er blevet identificeret og anvendt med succes til at introducere fluorescens protein markører i gnavere og humane malaria parasitter ved dobbelt homologe rekombination, for at sikre et stabilt udtryk i alle livscyklus stadier40 ,41,42. Et eksempel på disse WT-lignende transgene parasitter er Py230p (-) parasitter, som er blevet genereret i vores laboratorium, og viste ingen tilsyneladende defekt i udviklingen af blod og myg livscyklus stadier15,16, 17. disse transgene reporter parasitter udtrykte egfp, under kontrol af den stærke og konstitutive promotor af PyHSP70, i blod stadier (figur 1a) ookinetes (figur 1b), unge oocyster (figur 1c ) på Anopheles stephensi midguts, og i sporozoiter isoleret fra spytkirtlerne af Anopheles stephensi hunner (figur 1d). Således gjorde de eGFP-udtrykte blod parasitter det meget lettere og mindre tidskrævende at evaluere blod-Stadium parasitemia ved hjælp af flow cytometri mellem forskellige genotyper af transgene parasitter eller mellem stof-behandlede og-ubehandlet i Drug-målretning undersøgelser ved hjælp af transgene reporter parasitter.
For at bekræfte, at der ikke er nogen kvantitativ forskel mellem anvendelsen af flowcytometri og det mere kedelige parasitemia-skøn ved mikroskopi, blev den eGFP-udtrykte Pyp230p (-) anvendt til at anslå procentdelen af parasitære erythrocytter ved flow flowcytometri og af Giemsa-farvede tynde blod smøre i en gruppe af schweiziske Webster mus IV-inficeret med 10.000 parasitiserede erythrocytter. Flowcytometri parasitemia% værdierne svarede direkte til den anslåede parasitemia% ved at monitorere Giemsa-farvede fortyndede blod udstrygninger, som blev anslået af to videnskabsmænd (figur 2). Dette repræsenterer en mere præcis alternativ til den kedelige og tilbøjelige-til-menneske-fejl metode til mikroskopi i bestemmelsen af vækstraten af blod-fase parasitter.
En vigtig uoverensstemmelse forbundet med infektion af gnavere med malaria parasitter blod stadier er valget af smitte vejen, med en stærk præference i litteraturen for IP sammenlignet med IV smitte rute, da det er mindre tidskrævende. For at sammenligne disse to infektionsveje blev to grupper af fem BALB/c-mus inficeret med 1.000 eGFP-udtrykte Pyp230p (-) parasitære erythrocytter pr. mus, enten gennem IV eller IP-ruter. Parasitemaen blev overvåget dagligt ved hjælp af flowcytometri i en periode på 4 dage. En statistisk signifikant nedgang i den IP-inficerede gruppe parasitemia% sammenlignet med den IV-inficerede gruppe blev noteret på alle dage testet (figur 3). Dette giver bevis for, at IV infektion rute er en mere kvantitativt nøjagtige vej af infektion for assays med malaria parasiten blod stadier.
Ikke desto mindre, en begrænsning til brugen af flow cytometri at evaluere blod-Stadium parasitemia er sondringen mellem seksuelle og aseksuelle stadier og mellemmand lige og kvindelige gametocytter. Derfor skal skønnet over procentdelen af hver af de forskellige aseksuelle og seksuelle stadier (figur 4) afhænge af en morfologi evaluering af Giemsa-farvede tyndt blod smear. På trods af den tilsyneladende forskellige morfologi af modne mandlige og kvindelige gametocytter (figur 4), umodne seksuelle stadier er ofte umulig at skelne fra aseksuelle stadier.
En væsentlig funktion af de mandlige gameter ved fremkomsten af mandlig gametocyte i myg ileum er den mandlige gamet exflagellation, som er et meget kritisk skridt i transmissionen, der skal ske inden for en meget kort periode. Der er beskrevet variable metoder til at evaluere dette i mange forskellige systemer. Heri, vi viser en standardiseret metode, der kan gentages i enhver simpel Lab indstilling. Vi vurderede mandlig gamet exflagellation med eller uden injektion af phenylhydrazin i modtager mus (figur 5). Vi kunne vise, at phenylhydrazin behandling signifikant (fire gange) øget satsen for mandlig gamet exflagellation, som igen vil øge gødskning sats og antallet af alle efterfølgende myg stadier.
