Summary
Debido a las sorprendentes similitudes del ciclo de vida y la biología de los parásitos del paludismo de roedores con los parásitos del paludismo humano, los modelos de malaria de roedores se han vuelto indispensables para la investigación del paludismo. En este documento, estandarizamos algunas de las técnicas más importantes utilizadas en el análisis fenotípico de especies de malaria de roedores de tipo salvaje y transgénico.
Abstract
Los recientes avances en las tecnologías de la genética y la biología de los sistemas han promovido nuestra comprensión de la biología de los parásitos de la malaria a nivel molecular. Sin embargo, las metas eficaces de los parásitos del paludismo para el desarrollo de vacunas y quimioterapia siguen siendo limitadas. Esto se debe en gran medida a la indisponibilidad de modelos de infección in vivo relevantes y prácticos para las especies humanas de Plasmodium, sobre todo para P. falciparum y P. vivax. Por lo tanto, las especies de malaria de roedores se han utilizado ampliamente como modelos prácticos alternativos in vivo para la vacuna contra el paludismo, la segmentación de fármacos, la respuesta inmunitaria y los estudios de caracterización funcional de los genes Plasmodiumspp conservados. De hecho, los modelos de malaria de roedores han demostrado ser invaluables, especialmente para explorar la transmisión de mosquitos y la biología de la etapa hepática, y eran indispensables para los estudios inmunológicos. Sin embargo, existen discrepancias en los métodos utilizados para evaluar los fenotipos de los parásitos transgénicos y de tipo salvaje asexual y sexual en estadio sanguíneo. Ejemplos de estas discrepancias son la elección de una infección intravenosa frente a la infección intraperitoneal de roedores con parásitos en estadio sanguíneo y la evaluación de la exflagelación de gametos masculinos. En este documento, detallamos métodos experimentales estandarizados para evaluar los fenotipos de las etapas de la sangre asexual y sexual en parásitos transgénicos que expresan especies de parásitos de la malaria de roedores de tipo reportero o salvaje. También detallamos los métodos para evaluar los fenotipos de las etapas de los mosquitos parásitos de la malaria (gametos, ookinetes, ovocitos y esporozoitas) dentro de los vectores de mosquitos Anopheles. Estos métodos se detallan y simplifican aquí para las cepas letales y no letales de P. berghei y P. yoelii, pero también se pueden aplicar con algunos ajustes a las especies de malaria de roedores P. chabaudi y P. vinckei.
Introduction
Los parásitos de la malaria causan cientos de millones de infecciones por paludismo en humanos en todo el mundo, con más de 600.000 muertes cada año1. Las infecciones humanas son causadas por cinco especies de parásitos de la malaria, a saber, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaey P. knowlesi. La mayoría de las muertes clínicas por paludismo son causadas por P. falciparum en el Africa subsahariana1. Otra especie de parásito de la malaria humana que causa grandes morbilidades en todo el mundo fuera del Africa subsahariana es P. vivax2. Las otras tres especies están más restringidas geográficamente y causan infecciones benignas de malaria, excepto la letal P. knowlesi3. La indisponibilidad de modelos pertinentes y prácticos de infecciones no humanas in vivo siempre ha sido y sigue siendo un obstáculo para la vacuna contra el paludismo y el desarrollo de medicamentos. Los estudios metabólicos y de la focalización de los medicamentos para el paludismo anteriores han dependido ampliamentede modelos de malaria aviar como P. gallinaceum y P. lophurae,infectando pollos y patos, respectivamente 4. A partir de entonces, las especies de malaria de roedores se introdujeron gradualmente en varias vacunas y estudios de segmentación de fármacos como modelos in vivo. A lo largo de los años, se han acumulado evidencias de similitudes de la biología y las interacciones huésped-parásito de las etapas del ciclo de vida de los modelos de malaria de roedores con las especies de malaria humana.
En particular, los modelos de malaria de roedores fueron extremadamente importantes paraexplorar y caracterizar la biología de las etapas 5 de mosquitos y preeritróticos. Sin embargo, hay cuatro especies de malaria de roedores (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi,y P. vinckei) que tienen diferentes características biológicas, las más notables de las cuales se encuentran en las etapas de la sangre6. Las especies de malaria de roedores difieren en la sincronicidad de las etapas de la sangre, donde las etapas de la sangre de las cepas de P. chabaudi y P. vinckei son en su mayoría sincrónicas, mientras que las etapas de sangre de P. berghei y P. yoelii no son6 , 7. Otra diferencia notable es el autoaclaramiento delas etapas de la sangre que se produce en algunas cepas (por ejemplo, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, y P. vinckei lentum), mientras que la infección sanguínea de otras cepas de la misma especie podrían ser letales si no se tratan (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, y P. chabaudi AS). Además, la cepa P. yoelii 17X-NL y la cepa P. berghei ANKA invaden preferentemente reticulocitos8,9,10,11, aunque estas características de P. Las cepas yoelii y P. berghei no son un estricto requisito de crecimiento12,13,14. Por lo tanto, los ratones son tratados con fenilhidrazina antes de una infección con las etapas de la sangre de esos parásitos para aumentar la parasitamia y la gamecitomia necesarias para una infección por mosquitos para la cepa P. berghei ANKA y para P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.
También existen diferencias en el desarrollo de las etapas de los mosquitos entre las diferentes especies depaludismo de roedores, siendo la más notable la temperatura y el tiempo necesarios para el desarrollo óptimo de las etapas de los mosquitos y la longitud 5,6, 20. En las etapas preeritroccíticas de las especies de paludismo de roedores, las diferencias incluyen las especies de roedores y la cepa que son más susceptibles a la inoculación infecciosa de esporozoita, el número de esporozoitos necesarios para la inoculación en una cepa de roedores susceptible, el tipos de células de mamíferos necesarias para los ensayos de desarrollo de la etapa hepática in vitro, y el tiempo para completar el desarrollo de la etapa hepática5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
A pesar de estas variabilidades, los parásitos del paludismo de los roedores fueron los modelos favorables desde el principio para la aplicación de enfoques genéticos inversos, porque conllevarban menos tiempo y recursos con una alta probabilidad de éxito31. De hecho, los modelos de malaria de roedores fueron los mejores modelos, y en muchos casos los únicos modelos, disponibles durante muchos años para caracterizar funcionalmente los genes expresados en las etapas de mosquitos y hígado.
