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Biology

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55698

Summary

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pHeu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

Abstract

Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pHeu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celulareu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pKum adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pHi em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H+) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.

Introduction

O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pHi) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H+ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave1. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolicamente ativas células principais com distintas apicais (luminal) e polaridade basolateral (hemocoel), bem como células estreladas intercaladas. MTs anteriores são compostas de 3 morfologicamente, funcionalmente, e mentalmente distintos segmentos, nomeadamente a inicial dilatadas segmento, segmento de transição e secretora segmento principal, que se junta ao ureter2. Na escala celular transporte trans-epitelial íons no lúmen é realizado por uma membrana plasmática apical V-ATPase3 e um cambista do alcaloide-metal/H+ , bem como um basolateral at+-+K-ATPase4, aperfeiçoamento activo-retificador K+ canais5, at+-conduzido Cl/HCO3 cambista (NDAE1)6e Na+-K+-2 Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, enquanto células estreladas mediam Cl e transporte de água8,9. Este sistema fisiológico complexo mas acessível oferece excelentes oportunidades para a investigação de mecanismos de transporte de íon endógena quando combinado com diversos fatores genéticos e comportamentais conjuntos de ferramentas de Drosophila.

A justificativa para este protocolo foi descrever um sistema geneticamente maleável para estudar o transporte de íons epitelial com potencial para a integração do celular para o comportamento e exportação de ferramentas para outros sistemas de modelo. Expressão de pHerry10, uma GEpHI derivada de uma fusão de verdes sensíveis ao pH super eclíptica pHluorin11,12 (SEpH) e vermelho mCherry diferenciação de pH13, em MTs permite a quantificação de transporte H+ , em células únicas MT através da alta K+/nigericin calibração técnica14. Como muitos transportadores de iões mover equivalentes de H+ , quantificação de pH intracelular serve como uma representação funcional do movimento de iões através de uma variedade de transportadores. O modelo de sistema de Drosophila MT também oferece ferramentas poderosas de genéticas em tecido-específica do transgene15 e RNA interferência (RNAi)16 expressão, que pode ser combinado com o celular imagens e ensaios todo-órgão17 , 18 , 19 da função do túbulo para criar um conjunto de ferramentas robusto com integração vertical das moléculas de comportamento. Isto contrasta com muitos outros protocolos para avaliação biologia epitelial, como historicamente, tais medidas têm confiado na intrincada e assustadora micro-dissecção, sofisticado eletrodos íon-seletivos20,21, e sensíveis ao pH caro tinge22 com requisitos de carga restritiva e pobre especificidade celular em tecidos heterogêneos. GEpHIs têm sido utilizados para medir o pHeu em uma variedade de tipos de célula23extensivamente. Primeiros trabalhos exploraram a pH-sensibilidade inerente de proteína fluorescente verde (GFP) para monitorar o pHeu em culturas de células epiteliais24 mas nas duas últimas décadas viram GEpHIs usado em neurônios25, glia26, fungos27 , e células de plantas28. A combinação do potencial de segmentação celular de construções genéticas através da expressão de GAL4/UAS sistema15 e a acessibilidade fisiológica de MT a drosófila isto fazer uma preparação ideal para investigações de pHeu regulamento e transporte de íon epitelial.

pHeu regulamento tem sido estudado há décadas e é vital para a vida. A preparação de MT oferece um modelo robusto de ensinar fisiologia do Regulamento pHeu mas também realizar sofisticadas investigações de pHi Regulamento ex vivo e in vivo. Este protocolo descreve a quantificação do movimento H+ através da membrana basolateral das células epiteliais da drosófila MT usando o NH4Cl ácido de pulso técnica21a carregar, mas como o indicador de pH é geneticamente codificado, esses métodos e o seu enquadramento teórico podem ser aplicados a qualquer preparação passível de transgênese e geração de imagens ao vivo.

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Protocol

Todas as etapas neste protocolo estar em conformidade com as diretrizes de uso de animais da clínica Mayo (Rochester, MN).

