Summary
På grund av de slående likheter av livscykeln och biologi av gnagare malariaparasiter till mänskliga malariaparasiter, gnagare malaria modeller har blivit oumbärlig för malaria forskning. Häri, standardiserade vi några av de viktigaste teknikerna som används i fenotypisk analys av vildtyp och transgena gnagare malaria arter.
Abstract
Senaste framstegen inom genetik och systembiologi teknik har främjat vår förståelse av biologi malariaparasiter på molekylär nivå. Emellertid, effektiva malariaparasiten mål för vaccin och kemoterapi utveckling är fortfarande begränsade. Detta beror till stor del på otillgängligheten av relevanta och praktiska in vivo -infektionsmodeller för humana plasmodiumarter , framför allt för p. falciparum och p. vivax. Därför har gnagare malaria arter använts i stor utsträckning som praktiskt alternativ in vivo modeller för malariavaccin, drog inriktning, immunsvar, och funktionella karakteriseringsstudier av bevarade Plasmodiumspp. gener. Faktum är att gnagare malaria modeller har visat sig vara ovärderliga, särskilt för att utforska myggnät och lever scen biologi, och var oumbärliga för immunologiska studier. Det finns dock avvikelser i de metoder som används för att utvärdera fenotyper av transgena och vildtyp asexuella och sexuella blod-scenen parasiter. Exempel på dessa avvikelser är valet av en intravenös kontra intraperitoneal infektion av gnagare med blod-Stadium parasiter och utvärderingen av manliga könscell exflagellation. Häri, vi detalj standardiserade experimentella metoder för att utvärdera fenotyper av asexuella och sexuella blod stadier i transgena parasiter som uttrycker reporter-gen eller vild-typ gnagare malaria parasitarter. Vi detalj också metoder för att utvärdera fenotyper av malaria parasit mygga stadier (könsceller, ookinetes, oocyster, och sporozoiter) inuti Anopheles mygga vektorer. Dessa metoder är detaljerade och förenklade här för dödliga och icke-dödliga stammar av p. berghei och p. yoelii men kan också tillämpas med vissa justeringar av p. chabaudi och p. vinckei gnagare malaria arter.
Introduction
Malariaparasiter orsaka hundratals miljoner malaria infektioner i människor över hela världen, med mer än 600 000 dödsfall varje år1. Mänskliga infektioner orsakas av fem malaria parasitarter, nämligen p. falciparum, p. vivax, p. ovale, p. malariaeoch p. knowlesi. De flesta kliniska malaria mortalitet orsakas av P. falciparum i Afrika söder om Sahara1. En annan mänsklig malaria parasitarter som orsakar omfattande globala komorbiditeter utanför Afrika söder om Sahara är P. vivax2. De andra tre arterna är alla mer geografiskt begränsade och orsakar godartade malaria infektioner, utom den dödliga P. knowlesi3. Otillgängligheten av relevanta och praktiska icke-humana in vivo-modeller av infektioner har alltid varit och är fortfarande ett hinder för malariavaccin och läkemedelsutveckling. Tidigare malaria drog inriktning och metaboliska studier har åberopats i stor utsträckning på aviär malaria modeller som p. gallinaceum och p. lophurae, infekterar kycklingar och änder, respektive4. Därefter infördes gnagare malaria arter successivt i olika vacciner och drog inriktning studier som in vivo-modeller. Under årens lopp har bevis för likheter av biologi och värd-parasit interaktioner av livscykelstadier av gnagare malaria modeller till mänskliga malaria arter ackumuleras.
I synnerhet, gnagare malaria modeller var oerhört viktigt att utforska och karakterisera biologi av mygga och pre-erytrocytiska stadier5. Det finns dock fyra gnagare malaria arter (p.berghei, p. yoelii, p. chabaudi, och p. vinckei) som har olika biologiska egenskaper, den mest anmärkningsvärda av dessa är i blodet stadier6. Gnagare malaria arter skiljer sig i Synchronicity av blod stadier, där blod stadier av p. chabaudi och p. vinckei stammar är mestadels synkrona, medan blod stadierna av p. berghei och p. yoelii är inte6 , 7. en annan anmärkningsvärd skillnad är själv klarering av blod stadier som förekommer i vissa stammar(t. ex., p. yoelii 17x-nl, p. berghei NK65, och p. vinckei lentum), medan blod infektionen av andra stammar av samma art kan vara dödliga om de lämnas obehandlade (p. yoelii 17x-L, p. berghei anka, och P. chabaudi as). Dessutom, p. yoelii 17x-nl stam och p. berghei anka stam företrädesvis invadera retikulocyter8,9,10,11, även om dessa funktioner i p. yoelii och P. berghei stammar är inte en strikt tillväxt krav12,13,14. Därför, möss behandlas med Fenylhydrazin före en infektion med blod stadier av dessa parasiter för att öka parasitemia och gametocytemia behövs för en mygga infektion för p. berghei anka stam och för p. yoelii 17x-nl15,16,17,18,19.
Skillnader i Mosquito stadier utveckling finns också bland olika gnagare malaria arter, den mest anmärkningsvärda är den temperatur och tid som krävs för optimal Mosquito stadier utveckling och sporozoite längd5,6, 20. I pre-erytrocytiska stadier av gnagare malaria arter, skillnader inkluderar gnagare arter och stam som är mest mottagliga för infektiös sporozoit Inympning, antalet sporozoiter som behövs för inympning i en mottaglig gnagare stam, däggdjursceller som behövs för in vitro-utvecklingstester för lever stadiet, och tiden för att slutföra utvecklingen av lever stadiet5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
Trots dessa variabilities var gnagare malariaparasiter gynnsamma modeller tidigt för tillämpningen av omvänd genetiska metoder, eftersom de var mindre tid-och resurskrävande med en hög sannolikhet för framgång31. I själva verket, gnagare malaria modeller var de bästa modellerna, och i många fall de enda modellerna, tillgängliga för många år att funktionellt karakterisera gener uttrycks i mygga och lever stadier.