A la luz de la popularidad y amenabilidad de los enfoques genéticos inversos en los modelos de malaria de roedores, se han utilizado una serie de metodologías diferentes para analizar los fenotipos de las etapas del ciclo de vida del parásito transgénico, especialmente las etapas de la sangre. Sin embargo, algunas de estas metodologías son inconsistentes; por ejemplo, comparando las infecciones de parásitos en estadio sanguíneo después de una inyección de IP (que posiblemente se drenan a los ganglios linfáticos peritoneales y, a partir de ahí, pueden entrar en el torrente sanguíneo; por lo tanto, los parásitos inyectados no terminan por igual en el torrente sanguíneo) , comparando la transmisión de mosquitos de clones con un número diferente de transferencias en estadio sanguíneo serie o número G (que podrían afectar a la gametocitogénesis32,33), o comparar parásitos transgénicos directamente con el tipo salvaje ingenuo (WT) parásitos que nunca fueron sometidos a electroporación y selección positiva de fármacos y a las diversas evaluaciones no estandarizadas de la exflagelación de gametomasculino masculino. Por lo tanto, es crucial estandarizar los protocolos que son fáciles de seguir para el análisis fenotípico de cualquier tipo de parásitos transgénicos o WT de malaria de roedores en la sangre y en el mosquito para adaptarse a las variabilidades biológicas del paludismo de roedores especies de parásitos.
Aquí, informamos sobre un protocolo experimental estandarizado y detallado para el análisis fenotípico de las etapas del ciclo de vida de la sangre y mosquitos de los parásitos transgénicos o salvajes P. yoelii y P. berghei. Estos protocolos también son aplicables a los parásitos P. chabaudi y P. vinckei.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tulane y el comité de ética de animales de la Universidad Bezmialem Vakif. Todos los demás protocolos experimentales y el uso de ADN recombinante se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Tulane.
1. Infección de ratones con parásitos en estadio sanguíneo para el análisis de parásitos y ensayos de infección de mosquitos
- Día -3: inyección opcional de fenilhidrazina en ratones receptores
- Inyectar ratones receptores de SW o CD1 (ratones que se utilizarán para la infección por mosquitos y ensayos de infección por mosquitos) por vía intraperitoneal (IP) con 100 ol de fenilhidrazina (50 mg de fenilhidrazina en 5 ml de 1 salina con amortiguación de fosfato (PBS)) utilizando una aguja de 26 G Jeringa.
NOTA: Para las infecciones de mosquitos robustos de P. berghei y P. yoelii,la fenilhidrazina se utiliza para inducir la reticulocitosis en los ratones receptores, lo que aumenta el parásito mia y, posteriormente, el porcentaje de gametocitos, y significativamente aumenta la exflagelación de gametos masculinos (Figura5), lo que conducirá a una mejor infección por etapas de mosquitos para las cepas de P. berghei y P. yoelii 15,16,17, 18.
- Inyectar ratones receptores de SW o CD1 (ratones que se utilizarán para la infección por mosquitos y ensayos de infección por mosquitos) por vía intraperitoneal (IP) con 100 ol de fenilhidrazina (50 mg de fenilhidrazina en 5 ml de 1 salina con amortiguación de fosfato (PBS)) utilizando una aguja de 26 G Jeringa.
- Día -2: inyección de existencias de parásitos congelados en ratones donantes
- Descongelar rápidamente las existencias congeladas crioconservadas e inyectar inmediatamente cada ratón donante (normalmente dos ratones por genotipo) IP con 200 l de stock utilizando una jeringa de aguja de 26 G.
NOTA: No más de cinco ratones están alojados por jaula dentro de entornos de vivario controlados. - Comience a comprobar la parasitemia bajo un objetivo de microscopio de 100x en un frotis de sangre delgada manchada de Giemsa después de 24 horas después de la infección. Siga la sección 2.1 del protocolo para frotis de sangre fina manchados de Giemsa.
NOTA: Debido a la incapacidad de contar con precisión las etapas de sangre viables sobrevivientes después de descongelar rápidamente e inyectar sangre infectada crioconservada, los ratones donantes reciben primero la sangre crioconservada. Los eritrocitos infectados del ratón donante se pueden cuantificar y utilizar con precisión.
- Descongelar rápidamente las existencias congeladas crioconservadas e inyectar inmediatamente cada ratón donante (normalmente dos ratones por genotipo) IP con 200 l de stock utilizando una jeringa de aguja de 26 G.
- Día 0: sangrado de los ratones donantes
- Sangra a los ratones donantes (ver sección 3.1) cuando su parasitemia está entre 0,1% y 1%, que generalmente se obtiene 2-3 días después de la infección de stock congelado en el caso de cepas De P. yoelii 17X-NL y P. berghei ANKA.
- Utilice la punción de la vena facial (para obtener entre 200 y 500 ol), o sangra terminalmente a los animales por punción cardíaca (para obtener entre 600 oL y 1,2 ml) de sangre infectada. Sangra terminalmente a los ratones por punción cardíaca como se describe en detalle en la sección 3.1.
NOTA: El sangrado de las venas faciales no es un método rutinario para obtener sangre, ya que es mucho más difícil de aplicar y es muy angustiante para los ratones, en comparación con el sangrado terminal. La parasitemia óptima para el sangrado de ratones donantes está entre 0.1%-1% porque, en este rango de parásitos, hay muy pocos gametocitos (que no pueden replicarse para producir etapas de sangre asexual) y hay menos eritrocitos de doble o triple infección (que hace que la cuantificación sea menos precisa).