1. criação de voar

  1. Aumento voa e conjunto cruza de acordo com o padrão de criação29.
    Nota: A expressão fluorescente repórter pelo sistema GAL4/UAS é proporcional à temperatura e, portanto, a criação da temperatura pode ser ajustada para alterar o nível de expressão. Enquanto os níveis de alta expressão muitas vezes levam a uma melhor relação sinal-ruído esta condição também é associada com aumento citosólico e organellar agregados quando usando as boas práticas agrícolas para fusão de proteína fluorescente vermelha (RFP) constrói como pHerry10, 30,31. Se a agregação é inevitável, quantificação ainda é possível através da realização de calibrações no ponto em cada experimento e normalização de dados tais que uma proporção de fluorescência de 1.0 corresponde ao pHeu 7.0 (ver passo 7.4 nota na calibração abaixo).
  2. Conjunto de cruzes de homozigotos capaR-GAL432 machos homozigotos UAS-pHerry10 fêmeas virgens e homozigotos c724-GAL42 machos às fêmeas virgens de homozigotos UAS-pHerry para permitir imagens de pH em células principais e células estreladas de MT, respectivamente. Lugar 6 UAS-pHerry fêmeas com 3 machos GAL4 dentro dos frascos de frescos de comida e deixar de acasalar a 28 ° C.
    Nota: As larvas devem ser evidentes dentro de 4D e adultos começará a eclose próximo dia 10.
  3. Colete femininas moscas em cima de eclosão e reserve a idade para d 10 a 28 ° C.
    Nota: O tempo de experimentação pode ser ajustado para corresponder à qualquer restritivos ensaios comportamentais (como o Ramsay secreção ensaio17,19) que vão ser correlacionados a imagem latente do pH intracelular de ao vivo. Moscas masculinas podem ser usadas mas túbulos das fêmeas são geralmente maiores e mais robusta.

2. preparação de lâminas de poli-L-lisina.

  1. Desenhar uma borda de 40 x 20 mm com uma caneta PAP hidrofóbica ao redor do topo de slides padrão 75 x 25 mm e Reserve secar durante 15 min em lamelas de grande uso de RT. se as lâminas não são compatíveis com imagem latente ótica.
  2. 2 ml da solução de poli-L-lisina (PLL) de 0,01% das ações para cada slide e reserve por 1h no RT
  3. Remova o excesso PLL com uma pipeta. Salve a solução em um frasco de 50 mL cônica para uso futuro. Loja a 4 ° C.
  4. Aspire qualquer solução restante com uma linha de vácuo. Execute a linha de vácuo sobre a superfície inteira do slide para que permaneça sem solução nos slides.
  5. Defina os slides lado por 1h adicional à antes da RT para usar. Armazene os slides seca em RT até 1 mês em um livro de slide padrão.

3. preparação do prato e hastes de vidro de dissecação

  1. Adicione 0,5 mL de agente de cura de elastômero de 4,5 mL de elastômero base em poliestireno um 35 x 10 mm placa de Petri em RT para produzir uma profundidade de 5 mm. misture com a ponta da pipeta descartável. Permitir que o elastômero curar O/N em RT
    Nota: Elastômero deve ser clara e livre de bolhas. Clareira de bolhas pode ser facilitada pela manter placas de elastômero em um frasco de vácuo para 10-15 min depois de derramar.
  2. Segure uma vareta de vidro de diâmetro de 5 mm entre as mãos e derreta o centro da haste em um bico de Bunsen aceso enquanto puxa as extremidades separados. Como o vidro derrete puxa mais rapidamente para produzir um fino (0,1 mm) e o eixo cônico (Figura 1).
    Nota: Um ângulo de 45 ° na haste da é frequentemente útil no tratamento de túbulos. Isto pode ser conseguido através de uma redução de uma mão como a haste é puxada (ver Figura 1).
  3. Quebre a haste fina no meio com o lado sem corte de uma lâmina de aço carbono com arestas único. Inspecione a extremidade fina da haste em um escopo de dissecação para garantir que o tempo está limpo.

Figure 1
Figura 1: Fabricação de hastes de vidro para a manipulação de túbulos de Malpighi.
A - E. Processo de aquecimento e puxando uma vareta de vidro para produzir um atarraxamento e ângulo adequado para manipulação mts. setas indicam direção e magnitude da força a ser aplicada. F. fotografia de uma ferramenta de vidro fabricada adequadamente. Barra de escala = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. preparação de soluções e sistema de perfusão

Nota: Sistemas de perfusão diferem pelo fabricante. Este protocolo é baseado em torno de um reservatório aberto 8 canais de gravidade-alimentado com um regulador de taxa de fluxo de entrada e uma saída controlado por vácuo, mas o método de montagem que MTS conforme descrito aqui podem ser adaptados para funcionar com qualquer sistema de perfusão.