Mot bakgrund av populariteten och möjligheten att omvända genetiska metoder i gnagare malaria modeller, har ett antal olika metoder utnyttjats för att analysera fenotyper av transgena parasiter livscykelstadier, särskilt blod stadier. Vissa av dessa metoder är dock inkonsekvent. till exempel, jämföra infektioner i blod-skede parasiter efter en IP-injektion (som möjligen dräneras till peritoneala lymfkörtlar och, därifrån, kan komma in i blodomloppet; därför, de injicerade parasiter inte hamna lika i blodet) , jämföra mygga överföring av kloner med olika antal seriella blod-steg överföringar eller G-nummer (som kan påverka gametocytogenesis32,33), eller jämföra transgena parasiter direkt till naiva vildtyp (WT) parasiter som aldrig utsattes för elektroporation och positivt val av läkemedel och de olika ostandardiserade utvärderingar av manliga könscell exflagellation. Därför är det viktigt att standardisera protokoll som är enkla att följa för fenotypisk analys av någon typ av transgena eller WT gnagare malariaparasiter i blodet och i mygga för att tillgodose de biologiska variabiliteterna av gnagare malaria parasitarter.
Häri, Vi rapporterar om ett standardiserat, detaljerat experimentprotokoll för fenotypisk analys av blod och myggor livscykelstadier av transgena eller vildtyp p. yoelii och p. berghei parasiter. Dessa protokoll är också tillämpliga på p. chabaudi och p. vinckei parasiter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här genomfördes enligt de godkända protokollen från den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Tulane University och djur etikkommittén för Bezmialem Vakif University. Alla andra experimentella protokoll och användningen av rekombinant DNA utfördes enligt de godkända protokollen från den institutionella Biosäkerhetskommittén (IBC) vid Tulane University.
1. infektion av möss med blod-skede parasiter för Parasitemia analys och myggor infektion assays
- Dag-3: valfri injektion av Fenylhydrazin i mottagar möss
- Injicera utavlade SW eller CD1 mottagare möss (möss som kommer att användas för mygga infektion och myggor infektion assays) intraperitonealt (IP) med 100 μL av Fenylhydrazin (50 mg Fenylhydrazin i 5 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) med en 26 G nål Spruta.
Anmärkning: För robusta mygga infektioner av p. berghei och p. yoelii, Fenylhydrazin används för att inducera retikulocytosis hos mottagar möss, vilket ökar parasitemia och, därefter, andelen gametocyter, och signifikant ökar exflagellation av manliga könsceller (figur 5), vilket kommer att leda till en bättre mygga stadier infektion för både p. berghei och p. yoelii stammar15,16,17, 18.
- Injicera utavlade SW eller CD1 mottagare möss (möss som kommer att användas för mygga infektion och myggor infektion assays) intraperitonealt (IP) med 100 μL av Fenylhydrazin (50 mg Fenylhydrazin i 5 mL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) med en 26 G nål Spruta.
- Dag-2: injektion av frysta parasit bestånd till givare möss
- Snabbt Tina nedfrysta frysta bestånd och omedelbart injicera varje givare mus (typiskt två möss per genotyp) IP med ~ 200 μl av beståndet med hjälp av en 26 G nål spruta.
Anmärkning: Högst fem möss är inhysta per bur inom kontrollerade Vivarium-inställningar. - Börja kontrollera parasitemia under en 100x Mikroskop mål på Giemsa-färgade tunna blod smeta efter 24 h postinfection. Följ avsnitt 2,1 i protokollet för Giemsa-färgade tunna blodsmetar.
Anmärkning: På grund av oförmåga att exakt räkna de överlevande livskraftiga blod stadierna efter snabbt upptinning och injicera kryopreserverad infekterade blod, donator möss får det kryopreserverade blod först. De infekterade erytrocyter av givaren musen kan kvantifieras exakt och användas därefter.
- Snabbt Tina nedfrysta frysta bestånd och omedelbart injicera varje givare mus (typiskt två möss per genotyp) IP med ~ 200 μl av beståndet med hjälp av en 26 G nål spruta.
- Dag 0: blödning från givarnas möss
- Blöder givar möss (se avsnitt 3,1) när deras parasitemia är mellan 0,1% och 1%, som vanligtvis erhålls 2-3 dagar efter fryst-Stock-infektion i fallet med p. yoelii 17X-nl och P. berghei anka stammar.
- Använd ansikts venen punktering (för att få mellan 200 och 500 μL), eller oboskt blöda djuren genom hjärt punktering (för att få mellan 600 μL och 1,2 mL) av infekterat blod. Blödning från möss genom hjärt punktering som beskrivs i detalj i avsnitt 3,1.
Anmärkning: Facial ven blödning är inte en rutinmetod för att få blod eftersom det är mycket svårare att tillämpa och är mycket påfrestande för möss, jämfört med Terminal blödning. Den optimala parasitemia för blödning av givare möss är mellan 0,1%-1% eftersom, vid denna parasitemia intervall, det finns mycket få gametocyter (som inte kan replikera för att producera asexuella blod stadier) och det finns mindre dubbel-eller treinfekterade erytrocyter (som gör kvantifieringen mindre noggrann).
- Dag 0: kvantifiering av infekterat blod för att bereda doser av infekterade erytrocyter genom seriella utspädningar
- Bered seriella utspädningar av givar blod genom att tillsätta 100 μL blod till ett microcentrifugerör (utspädnings rör 1). Tillsätt 900 μL RPMI-medium till tub 1 och blanda väl genom att Pipettera upp och ner med samma pipettspets, vilket skapar en 1:10 utspädning.
- Ta 100 μL av det utspädda blodet från tub 1 och tillsätt det till ett nytt microcentrifugerör (utspädnings rör 2). Tillsätt 900 μL RPMI-medium till tub 2 och blanda väl genom att Pipettera upp och ner med samma pipettspets, vilket skapar en 1:100 utspädning.
