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Immunology and Infection

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

doi: 10.3791/55688 Published: May 30, 2019

Summary

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。

Abstract

近年の遺伝学・システム生物学技術の進歩により、マラリア原虫の生物学に対する理解が分子レベルで進められています。しかし、ワクチンや化学療法の開発に有効なマラリア原虫標的は依然として限られている。これは主に、ヒトプラスモジウム種の生体内感染モデルの関連性と実用的性の欠如によるもので、特にP.ファルシパラムおよびP.vivaxに対して特に。従って、げっ歯類マラリア種は、マラリアワクチン、薬物標的化、免疫応答、および保存されたプラスモジウムスップ遺伝子の機能特性特性研究の生体内モデルにおいて実用的な代替手段として広く使用されている。実際、げっ歯類のマラリアモデルは、特に蚊の伝染や肝臓期生物学の探索に非常に貴重であることが証明されており、免疫学的研究に欠かせない存在でした。しかし、トランスジェニックおよび野生型の無性および性的血液段階寄生虫の表現型を評価するために使用される方法には矛盾がある。これらの不一致の例は、血液段階寄生虫を伴うげっ歯類の静脈内感染と腹腔内感染の選択およびオスのガメテ外発性の評価である。ここでは、レポーター遺伝子または野生型げっ歯類マラリア原虫種を発現するトランスジェニック寄生虫における無性および性的血液段階の表現型を評価するための標準化された実験方法を詳細に説明する。また、アノフェレス蚊ベクター内のマラリア寄生虫の蚊の段階(ガメテス、オキネテス、卵胞、スポロゾイテス)の現象型を評価する方法についても詳しく述べる。これらの方法は、P.ベルゲヘイとP.ヨーエリの致死株と非致死株のためにここで詳細かつ簡素化されていますが、P.チャバウディとP.ヴィンケイげっ歯類マラリア種にいくつかの調整を適用することもできます。

Introduction

マラリア原虫は世界中のヒトで数億人のマラリア感染を引き起こし、毎年60万人以上が死亡しています。ヒト感染は、5つのマラリア原虫種、すなわちP.ファルシパラム、P.ビバックス、P.楕円形、P.マラリア、およびP.ノレシによって引き起こされる。ほとんどの臨床マラリアの死亡率は、サハラ以南のアフリカ1のP.ファルシパルムによって引き起こされる。サハラ以南のアフリカ以外で広範な世界的罹患率を引き起こすもう一つのヒトマラリア寄生虫種はP.vivax2である。他の3種は、すべて地理的に制限されており、致死性P.ノウレシ3を除いて、良性マラリア感染を引き起こす。感染症の生体内モデルにおける関連的で実用的な非ヒトの利用不能は、常に存在し、依然としてマラリアワクチンと薬剤開発の障害となっている。以前のマラリア薬の標的化と代謝研究は、P.ガリナセウムおよびP.lophuraeのような鳥のマラリアモデルに広く依存しており、それぞれ4.その後、げっ歯類のマラリア種は、生体内モデルのように様々なワクチンや薬物標的研究に徐々に導入された。長年にわたり、げっ歯類マラリアモデルとヒトマラリア種のライフサイクル段階の生物学と宿主寄生虫相互作用の類似性の証拠が蓄積されてきました。

特に、げっ歯類マラリアモデルは、蚊および前赤血球期5の生物学を探索し、特徴付けるために非常に重要であった。しかし、4つのげっ歯類マラリア種(P.ベルヘイ、P.ヨーエリ、P.シャバウディ、P.ヴィンケイ)が異なる生物学的特徴を有し、その中で最も顕著なのは血液段階6である。げっ歯類マラリア種は、P.チャバウディとP.ビンケイ株の血液段階がほとんど同期しているが、P.ベルゲヘイとP.ヨエリの血液段階は6ではない血液段階の同期性が異なる。,7.もう一つの顕著な違いは、いくつかの株で発生する血液段階の自己クリアランス(えば、P.ヨーエリ17X-NL、P.ベルギーNK65、およびP.ヴィンケイレンタム)、他の血液感染である。 同じ種の株は、未処理のまま放置すると致死する可能性がある(P.ヨーエリ17X-L、P.ベルグヘイANKA、およびP.チャバウディAS)。また、P.エリ17X-NL株およびP.ベルゲイANKA株は、Pのこれらの特徴であるが、網状細胞8、9、10、11を優先的に侵入する。ヨエリとP.ベルゲイ株は、厳格な成長要件12、13、14ではありません。したがって、マウスは、P.ベルグヘイANKA株およびP.ヨーエリのために蚊の感染に必要な寄生虫血症とゲームトサイト血症を増加させるために、それらの寄生虫の血液段階に感染する前にフェニルヒドラジンで治療される17X-NL1516171819.