- Día 0: cuantificación de la sangre infectada para preparar dosis de eritrocitos infectados por diluciones en serie
- Preparar diluciones en serie de sangre de donante añadiendo 100 ml de sangre a un tubo de microcentrífuga (tubo de dilución 1). Añadir 900 l de RPMI medio al tubo 1 y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la misma punta de pipeta, creando una dilución 1:10.
- Tomar 100 ml de la sangre diluida del tubo 1 y añadirla a un nuevo tubo de microcentrífuga (tubo de dilución 2). Añadir 900 l de RPMI medio al tubo 2 y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la misma punta de pipeta, creando una dilución 1:100.
- Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2 para realizar dos diluciones seriales más, creando 1:1.000 (tubo de dilución 3) y 1:10.000 diluciones (tubo de dilución 4).
- Añadir 12 ml de sangre diluida a partir del tubo 3 y 12 l de sangre diluida desde el tubo 4 a diferentes lados de un hemocitómetro y determinar el número medio de eritrocitos a cada lado del hemocitómetro. Multiplique estos números por 10. Multiplique estos números por el factor de dilución, 1.000 o 10.000, respectivamente, para determinar el número de eritrocitos en 1 l de cada dilución.
- Divida el número deseado de eritrocitos infectados que se inyectarán por el número de eritrocitos en 1 l de cada dilución para determinar el volumen de sangre de donante diluido necesario para la inyección. Elija la dilución con el volumen de inyección más adecuado, añada el volumen a un nuevo tubo de microcentrífuga y retírelo a 120 ml con medio RPMI.
- Día 0: inyección intravenosa de los ratones receptores
- Coloque los ratones receptores bajo una lámpara de calor rojo para dilatar sus venas para inyección. Cargue las dosis del parásito en una jeringa de insulina de 27 G y coloque el ratón receptor en un restrainer.
- Inyectar 1 millón o 10.000 eritrocitos infectados por vía intravenosa (IV) utilizando la jeringa de insulina de 27 G en cada ratón receptor para ensayos de infección de mosquitos o para ensayos de crecimiento en estadio sanguíneo asexual y sexual, respectivamente. Continúe manteniendo los ratones en condiciones de vivienda estándar.
NOTA: Una inyección IP es un método indirecto de introducir parásitos en el torrente sanguíneo, ya que los eritrocitos parasitados tienen que pasar a través de los ganglios linfáticos drenantes de la cavidad peritoneal para llegar a la sangre. Esto hace que una inyección IP sea una vía de entrega indirecta para inyectar un número preciso de parásitos en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, se prefiere la vía IV, ya que entrega dosis de parásitos precisas directamente en el torrente sanguíneo, como se muestra en la Figura 3 y se describe en los Resultados Representativos.
2. Determinación de la carga parasitaente en etapas de sangre para etapas sexuales y asexuales
NOTA: En esta sección, se enumeran los métodos estandarizados de evaluación fenotípica de las etapas de la sangre del parásito de la malaria. Estos métodos son útiles en la evaluación de nuevos candidatos a antipalúdicos o vacunas o incluso en el desarrollo de genes notorios en etapas sexuales y asexuales en los mismos ratones experimentales. Cabe destacar que P. chabaudi y P. vinckei también son opciones alternativas muy racionales e importantes para este tipo de ensayos, especialmente en el cribado de drogas.
- Determinación de la parásitomia de las etapas asexuales y de los gametocitos masculinos frente a femeninos por frotis de sangre delgada manchados por Giemsa para ensayos de crecimiento de parásitos
- Con una aguja de 26 G o 27 G, pinche la cola del ratón y recoja la gota de sangre en una diapositiva del microscopio. Utilice el borde corto de otra diapositiva del microscopio para frotar rápidamente la sangre a través de la diapositiva.
- Fijar la diapositiva con 100% de metanol durante al menos 1 min, sólo después de que la sangre se haya secado completamente en la diapositiva. Mancha en 10% Giemsa durante 10-15 min. Lavar el portaobjetos con agua de destilación simple o doble y dejar que se seque.
- Lea la diapositiva utilizando un objetivo de 100x y una inmersión en aceite bajo un microscopio de luz. Para una medición precisa de la parasitemia, compruebe al menos un total de 6.000 eritrocitos, que se pueden obtener contando al menos 30 o 40 redes microscópicas con un número promedio de 200 o 150 eritrocitos (RBR) por cuadrícula, respectivamente. Cuente el número total de glóbulos rojos en la primera y la última cuadrícula para determinar el número medio de glóbulos rojos para todas las cuadrículas.
- Cuente el número total de eritrocitos infectados por cuadrícula. Los gamecitos masculinos y femeninos se pueden contar por separado para determinar la gamecitomia, pero también deben incluirse en el recuento total de parásitos.
- Determinar el porcentaje total de parásitos dividiendo el número total de eritrocitos parasitados entre el número total de glóbulos rojos observados. Multiplique este número por 100 para determinar el porcentaje de parásitos.
- Determinar la gametocitosmia dividiendo el número total de gametocitos contados por el número total de glóbulos rojos observados. Multiplique este número por 100 para determinar el porcentaje de gametocitosmia por ratón.
NOTA: El único método fiable de diferenciación entre diferentes etapas de la sangre asexual y sexual es el uso de un microscopio para evaluar los frotis de sangre delgada manchados de Giemsa, ya que cada una de las etapas tiene una morfología diferente, con la excepción de los gametocitos inmaduros, que son en su mayoría indistinguibles de las etapas de la sangre asexual.
- Determinación de la parasitemia en la etapa sanguínea por citometría de flujo para el reportero fluorescente que expresan cepas de parásitos similares a WT
- Etiquetar dos tubos de microcentrífuga para cada muestra de ratón, designando un tubo para una dilución de 1:1.000 y el otro para una dilución de 1:2.000. Añadir 1,5 ml de 1x de heparina al tubo de dilución 1:1.000.