- Upprepa steg 1.4.1 och 1.4.2 för att göra ytterligare två seriella utspädningar, skapa 1:1000 (utspädnings rör 3) och 1:10000 spädningar (utspädnings rör 4).
- Tillsätt 12 μL utspädd blod från tub 3 och 12 μL av utspätt blod från tub 4 till olika sidor av en hemocytometern och Bestäm det genomsnittliga antalet erytrocyter på vardera sidan av hemocytometern. Multiplicera dessa siffror med 10. Multiplicera dessa tal med utspädningsfaktorn 1 000 respektive 10 000 för att bestämma antalet erytrocyter i 1 μL av varje spädning.
- Dela upp önskat antal infekterade erytrocyter som ska injiceras med antalet erytrocyter i 1 μL av varje utspädning för att bestämma volymen av utspädd donator blod som behövs för injektion. Välj utspädning med den lämpligaste volymen för injektion, tillsätt volymen till ett nytt microcentrifugerör och slutför det till 120 μL med RPMI-medium.
- Dag 0: intravenös injektion av mottagar möss
- Placera mottagar möss under en värme röd lampa för att vidga sina vener för injektion. Ladda parasit doserna i en 27 G insulinspruta och placera mottagaren musen i en hämmaren.
- Injicera 1 000 000 eller 10 000 infekterade erytrocyter intravenöst (IV) med hjälp av 27 G insulinspruta i varje mottagare mus för mygginfektion analyser eller för asexuella och sexuella blod-steg tillväxt analyser, respektive. Fortsätt att underhålla mössen under vanliga boendeförhållanden.
Anmärkning: En IP-injektion är en indirekt metod för att införa parasiter i blodomloppet, som parasitiserade erytrocyter måste passera genom dränerande lymfkörtlar i bukhålan för att nå blodet. Detta gör en IP-injektion en indirekt leveransväg för att injicera ett exakt antal parasiter i blodomloppet. Därför är IV rutten att föredra, eftersom det ger korrekta parasit doser direkt i blodomloppet, som visas i figur 3 och beskrivs i representativa resultat.
2. bestämning av parasit belastningen i blod fasen för sexuella och asexuella stadier
Anmärkning: I detta avsnitt, standardiserade fenotypiska metoder för utvärdering av malaria parasit blod stadier listas. Dessa metoder är användbara i utvärderingen av nya mot malaria eller vaccinkandidater eller ens Gene knockout på sexuella och asexuella stadier utveckling i samma experimentella möss. Notera, p. chabaudi och p. vinckei är också mycket rationella och viktiga alternativa alternativ för dessa typer av analyser, särskilt i Drug screening.
- Bestämning av parasitemia av asexuella stadier och manliga vs. kvinnliga gametocyter av Giemsa-färgade tunna blod smetar för parasit tillväxt analyser
- Med hjälp av en 26 G eller 27-G nål, sticka musens svans och samla in blod droppet på ett Mikroskop bild. Använd kortsidan av en annan Mikroskop bild för att snabbt smutskastar blodet över hela bilden.
- Fäst bilden med 100% metanol i minst 1 min, först efter att blodet har torkat helt på bilden. Fläcken i 10% Giemsa för 10-15 min. Tvätta glaset med enkel-eller dubbeldestillerat vatten och låt det torka.
- Läs bilden med en 100x objektiv och oljeimmersion under ett ljusmikroskop. För en noggrann parasitemia mätning, kontrollera minst totalt 6 000 erytrocyter, som kan erhållas genom att räkna minst 30 eller 40 mikroskopiska galler med ett genomsnittligt antal 200 eller 150 erytrocyter (RBCs) per rutnät, respektive. Räkna det totala antalet RBCs i det första och sista rutnätet för att bestämma det genomsnittliga antalet röda blodkroppar för alla rutnät.
- Räkna det totala antalet infekterade erytrocyter per rutnät. Manliga och kvinnliga gametocyter kan räknas separat för att bestämma gametocytemia men bör också ingå i den totala parasitemia räkna.
- Bestäm den totala parasitemia procent genom att dividera det totala antalet parasitiserade erytrocyter med det totala antalet RBCs observerats. Multiplicera detta antal med 100 att bestämma parasitemia procent.
- Bestäm gametocytemia genom att dividera det totala antalet gametocyter räknat med det totala antalet observerade RBCs. Multiplicera detta antal med 100 att bestämma gametocytemia procent per mus.
Anmärkning: Den enda pålitliga metoden för differentiering mellan olika asexuella och sexuella blod faser är användningen av ett mikroskop för att utvärdera Giemsa-färgade tunna blodets utstryk, eftersom var och en av stadierna har olika morfologi, med undantag för omogna gametocyter, som är mestadels omöjlig att skilja från asexuella blod stadier.
- Bestämning av blod-Stadium parasitemia av flödescytometri för fluorescerande reporter protein-uttrycker WT-liknande parasit stammar
- Märk två mikrocentrifugrör för varje mus prov som betecknar ett rör för en utspädning på 1:1000 och det andra för en utspädning på 1:2000. Tillsätt 1,5 μL 1x heparin till 1:1000 spädnings röret.
- Använd en 26 G eller 27 G nål, sticka musens svans och överför 1,5 μL blod till röret som innehåller 1,5 μL 1x heparin (1:1000 spädnings röret). Blanda blodet och 1x heparin försiktigt tillsammans genom att Pipettera upp och ner.
- Tillsätt 1 497 μL RPMI-medium till microcentrifugeröret och Pipettera försiktigt upp och ner för att blanda väl.
- Överför 500 μL av blandningen från 1:1000 spädnings röret till utspädnings röret 1:2000. Tillsätt 500 μL RPMI-medium till 1:2000-röret och blanda försiktigt genom att Pipettera upp och ner.