蚊の段階の発達の違いはまた、異なるげっ歯類マラリア種の間に存在し、最も顕著なのは、最適な蚊の段階の発達とスポロゾイテ長さ5、6に必要な温度と時間である、 20.げっ歯類マラリア種の前赤血球期段階では、感染性スポロゾイト接種の影響を最も受けやすいげっ歯類種と菌株、感受性の高いげっ歯類株の接種に必要なスポロゾイトの数、およびインビトロ肝期発達アッセイに必要な哺乳動物細胞型、および肝臓期発達完了する時間 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

これらの変動にもかかわらず、げっ歯類マラリア寄生虫は、逆遺伝的アプローチの適用のために早い段階で有利なモデルであった。実際、げっ歯類マラリアモデルは最良のモデルであり、多くの場合、蚊や肝臓の段階で発現した遺伝子を機能的に特徴付けるために何年も利用できる唯一のモデルであった。

げっ歯類マラリアモデルにおける逆遺伝的アプローチの人気とアメニティに照らして、トランスジェニック寄生虫ライフサイクル段階、特に血液段階の現象型を分析するために、多くの異なる方法論が利用されている。ただし、これらの方法論の一部は矛盾しています。例えば、IP注射後の血液期寄生虫の感染を比較する(おそらく両腸リンパ節に排出され、そこから血流に入り込むことができる)。、クローンの蚊の伝染を異なる数の連続血液段階の伝達またはG数(ゲームトサイト形成32、33に影響を与える可能性がある)と比較するか、またはトランスジェニック寄生虫をナイーブ野生型(WT)に直接比較するエレクトロポレーションおよび陽性薬物選択および男性のガメテの駆除の様々な標準化されていない評価を受けたことがない寄生虫。したがって、げっ歯類マラリアの生物学的変動に対応するために、血液中および蚊内のトランスジェニックまたはWTげっ歯類マラリア寄生虫の表現型分析に従うのが簡単なプロトコルを標準化することが重要です。寄生虫種。

本明細書では、トランスジェニックまたは野生型P.ヨーエリおよびP.ベルゲイ寄生虫の血液および蚊のライフサイクル段階の表現型分析のための標準化された詳細な実験プロトコルについて報告する。これらのプロトコルは、P.チャバウディおよびP.ヴィンケイ寄生虫にも適用可能である。

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Protocol

ここに記載されているすべての動物実験は、トゥレーン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)とベズミアレム・ヴァキフ大学の動物倫理委員会の承認されたプロトコルに従って行われました。他のすべての実験プロトコルと組換えDNAの使用は、トゥレーン大学の機関バイオセーフティ委員会(IBC)の承認されたプロトコルに従って行われました。

1. 寄生虫分析と蚊感染アッセイのための血液段階寄生虫を用いてマウスの感染

  1. 日-3:レシピエントマウスへのフェニルヒドラジンの任意注射
    1. 26G針を用いて、100μLのフェニルヒドラジン(50mgのフェニルヒドラジンでフェニルヒドラジンの50mg)を用いて、アウトブレッドSWまたはCD1レシピエントマウス(蚊の感染および蚊の感染アッセイに使用されるマウス)を注射する注射 器。
      注:P.ベルゲイとP.ヨーエリの堅牢な蚊の感染症のために、フェニルヒドラジンは、寄生虫を増加させ、その後、ゲームトサイトの割合を増加させるレシピエントマウスで網状細胞症を誘導するために使用され、そして有意にP.ベルゲイとP.ヨーエリ株15、16、17の両方のためのより良い蚊の段階の感染につながる男性のゲームの剥がれ(図5)を増加させます。 18.
  2. 日-2:ドナーマウスへの凍結寄生虫株の注入
    1. 凍結保存された凍結株を素早く解凍し、26G針注射器を使用して約200μLのストックを使用して、各ドナーマウス(通常は遺伝子型ごとに2匹のマウス)IPを注入します。
      注:制御されたバイバリウム設定内でケージごとに5匹以下のマウスが収容される。
    2. 24時間後にギムサ染色された薄血中傷に対する100倍の顕微鏡目的で寄生虫の検査を開始する。Giemsa染色された薄い血液スミアのプロトコルのセクション2.1に従ってください。
      注:迅速に解凍し、凍結保存された感染した血液を注入した後に生存生存可能な血液段階を正確に数えることができないため、ドナーマウスは最初に凍結保存された血液を受け取る。ドナーマウスの感染した赤血球を正確に定量し、その後使用することができる。
  3. 0日目:ドナーマウスの出血
    1. 彼らの寄生虫が0.1%と1%の間にある場合にドナーマウスを出血させ、これは通常、P.ヨエリ17X-NLおよびP.ベルゲイANKA株の場合には2〜3日後に凍結ストック感染後に得られる。
    2. 顔面静脈穿刺(200~500μLの間に取得する)を使用するか、感染した血液の心臓穿刺(600 μLと1.2 mLの間で得るために)によって動物を末期出血させる。セクション3.1で詳しく説明したように、心臓穿刺によってマウスを末端に出血させた。
      注:顔面静脈出血は、適用がはるかに困難であり、末期出血と比較して、マウスに非常に苦痛を与えるため、血液を得る日常的な方法ではありません。ドナーマウスの出血に最適な寄生虫は0.1%~1%の間です。定量化の精度が低下します)。
  4. Day 0: 連続希釈による感染赤血球の用量を調剤する感染血液の定量化
    1. マイクロ遠心管(希釈管1)に100μLの血液を加えてドナー血液のシリアル希釈を調べます。チューブ1に900 μLのRPMI培地を追加し、同じピペット先端で上下にピペットを入れ、1:10希釈を作成してよく混ぜます。
    2. チューブ1から希釈された血液の100 μLを取り、新しいマイクロ遠心管(希釈管2)に加えます。チューブ2に900 μLのRPMI培地を追加し、同じピペット先端で上下にピペットを入れ、1:100希釈を作成してよく混ぜます。
    3. 手順 1.4.1 と 1.4.2 を繰り返して、さらに 2 つのシリアル希釈を行い、1:1,000 (希釈管 3) と 1:10,000 希釈 (希釈チューブ 4) を作成します。
    4. チューブ4から血球計の異なる側面に希釈された血液の12 μLと12 μLの希釈された血液を追加し、血球計の両側の赤血球の平均数を決定します。これらの数値に 10 を掛します。これらの数値に希釈係数をそれぞれ1,000または10,000で乗算し、各希釈の1μL中の赤血球数を決定します。
    5. 各希釈の1μLで注入される感染赤血球の所望の数を分割し、注射に必要な希釈ドナー血液の量を決定する。注入に最適な体積で希釈を選択し、新しいマイクロ遠心管に体積を追加し、RPMI培地で120 μLに完成させます。
  5. 0日目:レシピエントマウスの静脈内注射
    1. レシピエントマウスを熱赤色ランプの下に置き、注射用の静脈を拡張します。27Gインスリン注射器に寄生虫用量をロードし、レシピエントマウスを拘束器に入れます。
    2. 蚊感染アッセイまたは無性および性的血液段階の成長アッセイのために、各レシピエントマウスに27Gインスリン注射器を用いて静脈内に100万または10,000の感染赤血球を注入する。標準的なハウジング条件の下でマウスを維持し続ける。
      注:IP注射は、寄生虫を血流に導入する間接的な方法であり、寄生虫は血に到達するために精膜腔の排出リンパ節を通過しなければならない。これは、IP注射を血流に寄生虫の正確な数を注入するための間接的な配信ルートになります。したがって、IV経路は、正確な寄生虫用量を血流に直接伝えるので、図3に示すように、代表的な結果に記載されている。