- Con una aguja de 26 G o 27 G, pinche la cola del ratón y transfiera 1,5 ml de sangre al tubo que contiene 1,5 ml de 1 x heparina (el tubo de dilución 1:1.000). Mezcle suavemente la sangre y la 1x heparina pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Añadir 1.497 ml de medio RPMI al tubo de microcentrífuga, y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien.
- Transfiera 500 l de la mezcla desde el tubo de dilución 1:1.000 al tubo de dilución 1:2.000. Agregue 500 ml de medio RPMI al tubo 1:2.000 y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Siga el protocolo de arranque adecuado del fabricante para el catómetro de flujo. Ejecute las muestras a un caudal lento y establezca la detección para al menos 20.000 eventos.
NOTA: Existe un ensayo práctico alternativo para medir la parásitomia a través de la clasificación FACS tricolor, ya sean los parásitos expresos de marcadores fluorescentes o no34. Sin embargo, el ensayo descrito aquí ofrece una medida precisa de parásitos en parásitos vivos sin la adición de colorantes de unión al ADN y el uso de la clasificación FACS.
- Determinación de la tasa de exflagelación de gametos masculinos por microlitro de sangre de ratón infectada
- Preparar un tubo de microcentrífuga de dilución 1:10 con 40 ml de medio de ookinete incompleto (RPMI + bicarbonato sódico + hipoxantina + ácido xanthurenic) y 5 l de 1x heparina.
- Con una aguja de 26 G o 27 G, pinche la cola del ratón y transfiera 5 ml de sangre (utilizando un micropipeta) rápidamente al tubo que contiene el medio de ookinete incompleto + heparina. Mezcle suavemente y cargue 12 éL del tubo de dilución en sangre 1:10 en un hemocitómetro y déjelo a temperatura ambiente (20-24 oC).
- Comience a contar los eventos de exflagelación 9-10 min después de preparar la dilución 1:10. Utilice un microscopio de luz de contraste de fase con aumento de 40x.
- Multiplique el número medio de eventos de exflagelación contados por 10 y luego multiplique por el factor de dilución (10) para determinar el número promedio de exflagelación por microlitro de sangre infectada.
NOTA: Este ensayo mide el número de eventos de exflagelación de gametos masculinos en un volumen de sangre de 1 l, que se puede cuantificar utilizando un hemocítómetro. Un medio ookinete incompleto18 se mezcla con la sangre para imitar de cerca las condiciones durante las cuales se produce la exflagelación dentro de la parte media del mosquito poco después de una comida de sangre.
3. Aislamiento y procesamiento de parásitos en estadio sanguíneo de eritrocitos infectados y preparación de existencias congeladas
- Sangrado terminal de roedores infectados por punción cardíaca
- Prepare una jeringa de aguja de 26 G que contenga aproximadamente 20 l de 1 x heparina (200 unidades/ml) para recoger la sangre del ratón donante mediante punción cardíaca.
- Utilice un flujo lento de CO2 para eutanasiar el ratón antes de sangrar. Alternativamente, anestetizar el ratón con isoflurano (que debe mantenerse antes y durante la incisión de la piel para exponer el corazón).
- Poner el ratón en su espalda y fijar sus apéndices. Haga una pequeña incisión en la piel cerca de la base del esternón tirando de la piel con fórceps y cortándola con tijeras. Tire de la piel en el sitio de la incisión para exponer el diafragma y la parte superior de la cavidad abdominal.
- Sostenga la base de la caja torácica con fórceps y corte a través del diafragma para entrar en la cavidad torácica; tenga cuidado de no dañar el corazón o los pulmones. Retroceda la caja torácica para exponer el corazón.
- Perfore suavemente el corazón y tire lentamente hacia arriba del émbolo de la jeringa para recoger 1 ml de sangre y transferirlo a un tubo de microcentrífuga.
- Preparación de poblaciones congeladas a partir de sangre infectada
- Sangra a los ratones (ver sección 3.1) con parásitos sanguíneos que están entre aproximadamente el 2% y el 5%, con una cantidad significativa de etapas del anillo y no tantos gametocitos.
- Mezclar la porción deseada de sangre con la solución de congelación (10% glicerol en la solución de Alsever) en una proporción de 1:2 y almacenar en viales criogénicos. Congelar en nitrógeno líquido.
- Aislamiento y purificación de parásitos en estadio sanguíneo para la extracción de ADN, ARN y proteínas
- Ratones sangrantes (ver sección 3.1) con parásitos sanguíneos superiores al 0,5%.
- Prepare una jeringa de 10 ml retirando el émbolo e insertando un pequeño hisopo de algodón. Empaque el algodón hasta la parte inferior de la jeringa. Llénelo con celulosa hasta que el nivel de celulosa alcance la marca de 3 ml pero no supere la marca de 4 ml en la jeringa.
- Fije la jeringa en un clip en un soporte de anillo y coloque un tubo de recolección de residuos debajo de él. Agregue 5 ml de PBS a la jeringa y deje que fluya a través del tubo de desecho.
- Preparar las existencias congeladas si es necesario, utilizando sólo 100-300 l de sangre. Añadir el resto de la sangre infectada (400-700 l) a la columna. Recoja el flujo a través con un tubo de desecho hasta que las gotas comiencen a ponerse rojas. Una vez que las gotas comiencen a ponerse rojas, coloque un nuevo tubo de recogida de 14 ml debajo de la jeringa para recoger el flujo a través.
- Una vez que el flujo comienza a disminuir, agregue PBS a la jeringa y recoja el flujo a través en el tubo de 15 ml hasta alcanzar un volumen total de 14 ml. Recoja el flujo restante a través de un tubo de desecho.