  1. Prepare as seguintes soluções:
    1. Do alíquota Schneider médio (40 mL dentro dos frascos de Erlenmeyer de 50 mL) e em 4 ° C.
    2. Preparar soluções (ou seja, o inseto Phosphate-Buffered salina (iPBS) e iPBS com NH4Cl) em RT conforme necessário de acordo com a tabela 1). Soluções warm para RT antes de usar no dia do experimento.
      Nota: iPBS e iPBS com 40mm NH4Cl pode ser preparado em grandes volumes (1 L ou mais) e armazenadas a 4 ° C.
    3. Preparar 8 soluções de calibração em volumes de 500 mL pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 e 9.0, conforme indicado na tabela 1 e em 4 ° C. Ajuste o pH de cada solução por titulação com N-metil-D-glucamine (NMDG) e HCl.
    4. No dia de experimentos, aquecer alíquotas de 5 mL das soluções de calibração para RT e adicionar solução de nigericin de estoque (20 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) para produzir uma concentração final de 10 µM.
      Atenção: Lidar com nigericin com luvas. Trate todos os equipamentos que entra em contato com nigericin como descartável. Nigericin permanece em vidro e plástico e comprometam preparações biológicas se o equipamento está sendo reutilizado.
  2. Sistema de perfusão:
    1. Encha o sistema de perfusão através do preenchimento de todos os reservatórios com O ddH2(Figura 2). Abra os canais, um de cada vez para permitir que todas as linhas proximal para o regulador de taxa de fluxo para preencher.
      Nota: Pode ser necessário limpar o ar nas linhas abrindo o canal paralisado e usando um êmbolo ao fluxo de movimentação do reservatório.
    2. Abra 2 canais e permitir o ddH2O drenar. Uma vez que os reservatórios estão quase vazios, encha o reservatório de primeiro com iPBS e o segundo reservatório com NH4Cl-pulsada iPBS. Definir a taxa de fluxo ao máximo com o regulador de taxa de fluxo e permitir que cada solução a fluir por 1 min preencher as linhas distais e, em seguida, interromper o fluxo (Figura 2).
    3. Posição 2 conjuntos de solda grampos "dando uma mãozinha" na cena de imagem do microscópio. Coloque um grampo em cada lado da plataforma de imagem.
    4. Aquecer cuidadosamente as 0,5 polegadas distais de um pedaço de vidro capilar (diâmetro interno de 1.5 mm, diâmetro externo 0,86 mm, comprimento 100mm) sobre um bico de Bunsen. Crie uma curva de 45 °, permitindo que a extremidade distal dobrar pela gravidade e remover o vidro da chama, uma vez atingido o ângulo desejado. Repita este processo com um segundo pedaço de vidro capilar.
    5. Inserir os capilares de vidro vergado no fluxo em linha e linha de saída conectado a vácuo, respectivamente e montá-los nas mãos de"ajudar" para alinhá-los com o estágio de imagem do microscópio (Figura 3).

Figure 2
Figura 2: Sistema de perfusão e configuração de imagem.
Componentes necessários para a avaliação fisiológica da função de transporte MT basolateral através de simultânea ao vivo troca de solução de imagem e rápida de fluorescência. Linhas de gás mostradas são opcionais e permitam a expansão de experiências para a avaliação do transporte HCO3 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama esquemático do fluxo de perfusão aparelhos para NH4Cl pulso experimentos.
As setas mostram caminho de fluxo e válvula de comutação pontos. Solução se move do reservatório a amostra por fluxo de gravidade e é desenhada da câmara de amostra para o balão de resíduos por sucção à vácuo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. dissecação de túbulos de Malpighi Anterior adulto drosófila .

  1. Recolher o prato de dissecação e puxei a vareta de vidro da seção 3, um slide PLL-revestido da secção 2, um adesivo divisor de perfusão-bem, vácuo graxa, uma 4 x 2" tira de filme de selagem, 2 pares de #5 finas fórceps e alíquotas de 40 mL do gelado Schneider médio e RT iPBS.
  2. Espalhe a graxa vácuo na fita da selagem e pressione o adesivo divisor de perfusão-bem para a fita para revestir o fundo com graxa. Descole o adesivo divisor de perfusão-bem e coloque graxa-lado-para baixo em cima de um slide revestido de PLL. Retire o divisor de perfusão-bem para deixar cada amostra poços traçados a graxa hidrofóbica.
  3. Lugar 200 µ l de iPBS de RT na graxa-cercado bem no slide revestido PLL e deslocar o carro sob o estereoscópio.
  4. Moscas UAS-pHerry/capaR-GAL4 lugar em um vazio voar frasco e anestesia no gelo por 10 min.
    Nota: Este método de anestesia, ao contrário de CO2, assegura que as moscas não desidratar.
  5. Despeje o prato de dissecação médio do Schneider gelada e use pinça fina para transferir uma única mosca feminina anestesiada para a placa sob um estereoscópio dissecação.
  6. Segure a mosca pelo tórax com um conjunto de pinças e usar o outro para segurar suavemente a parte posterior do abdômen. Abra a parte posterior da mosca usando a pinça, em suma, moções deliberadas. Uma vez que o intestino grosso é visível, segure a extremidade distal e libertar o intestino e MTs os subjacentes tracheoles puxando o intestino posterior, longe do corpo através de rebocadores repetitivos, breves.
    Nota: Os anteriores e posteriores MTs será visível onde se encontram com a junção do intestino grosso através do ureter e intestino. O primeiro par de MTs para ser livre arbítrio provável ser túbulos posteriores como eles cercam o intestino grosso. Estes podem ser ignorados (Figura 4A).
  7. Beliscar fora os anteriores MTs no ureter com pinça fina uma vez que o segundo conjunto de MTs é livre do abdômen. Isto irá separar os MTs anteriores do intestino e fechar o ureter.
  8. Pega os MTs livre anteriores com a vareta de vidro puxado deslizando a haste sob o ureter, tal que os túbulos cair para o outro lado. Levante os MTs em linha reta fora da solução.
  9. Transformar a vareta de vidro, tal que o MTs e ureter são respeitados na parte inferior da haste e descer o ureter diretamente para o slide. Apor o ureter e selar as extremidades distais dos MTs pressionando o ureter baixo a lâmina de vidro (Figura 4B). Não manipule os MTs mais que o necessário. As MTs devem ser flutuar na solução com o ureter ancorado no slide.
  10. Use bem final da haste de vidro para varrer suavemente cada túbulo através da superfície do slide. Segure a vara contra o slide para evitar o esmagamento do túbulo e deslize a haste no topo do túbulo, movendo-se distal para proximal, para anexar o comprimento total de cada túbulo à superfície do slide PLL-revestido (Figura 4).
  11. Coloque o adesivo divisor de perfusão-bem novamente no slide para formar um pequeno cheio de líquido ao longo do túbulo montado.
  12. Coloque a amostra no palco microscópio. Posicione o influxo e capilares de saída sobre a entrada e a abertura de saída da perfusão bem, respectivamente.
    Nota: O divisor bem pode ser deixado se uma câmara aberta perfusão é desejada. Neste caso, os capilares de entrada e saída podem ser alinhados para lados opostos de uma imagem bem.