2. 性的・無性段階に対する血中段階寄生虫負荷の決定

注:このセクションでは、マラリア寄生虫の血液段階の標準化された型表評価方法を列挙する。これらの方法は、新しい抗マラリアまたはワクチン候補の評価、あるいは同じ実験マウスにおける性的および無性段階の発達に対する遺伝子ノックアウトに有用である。注意すべきでは、P.シャバウディとP.ビンケイはまた、特に薬物スクリーニングにおいて、これらのタイプのアッセイのための非常に合理的で重要な代替オプションです。

  1. 寄生虫成長アッセイのためのジエムサ染色薄血スミアによる無性期と男性女性のゲームトサイトの寄生虫の決定
    1. 26 G または 27 G の針を使用して、マウスの尾を刺し、顕微鏡スライド上の血滴を収集します。別の顕微鏡スライドの短いエッジを使用して、スライド全体に血液をすばやく塗りつぶします。
    2. 血液がスライド上で完全に乾燥した後にのみ、少なくとも1分間、100%メタノールでスライドを修正します。10%ギムサで10~15分間染色し、スライドを単一または二重蒸留水で洗浄し、乾燥させます。
    3. 100倍の目的と油浸しを使用してスライドを読み取り、小顕微鏡で使用します。正確な寄生虫の測定のために、グリッドあたりの平均数が200または150赤血球(RBC)の少なくとも30または40の顕微鏡グリッドを数えることによって得ることができる6,000赤血球の少なくとも合計をチェックしてください。最初と最後のグリッドの RBC の合計数をカウントして、すべてのグリッドの赤血球の平均数を決定します。
    4. グリッドあたりの感染した赤血球の総数をカウントします。男性と女性のゲームトサイトは、ゲームトサイト血症を決定するために別々にカウントすることができますが、総寄生虫血症数にも含まれるべきです。
    5. 寄生虫の総数を観察したRBCの総数で割ることによって、寄生虫の総割合を決定する。この数に 100 を掛け、寄生虫の割合を決定します。
    6. 観察されたRBCの総数でカウントされたゲームトサイトの総数を割ることによって、ゲームトサイト血症を決定する。この数に 100 を掛け、マウスあたりのゲームトサイト血症の割合を決定します。
      注:異なる無性および性的な血液段階を区別する唯一の信頼性の高い方法は、未成熟な遊病細胞を除いて、各段階が異なる形態を有するギムサ染色された薄血中傷を評価するために顕微鏡を使用することです。ほとんど無性の血液段階と区別がつかない。
  2. 蛍光レポータータンパク質発現WT様寄生虫株に対するフローサイトメトリーによる血液期寄生虫の決定
    1. マウスサンプルごとに2本のマイクロ遠心管にラベルを付け、1:1,000希釈用に1つのチューブを指定し、もう1つのチューブを1:2,000希釈に指定します。1:1,000希釈管に1xヘパリンの1.5 μLを加えます。
    2. 26 G または 27 G の針を使用して、マウスの尾を刺し、1x ヘパリンの 1.5 μL (1:1,000 希釈管) を含むチューブに 1.5 μL の血液を移します。血液と1xヘパリンを上下にピペッティングして穏やかに混ぜます。
    3. マイクロ遠心管にRPMI培地の1,497 μLを加え、上下に優しくピペットを加えてよく混ぜます。
    4. 混合物の500 μLを1:1,000希釈管から1:2,000希釈管に移します。1:2,000チューブに500 μLのRPMI培地を追加し、上下にピペッティングして穏やかに混合します。
    5. フローサイトメーターの製造元の適切な起動プロトコルに従ってください。低速の流量でサンプルを実行し、少なくとも 20,000 イベントの検出を設定します。
      注:寄生虫が蛍光マーカーを発現するかどうかにかかわらず、三色FACS選別を介して寄生虫を測定する代替実用的なアッセイがある。しかし、ここで説明するアッセイは、DNA結合染料の添加およびFACS選別の使用なしに生きている寄生虫における寄生虫の正確な尺度を提供する。
  3. 感染したマウス血液のマイクロリットル当たりのオスのガメの排泄速度の決定
    1. 不完全なオキネテ培地の40μL(RPMI+重炭酸ナトリウム+ヒポキサンチン+キサンスレン酸)と1xヘパリンの5μLを含む1:10希釈マイクロ遠心管を調製する。
    2. 26 G または 27 G の針を使用して、マウスの尾を刺し、不完全なオキネテ媒体+ヘパリンを含むチューブに(マイクロピペットを使用して)5 μLの血液を素早く移します。穏やかに混合し、1:10血液希釈管の12 μLを血球計にロードし、室温(20-24 °C)のままにします。
    3. 1:10希釈を準備した後、9-10分の排旗イベントのカウントを開始します。40倍の倍率の位相コントラスト小顕微鏡を使用してください。
    4. 10でカウントされた排旗イベントの平均数を乗算し、希釈係数(10)を掛け、感染した血液のマイクロリットル当たりのエクスフラグの平均数を決定します。
      注:このアッセイは、血球計を用いて定量することができる血液の1μL体積におけるオスのガメテ排旗イベントの数を測定する。不完全なオキネテ媒体18は、血液食の直後に蚊の中腸内で排尿が起こる条件を密接に模倣するために血液と混合される。