- Följ tillverkarens lämpliga start protokoll för flödescytometern. Kör proverna med ett långsamt flöde och ange identifieringen för minst 20 000 händelser.
Anmärkning: Det finns en alternativ praktisk analys för att mäta parasitemia via TRICOLOR FACS sortering, oavsett om parasiter uttrycker fluorescerande markörer eller inte34. Emellertid, analysen beskrivs här erbjuder ett exakt mått av parasitemia i levande parasiter utan tillsats av DNA-bindande färgämnen och användning av FACS sortering.
- Bestämning av exflagellation hastighet manliga könsceller per mikroliter infekterade mus blod
- Bered ett 1:10-mikrocentrifugerör med 40 μl ofullständigt ookinete-medium (RPMI + natriumbikarbonat + hypoxantin + xanthurensyra) och 5 μl 1x heparin.
- Med hjälp av en 26 G eller 27 G nål, sticka musens svans och överför 5 μL blod (med en mikropipett) snabbt till röret som innehåller den ofullständiga ookinete Media + heparin. Blanda försiktigt och lasta 12 μL av 1:10-blodutspädnings röret på en hemocytometern och lämna det i rumstemperatur (20-24 ° c).
- Börja räkna exflagellation händelser 9-10 min efter beredning av 1:10 utspädning. Använd en faskontrast ljusmikroskop med 40x förstoring.
- Multiplicera Genomsnittligt antal exflagellation händelser räknat med 10 och sedan multiplicera med utspädningsfaktorn (10) för att bestämma det genomsnittliga antalet exflagellation per mikroliter infekterat blod.
Anmärkning: Denna analys mäter antalet manliga könscell exflagellation händelser i en 1 μl volym av blod, som kan kvantifieras med hjälp av en hemocytometer. En ofullständig ookinete medium18 blandas med blodet för att nära efterlikna de förhållanden under vilka exflagellation sker inne i Mosquito midgut strax efter en blodmjöl.
3. isolering och bearbetning av Blodfasade parasiter från infekterade erytrocyter och fryst beredning av lager
- Terminal blödning av infekterade gnagare genom hjärt punktering
- Förbered en 26 G nål spruta som innehåller cirka ≤ 20 μL av 1x heparin (200 enheter/mL) för att samla blod av givaren musen genom hjärt punktering.
- Använd ett långsamt flöde av CO2 för att euthanize musen före blödning. Alternativt, söva musen med isofluran (som måste upprätthållas före och under huden snitt för att exponera hjärtat).
- Låg musen på ryggen och stift ner dess bihang. Gör ett litet snitt i huden nära basen av bröstbenet genom att dra upp huden med pinps och skära den med sax. Dra isär huden på platsen för snittet för att exponera membranet och toppen av bukhålan.
- Håll basen av revbenen med tång och skär genom membranet för att komma in i brösthålan; var försiktig så att du inte skadar hjärtat eller lungorna. Stift tillbaka revbenen för att exponera hjärtat.
- Försiktigt punktera hjärtat och sakta dra upp på sprutkolven för att samla ~ 1 mL blod och överföra det till ett microcentrifug rör.
- Beredning av frysta bestånd från infekterat blod
- Blöder möss (se avsnitt 3,1) med blodparasitemier som är mellan ca 2% och 5%, med en betydande mängd ring stadier och inte så många gametocyter.
- Blanda den önskade delen av blod med frys lösning (10% glycerol i Alsevers lösning) i ett 1:2-förhållande och förvara i kryogena injektionsflaskor. Frys i flytande kväve.
- Isolering och rening av blod-scenen parasiter för utvinning av DNA, RNA, och proteiner
- Blöder möss (se avsnitt 3,1) med blodparasitemier som är högre än 0,5%.
- Bered en 10 mL spruta genom att ta bort kolven och sätta i en liten bomullspinne. Packa ner bomullen till botten av sprutan. Fyll den med cellulosa tills cellulosa nivån når 3 mL-märket men inte överskrider 4 mL-märket på sprutan.
- Fäst sprutan i ett klipp i ett ring stativ och placera ett uppsamlings rör under den. Tillsätt 5 mL PBS till sprutan och låt den flöda in i spill röret.
- Förbered frysta lager om det behövs, med endast 100-300 μL blod. Tillsätt resten av det infekterade blodet (400-700 μL) till kolonnen. Samla flödet genom med ett spill rör tills dropparna börjar bli röda. När dropparna börjar bli röda, placera ett nytt 14-mL uppsamlings rör under sprutan för att samla in flödet genom.
- När flödet börjar sakta, tillsätt PBS till sprutan och samla upp flödet i 15 mL-röret tills en total volym på 14 mL har uppnåtts. Samla det resterande flödet genom med ett spill rör.
- Centrifugera 14 mL-röret med blod/PBS-blandning i 8 min vid 250 x g utan bromsar. Ta bort supernatanten och tillsätt 14 mL kyld saponin (50 mg saponin i 50 mL PBS). För att få bort pelleten, vänd röret flera gånger och virvel vid behov.
- Centrifugera röret i 8 min vid 1 217 x g utan bromsar. Avlägsna supernatanten och lämna ca 0,5 mL av lösningen ovanför pelleten.
- Omsuspendera pelleten i lösningen med en mikropipett och överför den till ett microcentrifugerör. Tillsätt 500 μL PBS till 14 mL-röret för att tvätta eventuella kvarvarande parasiter som finns kvar i röret. Tillsätt detta till samma microcentrifug tub.
- Centrifugera röret i 2 min vid 6 010 x g. Avlägsna supernatanten och Omsuspendera 1 mL PBS. Centrifugera i 2 min vid 9 391 x g.
- Fortsätt att extrahera genomiskt DNA, totalt RNA och protein.
- För genomisk DNA-extraktion, avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 200 μl PBS, och följ sedan alla lämpliga protokoll för gDNA-extraktion.