6. validação de imagem protocolo e túbulo saúde

Nota: Este protocolo é realizado em um microscópio de epifluorescente invertido de campo amplo com GFP (SEpH) e conjuntos de filtros RFP (mCherry) (excitação de 470/40 nm (ex), emissão de longpass 515 nm (em), 500 nm nm dicroicas e 546/10 ex em de longpass 590 nm, 565 nm dicroicas), um 10 X / 0.45 ar objetivo, uma câmera monocromática para captura de imagem ao vivo e software de imagem. O protocolo pode ser adaptado para qualquer posição vertical ou microscópio invertido com filtro automático comutação entre as boas práticas agrícolas e RFP óptica e imagem software de aquisição, embora as parâmetros, intensidade de luz e tempos de exposição ideal variará. Em todas as análises, a intensidade de fluorescência deve ser analisada como a intensidade do pixel média na região de interesse (ROI), após subtração do fundo em cada canal usando um ROI com não contém nenhuma fluorescência adjacente ao sinal ROI.

  1. Ligue o microscópio, fonte de luz e sistema de imagem.
  2. Software aberto de imagem associado.
  3. Olhe através da ocular e ajustar o foco manualmente até o lúmen do MT é claramente visível sob luz transmitida.
  4. Clique na opção "Aquisição" no software de análise de imagem e selecione "2 x 2" no menu suspenso "Binning" na seção "Modo de aquisição".
  5. Inserir um filtro de densidade neutra de 5% para o caminho de luz para reduzir a luz de iluminação e minimizar fotobranqueamento.
  6. Clique no canal GFP (SEpH) no menu "Canais" e, em seguida, clique em "Live" para observar o sinal fluorescente através da câmera.
  7. Ajuste o controle deslizante "Tempo" para definir o tempo de exposição, tais que os valores de pixel mais brilhantes no histograma intensidade são cerca de 40% do valor máximo e, em seguida, clique em "Stop" para parar a iluminação.
  8. Repita etapas 6.6-6,7 no RFP (mCherry) canal e confirmam a presença do segmento inicial dilatada de MT a anterior e a ausência de mCherry citosólica agrega (indicativa de dano tecidual ou superexpressão) (Figura 4).
    Nota: O segmento dilatado deve ser evidente, como é o segmento mais proximal do túbulo e o diâmetro do lúmen interno deste segmento é maior do que a do segmento adjacente transitório de ~ 20 µm. 2 x 2 pixel binning, muitas vezes é suficiente, mas pode ser aumentado para reduzir a intensidade de iluminação exigida. Tempos de exposição típicas são entre 150 e 800 ms/canal. Use como pouca luz possível para minimizar o fotobranqueamento. Minimizar o fotobranqueamento é vital para a utilização de indicadores de dual-fluoróforo como pHerry como os dois fluorophores pode descorar independentemente, invalidando assim qualquer calibração de relação.
  9. Habilite um lapso de tempo protocolo de imagem clicando na caixa de seleção "Séries temporais".
  10. Ajuste a "duração" no menu suspenso na seção "Séries temporais" para 10 min e o slider de "Intervalo" de 0 para definir o tempo de captura total com uma taxa de aquisição de imagem máxima. Uma taxa de aquisição total de 0,2 Hz é muitas vezes suficiente.
  11. Verifique a GFP (SEpH) e caixas RFP (mCherry) na seção de "Canais".
  12. Abra a linha de iPBS do sistema de perfusão ativando o controlador de válvula apropriada e iniciar o protocolo de imagem clicando em "Iniciar experiência." Depois de 1 min, alterne para NH4Cl solução de pulso por 20 s abrindo a válvula apropriada e fechando a linha iPBS, em seguida, retornar para iPBS fechando o NH4Cl linha e reabrindo a válvula iPBS. Permitir que o protocolo de imagem completo completar antes de interromper o sistema de perfusão.
    Nota: Análise de lapso de tempo deve revelar um sinal mCherry estável e um sinal de SEpH que aumenta na presença de NH4Cl, sacia com esmaecimento e recupera gradualmente.
  13. Realize uma calibração de 2 pontos.