3. 感染した赤血球および凍結ストック製剤からの血液期寄生虫の単離と処理

  1. 心臓穿刺による感染したげっ歯類の末端出血
    1. 心臓穿刺によってドナーマウスの血液を収集するために、1xヘパリン(200単位/mL)の約≤20 μLを含む26G針注射器を準備します。
    2. 出血する前にマウスを安楽死させるためにCO2の遅い流れを使用してください。あるいは、イソファランでマウスを麻酔する(心臓を露出させる前と皮膚切開中に維持されなければならない)。
    3. マウスを背中に置き、付属品を固定します。鉗子で皮膚を引き上げ、はさみで切ることによって、胸骨の基部付近の皮膚に小さな切開を行います。切開部位で皮膚を引き離し、横隔膜と腹腔の上部を露出させる。
    4. 鉗子で肋骨のケージの基盤を保持し、胸腔に入るために横隔膜を通して切断;心臓や肺に損傷を与えないように注意してください。リブケージをピンバックして心臓を露出します。
    5. 心臓を優しく穿刺し、注射器プランジャーをゆっくりと引き上げて約1mLの血液を採取し、マイクロ遠心管に移します。
  2. 感染した血液からの冷凍ストックの調製
    1. 約2%から5%の間にある血液寄生虫を有するマウス(セクション3.1を参照)を出血させ、かなりの量のリングステージを有し、多くの遊虫細胞ではない。
    2. 血液の所望の部分を凍結溶液(Alsever溶液中の10%グリセロール)と1:2の比率で混合し、低温バイアルに保存します。液体窒素で凍結します。
  3. DNA、RNA、タンパク質の抽出のための血液期寄生虫の単離と精製
    1. 血中寄生虫症を有する出血マウス(セクション3.1参照)は0.5%より高い。
    2. プランジャーを取り外し、小さな綿棒を挿入して10mLの注射器を準備します。綿を注射器の底に詰め込みます。セルロースのレベルが3 mLマークに達するまでセルロースで満たしますが、シリンジの4mLマークを超えません。
    3. リングスタンドのクリップに注射器を固定し、その下に廃棄物収集チューブを置きます。注射器に5mLのPBSを追加し、廃棄物チューブに流れ込みます。
    4. 必要に応じて冷凍ストックを準備し、血液の100-300 μLのみを使用します。感染した血液の残りの部分(400-700 μL)をカラムに追加します。液滴が赤くなるまで、廃管で流れを集めます。液滴が赤色に変わり始めたら、新しい14mLの回収管を注射器の下に置き、流れを回収します。
    5. 流れが遅くなり始めたら、注射器にPBSを追加し、14 mLの総容積に達するまで15 mLチューブ内の流れを収集します。廃棄物チューブで残りの流れを収集します。
    6. ブレーキなしで250 x gで8分間血液/PBS混合物が付いている14 mL管を遠心分離する。上清を取り出し、14 mLの冷蔵サポニン(PBSの50mLでサポニン50mg)を加える。ペレットを外すには、必要に応じてチューブを複数回反転し、渦を反転させます。
    7. ブレーキなしで1,217 x gで8分間チューブを遠心分離します。上清を取り出し、ペレットの上に溶液の約0.5mLを残します。
    8. マイクロピペットを使用して溶液中のペレットを再中断し、マイクロ遠心管に移します。14 mLチューブに500 μLのPBSを加え、チューブに残っている残留寄生虫を洗浄します。これを同じマイクロ遠心管に加えます。
    9. 6,010 x gで2分間チューブを遠心分離します。上清を取り出し、PBSの1mLを再中断します。9,391 x gで2分間遠心分離機。
    10. ゲノムDNA、総RNA、およびタンパク質の抽出に進みます。
      1. ゲノムDNA抽出の場合、上清を除去し、PBSの200 μLでペレットを再中断し、gDNA抽出の任意の適切なプロトコルに従います。
      2. 全RNA抽出のために、上清を除去し、ペレットを任意のフェノールおよびグアニジンイソチオシアネートベースの溶液または他の適切な試薬の1 mLで再中断し、渦させ、その後、総RNA抽出の任意の適切なプロトコルに従う。
      3. 全タンパク質抽出のために、上清を取り除き、6xドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ローディング色素または他の適切な試薬の適切な体積でペレットを再中断し、次に、全タンパク質処理の任意の適切なプロトコルに従う。

