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Immunology and Infection

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

doi: 10.3791/55688 Published: May 30, 2019

Summary

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

Abstract

유전학 및 시스템 생물학 기술에 있는 최근 어드밴스는 분자 수준에 말라리아 기생충의 생물학의 우리의 이해를 승진시켰습니다. 그러나, 백신 및 화학요법 발달을 위한 효과적인 말라리아 기생충 표적은 아직도 제한됩니다. 이것은 주로 인간 Plasmodium 종에 대한 관련및 실용적인 생체 내 감염 모델의 가용성, 특히 P. falciparumP. vivax에대한 가용성 때문입니다. 따라서, 설치류 말라리아 종은 말라리아 백신, 약물 표적화, 면역 반응 및 보존된 Plasmodiumspp. 유전자의 기능적 특성화 연구를 위한 생체내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다. 실제로, 설치류 말라리아 모형은 특히 모기 전송 및 간 단계 생물학을 탐구를 위해 귀중한 것으로 입증되고, 면역학 연구 결과를 위해 필수적이었습니다. 그러나, 형질전환 및 야생형 무성 및 성혈액 기기생충의 표현형을 평가하는 데 사용되는 방법에는 불일치가 있다. 이러한 불일치의 예로는 혈액 단계 기생충을 가진 설치류의 정맥 내 감염 과 남성 gamete exflagellation의 평가의 선택입니다. 본 명세서에서, 우리는 리포터 유전자 또는 야생형 설치류 말라리아 기생충 종을 발현하는 형질전환 기생충에서 무성 및 성혈액 단계의 표현형을 평가하기 위한 표준화된 실험 방법을 상세히 설명한다. 우리는 또한 Anopheles 모기 벡터 안쪽에 말라리아 기생충 모기 단계 (gametes, ookinetes, oocysts 및 sporozoites)의 표현형을 평가하는 방법을 상세히 설명합니다. 이러한 방법은 P. bergheiP. yoelii의 치명적이고 비 치명적인 균주에 대해 여기에서 상세하고 단순화되지만 P. chabaudiP. vinckei 설치류 말라리아 종에 대한 일부 조정으로도 적용 될 수 있습니다.

Introduction

말라리아 기생충은 인간에 있는 말라리아 감염의 수억을 세계전반 일으키는 원인이 되고,이상 600,000의 죽음과 함께 매년 1. 인간적인 감염은 5개의 말라리아 기생충 종, 즉 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P.말라리아, 및 P. knowlesi에기인합니다. 대부분의 임상 말라리아 사망자는 사하라 사막 이남의 아프리카에서 P. falciparum에 의해 발생1. 사하라 사막 이남의 아프리카 외부광범위 한 세계적인 이환을 일으키는 원인이 되는 또 다른 인간적인 말라리아 기생충 종은 P. vivax2입니다. 다른 세 종은 모두 더 지리적으로 제한되고 치명적인 P. knowlesi3를 제외하고 양성 말라리아 감염을 일으킵니다. 감염의 관련되고 실제적인 비 인간 적인 모형의 가용성은 항상 이고 아직도 말라리아 백신 및 약 발달에 장애물입니다. 이전 말라리아 약 표적화 및 신진 대사 연구 결과는 P. gallinaceumP. lophurae같이 조류 말라리아 모형에 광범위하게, 닭과 오리를 감염시키는, 각각4. 그 후, 설치류 말라리아 종은 생체 내 모델로서 다양한 백신 및 약물 표적 연구에서 점차적으로 도입되었다. 수년에 걸쳐, 인간 말라리아 종에 설치류 말라리아 모형의 생활 주기 단계의 생물학 그리고 호스트 기생충 상호 작용의 유사성의 기록이 축적되었습니다.

특히, 설치류 말라리아 모델은 모기의 생물학을 탐구하고 특성화하는 것이 매우중요했으며 적혈구 전 단계 5. 그러나, 4개의 설치류 말라리아 종(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi,P. vinckei)이다른생물학적 특징을 가지며, 그 중 가장 주목할 만한 것은 혈액 단계 6에 있다. 설치류 말라리아 종은 혈액 단계의 동시성에 차이가, 어디 P. chabaudi와 P. vinckei 균주의 혈액 단계는 대부분 동기, P. berghei와 P. yoelii의 혈액 단계는 하지 않습니다 하는 동안6 , 7. 또 다른 주목할만한 차이점은 일부 균주에서 발생하는 혈액단계의 자기 정리입니다 (예를 들어, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 및 P. vinckei lentum),다른 사람의 혈액 감염에 대한 경우 동일한 종의 균주는 치료되지 않은 상태로 방치하면 치명적일 수 있습니다(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA 및 P. chabaudi AS). 더욱이, P. yoelii 17X-NL 균주 및 P. 베르게이 ANKA 균주는 P의 이러한 특징이 있지만, 우선적으로 망상 세포 8,9,10,11을침범한다. yoeliiP. berghei 균주는 엄격한 성장 요구 사항이 아니다12,13,14. 따라서, 마우스는 P. berghei ANKA 균주와 P. yoelii에 대한 모기 감염에 필요한 기생충 및 gametocytemia를 증가시키기 위해 그 기생충의 혈액 단계로 감염하기 전에 페닐히드라진으로 치료된다. 17X-NL15,16,17,18,19.

모기 단계 발달의 차이는 또한 다른 설치류 말라리아 종 사이에서 존재하며, 가장 주목할만한 것은 최적의 모기 단계발달과 스포로조이트 길이 5,6에필요한 온도와 시간입니다. 20. 설치류 말라리아 종의 사전 적혈구 단계에서, 차이는 감염성 포자형 접종에 가장 취약 설치류 종과 균주를 포함, 영향을 받기 쉬운 설치류 균주에서 접종에 필요한 포자 형화물의 수, 체외 간 단계 발달 에 필요한 포유류 세포 유형, 및 간단계 발달을 완료하는 시간 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

이러한 가변성에도 불구하고, 설치류 말라리아 기생충은 역유전적 접근법의 적용을 위해 초기에 유리한 모델이었으며, 성공 확률이높은 31보다 적은 시간과 자원소비가 적기 때문이다. 사실, 설치류 말라리아 모형은 제일 모형이고, 많은 경우에 유일한 모형은, 기능적으로 모기와 간 단계에서 표현된 유전자를 특성화하기 위하여 수년간 유효합니다.