    1. Retire o divisor bem descascando-lo longe do slide subjacente e retire a imagem bem os grampos e capilares de perfusão.
    2. Aplica a imagem bem com uma pipeta de 200 µ l 200 µ l calibração iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin). Remover a solução da imagem bem com a pipeta e, em seguida, substitua por outro 200 µ l de solução de calibração. Repita este processo 4 vezes para garantir a troca da solução completa.
    3. Incube a preparação em solução de calibração para 30 min antes de imagem. Repito o protocolo de imagem usando os mesmos parâmetros determinados nas etapas 6.6-6.11, com a modificação de apenas 1 min da imagem de captura.
      Nota: O sistema de perfusão e capilares não são necessários nesta etapa e não deve ser ligados à imagem bem para evitar expor os capilares para nigericin.
    4. Adicione 200 µ l calibração iPBS (pH 9.0, 10 nigericin µM) para a imagem bem com uma pipeta de 200 µ l. Remover a solução da imagem bem com a pipeta e, em seguida, substitua por outro 200 µ l de solução de calibração. Repita este processo 4 vezes para garantir a troca da solução completa.
    5. Incube a preparação da solução de calibração segundo por 10 min antes de imagem. Repeti o protocolo de imagem como na etapa 6.13.3.
    6. Examine a pilha de imagem capturada em software de análise de imagem para confirmar que nenhum pixel em qualquer canal é saturada clicando em "Significa ROI" e rolagem embora a pilha de imagem com o controle deslizante "Frame", observando que não há valores relatados no histograma intensidade atingir o valor máximo detectável. Se quaisquer quadros contêm pixels que atingem a intensidade máxima detectável, reduza a intensidade de tempo ou iluminação de exposição e repetição seção 6.
      Nota: Uma vez estabelecida não altere parâmetros de imagem entre experiências ou calibração a menos ponto calibrações devem ser usados em cada preparação (ver passo 8.3).
  14. Analise a pilha de imagem para plotar a intensidade fluorescente e relação de fluorescência (SEpH/mCherry) em função do tempo.
    1. Clique em "Quer dizer ROI" e selecione a ferramenta de forma livre. Segure o botão esquerdo do mouse para rastrear um ~ 50 µm Comprimento do Mt. Clique com o botão direito para terminar o ROI de desenho e, em seguida, repita em uma área adjacente a MT para definir um fundo ROI (Figura 5A).
    2. Clique em "Intensidade significa" sob "Medições". Criar uma tabela de valores de intensidade, clicando em "Exportar > tabela de dados > criar."
    3. Clique no ícone de roda dentada de configuração e desmarcar todos os parâmetros, exceto o "Tempo" e "Significa intensidade." Guia para a tabela de dados recém-criado com o botão direito, selecione "Salvar como" e exportar os dados como um arquivo. csv.
      Nota: As medições semelhantes também podem ser feitas usando o software livre como o ImageJ.
    4. Abrir uma tabela de planilha e importar a tabela de dados selecionando a aba "Dados" seguida por "De texto".
    5. Use funções na planilha para subtrair a intensidade de fundo SEpH de intensidade de sinal o SEpH em cada ponto de tempo. Repita este processo para o sinal de mCherry.
    6. Plotar cada intensidade do canal em função do tempo, selecionando as colunas contendo o tempo e dados de intensidade de correção de fundo e em seguida, clicando em "Inserir > Scatter (gráficos) > dispersão com linhas retas" (Figura 5B).
    7. Use funções de planilha para calcular a proporção de fluorescência SEpH/mCherry em cada ponto de tempo.
    8. Relação de fluorescência trama em função do tempo, selecionando as colunas que contêm os dados de tempo e proporção e em seguida, clicando em "Inserir > Scatter (gráficos) > dispersão com linhas retas" (Figura 5).

7. completa calibração de pHerry em túbulos de Malpighi Ex Vivo.