4. 蚊感染アッセイ

注:蚊は、性的生殖が行われるマラリア原虫の主要な宿主である。マラリア原虫を蚊に伝えるマウスの感染は、少なくとも100万個の血液段階のIV注射によって行われ、続いて感染したマウス(最も高いオスのゲームテ排尿率を示す各遺伝子型から)を供給し、マウス感染後3日目にケージ内の蚊をアノフェールする。フェニルヒドラジン処理マウスに100万個の血液期寄生虫を用いたIV注射は、男性および女性のゲームトサイトの発達をより速く、より高い速度で保証する。P.ヨエリおよびP.ベルゲイに感染した蚊は、それぞれ24°Cおよび20〜21°Cでインキュベートされ、可能な限り最高の蚊段階の開発6を可能にする。

  1. 蚊の摂食と蚊1個あたりのオキンの数の決定
    1. 飢えた成人女性アノフェレス・スティーブンシまたはA.ガンビア蚊(生後4~7日)を摂食前に8〜12時間。成体蚊が感染した麻酔マウス(ケタミン/キシラジンの適切な用量で注射)に少なくとも15分間餌を与え、最高の排旗揚げ率(セクション2.3で測定)を許可する。
      注:ケタミン/キシラジン作動溶液は、マウス当たり100μLを注入する生理生理中およびIPにおけるストック溶液の1:5希釈によって調製される。10 mLのストック溶液の場合、1 mLのキシラジン(100mg/mL)を9mLのケタミン(100mg/mL)に添加する。
    2. 口の吸引器で、飼育されていない雌の蚊と雄の蚊を取り除きます。
    3. 18-20 hのポストフィードで、20-30蚊を収集し、死を確実にするために10分以上冷凍庫に入れてください。双眼解剖スコープを使用して、2つの26Gまたは27Gの針またはRPMIまたはPBS解剖媒体の針と鉗子で20-30の血液で満たされた中腸を解剖し、中腸をRPMIまたはPBSの200 μLを含むマイクロ遠心管に移す(解剖法のために)セクション4.3を参照してください)。
    4. 700 x gで1分間収集管を遠心分離します。害虫を使用してペレット化された中腸を粉砕します。この手順を繰り返します。
    5. 地中腸のチューブから新しいマイクロ遠心管に50 μLを移します。RPMIまたはPBSの200 μLを追加して、1:5希釈を作成します。
    6. 12 μLをヘモサイトメーターに移し、室温で5分間インキュベートして内容物を落ち着かせるようにします。
    7. 位相コントラストと40倍の倍率の光顕微鏡を使用して、オキネテスの平均数を決定します。
    8. 成熟したオキンの平均数に 10 を掛け、次に希釈係数を 5 ずつ掛して、オキンテの平均総数を決定します。
    9. オカインテの平均数を解剖した蚊の数で割り、血液供給蚊あたりのオカインテの数を決定する。
  2. WT様寄生虫株を発現する蛍光レポータータンパク質に対する早期卵胞数の決定
    注:このアッセイの目的は、蚊の中腸の完全な感染を確立し、早期球状の卵胞を形成した緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する生きている寄生虫の数を決定することです。このアッセイは、オキネテス(前のアッセイで推定されるその発達)が蚊中腸上皮細胞を通過することによってその機能を完了したかどうか、および中腸の基底ラミナ側の初期卵胞への形質転換を決定する。上皮かどうか。これは、この段階で早期の卵胞を数えることは退屈な免疫染色なしではほとんど不可能であるとして、GFPを発現する寄生虫を大いに利用する別のアッセイである。
    1. 20-30の血液供給蚊の中腸(セクション4.1を参照)を解剖し、P.エリ17X-NLの3日目または4日目の蚊供給後(pmf)で、P.ベルギーANKAの6日目または7pmfで、26 Gまたは27G針またはRPMIの針と鉗子を持つエジウム(解剖方法については、セクション4.3を参照してください)。
    2. ガラススライドの長い端の水平中線に解剖媒体の40-50 μLを広げます。このラインに中間腸を一度に1つずつ移し、解剖中に、必要に応じて中域に培地を加えて乾燥を避ける。
    3. 解剖されたミッドガットにそっとカバースリップを置き、マニキュアで密封します。
    4. 緑色蛍光フィルターを用いて蛍光顕微鏡の10倍または20倍の目的を用いて、少なくとも20個の中腸内の各中腸の初期卵胞の数をカウントする。
  3. 蚊1個当たりの卵胞胞の数の決定
    1. 26-Gまたは27-Gの針またはRPMIまたはPBS解剖媒体で針と鉗子を持つ少なくとも20〜30匹の蚊の中腸を解剖し、RPMIの200 μLで解剖された中腸を集める。
    2. 下腹部セグメントを1本の針(または鉗子)でしっかりと固定し、胸部と腹部の接合部でもう一方の針と共に胸郭を上向きに軽く押します。胸部が腹部から離れるまで慎重に短いプッシュを行います。分離が始まるとすぐに白い中腸が伸びて現れ、その後、胸郭を分離するために使用されたのと同じ針を使用して食道の端から中腸が切断されます。腹部にまだ取り付けられている場合は、同じ針を使用して腹部から中腸を引き離すことができます。すべての蚊の中腸を、針で媒体から一度に1つずつ集めることによって、収集チューブに移動します。