설치류 말라리아 모형에 있는 역유전 접근의 대중성과 구역성에 비추어, 다른 방법론은 형질전환 기생충 생활 주기 단계, 특히 혈액 단계의 표현형을 분석하기 위하여 이용되었습니다. 그러나 이러한 방법론 중 일부는 일치하지 않습니다. 예를 들어, IP 주입 다음 혈액 단계 기생충의 감염을 비교 (이는 아마도 후막 림프절에 배수하고, 거기에서, 혈류를 입력 할 수 있습니다; 따라서, 주입 된 기생충은 혈류량에서 동등하게 끝나지 않는다) , 일련 혈액 단계 전송 또는 G 번호의 다른 번호와 클론의 모기 전송을 비교 (이는 gametocytogenesis에 영향을 미칠 수32,33),또는 순진한 야생 유형에 직접 형질 전환 기생충을 비교 (WT) 전형및 양성 약물 선택 및 남성 gamete exflagellation의 각종 표준화되지 않은 평가를 결코 겪지 않았던 기생충. 따라서, 설치류 말라리아의 생물학적 가변성을 수용하기 위해 혈액과 모기에 있는 모든 유형의 형질전환 또는 WT 설치류 말라리아 기생충의 표현형 분석을 위해 따르기 위하여 따르기 위하여 간단한 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다 기생충 종.

본 명세서에서, 우리는 형질전환 형 또는 야생형 P. yoeliiP. berghei 기생충의 혈액 및 모기 수명 주기 단계의 표현형 분석을 위한 표준화되고 상세한 실험 프로토콜에 보고한다. 이들 프로토콜은 또한 P. 차보디P. 빈케이 기생충에 적용 가능하다.

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Protocol

여기에 설명된 모든 동물 실험은 툴레인 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)와 베즈미알렘 바키프 대학의 동물 윤리 위원회의 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 다른 모든 실험 프로토콜및 재조합 DNA의 사용은 툴레인 대학의 기관 생물 안전위원회 (IBC)의 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 기생충 분석 및 모기 감염 분석을 위한 혈액 단계 기생충을 가진 마우스의 감염

  1. 일 -3: 받는 사람 마우스에 페닐히드라진의 선택적 주입
    1. 26 G 바늘을 사용하여 100 μL의 페닐히드라진(페닐히드라진 50 mg의 페닐히드라진 50 mg)을 사용하여 26G 바늘을 사용하여 상강 된 SW 또는 CD1 수용자 마우스 (모기 감염 및 모기 감염 검정에 사용될 마우스)를 주입합니다. 주사기.
      참고: P. berghei및 P. yoelii의강력한 모기 감염을 위해, 페닐히드라진은 수용인자 마우스에 있는 망상 세포증을 유도하기 위하여 이용됩니다, 이는 기생충을 증가시키고, 그 후에, gametocytes의 백분율, 및 현저하게 P. bergheiP. yoelii 균주15,16,17,모두 더 나은 모기 단계 감염으로 이어질 것입니다 남성 gametes의 배설을 증가 (그림5), 18.
  2. 일 -2: 기증자 마우스에 냉동 기생충 주식의 주입
    1. 냉동 보존 된 주식을 신속하게 해동하고 즉시 각 기증자 마우스 (일반적으로 유전자형 당 2 마리의 마우스) IP를 ~ 200 μL의 스톡으로 26 G 바늘 주사기를 사용하여 주입합니다.
      참고: 제어 된 사육장 설정 내에서 케이지 당 5 마리 이하의 마우스가 보관되지 않습니다.
    2. 24 시간 후 감염 후 Giemsa 염색 얇은 혈액 얼룩에 100 x 현미경 목표에서 기생충 검사를 시작합니다. Giemsa 염색된 얇은 혈액 얼룩에 대한 프로토콜의 섹션 2.1을 따르십시오.
      참고: 급속하게 해동하고 냉동 보존된 감염한 혈액을 주입한 후에 살아남은 생존 가능한 혈액 단계를 정확하게 계산하는 무능력 때문에, 기증자 마우스는 먼저 저온 보존된 혈액을 수신합니다. 공여자 마우스의 감염된 적혈구는 정밀하게 정량화되고 이후에 사용될 수 있다.
  3. 일 0: 기증자 마우스의 출혈
    1. 그들의 기생충이 0.1%와 1% 사이일 때 기증자 마우스(섹션 3.1 참조)는 일반적으로 P. yoelii 17X-NL 및 P. berghei ANKA 균주의 경우에 2-3 일 후 냉동-주식 감염을 수득한다.
    2. 안면 정맥 천자(200~500 μL 사이를 얻으려면)를 사용하거나, 감염된 혈액의 심장 천자(600 μL에서 1.2 mL 사이를 얻으려면)에 의해 동물을 말단 출혈시요. 말단은 3.1절에 상세히 기재된 바와 같이 심장 천자에 의해 마우스를 출혈시켰다.
      참고: 안면 정맥 출혈은 적용하기가 훨씬 더 어렵고 말기 출혈에 비해 마우스에게 매우 고통스럽기 때문에 혈액을 얻는 일상적인 방법이 아닙니다. 기증자 마우스의 출혈을 위한 최적 기생충은 0.1%-1% 사이이기 때문에, 이 기생충 범위에, 아주 몇몇 gametocytes가 있습니다 (무성혈 혈액 단계를 일으키기 위하여 복제할 수 없습니다) 및 더 적은 이중 또는 삼중 감염적적혈구가 있습니다 (있는 정량화의 정확도가 떨어집니다).
  4. 일 0: 연쇄 희석에 의해 감염된 적혈구의 복용량을 준비하기 위하여 감염된 혈액의 정량화
    1. 100 μL의 혈액을 미세 원심 분리튜브(희석관 1)에 첨가하여 기증자 혈액의 연속 희석을 준비합니다. 튜브 1에 RPMI 배지 900 μL을 추가하고 동일한 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞어서 1:10 희석을 만듭니다.
    2. 튜브 1에서 희석 된 혈액 의 100 μL을 가지고 새로운 미세 원심 분리튜브 (희석 튜브 2)에 추가하십시오. 튜브 2에 RPMI 배지 900 μL을 추가하고 동일한 파이펫 팁으로 위아래로 파이펫팅하여 잘 혼합하여 1:100 희석을 만듭니다.
    3. 1.4.1 단계와 1.4.2 단계를 반복하여 두 개의 직렬 희석을 더 만들어 1:1,000(희석 튜브 3) 및 희석 1:10,000(희석 튜브 4)를 만듭니다.
    4. 튜브 3 및 12 μL의 희석 된 혈액을 튜브 4에서 혈전계의 다른 면으로 12 μL을 추가하고 혈세포계의 각 측면에 적혈구의 평균 수를 결정합니다. 이 숫자를 10으로 곱합니다. 이 숫자를 희석 인자, 각각 1,000 또는 10,000을 곱하여 각 희석의 1 μL에서 적혈구의 수를 결정합니다.
    5. 주입에 필요한 희석공여자혈액의 부피를 결정하기 위해 각 희석의 1 μL에서 적혈구의 수에 의해 주입되는 감염된 적혈구의 원하는 수를 나눈다. 주입에 가장 적합한 부피로 희석을 선택하고 새로운 미세 원심 분리튜브에 부피를 추가하고 RPMI 배지로 120 μL로 완성하십시오.
  5. 일 0: 받는 마우스의 정 맥 주입
    1. 수용자 마우스를 열 빨간 램프 아래에 놓고 주사를 위해 정맥을 팽창시냅니다. 27 G 인슐린 주사기에 기생충 복용량을 로드 하 고 구속자에 받는 사람 마우스를 배치.
    2. 모기 감염 검문 또는 무성 및 성혈액 기 성장 검정을 위해 각 수용자 마우스에 27 G 인슐린 주사기를 사용하여 1백만 또는 10,000개의 감염된 적혈구를 정맥내(IV)로 주입합니다. 표준 하우징 조건 하에서 마우스를 계속 유지합니다.
      참고: IP 주사는 혈액에 도달하기 위해 복막 강의 배수 림프절을 통과해야기 때문에 기생충을 혈류로 도입하는 간접적인 방법입니다. 이것은 IP 주입 혈 류로 기생충의 정확한 수를 주입 에 대 한 간접 배달 경로. 따라서, IV 경로는 대표적인 결과에도시된 바와 같이 혈류로 직접 정확한 기생충 투여량을 전달하기 때문에 바람직하다.