  1. Dissecar e montar um novo conjunto de MTs anteriores, conforme descrito na seção 5.
  2. Trocar iPBS para calibração iPBS (pH 7,4, nigericin de 10 µM), conforme descrito na etapa 6.13.2. Incube durante 30 min.
  3. Localize os MTs e coletar os pares de imagens SEpH/mCherry conforme descrito nas etapas 6.1-6.11. Substitua a solução com outro estoque de calibração iPBS conforme descrito na etapa 6.13.4, esperar 10 min e a imagem novamente. Repita este processo até que a proporção de SEpH/mCherry tem sido fotografada em todas as soluções. Obter pH 9,0 imagens última como o espécime raramente se recupera de pH elevado.
  4. Plotar rácio de fluorescência de SEpH para mCherry de calibrações em oito amostras em função do pH impostaeu conforme descrito na etapa 6.14.9. Ajuste os dados de calibração com uma curva de Boltzmann para obter a função de calibração completa de acordo com a equação 1 (Figura 5). Se dados são inconsistentes, plotar conjuntos de calibração de cada amostra normalizada de tal forma que uma relação de fluorescência de 1.0 corresponde ao pHi 7.0 e re-analisar (Figura 5E).
    Nota: Se o último processo é necessário experiências individuais terá seu próprio ponto interno calibrações33 (ver procedimento de quantificação abaixo (etapa 8.3)).
  5. Equação 1
    Equation 1
    Onde R = relação SEpH/mCherry e um1,2, xóe dx é curva encaixe parâmetros que representam a proporção mínima de fluorescência, fluorescência máxima relação, pKume largura da função respectivamente. xo = aparente pKum de pHerry, que pode variar entre 7.1 e 7.4 dependendo do tipo de célula e as condições de calibração exata.

8. quantificação de ácido Basolateral extrusão do epitélio do túbulo de Malpighi Ex Vivo .

  1. Células estreladas pHerry-expressando de imagem e diretor pHerry-expressando células simultaneamente.
    1. Dissecar MTs anteriores de uma mosca UAS-pHerry/capaR-GAL4 , conforme descrito na seção 5, mas não a transferência MTs de meio a dissecação Schneider para a geração de imagens bem.
    2. Disse MTs anteriores de uma mosca UAS-pHerry/c724-GAL4 no mesmo prato dissecação usando o procedimento descrito na seção 5.
    3. Transferi os 2 conjuntos de MTs para a mesma imagem bem como descrito nos passos 5.8-5.11.
      Nota: Quando varrendo os braços das MTs até o slide, coloque os MTs da UAS-pHerry/c724-GAL4 e túbulos UAS-pHerry/capaR-GAL4 perto uns dos outros por células estreladas e principais pHerry-expressando podem ser visualizadas no mesmo campo ( Figura 6A).
  2. Aplica o NH4Cl prepulse conforme descrito na etapa 6.12.
    Nota: Se não será possível calibração consistente (Figura 4B), realizar uma calibração de ponto definindo pHi para 7,0 ao final de cada experimento com calibração iPBS (pH 7.0, 10 µM nigericin, incubação de 30 min) após o adesivo divisor de perfusão-bem e o equipamento de perfusão foram removidos.
  3. Calibrar os traços de células estreladas e principais dos diferentes segmentos de MT (usando a proporção absoluta ou normalizada conforme apropriado) com a equação 2 e analisar a fase de recuperação depois de NH4Cl retirada aplicando as funções de decaimento exponencial usando software de análise estatística e salientando a constante de decaimento (τ) (Figura 6B).
    Equação 2
    Equation 2
    Onde R = relação SEpH/mCherry e um1,2, xóe dx é curva encaixe parâmetros determinados pela calibração na etapa 7.4 (equação 1).
    1. Calcule a taxa de ácido extrusão (JH +, ver equação 3) em função do pHeu para dar conta das variações de pHeu e ácido carregando entre preparações34a descansar. Use as funções exponenciais derivadas na etapa 8.3 para calcular a derivada de pHeu em relação ao tempo em cada intervalo de tempo.
      Equação 3
      Equation 3
    2. Calcular a capacidade intrínseca de buffer (βi; Equação 4) do citosol para o pH, desde o início de cada intervalo na etapa 8.3.1 baseada na literatura anterior (ver equação 4).
      Nota: Em Drosophila, a mais completa caracterização de β, vem do nervo motor larval terminais35 e estes dados podem-se supor para segurar por células de MT na ausência de outros dados disponíveis.
      Equação 4
      Equation 4
    3. Calcule o produto de βT (da etapa 8.3.2)e dpHeu/DT. (da etapa 8.3.1) para determinar JH + (equação 3).
      Nota: Em soluções de bicarbonato nominalmente livre como os descritos no presente protocolo, capacidade tampão bicarbonato-derivado (βb) presume-se ser ~ 0 mM. Capacidade (βT) tampão de total é a soma de βeu eβbe, portanto, βeu = βT na ausência de HCO3/CO236.
    4. Plot JH + em função do pH no início de cada intervalo de tempo, conforme descrito na etapa 6.14.9.
    5. Aplica funções de decaimento exponencial para a parte de todos os conjuntos de dados que se sobrepõem no pHeu usando software de análise estatística. Compare taxas de alteração das funções resultantes para comparar taxas de extrusão ácido entre células e segmentos MT (Figura 6).
      Nota: A função mais adequada utilizada para o encaixe de curva não pode sempre ser um único exponencial. Outras funções podem ser substituídas se elas melhoram a bondade de ajuste.
    6. Calcular o ácido flux (ver equação 5), em função do pHeu para dar conta das variações de forma e tamanho da célula.
      Equação 5
      Equation 5
      Nota: Dimensões da célula podem ser medidos diretamente em imagens ou aproximados. Células principais podem ser representadas como as metades de um tubo oco, com as seguintes dimensões: diâmetro interno 24 µm; diâmetro exterior 48 µm; altura 50 µm. transitório células estreladas são variáveis, mas podem ser representadas aproximadamente como cilindros com diâmetros de 10 µm e alturas de 50 µm. Ver o parágrafo final do Representante resultados abaixo.
    7. Aplica funções de decaimento exponencial para a parte de todos os conjuntos de dados que se sobrepõem no pHeu usando software de análise estatística. Compare taxas de alteração das funções resultantes para comparar ácidos fluxos entre células e segmentos MT (Figura 6).