- För Total RNA-extraktion, avlägsna supernatanten, Omsuspendera och Vortexblanda pelleten i 1 ml av någon fenol-och guanidinisotiocyanatbaserad lösning eller något annat lämpligt reagens och följ sedan alla lämpliga protokoll för total RNA-extraktion.
- För totalprotein utvinning, avlägsna supernatanten, Omsuspendera pelleten i en lämplig volym av 6x natriumdodecylsulfat (SDS)-lastning färgämne eller någon annan lämplig reagens och därefter följa alla lämpliga protokoll för totalprotein bearbetning.
4. mygg infektion assays
Anmärkning: Mygga är den primära värden för malariaparasiter där sexuell reproduktion äger rum. Infektion av möss för att överföra malariaparasiter till myggor utförs av en IV injektion av minst 1 000 000 blod stadier, följt av utfodring en infekterad mus (från varje genotyp som visar den högsta manliga könscell exflagellation Rate) till Anopheles myggor i en bur på dag 3 post-mus-infektion. Den IV injektion med 1 000 000 blod-skede parasiter i Fenylhydrazin-behandlade möss kommer att säkerställa utvecklingen av manliga och kvinnliga gametocyt i en snabbare och högre takt. Myggor infekterade med p. yoelii och p. berghei inkuberas vid 24 ° c respektive 20-21 ° c, för att möjliggöra bästa möjliga Mosquito stadier utveckling6.
- Mygg matning och bestämning av antalet ookineter per mygga
- Svälta vuxna kvinnliga Anopheles stephensi eller A. gambiae myggor (4-7 dagar gamla) för 8-12 h före utfodring. Låt vuxna myggor Mata i minst 15 min på de infekterade sövda möss (injiceras med en lämplig dos av ketamin/xylazin) med den högsta exflagellationshastighet (mätt i avsnitt 2,3).
Anmärkning: Ketamin/xylazine arbetslösning bereds av 1:5 utspädning av stamlösningen i saltlösning och IP Injicera 100 μL per mus. För en 10 mL stamlösning tillsätts 1 mL xylazin (100 mg/mL) till 9 mL ketamin (100 mg/mL). - Ta bort omatade kvinnliga myggor och manliga myggor med en mun aspirator.
- Vid 18-20 h postfeeding, samla 20-30 myggor och placera dem i frysen för inte mindre än 10 min för att säkerställa döden. Med hjälp av en kikare dissekering omfattning, dissekera ut 20-30 blodfyllda midguts med 2 26 G eller 27 G nålar eller en nål och pinps i RPMI eller PBS dissektion medium och överföra midguts till ett microcentrifug rör som innehåller 200 μL av RPMI eller PBS (för dissektion metod Se avsnitt 4,3).
- Centrifugera samlingsröret i 1 min vid 700 x g. Slipa inblandning pelleterat midguts med en mortelstöt. Upprepa det här steget.
- Överför 50 μL från röret av malda midguts till ett nytt microcentrifugerör. Tillsätt 200 μL RPMI eller PBS för att skapa en 1:5 utspädning.
- Överför 12 μL till en hemocytometern och inkubera den vid rumstemperatur i 5 minuter så att innehållet kan sedimentera.
- Bestäm det genomsnittliga antalet ookinetes med hjälp av ett lätt Mikroskop med en faskontrast och 40x förstoring.
- Multiplicera det genomsnittliga antalet mogna ookinetes med 10 och sedan med utspädningsfaktorn 5 för att fastställa det genomsnittliga totala antalet ookinetes.
- Dividera det genomsnittliga antalet ookinetes med antalet blodmatade myggor dissekeras för att bestämma antalet ookinetes per blodmatad mygga.
- Svälta vuxna kvinnliga Anopheles stephensi eller A. gambiae myggor (4-7 dagar gamla) för 8-12 h före utfodring. Låt vuxna myggor Mata i minst 15 min på de infekterade sövda möss (injiceras med en lämplig dos av ketamin/xylazin) med den högsta exflagellationshastighet (mätt i avsnitt 2,3).
- Bestämning av antalet tidiga oocyster för fluorescerande reporter protein-uttrycker WT-liknande parasit stammar
Anmärkning: Syftet med denna analys är att bestämma antalet levande parasiter som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) som etablerat en fullständig infektion av Mosquito midguts och bildade tidiga sfäriska oocyster. Denna analys avgör om ookinetes (deras utveckling uppskattas i den tidigare analysen) avslutat sina funktioner genom Traversal genom Mosquito midgut epitelceller och omvandlingen till tidiga oocyster på basal lamina sidan av midgut epitelia eller inte. Detta är en annan analys som gör stor nytta av parasiterna uttrycker GFP, som räknar tidiga oocyster i detta skede kommer att vara nästan omöjligt utan långtråkig immunofärgning.- Dissekera midguts (se avsnitt 4,1) av 20-30 blodmatade myggor, dag 3 eller 4 efter mygg-utfodring (PMF) för p. yoelii 17X-nl, och på dag 6 eller 7 PMF för p. berghei anka, med 2 26 g eller 27 g nålar eller en nål och tång i RPMI eller PBS dissektion m edium (för dissekeringsmetod, se avsnitt 4,3).
- Fördela 40-50 μL av dissekera mediet på den horisontella mittlinjen på den längre kanten av glas bilden. Överför midguts till denna linje, en i taget, under dissektion, och tillsätt mer medium till midguts, om det behövs, för att undvika uttorkning.
- Placera en täckslip försiktigt på dissekerade midguts, och täta den med nagellack.
- Med hjälp av målsättningen 10X eller 20x i fluorescensmikroskopet med det gröna fluorescensfiltret, räkna antalet tidiga oocyster i varje midgut, i minst 20 midguts.
- Bestämning av antalet oocyster sporozoiter per mygga
- Dissekera midguts av minst 20-30 myggor med 2 26-G eller 27-G nålar eller en nål och pinps i RPMI eller PBS dissektion medium och samla dissekerade midguts i 200 μL av RPMI.