2. 성적 및 무성 단계에 대한 혈액 단계 기생충 부하의 결정

참고: 이 섹션에서는 말라리아 기생충 혈액 단계의 표준화된 자형학적 평가 방법이 나열됩니다. 이러한 방법은 동일한 실험 마우스에서 성및 무성단계 발달에 대한 새로운 항말라리아 또는 백신 후보물 또는 유전자 녹아웃의 평가에 유용하다. 참고로, P. chabaudiP. vinckei는 또한 특히 약물 스크리닝에서 이러한 유형의 검정에 대해 매우 합리적이고 중요한 대체 옵션입니다.

  1. 기생충 성장 측정을 위한 Giemsa 염색한 얇은 혈액 얼룩에 의하여 무성 단계 및 남성 여성 gametocytes의 기생충의 결정
    1. 26 G 또는 27-G 바늘을 사용하여 마우스의 꼬리를 찌르고 현미경 슬라이드에서 혈액 방울을 수집합니다. 다른 현미경 슬라이드의 짧은 가장자리를 사용하여 슬라이드를 가로 질러 혈액을 빠르게 얼룩지게하십시오.
    2. 혈액이 슬라이드에서 완전히 건조 된 후에만 1 00 % 메탄올로 슬라이드를 수정하십시오. 10%의 Giemsa에 10-15분 동안 얼룩을 묻혀 있습니다.
    3. 100x 대물렌즈를 사용하여 슬라이드를 읽고 가벼운 현미경으로 오일침을 합니다. 정확한 기생충 측정을 위해, 적어도 총 6,000개의 적혈구를 확인하되, 그리드당 평균 200 또는 150개의 적혈구(RBC)를 가진 적어도 30개 또는 40개의 미세한 격자를 계산하여 얻을 수 있습니다. 첫 번째 및 마지막 그리드의 총 RBC 수를 계산하여 모든 그리드에 대한 평균 적혈구 수를 결정합니다.
    4. 그리드당 감염된 적혈구의 총 수를 계산합니다. 남성과 여성의 게임 토키테는 gametocytemia를 결정하기 위하여 별도로 계산될 수 있습니다 그러나 또한 총 기생충 수에 포함되어야 합니다.
    5. 관찰 된 RBC의 총 수로 기생 적혈구의 총 수를 나누어 총 기생충 백분율을 결정합니다. 이 숫자를 100으로 곱하여 기생충 백분율을 결정합니다.
    6. 관찰된 총 RBC 수로 계산된 총 게임 토심구 수를 나누어 게임 세포혈증을 결정합니다. 이 숫자를 100으로 곱하여 마우스당 게임 세포혈증 백분율을 결정합니다.
      참고: 다른 무성 및 성혈액 단계 사이 분화의 유일한 믿을 수 있는 방법은 각 단계는 미성숙한 gametocytes를 제외하고, 다른 형태를 가지고 있기 때문에, Giemsa 염색된 얇은 혈액 얼룩을 평가하기 위하여 현미경의 사용입니다, 미성숙한 gametocytes를 제외하고, 무성 혈기성 단계와 는 대부분 구별할 수 없습니다.
  2. 형광 기자 단백질 발현 WT 유사 기생충 균주에 대한 유동 세포측정에 의한 혈액 단계 기생충의 결정
    1. 각 마우스 샘플에 대해 두 개의 미세 원심분리튜브를 라벨링하고, 한 튜브는 1:1,000 희석에, 다른 하나는 1:2,000 희석을 지정합니다. 1:1,000 희석 튜브에 1.5 μL의 헤파린을 넣습니다.
    2. 26 G 또는 27 G 바늘을 사용하여 마우스의 꼬리를 찌르고 1x 헤파린 (1 : 1,000 희석 튜브)의 1.5 μL을 함유 한 튜브로 1.5 μL의 혈액을 옮긴다. 피와 1x 헤파린을 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
    3. 1,497 μL의 RPMI 배지를 미세 원심 분리튜브에 넣고 부드럽게 파이펫을 위아래로 섞어 잘 섞습니다.
    4. 혼합물의 500 μL을 1:1,000 희석관으로부터 1:2,000 희석관으로 옮니다. 1:2,000 튜브에 RPMI 배지 500 μL을 추가하고 위아래로 파이펫팅하여 부드럽게 섞습니다.
    5. 유세포계에 대한 제조업체의 적절한 시동 프로토콜을 따르십시오. 느린 유량으로 샘플을 실행하고 최소 20,000개의 이벤트에 대한 검색을 설정합니다.
      참고: 기생충이 형광 마커를 표현하든 그렇지 않든 삼색 FACS 분류를 통해 기생충을 측정하는 대안실용적인 분석이있다34. 그러나, 여기에 기술된 분석법은 DNA 결합 염료의 추가 및 FACS 선별의 사용 없이 살아있는 기생충에 있는 기생충의 정확한 측정을 제안합니다.
  3. 감염된 마우스 혈액의 마이크로 리터 당 남성 게임의 배멸 속도의 결정
    1. 불완전한 오키네테 배지(RPMI + 중탄산나트륨 + 저산소산틴 + 크산투렌산) 및 1x 헤파린 5 μL로 1:10 희석 미세원심분리튜브를 준비합니다.
    2. 26 G 또는 27 G 바늘을 사용하여 마우스의 꼬리를 찌르고 불완전한 오키네테 매질 + 헤파린을 함유한 튜브로 신속하게 5 μL의 혈액(마이크로파이펫 사용)을 전달합니다. 부드럽게 혼합하고 1:10 혈액 희석 튜브의 12 μL을 혈세포계에 적재하고 실온 (20-24 °C)에 둡니다.
    3. 1:10 희석을 준비한 후 9-10분 동안 폭발 이벤트를 계산하기 시작합니다. 40배 배율의 위상 대비 광 현미경을 사용합니다.
    4. 감염된 혈액의 마이크로리터당 평균 배멸 횟수를 결정하기 위해 희석 인자(10)를 곱한 후 10으로 계산된 폭발 이벤트의 평균 수를 곱합니다.
      참고: 이 분석은 혈세포계를 사용하여 정량화될 수 있는 1 μL 의 혈액 부피에서 남성 게임테 배압 사건의 수를 측정합니다. 불완전한 ookinete 배지18은 혈액 식사 직후 모기 midgut 안쪽에 배증이 일어나는 동안 조건을 밀접하게 모방하기 위하여 혈액과 혼합됩니다.