- Centrifugar el tubo de 14 ml con mezcla de sangre/PBS durante 8 min a 250 x g sin frenos. Retire el sobrenadante y agregue 14 ml de saponina refrigerada (50 mg de saponina en 50 ml de PBS). Para desalojar el pellet, invierta el tubo varias veces y el vórtice si es necesario.
- Centrifugar el tubo durante 8 min a 1.217 x g sin frenos. Retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 0,5 ml de la solución por encima del pellet.
- Resuspenda el pellet en la solución utilizando un micropipeta y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Añadir 500 ml de PBS al tubo de 14 ml para lavar los parásitos residuales que quedan en el tubo. Agregue esto al mismo tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar el tubo durante 2 min a 6.010 x g. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender 1 ml de PBS. Centrífuga durante 2 min a 9.391 x g.
- Proceda a extraer ADN genómico, ARN total y proteína.
- Para la extracción de ADN genómico,retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 200 s de PBS, y luego siga cualquier protocolo adecuado de extracción de ADN.
- Para la extracción totalde ARN, retire el sobrenadante, resuspenda y vórtice el pellet en 1 ml de cualquier solución a base de isotiocianato de fenol y guanidina o cualquier otro reactivo adecuado y, a continuación, siga cualquier protocolo adecuado de extracción total de ARN.
- Para la extracción totalde proteínas, eliminar el sobrenadante, resuspender el pellet en un volumen adecuado de 6x de dodecilo sulfato sódico (SDS) -carga de coloro o cualquier otro reactivo adecuado y, a continuación, seguir cualquier protocolo adecuado de procesamiento total de proteínas.
4. Ensayos de infección por mosquitos
NOTA: El mosquito es el huésped principal de los parásitos de la malaria donde tiene lugar la reproducción sexual. La infección de ratones para transmitir parásitos de la malaria a los mosquitos se lleva a cabo mediante una inyección intravenosa de al menos 1 millón de etapas de sangre, seguida de la alimentación de un ratón infectado (de cada genotipo que muestra la mayor tasa de exflagelación de gametomasculino masculino) para Anopheles mosquitos en una jaula en el día 3 después de la infección del ratón. La inyección intravenosa con 1 millón de parásitos en estadios sanguíneos en ratones tratados con fenilhidrazina garantizará el desarrollo de gametocitos masculinos y femeninos a un ritmo más rápido y más alto. Los mosquitos infectados con P. yoelii y P. berghei se incuban a 24oC y 20-21oC, respectivamente, para permitir el mejor desarrollo de etapas de mosquitos posibles6.
- Alimentación de mosquitos y determinación del número de ocaqueñitas por mosquito
- Mujer adulta anopheles stephensi o mosquitos A. gambiae (4-7 días de edad) durante 8-12 h antes de alimentarse. Permitir que los mosquitos adultos se alimenten durante al menos 15 minutos en los ratones anestesiados infectados (inyectados con una dosis adecuada de ketamina/xilazina) con la mayor tasa de exflagelación (medida en la sección 2.3).
NOTA: La solución de trabajo de ketamina/xilazina se prepara mediante la dilución 1:5 de la solución en solución salina e IP que inyecta 100 l por ratón. Para una solución en stock de 10 ml, se añade 1 ml de xilazina (100 mg/ml) a 9 ml de ketamina (100 mg/ml). - Retire los mosquitos hembra no alimentados y los mosquitos machos con un aspirador de la boca.
- A las 18-20 h después de la alimentación, recoger 20-30 mosquitos y colocarlos en el congelador durante no menos de 10 minutos para asegurar la muerte. Usando un alcance de disección binocular, diseccione 20-30 midguts llenos de sangre con dos agujas de 26 G o 27 G o una aguja y fórceps en el medio de disección RPMI o PBS y transfiera los midguts a un tubo de microcentrífuga que contenga 200 ml de RPMI o PBS (Para el método de disección por favor vea la sección 4.3).
- Centrifugar el tubo de recogida durante 1 min a 700 x g. Moler los midguts peletados usando un pestillo. Repita este paso.
- Transfiera 50 l desde el tubo de las plantas medias de tierra a un nuevo tubo de microcentrífuga. Agregue 200 ml de RPMI o PBS para crear una dilución de 1:5.
- Transfiera 12 l a un hemocitómetro e incubarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que el contenido se asiente.
- Determine el número medio de ocaquinetas utilizando un microscopio de luz con un contraste de fase y un aumento de 40x.
- Multiplique el número medio de ocaquedas maduras por 10 y luego por el factor de dilución de 5 para determinar el número total promedio de ookinetes.
- Divida el número medio de ocaquetinas por el número de mosquitos alimentados con sangre diseccionados para determinar el número de ocanía por mosquito alimentado con sangre.
- Mujer adulta anopheles stephensi o mosquitos A. gambiae (4-7 días de edad) durante 8-12 h antes de alimentarse. Permitir que los mosquitos adultos se alimenten durante al menos 15 minutos en los ratones anestesiados infectados (inyectados con una dosis adecuada de ketamina/xilazina) con la mayor tasa de exflagelación (medida en la sección 2.3).
- Determinación del número de ovocitos tempranos para cepas de parásitos que expresan proteínas de reportero fluorescente en el WT
NOTA: El objetivo de este ensayo es determinar el número de parásitos vivos que expresan proteína fluorescente verde (GFP) que establecieron una infección completa de los intestinos medios del mosquito y formaron ovocitos esféricos tempranos. Este ensayo determina si las ocaiones (su desarrollo estimado en el ensayo anterior) completaron sus funciones por el travesía a través de las células epiteliales del mosquito midgut y la transformación a ovocitos tempranos en el lado basal de la lámina del intestino medio epitelial es o no. Este es otro ensayo que hace un gran uso de los parásitos que expresan GFP, ya que contar los ovocitos tempranos en esta etapa será casi imposible sin inmunomanchate tediosa.- Diseccionar los intestinos medios (ver sección 4.1) de 20-30 mosquitos alimentados con sangre, en el día 3 o 4 post-mosquito-alimentación (pmf) para P. yoelii 17X-NL, y en el día 6 o 7 pmf para P. berghei ANKA, con dos agujas de 26 G o 27 G o una aguja y fórceps en LA DIsección RPMI o PBS edium (Para el método de disección, consulte la sección 4.3).