    3. 700x gで1分間収集管を遠心分離し、中腸を回収管の底部に落ち着かせ、害虫で粉砕する。この手順を繰り返します。
    4. 12 μLをヘモサイトメーターに移し、室温で5分間インキュベートして内容物を定着させます。
    5. 光顕微鏡の40倍の目的を使用して、卵胞胞を数えます。蚊の残骸がスポロゾイツの正確なカウントを防ぐ場合、またはスポロゾイトの数が多すぎて正確に数えきれない場合は、1:5および/または1:10の希釈を使用してください。
    6. スポロゾイツの平均数に10を掛け、その数に希釈係数(ある場合)、および総体積(200 μL)を掛けることによって、卵胞スポロゾイツの平均総数を計算します。
    7. スポロゾイトの平均総数を解剖した蚊の数で割り、蚊1匹あたりの卵胞スポロゾイテスの平均数を計算します。
      注:蚊の段階感染の成功または生産性を測定するための一般的な間違いは、卵嚢胞の発達の後期段階における卵胞の数のカウントである。これは、一部の卵胞が後の時点で卵胞の発達の時点で空洞化し、他の人が同じ中腸でもスポロゾイテスを開発することができないためである。蚊の段階の感染の生産性を決定するための最良かつ最も信頼性の高い方法は、P.ヨエリのための10-12ポスト蚊感染の日と日12-14で中腸卵胞スポロゾイテスの平均数のカウントですP.ベルグヘイのための蚊の後の感染.
  4. 蚊1人当たりの唾液腺胞胞数の決定
    メモ:蚊の段階の開発の完全な完了の最終的な評価は脊椎動物への透過性および感染段階である唾液腺に侵入した胞子の数を推定することによって達成される。唾液腺の侵入は、卵胞スポロゾイテの発達の完了後に確立され、血球に出て、唾液腺アシナル細胞の基底ラミナへの付着、および唾液腺に到達するアシナー細胞の横断ダクト5.したがって、このアッセイは、これらのプロセスの全ての成功の評価でもある。それにもかかわらず、ヘモリンパスポロゾイト数の推定は、卵胞からの出口の欠陥と唾液腺の侵入の欠陥との間の区別を可能にするだろう35歳.唾液腺胞スポロゾイテスの精製は、スポロゾイテ運動性および侵入表現型に対して複数の機能的アッセイを行うことを可能にする。唾液腺胞スポロゾイテスは、マウスの生体内感染や免疫研究にも使用できます。36歳,37歳.さらに、インビトロ肝段階の侵入または開発アッセイを確立するために利用可能な最も再現可能な段階は、唾液腺胞子の使用による。
    1. 50-100メスの蚊の唾液腺を解剖し、P.ヨエリの日14-16 pmfで、P.ベルゲイの日17-20 pmfで、好ましくは26Gまたは27G針で、RPMIまたはDMEM培地で氷の上に保たれ、5%の胎児を補充したP.ヨエリ・スポロゾイテスのまたは3%のFBS/BSAの場合は、または/ウシ血清アルブミン(BSA)。 スポロゾイツを体外アッセイで肝臓に使用する場合は、解剖培地に1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加する。唾液腺の解剖には一般的に2つの方法があります。最初の方法は時間がかかりますが、汚染組織をほとんどまたはまったく持たない唾液腺の解剖につながります。第2の方法は、より少ない時間がかかりますが、汚染組織のかなりの量の収集につながります。最初の方法については、ここで詳しく説明します。
    2. 1本の針のベベサイドで上腹部セグメントを所定の位置に保持し、頭と胸郭の接合部で頭を非常に軽く(非常に短いプッシュで)上向きに押し込み、頭部が胸郭から慎重に分離されるまで、上向きに押し込みます。ガラス状の唾液腺を引き裂き、露出した唾液腺は頭部を上方に押し上げたのと同じ針で頭部から分離される。
    3. 解剖された唾液腺は、短いガラスパスツールピペットを使用して解剖培地から上昇します。
    4. すべての唾液腺が解剖され、収穫されると、才能は遠心分離機(1分、700 x g)に中腸を含むチューブを配置します。
    5. フェーズ2コントラストと40倍の倍率に設定された小顕微鏡下でヘモサイトメーターを使用してスポロゾイトを数えます。蚊の数が≥40を解剖した場合、期待される感染率に応じて唾液腺を1:5または1:10に希釈する(以前のアッセイで決定)。
    6. スポロゾイトの平均数に 10 を掛け、希釈係数 (がある場合) を掛けます。総体積を掛して、唾液腺胞の平均数を決定します。解剖された雌蚊の数で割り、蚊1匹あたりの平均唾液腺胞胞を決定する。
      注:唾液腺の解剖の問題は、その小さなサイズとガラス状の透明な外観です。したがって、唾液腺を分離することは非常に困難であり、したがって、それらは通常、採取中に唾液腺を破裂から保護するために重要である胸郭の前部から他の組織との一括合計として解剖される。