3. 감염된 적혈구 및 냉동 재고 준비에서 혈액 단계 기생충의 격리 및 처리

  1. 심장 천자에 의한 감염된 설치류의 말기 출혈
    1. 약 ≤20 μL의 1x 헤파린 (200 단위 / mL)을 포함하는 26 G 바늘 주사기를 준비하여 심장 천자에 의해 기증자 마우스의 혈액을 수집합니다.
    2. 출혈 전에 마우스를 안락사시키기 위해 CO2의 느린 흐름을 사용하십시오. 또는, 이소플루란으로 마우스를 마취 (이는 심장을 노출하기 위해 피부 절개 전과 동안 유지되어야한다).
    3. 마우스를 뒷면에 놓고 부속물을 고정합니다. 포셉으로 피부를 당기고 가위로 절단하여 흉골의 기저부근의 피부에 작은 절개를합니다. 절개 부위에서 피부를 떼어 내어 다이어프램과 복강 상단을 노출시다.
    4. 집게로 늑골 케이지의 베이스를 잡고 흉강 구멍에 들어가기 위해 횡격막을 통해 잘라; 심장이나 폐를 손상시키지 않도록 주의하십시오. 갈비뼈를 뒤로 고정하여 심장을 노출시다.
    5. 부드럽게 심장을 뚫고 천천히 혈액의 ~ 1 mL를 수집하고 미세 원심 분리튜브로 전송하는 주사기 플런저에 당겨.
  2. 감염된 혈액에서 냉동 주식의 준비
    1. 약 2%와 5% 사이의 혈액 기생충으로 마우스를 출혈(섹션 3.1 참조)하고, 상당한 양의 고리 단계가 있고 많은 게임토키트가 아닙니다.
    2. 원하는 혈액 부분을 냉동 용액(Alsever 용액의 10% 글리세롤)과 1:2 비율로 혼합하고 극저온 바이알에 보관하십시오. 액체 질소에 동결.
  3. DNA, RNA 및 단백질 추출을 위한 혈액 단계 기생충의 분리 및 정화
    1. 혈액 기생충이 0.5% 이상인 출혈 마우스(섹션 3.1 참조).
    2. 플런저를 제거하고 작은 면봉을 삽입하여 10 mL 주사기를 준비합니다. 면을 주사기 바닥에 싸서 포장합니다. 셀룰로오스 의 수준이 3 mL 마크에 도달하지만 주사기의 4 mL 마크를 초과하지 않을 때까지 셀룰로오스로 채웁니다.
    3. 주사기를 링 스탠드의 클립에 고정하고 폐수튜브를 그 아래에 놓습니다. 주사기에 PBS 5 mL을 추가하고 폐관으로 흐르도록하십시오.
    4. 필요한 경우 100-300 μL의 혈액만 사용하여 냉동 된 주식을 준비하십시오. 감염된 혈액의 나머지 부분 (400-700 μL)을 열에 추가합니다. 물방울이 빨간색으로 변하기 시작할 때까지 폐관으로 흐름을 수집합니다. 물방울이 빨갛게 변하기 시작하면 주사기 아래에 새로운 14mL 수집 튜브를 놓아 흐름을 수집합니다.
    5. 흐름이 느려지기 시작하면 주사기에 PBS를 추가하고 총 부피가 14 mL에 도달 할 때까지 15 mL 튜브에서 흐름을 수집합니다. 폐관으로 남은 흐름을 수집합니다.
    6. 브레이크없이 250 x g에서 8 분 동안 혈액 / PBS 혼합물로 14 mL 튜브를 원심 분리합니다. 상류를 제거하고 차가운 사포닌 14 mL (PBS 50 mL에서 사포닌 50 mg)를 추가하십시오. 펠릿을 빼내려면 튜브를 여러 번 반전시키고 필요한 경우 와류를 반전시키십시오.
    7. 브레이크없이 1,217 x g에서 8 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상한자를 제거하고 약 0.5 mL의 용액을 펠릿 위에 남겨 둡습니다.
    8. 마이크로파이펫을 사용하여 용액의 펠릿을 다시 중단하고 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김시. 튜브에 남아있는 잔류 기생충을 세척하기 위해 14 mL 튜브에 PBS 500 μL을 추가하십시오. 동일한 미세 원심 분리튜브에 이 것을 추가합니다.
    9. 6,010 x g에서 2 분 동안 튜브를 원심 분리기. 상급을 제거하고 PBS의 1 mL을 다시 일시 중단합니다. 9,391 x g에서 2 분 동안 원심 분리기 .
    10. 유전체 DNA, 총 RNA 및 단백질 추출물을 진행합니다.
      1. 게놈 DNA 추출을위해 상온자를 제거하고 PBS의 200 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단한 다음 gDNA 추출의 적절한 프로토콜을 따르십시오.
      2. 총 RNA추출을 위해, 페놀 및 구아니딘 이소티오냐네이트 기반 용액 또는 임의의 다른 적합한 시약의 1 mL에서 펠릿을 상류, 재중단 및 와류를 제거하고, 이어서, 총 RNA 추출의 임의의 적합한 프로토콜을 따른다.
      3. 총 단백질추출의 경우 상류를 제거하고 펠릿을 6x 나트륨 도데실 황산염 (SDS) 로딩 염료 또는 기타 적합한 시약의 적절한 부피로 다시 일시 중단하고 총 단백질 처리의 적절한 프로토콜을 따르십시오.