- Esparza 40-50 l de medio de disección en la línea media horizontal del borde más largo de la corredera de vidrio. Transfiera los midguts a esta línea, uno a la vez, durante la disección, y agregue más medio a los midguts, si es necesario, para evitar el secado.
- Coloque un cubreobjetos suavemente en las partes medias diseccionadas y séllelo con esmalte de uñas.
- Usando el objetivo 10x o 20x del microscopio de fluorescencia con el filtro de fluorescencia verde, cuente el número de ovocitos tempranos en cada midgut, en al menos 20 midguts.
- Determinación del número de esporozoitos de ovocitos por mosquito
- Diseccionar los intestinos medios de al menos 20-30 mosquitos con dos agujas de 26 G o 27 G o una aguja y fórceps en el medio de disección RPMI o PBS y recoger los midguts diseccionados en 200 oL de RPMI.
- Sostenga los segmentos inferiores del abdomen firmemente en su lugar con una aguja (o fórceps) y empuje ligeramente el tórax en dirección ascendente con la otra aguja en la unión entre el tórax y el abdomen. Haga empujones cortos cuidadosamente hasta que el tórax se separe del abdomen. Tan pronto como comience la separación, la parte media blanca aparecerá estirada, y luego el intestino medio será cortado del extremo del esófago usando la misma aguja que se utilizó para separar el tórax. Si todavía está unido al abdomen, se puede utilizar la misma aguja para alejar el intestino medio del abdomen. Transfiera los intestinos medios de todos los mosquitos al tubo de recolección recogiéndolos del medio con una aguja, uno a la vez.
- Centrifugar el tubo de recogida durante 1 min a 700x g para asentar las tripas medias en la parte inferior del tubo de recogida y molerlas con un pestillo. Repita este paso.
- Transfiera 12 l a un hemocitómetro e incubarlo a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que su contenido se asiente.
- Cuente los esporozoitos de ovocitos usando un objetivo 40X de un microscopio de luz. Use diluciones 1:5 y/o 1:10 si los mosquitos impiden el recuento preciso de los esporozoítos o si el número de esporozoítos es demasiado alto para contar con precisión.
- Calcular el número total medio de esporozoitos de ovocitos multiplicando el número medio de esporozoítos por 10 y, a continuación, multiplicando ese número por el factor de dilución, si existe, y por el volumen total (200 l).
- Divida el número total medio de esporozoítos por el número de mosquitos diseccionados para calcular el número medio de esporozoitos de ovocitos por mosquito.
NOTA: Un error común para medir el éxito o la productividad de la infección por etapas de mosquitos es el recuento del número de ovocitos en etapas posteriores del desarrollo de ovocitos. Esto se debe a que algunos ovocitos se vacuolan en momentos posteriores del desarrollo de los ovocitos, y otros no desarrollan esporozoitos, incluso en el mismo medio. El mejor y más confiable método para determinar la productividad de la infección por etapas de mosquitos es el recuento del número promedio de esporozooítos de ovocitos de la parte media en los días 10-12 después de la infección por mosquitos para P. yoelii y en los días 12-14 post-mosquito-infección para P. berghei.
- Determinación del número de esporozoítos de la glándula salival por mosquito
Nota:La evaluación final de la finalización completa del desarrollo de las etapas de los mosquitos se logra estimando el número de esporozoítos que invadieron la glándula salival, que son las etapas transmisibles e infecciosas de los vertebrados. La invasión de la glándula salival se establece después de la finalización del desarrollo de esporozoita ovocitos, salida en la hemolinfa, fijación a la lámina basal de las células acinares de la glándula salival, y recorrido de las células acinares para llegar a las glándulas salivales Conductos5. Por lo tanto, este ensayo es también una evaluación del éxito de todos estos procesos o no. Sin embargo, una estimación de los números de esporozoitas hemolinfas permitiría la diferenciación entre defectos en la salida de ovocitos y defectos en la invasión de las glándulas salivales35. La purificación de esporozoítos de la glándula salival permite realizar múltiples ensayos funcionales sobre motilidad esporozoita y fenotipos de invasión. Los esporozoitos de la glándula salival también se pueden utilizar para la infección in vivo de ratones y en estudios de inmunización36,37. Además, las etapas más reproducibles disponibles para establecer una invasión de la etapa hepática in vitro o un ensayo de desarrollo es mediante el uso de esporozoítos de la glándula salival.- Disseccionar las glándulas salivales de 50-100 mosquitos hembra, en días 14-16 pmf para P. yoelii y en los días 17-20 pmf para P. berghei, preferiblemente con dos agujas de 26 G o 27 G, en rpmI o medio DMEM mantenido en hielo y complementado con 5% suero bovino fetal (FBS) albúmina sérica o bovina (BSA) para esporozoitas de P. yoelii o 3% FBS/BSA para esporozoias de P. berghei. Si los esporozoitos se van a utilizar en ensayos in vitro de hepatoma, agregue un 1% de penicilina/estreptomicina al medio de disección. Generalmente hay dos métodos para la disección de las glándulas salivales. El primer método consume mucho tiempo, pero conduce a la disección de las glándulas salivales con muy poco o ningún tejido contaminante. El segundo método consume menos tiempo, pero conduce a la recolección de una cantidad significativa de tejidos contaminantes. El primer método se detalla aquí.
- Sostenga los segmentos superiores del abdomen en su lugar con el lado biselado de una aguja y empuje cuidadosamente la cabeza muy ligeramente (en escamas muy cortas) en la unión entre la cabeza y el tórax en dirección ascendente hasta que la cabeza esté cuidadosamente separada del tórax sin desgarrando las glándulas salivales cristalinas, las glándulas salivales expuestas se separan de la cabeza con la misma aguja que empujó la cabeza hacia arriba.