Figur 1 : Udviklingen af P. yoelii p230p (-) parasitter udtrykke egfp i blod og myg stadier. (A) billede af blandede blodets parasitter (1.000 x forstørrelse). (B) billede af ookinete (400x forstørrelse). (C) billede af en Anopheles stephensi Mosquito ileum inficeret med dag 4 PMF tidlige oocyster af levende p230p (-) parasitter udtrykker egfp (100x forstørrelse). (D) dette panel viser et live billede af en P. yoelii p230p (-) spytkirtel sporozoit, dissekeret ud på dag 15 PMF, der udtrykker egfp (400x forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Flowcytometri og mikroskopi evalueringer af den gennemsnitlige parasitemia P. yoelii p230p (-) parasitter er ikke signifikant forskellige. En gruppe på fire schweiziske Webster mus blev intravenøst inficeret med 10.000 parasitiserede erythrocytter af Pyp230p (-) per mus og den gennemsnitlige parasitemias i blodet blev registreret dagligt i 7 dage ved flow cytometri og ved mikroskopisk evaluering af Giemsa-farvede tynde blod udstrygninger fra i alt 20.000 og ~ 6.000 erythrocytter, hhv. De mikroskopiske undersøgelsesresultater, der er vist, er gennemsnittet af to undersøgelser af to videnskabsmænd pr. slide, og tidspunktet for vurdering af parasitemia af hvert dias var mindst 10 minutter af hver videnskabsmand. Ingen væsentlige forskelle kunne påvises på nogen af de dage, der er vist her. De gennemsnitlige værdier for alle parasit stammer blev analyseret med den to-tailed te-test. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : En intravenøs injektion af P. yoelii p230p (-) parasitter giver signifikant forskellige blod-Stadium parasitemia fra en intraperitoneal injektion. To grupper af fem BALB/c-mus blev inficeret med 1.000 parasitiserede erythrocytter af Pyp230p (-) pr. mus, enten gennem den intravenøse eller intraperitoneale rute, og den gennemsnitlige parasitemias i blodet blev registreret dagligt i 4 dage ved flow cytometri fra i alt 20.000 erythrocytter. Der kunne påvises en statistisk signifikant reduktion (angivet med en Asterisk) af parasitemia i blodet for alle dage, der blev testet i intraperitoneal-rutegruppen sammenlignet med den intravenøse rutegruppe. De gennemsnitlige værdier for alle parasit stammer blev analyseret med den to-tailed te-test. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Morfologi af P. yoelii gametocytter i en Giemsa-farvede tyndt blod smear. Et billede af en Giemsa-farvede tynde blod smøre (1.000 x forstørrelse) af en schweizisk Webster mus inficeret med WT P. yoelii 17x-NL stamme viser den typiske blålig farvede kvindelige gametocyte på venstre side (betegnet med en pil) og den Rosa farvede mandlige ( angivet med en Asterisk) gametocyte på højre side af billedet. De andre viste stadier er aseksuelle blod stadier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Virkningen af phenylhydrazin på mandlig gamet exflagellation. Virkningen af phenylhydrazin injiceret i recipient mus 5 dage før den mandlige gamet exflagellation rate vurdering af P. yoelii. Phenylhydrazin øger hastigheden af mandlig gamet exflagellation, hvilket fører til en højere myg stadier infektion post-myg-fodring. De gennemsnitlige værdier for alle parasit stammer blev analyseret med den to-tailed te-test. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På trods af ligheden i den generelle biologi i deres liv cykler til at af menneskelige malaria parasitter, mus malaria modeller har også mange forskelle til menneskelige Plasmodium arter, der ville begrænse deres anvendelse som pålidelige in vivo modeller. For eksempel, med undtagelse af levende svækkede parasitter som vacciner, alle vaccine undersøgelser med underenhed og DNA og andre vacciner gav fremragende resultater i musemodel, men hos mennesker, der bor i endemiske områder, resultaterne var langt fra tilfredsstillende.
Et andet problem er forskellen i livscyklus fase infektivitet fra en mus stamme til en anden, og nogle gange fra en dyr leverandør til en anden for den samme mus stamme. Desuden er de vigtigste to gnavere malaria arter, der er almindeligt anvendt som foretrukne in vivo malaria modeller, p. berghei og p. yoelii, ikke udviser en synkron blod-fase cyklus, som er helt forskellig fra enhver menneskelig malaria Parasit. Men fordelene ved at bruge mus malaria parasitter som in vivo modeller opvejer langt disse forskelle, som også kan overvindes ved mere dybtgående analyser af de molekylære drev af disse begrænsninger. Ikke desto mindre, disse begrænsninger er for det meste vises af gnaver malaria blod-fase parasitter, men ikke så meget for de andre livscyklus stadier af malaria parasitten.
Selv om blod stadier er vigtige for forskellige vaccine, narkotika målretning, immunologi, og funktionelle genomundersøgelser, der er en knaphed på standardiserede metoder og protokoller, der koncentrerer sig om den phenotypiske analyse og funktionelle analyser, der involverer gnaver malaria parasitten blod-fase parasitter, med mere fokus på myg transmission og transfektering protokoller. Derfor, metoderne i denne artikel vil bidrage til at give standardiserede og forenklede protokoller for at studere de sygdomsfremkaldende stadier af gnavere malaria parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ahmed Aly understøttes af finansiering til Bezmialem Vakif University fra det tyrkiske ministerium for udviklingstilskud 2015BSV036, og ved hjælp af midler fra Tulane University School of Public Health og Tropical Medicine, og ved at støtte fra NIH-NIAID for R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