4. 모기 감염 어세이

참고: 모기는 성적인 재생산이 일어나는 말라리아 기생충의 1 차적인 호스트입니다. 모기에 말라리아 기생충을 전송하는 마우스의 감염은 감염된 마우스를 공급한 다음 적어도 1백만 개의 혈액 단계의 IV 주입에 의해 수행됩니다 (가장 높은 남성 gamete exflagellation 비율을 표시하는 각 유전자형에서). 3 일째에 케이지에 있는 모기를 마우스 감염 후 3일째에 안과 백에 감염시. 페닐히드라진 처리 마우스에서 1백만 개의 혈액 단계 기생충을 가진 IV 주사는 더 빠르고 더 높은 비율로 남성과 여성 gametocyte의 발달을 보장할 것입니다. P. yoeliiP. berghei에 감염된 모기는 각각 24°C 및 20-21°C에서 배양되어,최상의 모기 단계 발달을 허용한다 6.

  1. 모기 먹이 및 모기 당 ookinetes의 수의 결정
    1. 굶주린 성인 여성 Anopheles stephensi 또는 A. 감비아에 모기 (4-7 일 오래 된) 에 대 한 8-12 먹이 전에 시간. 성인 모기가 감염된 마취 된 마우스 (케타민 / 자일라진의 적절한 용량으로 주입)에서 적어도 15 분 동안 먹이도록 허용하십시오 (섹션 2.3에서 측정).
      참고: 케타민/자일라진 작업 용액은 마우스당 100 μL을 주입하는 식염수 및 IP로 스톡 용액의 1:5 희석에 의해 제조된다. 10 mL 스톡 솔루션의 경우, 1 mL의 자일라진 (100 mg/mL)을 9 mL의 케타민 (100 mg / mL)에 첨가합니다.
    2. 입 흡입기로 먹이지 않은 암컷 모기와 수컷 모기를 제거합니다.
    3. 18-20 시간 후 먹이, 20-30 모기를 수집 하 고 죽음을 보장 하기 위해 적어도 10 분 동안 냉동실에 배치. 쌍안경 해부 범위를 사용하여, 20-30 혈액 채워진 midguts 26 G 또는 27 G 바늘 또는 RPMI 또는 PBS 해부 매체에 바늘과 집게를 해부하고 RPMI 또는 PBS의 200 μL을 포함하는 마이크로 원심 분리 튜브에 중간 을 전송 (해부 방법). 섹션 4.3을 참조하십시오.
    4. 700 x g에서 1 분 동안 수집 튜브를 원심 분리기. 펠릿 미드거트를 배고플을 사용하여 갈아서 갈아서 갈아놓습니다. 이 단계를 반복합니다.
    5. 지상 미드구트의 튜브에서 새로운 미세 원심 분리튜브로 50 μL을 옮김. RPMI 또는 PBS 200 μL을 추가하여 1:5 희석을 만듭니다.
    6. 12 μL을 혈세포계로 옮기고 실온에서 5 분 동안 배양하여 내용이 정착 될 수 있도록하십시오.
    7. 위상 대비 및 40배 배율을 가진 광 현미경을 사용하여 ookinetes의 평균 수를 결정합니다.
    8. 성숙한 우키넷의 평균 수를 10으로 곱한 다음 희석 계수를 5로 곱하여 오키넷의 평균 총 수를 결정합니다.
    9. 오키네의 평균 수를 해부된 혈액 공급 모기의 수로 나누어 혈액을 공급하는 모기 당 오키넷의 수를 결정합니다.
  2. 형광 리포터 단백질 발현 WT 유사 기생충 균주에 대한 초기 난모낭의 수의 결정
    참고: 이 분석의 목적은 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 기생충의 수를 결정하는 것입니다 (GFP) 모기 midguts의 전체 감염을 확립하고 초기 구형 난모낭을 형성. 이 분석은 ookinetes (이전 분석에서 추정된 그들의 발달)가 모기 midgut 상피 세포를 통해 통과에 의해 그들의 기능을 완료하고 midgut의 기저 층상 측에 초기 oocysts로 의한 변환을 결정합니다. 에피텔리아 여부. 이것은 GFP를 표현하는 기생충의 중대한 사용을 만드는 또 다른 분석실험입니다, 이 단계에서 초기 난모낭을 계산하는 것은 지루한 면역 얼룩 없이 거의 불가능할 것이기 때문에.
    1. P. yoelii 17X-NL에 대한 3 일 또는 4 후 모기 먹이 (pmf)에, 그리고 P. berghei ANKA에 대한 6 또는 7 pmf, 두 개의 26 G 또는 27 G 바늘 또는 RPMI 또는 PBS 의 바늘과 포셉으로 20-30 혈액 먹이 모기의 midguts (섹션 4.1 참조)를 해부 에듐 (해부 방법은 섹션 4.3을 참조하십시오).
    2. 유리 슬라이드의 긴 가장자리의 수평 중간선에 해부 매체의 40-50 μL을 확산시다. 해부 하는 동안 한 번에 하나씩이 라인에 midguts를 전송 하 고 중간 구트에 더 많은 매체를 추가, 필요한 경우, 밖으로 건조 를 방지 하기 위해.
    3. 해부된 미드거트에 커버슬립을 부드럽게 놓고 매니큐어로 밀봉합니다.
    4. 녹색 형광 필터와 형광 현미경의 10x 또는 20x 목표를 사용하여, 적어도 20 midguts에서 각 midguts에 초기 oocysts의 수를 계산합니다.
  3. 모기 당 난모포 포자화물의 수의 결정
    1. 26-G 또는 27-G 바늘 또는 RPMI 또는 PBS 해부 배지에서 바늘과 집게로 적어도 20-30 모기의 미드거트를 해부하고 RPMI의 200 μL에서 해부된 미드거트를 수집합니다.
    2. 하복부 세그먼트를 한 바늘 (또는 집게)으로 단단히 잡고 흉부와 복부 사이의 접합부에서 다른 바늘과 함께 위쪽으로 흉부를 가볍게 밀어 넣습니다. 흉부가 복부에서 분리 될 때까지 조심스럽게 짧게 밀어 넣습니다. 분리가 시작되자마자 흰 미드거트가 늘어난 것처럼 보이고, 흉부 분리에 사용된 것과 동일한 바늘을 사용하여 식도 끝에서 미드가트가 절단됩니다. 여전히 복부에 부착된 경우, 동일한 바늘을 사용하여 복부에서 미드구트를 당길 수 있습니다. 모든 모기의 미드거트를 한 번에 하나씩 바늘로 배지에서 수집하여 수집 튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 채취합니다.