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Representative Results

Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como isto irá danificar a camada epitelial de célula única (Figura 4). Devidamente dissecado MTs anteriores mostrará a distribuição uniforme de fluorescência vermelha e verde, através do citosol das células epiteliais e túbulo morfologicamente distintos segmentos. Túbulos danificado por perfusão inadequada ou maltrato exibirá agregação de fluorescência vermelha com nenhum agregados verdes emparelhados e erroneamente identificados MTs posteriores mostrará uniforme morfologia da extremidade proximal do cega para o ureter distal (Figura 4) . 

Funcionamento do pHerry deve ser confirmado avaliação embora fisiológica, bem como a morfologia. O método mais conveniente de confirmar a detecção adequada de pH é aplicar um NH4Cl pulso. Nestas condições o SEpH verde sinal deve relatar as alterações de pH esperado (um aumento no pHeu durante o pulso como NH3 entra na célula, um declínio gradual durante o pulso como NH4+ entra através de transportadores de K+ e canais e uma rápida acidificação e recuperação gradual sobre NH4Cl retirada21, enquanto o sinal vermelho mCherry deve permanecer constante (Figura 5A B). A magnitude das mudanças no sinal de SEpH irá variar de acordo com o protocolo e tipo de célula, mas o sinal de mCherry deve ser estável em todos os casos. Mudanças no sinal de mCherry durante as experiências individuais indicam artefatos de movimento ou geração progressiva dos agregados de sensor devido a danos nas células. O último impedirá a quantificação de pHeu e deve ser evitado. Ao completar o NH4Cl pulso é importante realizar uma calibração de 2 pontos (calibração iPBS, pH 7,4 e 9.0, 10 µM nigericin) para confirmar um descanso pHeu perto de 7,4 e certifique-se de que os parâmetros de imagem atuais não conduzem à saturação de deteção de fluorescência quando fluorescência é maximizada em pH 9.0 (Figura 5). Se descansar o pH é significativamente inferior a 7,4, o protocolo deve ser repetido com MTs saudáveis; e se a saturação ocorre em pH 9.0, o protocolo deve ser repetido com menor tempo de intensidade ou por exposição a luz. Uma vez que são determinados parâmetros de imagem adequados, eles não devem ser alterados entre experiências ou calibrações se os rácios de fluorescência absoluto deve ser usado. Enquanto a natureza de pseudo-ratiometric de pHerry pode fornecer um método de correção de movimento em preparações propensas à circulação ou alterações no diâmetro da célula, a quantificação absoluta de pH requer correlação completa sistemática da pHerry SEpH / mCherry relação a pHeu através da técnica de K+ nigericin/alto. A calibração de pHerry em preparações saudáveis deve produzir as curvas de calibração consistente com uma aparente pKum de 7.1-7.4, dependendo das condições de calibração e tipo de célula (Figura 5). Para as preparações em que mCherry a agregação é inevitável, a normalização dos valores de proporção tal que uma proporção de fluorescência de 1.0 corresponde ao pHeu 7.0 deve produzir resultados semelhantes (Figura 5E). Se ponto calibrações e curvas normalizadas são utilizadas, parâmetros de imagem pode ser otimizado para cada preparação. 