- Håll den nedre delen av buken stadigt på plats med en nål (eller tång) och tryck lätt bröstkorgen i en uppåtgående riktning med den andra nålen vid korsningen mellan bröstkorgen och buken. Gör försiktigt korta tryckningar tills bröstkorgen separerar från buken. Så snart separationen börjar den vita midgut kommer att visas sträckt, och sedan midgut kommer att skäras från matstrupen slutet med samma nål som användes för att separera bröstkorgen. Om det fortfarande är fäst vid buken, kan samma nål användas för att dra midgut bort från buken. Överför midguts av alla myggor till samlingsröret genom att samla dem från mediet med en nål, en i taget.
- Centrifugera samlingsröret i 1 min vid 700x g för att lösa midguts till botten av samlingsröret och slipa dem med en stöt. Upprepa det här steget.
- Överför 12 μL till en hemocytometern och inkubera den vid rumstemperatur i 5 minuter så att dess innehåll kan sedimentera.
- Räkna oocyster sporozoiter med hjälp av en 40X mål av ett ljusmikroskop. Använd 1:5 och/eller 1:10 spädningar om mygg avfall förhindrar exakt inventering av sporozoiter eller om antalet sporozoiter är för hög för att räkna exakt.
- Beräkna det genomsnittliga totala antalet oocyster sporozoiter genom att multiplicera det genomsnittliga antalet sporozoiter med 10 och sedan multiplicera detta antal med utspädningsfaktorn, om någon, och av den totala volymen (200 μL).
- Dividera det genomsnittliga totala antalet sporozoiter med antalet myggor dissekeras för att beräkna det genomsnittliga antalet oocyster sporozoiter per mygga.
Anmärkning: Ett vanligt misstag för att mäta framgången eller produktiviteten av Mosquito stadier infektion är att räkna antalet oocyster i senare stadier av oocyster utveckling. Detta beror på att vissa oocyster vaktas vid senare tidpunkter för oocyster utveckling, och andra misslyckas med att utveckla sporozoiter, även på samma midgut. Den bästa och mest pålitliga metoden för att bestämma produktiviteten av Mosquito stadier infektion är räkningen av det genomsnittliga antalet midgut oocyster sporozoiter på dagar 10-12 post-Mosquito-infektion för P. yoelii och på dagar 12-14 post-Mosquito-infektion för P. berghei.
- Bestämning av antalet spottkörtel sporozoiter per mygga
Observera:Den ultimata utvärderingen av den fullständiga slutförandet av Mosquito stadier utveckling åstadkoms genom att uppskatta antalet sporozoiter som invaderade spottkörtel, som är överförbara och smittsamma stadier till ryggradsdjur. Invasionen av spottkörtel är etablerad efter slutförandet av oocyster sporozoite utveckling, utgående i hemolymfa, fastsättning av basala lamina av spottkörtel acinar celler, och Traversal av acinar cellerna att nå spottkörtlarna Kanaler5. Därför är denna analys också en utvärdering av framgången för alla dessa processer eller inte. Icke desto mindre, en uppskattning av hemolymfa sporozoite siffror skulle möjliggöra differentiering mellan defekter i avstigning från oocyster och defekter i invasionen av spottkörtlar35. Rening av spottkörtel sporozoiter gör det möjligt att utföra flera funktionella analyser på sporozoite motilitet och invasion fenotyper. Den spottkörtel sporozoiter kan också användas för in vivo infektion av möss och i immuniseringsstudier36,37. Dessutom, de mest reproducerbara stadier tillgängliga för att etablera en in vitro lever skede invasion eller en utveckling assay är genom användning av spottkörtel sporozoiter.- Dissekera spottkörtlarna av 50-100 kvinnliga myggor, på dagar 14-16 PMF för p. yoelii och på dagar 17-20 PMF för p. berghei, helst med 2 26 G eller 27 G nålar, i RPMI eller DMEM medium hålls på is och kompletteras med 5% foster bovint serum (FBS) eller/bovint serumalbumin (BSA) för p. yoelii sporozoiter eller 3% FBS/BSA för p. berghei sporozoiter. Om sporozoiterna ska användas i hepatom in vitro-analyser, tillsätt 1% penicillin/streptomycin till dissekera mediet. Det finns i allmänhet två metoder för dissektion av spottkörtlarna. Den första metoden är tidskrävande men leder till dissektion av spottkörtlar med mycket lite eller inga kontaminerande vävnader. Den andra metoden är mindre tidskrävande men leder till insamling av en betydande mängd kontaminerande vävnader. Den första metoden beskrivs här.
- Håll övre delen av buken segment på plats med den avfasade sidan av en nål och försiktigt trycka huvudet mycket lätt (i mycket korta tryck) vid korsningen mellan huvudet och bröstkorgen i en uppåtgående riktning tills huvudet är noggrant åtskilda från bröstkorgen utan Riva upp den glasartad spottkörtlar, de exponerade spottkörtlarna separeras sedan från huvudet med samma nål som sköt huvudet uppåt.
- Den dissekerade spottkörtel kommer att höjas från dissektion medium med hjälp av en kort glas Pasteur pipett.
- När alla spottkörtlar har dissekeras och skördas, talang kommer att placera röret som innehåller midguts i centrifugen (1MIN, 700 x g).
- Räkna sporozoiter med hjälp av en hemocytometern under ett ljusmikroskop inställt på fas 2 kontrast och 40x förstoring. Om antalet myggor dissekeras ≥ 40, späd spottkörtlarna till 1:5 eller 1:10, beroende på förväntad smittsamhet avkastning (bestäms i tidigare analyser).
- Multiplicera Genomsnittligt antal sporozoiter med 10 och utspädningsfaktorn (om sådan finns). Multiplicera med den totala volymen för att bestämma det genomsnittliga antalet spottkörtel sporozoiter. Dividera med antalet dissekerade kvinnliga myggor för att bestämma den genomsnittliga spottkörtel sporozoiter per mygga.