    3. 수집 튜브를 700x g에서 1 분 동안 원심 분리하여 수집 튜브의 바닥에 미드 거트를 정착시키고 유봉으로 갈아냅니다. 이 단계를 반복합니다.
    4. 12 μL을 혈세포계로 옮기고 실온에서 5 분 동안 배양하여 내용이 정착 될 수 있도록하십시오.
    5. 빛 현미경의 40X 목표를 사용하여 난모포 포자를 계산합니다. 모기 파편이 포자화의 정확한 계산을 방해하거나 포자형의 수가 너무 많으면 정확하게 계산할 수 없을 때 1:5 및/또는 1:10 희석을 사용하십시오.
    6. 평균 포자이트 수에 10을 곱하여 난모포자 체의 평균 총 수를 계산한 다음, 그 숫자에 희석 계수(있는 경우)를 곱하고 총 부피(200 μL)를 곱합니다.
    7. 모기 당 난모사 포자의 평균 수를 계산하기 위해 해부 된 모기의 수로 평균 총 포자수염 수를 나눕니다.
      참고: 모기 단계 감염의 성공 또는 생산성을 측정하기위한 일반적인 실수는 난모낭 발달의 나중 단계에서 난모낭의 수를 계산하는 것입니다. 이것은 oocyst 발달의 나중 시점에서 일부 oocysts가 진공 화되고, 그 외는 같은 midgut에 조차, sporozoites를 개발하는 것을 실패하기 때문입니다. 모기 단계 감염의 생산성을 결정하는 가장 신뢰할 수있는 방법은 P. yoelii에 대한 10-12 후 모기 감염 및 일 12-14일에 중거트 oocyst 포자형의 평균 수를 계산하는 것입니다. P. berghei에대 한 모기 감염 후.
  4. 모기 당 타액 선 포자형의 수의 결정
    참고:모기 단계 발달의 완전한 완료의 궁극적인 평가는 척추동물에 투과성 및 전염단계인 침샘을 침략한 포포로조이의 수를 추정해서 달성됩니다. 침샘의 침입은 난모포종 개발이 완료된 후, 헤모림프로 송신되고, 타액선의 기저 라미나에 부착되고, 침샘에 도달하기 위해 아시나르 세포의 통과를 확립한다. 덕트5개. 따라서, 이러한 분석또한 이러한 모든 프로세스의 성공 여부에 대한 평가이다. 그럼에도 불구하고, 헤모 림프 스porozoite 숫자의 추정은 침샘의 침략에 있는 난모낭 및 결점에서 송신에 있는 결점 사이 분화를 허용할 것입니다35세. 침샘 포자형의 정제는 포자형 운동성 및 침입 표현형에 대한 여러 기능적 검사를 수행 할 수 있습니다. 침 샘 스포로 조이는 또한 쥐의 생체 내 감염 및 예방 접종 연구에 사용할 수 있습니다.36세,37세. 더욱이, 시험관내 간 단계 침략 또는 발달 분석기를 확립하기 위하여 이용 가능한 가장 재현가능한 단계는 침샘 포자조이스의 사용에 의하여 이다.
    1. 50-100 암컷 모기의 침샘을 해부, 일 14-16 p. yoelii에 대한 오후 17-20 pmf에 P. berghei,바람직하게는 두 개의 26 G 또는 27 G 바늘, RPMI 또는 DMEM 배지에 얼음에 보관하고 5 % 태아 소 혈청 (FBS)로 보충 또는 소 혈청 알부민 (BSA) P. yoelii sporozoites 또는 3% FBS/BSA P. berghei sporozoites에 대 한. 포을 종체가 시험관 내 세포종에서 사용되는 경우, 해부 매체에 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가하십시오. 일반적으로 침샘의 해부를위한 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째 방법은 시간이 많이 걸리지만 오염 된 조직이 거의 없거나 전혀없는 타액 샘의 해부로 이어집니다. 두 번째 방법은 시간이 덜 걸리지만 상당한 양의 오염 조직을 수집합니다. 첫 번째 방법은 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
    2. 한 바늘의 경사진 면으로 위 복부 세그먼트를 잡고 머리가 조심스럽게 흉부에서 분리 될 때까지 머리와 흉부 사이의 접합부에서 매우 가볍게 (매우 짧은 푸시로) 머리를 밀어 넣습니다. 유리 침샘을 찢어, 노출 된 타액 선은 다음 머리를 위쪽으로 밀어 같은 바늘로 머리에서 분리됩니다.
    3. 해부된 침선은 짧은 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 해부 배지로부터 제기될 것이다.
    4. 모든 타액선이 해부되고 수확되면, 재능은 미드구트가 들어있는 튜브를 원심 분리기 (1 분, 700 x g)에 넣습니다.
    5. 2상 대비 및 40배 배율로 설정된 가벼운 현미경으로 혈소계를 사용하여 스포로조이트 수를 계산합니다. 모기의 수가 ≥40을 해부한 경우, 예상 감염수율(이전 검문에서 결정)에 따라 침샘을 1:5 또는 1:10으로 희석한다.
    6. 평균 포포로조이트 수에 10을 곱하고 희석 계수(있는 경우)를 곱합니다. 총 부피를 곱하여 평균 침샘 스포로조이트 수를 결정합니다. 해부된 암컷 모기의 수를 나누어 모기 당 평균 침샘 포자를 결정합니다.
      참고: 침샘의 해부 문제는 작은 크기와 유리 투명 한 외관입니다. 따라서 타액선을 분리하는 것은 매우 어렵고, 따라서 흉부 의 정면 부분에서 다른 조직과 함께 일괄 합계로 해부되며, 이는 수집 중에 침샘을 파열로부터 보호하는 것이 중요합니다.