- La glándula salival diseccionada se levantará del medio de disección utilizando una pipeta Pasteur de vidrio corto.
- Cuando todas las glándulas salivales han sido diseccionadas y cosechadas, el talento colocará el tubo que contiene los intestinos medios en la centrífuga (1min, 700 x g).
- Cuente los esporozoítos usando un hemocitómetro bajo un microscopio de luz establecido en contraste de fase 2 y aumento de 40x. Si el número de mosquitos diseccionados 40, diluya las glándulas salivales a 1:5 o 1:10, dependiendo del rendimiento de infectividad esperado (determinado en ensayos anteriores).
- Multiplique el número medio de esporozoítos por 10 y el factor de dilución (si existe). Multiplique por el volumen total para determinar el número promedio de esporozoítos de la glándula salival. Divida por el número de mosquitos hembra diseccionados para determinar el promedio de esporozoítos de glándulas salivales por mosquito.
NOTA: El problema con la disección de las glándulas salivales es su pequeño tamaño y aspecto transparente vidrioso. Por lo tanto, es muy difícil aislar las glándulas salivales y, por lo tanto, por lo general se diseccionan como una suma global con otros tejidos de la parte frontal del tórax, que también es importante para proteger las glándulas salivales de la ruptura durante la recolección.
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Representative Results
El éxito de la aplicación de herramientas y técnicas genéticas inversas a los parásitos del paludismo ha revolucionado el campo de la investigación del paludismo, con la capacidad de añadir, eliminar o modificar segmentos genómicos específicos de varias especies de Plasmodium 39. Es importante destacar que los loci genómicos prescindibles se han identificado y utilizado con éxito para introducir marcadores de proteínade fluorescencia en parásitos de la malaria humana y roedores mediante una doble recombinación homóloga, para garantizar una expresión estable en todas las etapas del ciclo de vida40 ,41,42. Un ejemplo de estos parásitos transgénicos tipo WT son los parásitos Py230p(-), que se han generado en nuestro laboratorio, y no mostraron defectos aparentes en el desarrollo de la sangre y las etapas del ciclo de vida de mosquitos15,16, 17. Estos parásitos reporteros transgénicos expresaron eGFP, bajo el control del promotor fuerte y constitutivo de PyHSP70, en etapas de sangre (Figura 1A) ookinetes (Figura1B),ovocitos jóvenes (Figura1C ) en anopheles stephensi midguts, y en esporozoítos aislados de las glándulas salivales de las hembras de Anopheles stephensi (Figura1D). Por lo tanto, los parásitos sanguíneos que expresan eGFP hicieron que fuera mucho más fácil y menos lento evaluar la parasitemia en estadio sanguíneo utilizando citometría de flujo entre diferentes genotipos de parásitos transgénicos o entre tratados con drogas y no tratados en la segmentación por drogas ensayos utilizando parásitos de reporteros transgénicos.
Para confirmar que no hay diferencia cuantitativa entre el uso de citometría de flujo y la estimación más tediosa de parasitemia por microscopía, el Pyp230p(-) que expresa el eGFP se utilizó para estimar el porcentaje de eritrocitos parasitados por citometría de flujo y por frotis de sangre delgada teñida por Giemsa en un grupo de ratones Webster suizos infectados iv con 10.000 eritrocitos parasitados. Los valores de los parasitemia de citometría de flujo correspondieron directamente al parasitemia% estimado mediante el seguimiento de los frotis de sangre delgada manchados de Giemsa, que fueron estimados por dos científicos expertos (Figura2). Esto representa una alternativa más precisa al tedioso y propenso al método de error humano de la microscopía en la determinación de la tasa de crecimiento de los parásitos en la etapa sanguínea.
Una discrepancia importante asociada con la infección de roedores con parásitos de la malaria etapas de la sangre es la elección de la vía de infección, con una fuerte preferencia en la literatura para la IP en comparación con la vía IV de infección, ya que es menos lento. Para comparar estas dos vías de infección, dos grupos de cinco ratones BALB/c se infectaron con 1.000 eritrocitos parasitados Pyp230p(-) por ratón, ya sea a través de vías IV o IP. La parasitemia fue monitoreada diariamente usando citometría de flujo durante un período de 4 días. Se observó una disminución estadísticamente significativa del grupo infectado por IP parasitemia% en comparación con el grupo infectado por vía intravenosa en todos los días analizados (Figura3). Esto proporciona evidencia de que la vía de la infección intravenosa es una vía de infección cuantitativamente más precisa para los ensayos con las etapas de la sangre del parásito de la malaria.
No obstante, una limitación al uso de citometría de flujo para evaluar la parasitemia en estadio sanguíneo es la diferenciación entre las etapas sexual y asexual y entre los gametocitos masculinos y femeninos. Por lo tanto, la estimación de los porcentajesde cada una de las diferentes etapas asexuales y sexuales (Figura 4) debe depender de una evaluación morfológica de la mancha de sangre delgada teñida de Giemsa. A pesar de la aparente morfología diferente delos gamecitos masculinos y femeninos maduros (Figura 4), las etapas sexuales inmaduras son a menudo indistinguibles de las etapas asexuales.
Una función esencial de los gametos masculinos al aparición del gamecito masculino en la mitad del mosquito es la exflagelación del gameto masculino, que es un paso muy crítico en la transmisión que debe ocurrir en un período muy corto de tiempo. Se han descrito métodos variables utilizados para evaluar esto en muchos sistemas diferentes. Aquí, mostramos un método estandarizado que se puede repetir en cualquier entorno de laboratorio simple. Evaluamos la exflagelación de gameto masculino con o sin la inyección de fenilhidrazina en ratones receptores (Figura5). Podríamos demostrar que el tratamiento con fenilhidrazina aumentó significativamente (cuatro veces) la tasa de exflagelación de gameto masculino, lo que a su vez aumentará la tasa de fertilización y el número de todas las etapas posteriores del mosquito.