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Representative Results

マラリア原虫に逆遺伝的ツールと技術を適用する成功は、いくつかのプラスモジウム種39の特定のゲノムセグメントを追加、削除、または変更する能力を持つマラリア研究の分野に革命を起こしました。重要なことは、調剤可能なゲノム遺伝子座が同定され、二重相同組換えによってげっ歯類およびヒトマラリア寄生虫に蛍光タンパク質マーカーを導入することに成功し、すべてのライフサイクル段階で安定した発現を確保することに成功した40 、41、42。これらのWT様トランスジェニック寄生虫の一例は、当研究室で発生したPy230p(-)寄生虫であり、血液および蚊のライフサイクル段階15、16の発達に明らかな欠陥を示さなかった。17.これらのトランスジェニックレポーター寄生虫はeGFPを発現し、PyHSP70の強く構成的プロモーターの制御下で、血液段階(図1A)で(図1B)、若い卵胞(図1C)。)に)、アノフェレス・スティーブンシ・ミセスの唾液腺から分離されたスポロゾイテス(図1D)。したがって、eGFP発現血液寄生虫は、トランスジェニック寄生虫の異なるジェノタイプ間または薬物標的における未治療と未治療の間の流れサイトメトリーを用いて血液期寄生虫の評価をはるかに容易かつ少なくした。トランスジェニックレポーター寄生虫を用いてアッセイ。

フローサイトメトリーの使用と顕微鏡によるより退屈な寄生虫推定との間に定量的な差がないことを確認するために、eGFP発現Pyp230p(-)を用いて寄生赤血球の割合を推定した。10,000人の寄生赤血球に感染したスイスのウェブスターマウスIVのグループにおける血流細胞血小血症およびGiemsa染色された薄血中塗布。フローサイトメトリー寄生虫%の値は、2人の専門家によって推定されたGiemsa染色された薄血中スミアをモニタリングすることによって推定寄生虫%に直接対応した(図2)。これは、血液期寄生虫の増殖速度の決定における顕微鏡検査の退屈で人為的エラーが起こりやすい方法に代わるより正確な代替手段を表す。

マラリア原虫の血液段階を持つげっ歯類の感染に関連する重要な不一致は、感染経路の選択であり、感染のIV経路と比較してIPに関する文献の中で強い好みは、時間のかかる時間が少ない。これら2つの感染経路を比較するために、5匹のBALB/cマウスの2群が、IVまたはIP経路を介して、マウス1匹につき1,000 eGFP発現Pyp230p(-)寄生赤血球に感染した。寄生虫は、4日間のフローサイトメトリーを用いて毎日モニタリングした。IV感染群と比較したIP感染群寄生虫症の統計的に有意な減少は、試験されたすべての日に注目された(図3)。これは、IV感染経路がマラリア寄生虫の血液段階を伴うアッセイのためのより定量的に正確な感染経路であることを証明する。

それにもかかわらず、血液期寄生虫を評価するためのフローサイトメトリーの使用に対する1つの制限は、性的段階と無性段階と男性と女性のゲームトサイト間の区別である。したがって、異なる無性および性的段階(図4)のそれぞれのパーセンテージの推定は、Giemsa染色された薄血中傷の形態評価に依存する必要があります。成熟した男性と女性のゲームトサイトの明らかな異なる形態にもかかわらず(図4)、未熟な性的段階はしばしば無性段階と区別できない。

蚊の中腹のオスのゲームサイトからの出現時の男性のゲームの重要な機能の1つは、非常に短い期間内に起こらなければならない伝達の非常に重要なステップであるオスのゲームテエクスフラッグです。これを多くの異なるシステムで評価するために使用される可変メソッドが説明されている。ここでは、任意の簡易ラボ設定で繰り返すことができる標準化された方法を示す。レシピエントマウスへのフェニルヒドラジンの注射の有無にかかわらずオスのガメテ駆除を評価した(図5)。フェニルヒドラジン治療が有意に(4倍)男性のゲームテの排泄率を増加させ、受精率と後続のすべての蚊の段階の数を増加させることが示すことができる。