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Representative Results

말라리아 기생충에 역유전적 도구와 기술을 적용하는 성공은 말라리아 연구 분야에 혁명을 일으켰으며, 여러 Plasmodium 종의 특정 게놈 세그먼트를 추가, 삭제 또는 수정할 수 있는 능력으로39개에 달하는 말라리아 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다. 중요한 것은, 분배 가능한 게놈 loci는 설치류와 인간 말라리아 기생충에 있는 형광 단백질 마커를 이중 상동 재조합에 의하여, 모든 생활 주기 단계 40에서 안정한 발현을 지키기 위하여 성공적으로 이용되었습니다 ,41,42. 이러한 WT와 같은 형질전환 기생충의 예는 우리 실험실에서 생성된 Py230p(-) 기생충이며, 혈액 및 모기 수명 주기 단계15,16의 발달에 명백한 결함이 없음을 보여주었다. 17. 이러한 형질전환 기자 기생충은 eGFP를 표현, PyHSP70의강력하고 구성 프로모터의 제어하에, 혈액 단계에서 (그림1A)ookinetes (그림1B),젊은 oocysts (그림1C) ) 안노페레스 에 스티븐시 미드구트, 및 아노펠리스 스티븐시 여성의 침샘에서 분리 된 포자형체 (도1D). 따라서, eGFP 발현 혈액 기생충은 형질전환 기생충의 다른 유전자형 사이 또는 약물 치료 와 약물 표적화에서 치료되지 않은 사이 유동 세포측정을 사용하여 혈액 단계 기생충을 평가하는 것이 훨씬 쉽고 적은 시간 소모적 형질전환 기자 기생충을 이용한 어세이.

현미경 검사법에 의한 유세포분석의 사용과 더 지루한 기생충 추정 사이에 정량적 차이가 없음을 확인하기 위해, eGFP 발현 Pyp230p(-)에 의해 기생적 적혈구의 백분율을 추정하는데 사용하였다. 유세포 분석 및 10,000개의 기생 적혈구에 감염된 스위스 웹스터 마우스 IV군에서 Giemsa 염색된 얇은 혈액 얼룩에 의해. 유세포분석 기기생충% 값은 두 명의 전문 과학자에 의해 추정된 Giemsa 염색된 얇은 혈액 얼룩을 모니터링함으로써 추정된 기생충%에 직접적으로 대응하였다(그림 2). 이것은 혈액 단계 기생충의 성장 속도의 결정에 있는 현미경 검사법의 지루하고 수그린 인간 에러 방법에 더 정확한 대안을 나타냅니다.

말라리아 기생충 혈액 단계를 가진 설치류의 감염과 관련되었던 중요한 불일치는 감염의 IV 경로에 비교된 IP를 위한 문헌에 있는 강한 특혜와 함께 감염의 경로의 선택입니다, 그것은 더 적은 시간 소모로. 감염의 이 2개의 경로를 비교하기 위하여는, 5개의 BALB/c 마우스의 2개의 단은 IV 또는 IP 경로를 통해 마우스 당 1,000eGFP 표현 Pyp230p(-) 기생적 적혈구에 감염되었습니다. 기생충은 4 일의 기간 동안 유세포 측정을 사용하여 매일 모니터링되었다. IV-감염된 군에 비해 IP 감염군 기생충%의 통계적으로 유의한 감소가 시험된 모든날에 주목되었다(도 3). 이것은 IV 감염 경로가 말라리아 기생충 혈액 단계를 가진 분석검사를 위한 감염의 더 정량적으로 정확한 경로이다는 것을 증거를 제공합니다.

그럼에도 불구하고 혈액 단계 기생충을 평가하기 위한 유동 세포분석의 사용에 대한 한 가지 제한은 성단계와 무성단계, 그리고 남성과 여성의 게임토키스트 간의 분화이다. 따라서, 상이한 무성 및 성단계각각의 백분율의 추정(도 4)은 지름사 염색된 얇은 혈액 얼룩의 형태평가에 의존해야 한다. 성숙한 남성과 여성의 게임 토토키트의 명백한 다른형태에도 불구하고 (그림 4), 미성숙한 성적 단계는 종종 무성 단계와 구별할 수 없습니다.

모기 midgut에서 남성 gametocyte에서 출현 시 남성 gametes의 한 가지 필수적인 기능은 시간의 매우 짧은 기간 내에 발생 해야 하는 전송에 매우 중요 한 단계는 남성 gamete exflagellation. 많은 다른 시스템에서 이를 평가하는 데 사용되는 가변 메서드가 설명되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 임의의 임의의 간단한 실험실 설정에서 반복될 수 있는 표준화된 방법을 보여준다. 우리는 수용자 마우스에 페닐히드라진을 주입하거나 주입하지 않고 남성 게임테의 박멸을 평가하였다(그림 5). 우리는 페닐히드라진 치료가 남성 gamete 박증의 비율을 크게 증가시켰으며, 이는 차례로 수정 속도와 모든 후속 모기 단계의 수를 증가시킬 것을 보여줄 수 있었다.