Anmärkning: Problemet med dissektion av spottkörtlarna är deras ringa storlek och glasartad transparent utseende. Således är det mycket svårt att isolera spottkörtlarna och därför är de vanligtvis dissekeras ut som en klumpsumma med andra vävnader från den främre delen av bröstkorgen, vilket också är viktigt att skydda spottkörtlarna från bristning under samlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången med att tillämpa omvänd genetiska verktyg och tekniker för att malariaparasiter har revolutionerat området malaria forskning, med möjlighet att lägga till, ta bort eller ändra specifika genomisk segment av flera Plasmodium arter39. Viktigt, dispensable genomisk loci har identifierats och används framgångsrikt för att införa fluorescens protein markörer i gnagare och mänskliga malariaparasiter genom dubbel homolog rekombination, för att säkerställa ett stabilt uttryck i alla livscykelstadier40 ,41,42. Ett exempel på dessa WT-liknande transgena parasiter är Py230p (-) parasiter, som har genererats i vårt labb, och visade ingen uppenbar defekt i utvecklingen av blod och mygga livscykelstadier15,16, 17. dessa transgena reporter parasiter uttryckt egfp, under kontroll av den starka och konstitutiva promotorn för PyHSP70, i blod stadier (figur 1a) ookinetes (figur 1b), unga oocyster (figur 1c ) på Anopheles stephensi midguts, och i sporozoiter isolerade från spottkörtlarna hos Anopheles stephensi honor (figur 1d). Således, eGFP-uttrycker blodparasiter gjorde det mycket lättare och mindre tidskrävande att utvärdera blod-skede parasitemia använder flödescytometri mellan olika genotyper av transgena parasiter eller mellan läkemedelsinbehandlade och-obehandlade i drog-targeting analyser med transgena reporter parasiter.
För att bekräfta att det inte finns någon kvantitativ skillnad mellan användningen av flödescytometri och den mer tråkiga parasitemia uppskattning av mikroskopi, den eGFP-uttrycker Pyp230p (-) användes för att uppskatta andelen parasitiserade erytrocyter av flödescytometri och av Giemsa-färgade tunna blod smeta i en grupp schweiziska Webster möss IV-infekterade med 10 000 parasitiserade erytrocyter. Flödet flödescytometrianalys parasitemia% värden motsvarade direkt till den uppskattade parasitemia% genom övervakning Giemsa-färgade tunna blodets utstryk, som uppskattades av två sakkunniga forskare (figur 2). Detta är ett mer exakt alternativ till den tråkiga och benägna att mänskliga-fel metod för mikroskopi i fastställandet av tillväxttakten i blod-skede parasiter.
En viktig avvikelse i samband med infektion av gnagare med malariaparasiter blod stadier är valet av infektionsväg, med en stark preferens i litteraturen för UNDERSÖKNINGSperioden jämfört med IV väg av infektion, eftersom det är mindre tidskrävande. För att jämföra dessa två infektions vägar, två grupper av fem BALB/c möss var infekterade med 1 000 eGFP-uttrycker Pyp230p (-) parasitiserade erytrocyter per mus, antingen genom IV eller IP-vägar. Parasitemia övervakades dagligen med flödescytometri under en period av 4 dagar. En statistiskt signifikant minskning av den IP-infekterade gruppen parasitemia% jämfört med den IV-infekterade gruppen noterades på alla testade dagar (figur 3). Detta ger belägg för att IV infektions vägen är en mer kvantitativt exakt infektionsväg för analyser med malariaparasiten blod stadier.
Icke desto mindre, en begränsning av användningen av flödescytometri att utvärdera blod-skede parasitemia är differentiering mellan sexuella och asexuella stadier och mellan manliga och kvinnliga gametocyter. Uppskattningen av procentsatserna för var och en av de olika asexuella och sexuella stadierna (figur 4) måste därför bero på en morfologisk utvärdering av Giemsa-färgade tunna blod smear. Trots den uppenbara olika morfologin av mogna manliga och kvinnliga gametocyter (figur 4), omogna sexuella stadier är ofta omöjlig att skilja från asexuella stadier.
En viktig funktion av de manliga könsceller vid uppkomst från manliga gametocyt i Mosquito midgut är den manliga könscell exflagellation, vilket är ett mycket kritiskt steg i överföringen som måste ske inom en mycket kort tidsperiod. Variabel metoder som används för att utvärdera detta i många olika system har beskrivits. Häri visar vi en standardiserad metod som kan upprepas i en enkel labb inställning. Vi utvärderade manlig könscell exflagellation med eller utan injektion av Fenylhydrazin i mottagar möss (figur 5). Vi kunde visa att den Fenylhydrazin behandling signifikant (fyra gånger) ökade andelen manliga könscell exflagellation, vilket i sin tur kommer att öka fertilisering hastighet och antalet alla efterföljande myggor stadier.