Figura 1 : El desarrollo de P. yoelii p230p(-) parásitos que expresan constitutivamente eGFP en las etapas de la sangre y los mosquitos. (A) Imagen de parásitos mixtos en estadio sanguíneo (aumento de 1.000X). (B) Imagen del ookinete (aumento 400X). (C) Imagen de un mosquito Anopheles stephensi medio gut infectado con el día 4 pmf primeros ovocitos de parásitos vivos p230p(-) que expresan eGFP (aumento 100X). (D) Este panel muestra una imagen en vivo de una glándula salival P. yoelii p230p(-), diseccionada en el día 15 pmf, expresando eGFP (aumento 400X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Evaluaciones de citometría de flujo y microscopía de parasitemia media en estadio sanguíneo de P. yoelii p230p(-) parásitos no son significativamente diferentes. Un grupo de cuatro ratones webster suizos se infectó por vía intravenosa con 10.000 eritrocitos parasitados de Pyp230p(-) por ratón y el promedio de parásitos en estadio sanguíneose mientras que durante 7 días se registraba por citometría de flujo y por la evaluación microscópica de Manchas de sangre delgada teñidas por Giemsa de un total de 20.000 y 6.000 eritrocitos, respectivamente. Los resultados del examen microscópico mostrados son el promedio de dos lecturas de dos científicos expertos por diapositiva, y el tiempo para evaluar la parasitemia de cada diapositiva fue de al menos 10 minutos por cada científico. No se pudieron detectar diferencias significativas en ninguno de los días que se muestran aquí. Los valores medios para todas las cepas de parásitos se analizaron con la prueba tde dos colas. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Una inyección intravenosa de P. yoelii p230p(-) parásitos produce significativamente diferentes parásitos en estadio sanguíneo de una inyección intraperitoneal. Dos grupos de cinco ratones BALB/c fueron infectados con 1.000 eritrocitos parasitados de Pyp230p(-) por ratón, ya sea por vía intravenosa o intraperitoneal, y el promedio de parásitos en estadio sanguíneo se registraron diariamente durante 4 días por flujo citometría de un total de 20.000 eritrocitos. Se podría detectar una reducción estadísticamente significativa (denotada por un asterisco) de la parasitemia en estadio sanguíneo durante todos los días analizados en el grupo de rutas intraperitoneales en comparación con el grupo de vía intravenosa. Los valores medios para todas las cepas de parásitos se analizaron con la prueba tde dos colas. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Morfología de P. yoelii gametocitos en un frotis de sangre delgada manchada de Giemsa. Una imagen de un frotis de sangre delgada teñido de Giemsa (aumento de 1.000X) de un ratón Webster suizo infectado con cepa WT P. yoelii 17X-NL muestra el típico gametocyte femenino de color azulado en el lado izquierdo (denotado por una flecha) y el macho de color rosado ( denotado por un asterisco) gametocyte en el lado derecho de la imagen. Las otras etapas mostradas son etapas de la sangre asexual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : El efecto de la fenilhidrazina en la exflagelación de gameto masculino. El efecto de la fenilhidrazina inyectada en ratones receptores 5 días antes de la estimación de la tasa de exflagelación de gameto masculino de P. yoelii. La fenilhidrazina aumenta significativamente la tasa de exflagelación de gametos masculinos, lo que conduce a una infección por etapas de mosquitos más altas después de la alimentación de mosquitos. Los valores medios para todas las cepas de parásitos se analizaron con la prueba tde dos colas. Las barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A pesar de la similitud en la biología general de sus ciclos de vida con la de los parásitos de la malaria humana, los modelos de malaria de ratón también tienen muchas diferencias con las especies humanas de Plasmodium que limitarían su uso como modelos in vivo fiables. Por ejemplo, con la excepción de los parásitos vivos atenuados como vacunas, todos los estudios de vacunas con subunidad es y el ADN y otras vacunas dieron excelentes resultados en el modelo de ratón, pero en los seres humanos que vivían en zonas endémicas, los resultados distaban mucho de ser satisfactorios.
Otro problema es la diferencia de la infectividad de la etapa del ciclo de vida de una cepa de ratón a otra, y a veces de un vendedor de animales a otro para la misma cepa de ratón. Por otra parte, las dos principales especies de malaria de roedores que son ampliamente utilizadas como modelos preferidos de malaria in vivo, P. berghei y P. yoelii, no exhiben un ciclo síncrono en estadio sanguíneo, que es completamente diferente de cualquier malaria humana Parásito. Sin embargo, los beneficios del uso de parásitos de la malaria de ratón como modelos in vivo superan con mucho estas diferencias, que también pueden superarse mediante análisis más detallados de los impulsos moleculares de estas limitaciones. Sin embargo, estas limitaciones se muestran principalmente en los parásitos en estadios sanguíneos de la malaria de los roedores, pero no tanto para las otras etapas del ciclo de vida del parásito de la malaria.
Aunque las etapas de la sangre son importantes para diversas vacunas, la segmentación de fármacos, la inmunología y los estudios genómicos funcionales, existe una escasez de métodos y protocolos estandarizados que se concentran en el análisis fenotípico y los ensayos funcionales que implican parásitos de la malaria de los roedores parásitos en la etapa de la sangre, con más enfoque en la transmisión de mosquitos y los protocolos de transfección. Por lo tanto, los métodos de este artículo ayudarán a proporcionar protocolos estandarizados y simplificados para el estudio de las etapas patógenas de los parásitos del paludismo de los roedores.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Ahmed Aly recibe el apoyo de la financiación a la Universidad Bezmialem Vakif de la subvención del Ministerio de Desarrollo de Turquía 2015BSV036, y por la financiación proporcionada por la Escuela de Salud Pública y Medicina Tropical de la Universidad de Tulane, y con la financiación de NIH-NIAID para R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
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