Figure 1
그림 1 : 개발 P. yoelii p230p (-) 기생충은 혈액과 모기 단계에서 eGFP를 구성하여 표현한다. (A) 혼합 혈액 단계 기생충의 이미지 (1,000 X 배율). (B) 우키네테(400배 배율)의 이미지. (C) eGFP(100X 배율)를 발현하는 살아있는 p230p(-) 기생충의 초기 난모낭에 감염된 아노펠레스 스티븐시 모기 중거트의이미지. (D) 이 패널은 P. yoelii p230p(-) 타액선 스포로조이트(sporozoite)의 라이브 이미지를 나타내며, 15일 오후 15시에 해부되어 eGFP(400X 배율)를 표현한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : 유세포분석및현미경검사검사검사평가의평균혈액기혈중기혈증 P. yoelii p230p (-) 기생충은 유의적으로 다르지 않다. 4개의 스위스 웹스터 마우스의 그룹은 마우스 당 Pyp230p(-)의 10,000개의 기생적 적혈구에 정맥내 감염되었고, 평균 혈액-단계 기생충%는 유세포측정및 현미경 평가에 의해 7일 동안 매일 기록되었다. 짐사 염색 얇은 혈액 얼룩의 총에서 20,000 그리고 ~6,000 적혈구, 각각. 표시된 현미경 검사 결과는 슬라이드 당 2명의 전문가 과학자에 의해 2개의 독서의 평균이고, 각 슬라이드의 기생충을 평가하기 위한 시간은 각 과학자에 의해 적어도 10 분이었습니다. 여기에 표시된 날에는 중요한 차이점을 감지할 수 없습니다. 모든 기생충 균주에 대한 평균 값을 2꼬리 t-test로 분석하였습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : 정맥 주사 P. yoelii p230p (-) 기생충은 복강 내 주사로부터 현저하게 다른 혈액 단계 기생충을 산출합니다. 5개의 BALB/c 마우스의 2개의 단은 정맥 또는 복강 내 경로를 통해 마우스 당 Pyp230p(-)의 1,000의 기생적 적혈구에 감염되었고, 평균 혈액 단계 기생충%는 플로우에 의해 4 일 동안 매일 기록되었습니다. 총 20,000 개의 적혈구에서 세포측정. 혈액 단계 기생충의 통계적으로 유의한 감소 (별표로 표시) 정맥 경로 그룹에 비해 복강 내 경로 그룹에서 테스트 된 모든 일에 대해 검출 될 수있다. 모든 기생충 균주에 대한 평균 값을 2꼬리 t-test로 분석하였습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : P. Yoelii 게이머 는 Giemsa 스테인드 얇은 혈액 얼룩에. WT P. yoelii 17X-NL 균주에 감염된 스위스 웹스터 마우스의 Giemsa 스테인드 얇은 혈액 얼룩 (1,000X 배율)의 이미지는 왼쪽에있는 전형적인 푸른 색의 여성 gametocyte (화살표로 표시)와 분홍빛 남성 ( 별표) 게임토시테로 표시되어 있습니다. 표시된 다른 단계는 무성 혈액 단계입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5 : 페닐히드라진이 남성 게이머에게 미치는 영향. 페닐히드라진이 수용자 마우스에 주입된 효과는 5일 전에 수컷 게임테 의 박증율 추정치 P. yoelii. 페닐히드라진은 수컷 게이머 배설물의 속도를 크게 증가시킵니다. 모든 기생충 균주에 대한 평균 값을 2꼬리 t-test로 분석하였습니다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

인간 말라리아 기생충의 그것과 그들의 생활 주기의 일반적인 생물학에 있는 유사성에도 불구하고, 마우스 말라리아 모형은 또한 생체 내 모형에서 믿을 수 있는 그들의 사용을 제한하는 인간 적인 Plasmodium 종에 많은 유사점이 있습니다. 예를 들면, 백신으로 살아있는 감쇠한 기생충을 제외하고, 소단위와 DNA 및 그밖 백신을 가진 모든 백신 연구 결과는 마우스 모형에 있는 우수한 결과를 주었습니다, 그러나 풍토성 지역에 사는 인간에서는, 결과는 만족에서 멀리 이었습니다.

또 다른 문제는 한 마우스 변형에서 다른 마우스 균주에서 다른 수명 주기 단계 감염의 차이, 때로는 동일한 마우스 변형에 대 한 다른 한 동물 공급 업체에서. 더욱이, 생체내 말라리아 모델에서 선호되는 것으로 널리 사용되는 주요 2개의 설치류 말라리아 종, P. bergheiP. yoelii,어떤 인간 말라리아와는 완전히 다른 동기 혈액 단계 주기를 전시하지 않습니다 기생충. 그러나, 생체 내 모델로 마우스 말라리아 기생충을 사용 하 여 혜택 지금까지 이러한 유사성 보다 큽니다., 또한 이러한 제한의 분자 드라이브의 더 심층 분석에 의해 극복 될 수 있는. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 제한은 주로 설치류 말라리아 혈액 단계 기생충에 의해 표시 됩니다., 하지만 말라리아 기생충의 다른 라이프 사이클 단계에 대 한 많은.

혈액 단계는 각종 백신, 약 표적으로 하는, 면역학 및 기능적인 게놈 연구 결과를 위해 중요하더라도, 현상추나기 분석 및 기능적인 분석에 집중하는 표준화한 방법 및 프로토콜의 부족이 있습니다 설치류 말라리아 기생충 혈액 단계 기생충, 모기 전송 및 형혈 프로토콜에 더 많은 초점. 따라서이 기사의 방법은 설치류 말라리아 기생충의 병원성 단계를 연구하기위한 표준화되고 단순화 된 프로토콜을 제공하는 데 도움이됩니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

아메드 Aly는 개발 보조금의 터키 정부에서 Bezmialem Vakif 대학에 자금 지원 2015BSV036, 공중 보건 및 열대 의학의 툴레인 대학 학교에서 제공하는 자금으로, R21Grant에 대한 NIH-NIAID에서 자금지원 1R21AI11058-01A1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin Sigma 375095-100KU
Xanthurenic acid Sigma D120804-5G
Hypoxanthine Sigma H9377-25G
Alsever's solution Sigma A3551-500ML
Sodium Bicarbonate Sigma S5761-500G
Phenylhydrazine Sigma P26252-5G
Glycerol Sigma G5516-500ML
Giemsa Sigma GS1L-1L
26 G x 3/8 Precision Glide Needle,  Becton Dickinson 305110
1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 Becton Dickinson 309625
1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G Becton Dickinson 329412
Isoflurane, USB Piramal 2667- 46- 7
PBS, pH 7.4 Gibco 10010049
RPMI Gibco 22400105
DMEM Gibco 11995065
Pencillin/Streptomycin Gibco 10378016
Fetal Bovine Serum Gibco 10082147
Fiber Glass Wool Corning 3950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Aly, A. S. I., Deveci, G., Yilmaz, I., Abraham, A., Golshan, A., Hart, R. J. Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages. J. Vis. Exp. (147), e55688, doi:10.3791/55688 (2019).

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