Figur 1 : Utvecklingen av P. yoelii p230p (-) parasiter konstitutivt uttrycker egfp i blod och myggstadier. (A) bild av blandade blodfasade parasiter (1, 000x förstoring). (B) bild av ookinete (400x förstoring). (C) bild av en Anopheles stephensi mygga midgut infekterade med dag 4 PMF tidiga oocyster av levande p230p (-) parasiter uttrycker egfp (100x förstoring). (D) denna panel visar en levande bild av en P. yoelii p230p (-) spottkörtel sporozoite, dissekeras ut på dag 15 PMF, uttrycker Egfp (400x förstoring). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Flödescytometri och mikroskopi utvärderingar av genomsnittlig parasitemi i blodet av P. yoelii p230p (-) parasiter är inte signifikant annorlunda. En grupp av fyra schweiziska Webster möss var intravenöst infekterade med 10 000 parasitiserade erytrocyter av Pyp230p (-) per mus och den genomsnittliga blod-scenen parasitemias% spelades in dagligen i 7 dagar med flödescytometri och genom den mikroskopiska utvärderingen av Giemsa-färgade tunna blod smetar från totalt 20 000 och ~ 6 000 erytrocyter, respektive. Den mikroskopiska undersökning resultat som visas är genomsnittet av två avläsningar av två expert forskare per Slide, och tiden för att utvärdera parasitemia av varje bild var minst 10 minuter av varje vetenskapsman. Inga signifikanta skillnader kan upptäckas på någon av de dagar som visas här. Medelvärdena för alla parasit stammar analyserades med det tvåsidiga t-testet. Felstaplarna representerar standardavvikelsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : En intravenös injektion av P. yoelii p230p (-) parasiter ger signifikant olika blod-Stadium parasitemia från en intraperitoneal injektion. Två grupper om fem BALB/c möss var infekterade med 1 000 parasitiserade erytrocyter av Pyp230p (-) per mus, antingen genom den intravenösa eller intraperitoneala rutten, och den genomsnittliga blod-skede parasitemias% spelades in dagligen i 4 dagar genom flöde cytometri från totalt 20 000 erytrocyter. En statistiskt signifikant reduktion (betecknade med en asterisk) av parasitemia i blodet kunde upptäckas för alla dagar som testades i den intraperitoneala flödesgruppen jämfört med den intravenösa flödesgruppen. Medelvärdena för alla parasit stammar analyserades med det tvåsidiga t-testet. Felstaplarna representerar standardavvikelsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Morfologi av P. yoelii gametocyter i en Giemsa-färgade tunna blod smear. En bild av en Giemsa-färgade tunna blod smeta (1000X förstoring) av en schweizisk Webster mus infekterade med WT P. yoelii 17x-nl stam visar den typiska blåaktig färgade kvinnlig gametocyt på vänster sida (betecknas med en pil) och rosa färgade manliga ( betecknade med en asterisk) gametocyt på höger sida av bilden. De andra stadierna som visas är asexuella blod stadier. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Effekten av Fenylhydrazin på manlig könscell exflagellation. Effekten av Fenylhydrazin injiceras i mottagar möss 5 dagar före den manliga könscell exflagellation Rate uppskattning av P. yoelii. Fenylhydrazin ökar signifikant graden av manlig könscell exflagellation, vilket leder till en högre Mosquito stadier infektion efter Mosquito-utfodring. Medelvärdena för alla parasit stammar analyserades med det tvåsidiga t-testet. Felstaplarna representerar standardavvikelsen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots likheten i den allmänna biologin av deras livscykler till att mänskliga malariaparasiter, mus malaria modeller har också många olikheter till mänskliga Plasmodium arter som skulle begränsa deras användning som tillförlitlig in vivo modeller. Till exempel, med undantag för levande försvagade parasiter som vacciner, gav alla vaccin studier med subenhet och DNA och andra vacciner utmärkta resultat i musmodellen, men hos människor som lever i endemiska områden var resultaten långt ifrån tillfredsställande.
Ett annat problem är skillnaden i livscykel skede smittsamhet från en mus stam till en annan, och ibland från en djur leverantör till en annan för samma mus stam. Dessutom, de viktigaste två gnagare malaria arter som ofta används som föredras i vivo malaria modeller, p. berghei och p. yoelii, uppvisar inte en synkron blod-stegs cykel, som är helt annorlunda från någon mänsklig malaria Parasit. Men fördelarna med att använda mus malariaparasiter som in vivo modeller överväger långt dessa olikheter, som också kan övervinnas genom mer djupgående analyser av molekylära enheter av dessa begränsningar. Ändå, dessa begränsningar är oftast visas av gnagare malaria blod-skede parasiter, men inte lika mycket för andra livscykelstadier av malariaparasiten.
Även om blod stadier är viktiga för olika vaccin, drog inriktning, immunologi, och funktionella genomiska studier, det finns en brist på standardiserade metoder och protokoll som koncentrerar sig på fenotypisk analys och funktionella analyser som involverar gnagare malaria parasit blod-scenen parasiter, med mer fokus på mygg överföring och transfektion protokoll. Därför metoderna i denna artikel kommer att bidra till att ge standardiserade och förenklade protokoll för att studera de patogena stadierna av gnagare malariaparasiter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ahmed Aly stöds av finansiering till Bezmialem Vakif universitet från det turkiska ministeriet för utveckling Grant 2015BSV036, och genom finansiering från Tulane University School of Public Health and Tropical Medicine, och genom finansiering från NIH-NIAID för R21Grant 1R21AI111058-01A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | 375095-100KU | |
| Xanthurenic acid | Sigma | D120804-5G | |
| Hypoxanthine | Sigma | H9377-25G | |
| Alsever's solution | Sigma | A3551-500ML | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Phenylhydrazine | Sigma | P26252-5G | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| Giemsa | Sigma | GS1L-1L | |
| 26 G x 3/8 Precision Glide Needle, | Becton Dickinson | 305110 | |
| 1 mL TB Syringe, 26 G x 3/8 | Becton Dickinson | 309625 | |
| 1 cc Insulin Syringe, U-100 27 G | Becton Dickinson | 329412 | |
| Isoflurane, USB | Piramal | 2667- 46- 7 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| RPMI | Gibco | 22400105 | |
| DMEM | Gibco | 11995065 | |
| Pencillin/Streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Fiber Glass Wool | Corning | 3950 |
References
- Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
- Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071 (2014).
- Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
- Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
- Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
- Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
- Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
- Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
- Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
- Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600 (2015).
- Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
- Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
- Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
- Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882 (2015).
- Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518 (2016).
- Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
- Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665 (2014).
- Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
- Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260 (2017).
- Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
- Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
- Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
- Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
- House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
- Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
- Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
- Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
- Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
- Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
- Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
- Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
- Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
- Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
- Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118 (2011).
- Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
- Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
- Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
- Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
- de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
- Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
- Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289 (2011).
- Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760 (2014).