Figure 1
図 1: の開発 P.ヨエリp230p(-)寄生虫は、血液および蚊の段階でeGFPを構成的に発現する。(A) 混合血液期寄生虫の画像(倍率1,000倍)。(B) オキネテ(400倍倍)の画像。 (C) eGFP(100倍)を発現する生きているp230p(-)寄生虫の4日目pmf早期卵胞に感染したアノフェレス・スティーブンス・蚊中腸の画像。(D) このパネルは、P.ヨエリp230p(-)唾液腺胞子のライブ画像を示し、15日午後15時に解剖し、eGFP(400倍倍)を発現する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: 平均血液期寄生虫のフローサイトメトリーと顕微鏡検査評価 P. ヨエリ p230p(-) 寄生虫は有意に異なっていない。4匹のスイスウェブスターマウスのグループは、マウス当たりPyp230p(-)の10,000匹の寄生赤血球に静脈内感染し、平均血液期寄生虫%をフローサイトメトリーおよび顕微鏡評価により毎日7日間記録した。Giemsa染色された薄い血液は、それぞれ合計20,000および約6,000赤血球から塗りつぶされる。示された顕微鏡検査結果は、スライドごとに2人の専門家による2つの測定値の平均であり、各スライドの寄生虫を評価する時間は、各科学者によって少なくとも10分であった。ここに示す日には有意な差は検出されませんでした。すべての寄生虫株の平均値を両尾t-検定で分析した。 誤差余数は標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: 静脈内注射 P.ヨエリp230p(-)寄生虫は、経皮注射から有意に異なる血液期寄生虫を生み出す。5匹のBALB/cマウスの2群は、静脈内または食後経路を介して、マウス当たりPyp230p(-)の1,000個の寄生赤血球に感染し、平均血液期寄生虫%を流量別に毎日4日間記録した。合計20,000の赤血球からの細胞メトリー。血中期寄生虫の統計的に有意な減少(アスタリスクで示される)は、静脈内経路群と比較して、経常経路群で試験されたすべての日について検出することができる。すべての寄生虫株の平均値を両尾t-検定で分析した。 誤差余数は標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 形態学P.ヨーエリは、ギムサ染色された薄い血液スミア中のゲームトサイト。WT P. yoelii 17X-NL 株に感染したスイスのウェブスターマウスのギムサ染色された薄い血液スミア(1,000倍倍)の画像は、左側に典型的な青みがかった色のメスのゲームサイト(矢印で示される)とピンク色の男性()画像の右側にアスタリスク)ゲームトサイトで示されます。示されている他の段階は、無性の血液段階です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: フェニルヒドラジンがオスのガメテ排便に及ぼす影響P.ヨエリのオスのガメエクスフラゲレーション率推定の5日前にレシピエントマウスに注入されたフェニルヒドラジンの効果。フェニルヒドラジンは、男性のガメテの排旗の速度を有意に増加させ、蚊の摂食後に感染する蚊の段階が高くなる。すべての寄生虫株の平均値を両尾t-検定で分析した。 誤差余数は標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ヒトマラリア原虫のライフサイクルの一般的な生物学の類似性にもかかわらず、マウスマラリアモデルは、生体内モデルで信頼性の高い使用を制限するヒトプラスモジウム種と多くの相違点を持っています。例えば、ワクチンとしての生減衰寄生虫を除き、サブユニットとDNAおよび他のワクチンを用いたすべてのワクチン研究は、マウスモデルにおいて優れた結果を与えたが、流行地域に住むヒトでは、その結果は十分とは程遠いものであった。

もう一つの問題は、あるマウス株から別のマウス株へのライフサイクル段階の感染性の違いであり、時には同じマウス株に対してある動物ベンダーから別の動物ベンダーへ。さらに、生体内マラリアモデルで広く使用されている主な2つのげっ歯類マラリア種、P.ベルゲイとP.ヨーエリは、ヒトマラリアとは全く異なる同期血液段階サイクルを示さない。寄生虫。しかし、マウスマラリア寄生虫を生体内モデルとして使用することの利点は、これらの相違点をはるかに上回り、これらの制限の分子ドライブのより詳細な分析によっても克服することができる。それにもかかわらず、これらの制限は、主にげっ歯類マラリア血液段階寄生虫によって表示されますが、マラリア寄生虫の他のライフサイクル段階にはそれほど多くはありません。

血液段階は様々なワクチン、薬物標的、免疫学、機能ゲノム研究にとって重要であるが、表現型分析と機能的アッセイに集中する標準化された方法とプロトコルの不足がある。げっ歯類マラリア寄生虫の血液段階寄生虫は、蚊の伝染とトランスフェクションプロトコルに焦点を当てています。したがって、この記事の方法は、げっ歯類マラリア原虫の病原性段階を研究するための標準化された簡素化されたプロトコルを提供するのに役立ちます。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

アーメド・アリーは、トルコ開発省補助金2015BSV036のベズミアレム・ヴァキフ大学への資金提供、トゥレーン大学公衆衛生熱帯医学部からの資金提供、およびR21GrantのNIH-NIAIDからの資金提供によって支援されています。1R21AI111058-01A1。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

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References

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げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階
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Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).More

Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

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