PH calibrado traços podem ser usados para comparar o mecanismo regulatório de pH entre tipos de células. O sistema de expressão GAL4/UAS em Drosophila pode ser usado para expressar pHerry em células principais e células estreladas de MT anterior (figura 6A). Regulamento pH pode ser avaliado pelo carregamento de ácido células com NH4Cl pulsos e quantificar o índice de pHeu recuperação. Isso pode ser feito por encaixe funções exponenciais para a fase de recuperação em diferentes condições experimentais para extrair a constante de decaimento (τ) como células com mais rápido efluxo de H+ irão exibir uma recuperação mais rápida (e assim mais baixos valores de τ). Com base nesta análise, células estreladas de MT parecem ter extrusão ácida mais robusta do que as células principais (Figura 6B). Esta análise irá realizar, enquanto o descanso pHeu, extensão da carga ácida e capacidade tampão são semelhantes entre os grupos experimentais. No entanto, quando essas condições não forem atendidas, é necessário dar conta da observação que intrínseca capacidade tampão do citosol (βi) de muitas células é próprio dependente do pH35,37,38 e, assim, a taxa de pH mudança no pH diferentesi não pode ser diretamente comparável. Em tais casos, as curvas exponenciais cabem à seguinte fase de extrusão ácido um NH4Cl pulso e previamente determinadas estimativas de capacidade de armazenamento em buffer intrínseca (βi) podem ser usadas para plotar a taxa de ácido extrusão (JH +) como uma função de pHeu e determinar a taxa de compensado de extrusão ácida (equações 3 & 4). Uma vez que as diferenças em ácido carregando e descansando pHeu são contabilizadas para, é evidente extrusão ácido nas células principais do segmento de transição superior ao de células estreladas (Figura 6). Ao mesmo tempo atraente, esta análise não aborda isso medido pH é uma função do volume, enquanto ácido extrusão através da membrana plasmática é uma função da área de superfície da membrana. Dividir JH + por área de superfície à relação do volume da célula de interesse irá produzir valores em moles de ácido equivalente por unidade de área superficial por unidade de tempo (equação 5), permitindo assim a correção para as diferenças no tamanho da célula e morfologia. Cerca de duas células principais compõem a circunferência de MT nos segmentos de transição e, portanto, células únicas podem ser modeladas como metade de um tubo (diâmetro interno 24 µm; 48 µm de diâmetro exterior; altura 50 µm). Células estreladas são menores e tendem a ser em forma de barra no segmento de transição do MT2. Quantificação exata da área de superfície e volume é difícil, mas ainda conservadoras aproximações de forma células estreladas transicionais (cilindro com uma altura de 50 µm e um diâmetro de 10 µm) indicam uma área de superfície à relação do volume pelo menos 2 x que das células principais. Tendo em conta este revela que o fluxo de ácido células estreladas é significativamente inferior das células principais transitórias e na verdade se aproxima de células principais do segmento inicial (Figura 6).

Figure 4
Figura 4: Dissecação de túbulos de Malpighi Anterior adulto drosófila .
A. representação esquemática da remoção anterior de MT com 2 pares de pinças bem no meio do Schneider refrigerados. "R. túbulo" = Anterior Mt. "P. túbulo" = posterior Mt. B. Processo de recuperação e montagem MTs extraídos usando varas de vidro fino. C. processo de aderir a todo o comprimento da extraídos MTs para um slide para avaliação fisiológica e de imagem. D. representante widefield imagens do SEpH (470/510 nm ex / em) e mCherry (556/630 nm ex / em) componentes de UAS-pHerry impulsionado por capaR-GAL4 retratando saudável anterior MTs, MTs anteriores danificado por perfusão insuficiente, e identificados incorretamente posterior mts. nota que o saudáveis MTs anteriores exibem um claro dilatado cego segmento inicial, um segmento de transição constringido com expressão relativamente aumentada de UAS-pHerry quando impulsionado por capaR-GAL4e uma principal distal segmento. Danificado MTs visor perceptíveis agregados de fluorescência mCherry com nenhuma fluorescência SEpH correspondente. MTs posteriores são uniformes em diâmetro com nenhum morfologicamente distintos segmentos. Barra de escala = 50 µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Validação e calibração de pHerry em túbulos de Malpighi.
A. representante widefield imagens do SEpH (470/510 nm ex / em) e mCherry (556/630 nm ex / em) componentes de UAS-pHerry impulsionado por capaR-GAL4 retratando mts. anterior saudável "ROI" marcas de sinal a região de interesse. "BG" marcas fundo região de interesse que posteriormente foi subtraído o ROI de sinal no mesmo canal. Barra de escala = 50 µm. B. Alterações de fluorescência relativo em sinais de pHerry em resposta a um 20 s 40mm NH4Cl pulso SEpH e mCherry. Note que o sinal mCherry é estável, enquanto o sinal SEpH exibe um aumento característico durante o pulso (indicativo de alcalinização, ou seja, aumentou pHeu) e uma diminuição acentuada em cima de esmaecimento (indicativo de acidificação, ou seja, pHeudiminuiu). C. razão de fluorescência de pHerry (SEpH/mCherry) calculada a partir dados em B com dados adicionais após incubação 30 min em calibração iPBS (10 µM nigericin, 130 mM K+, pH 7,4 e 9.0). D. curva de calibração construída a partir de relação pHerry absoluto (SEpH / mCherry) como uma função do pHeu impostas durante a exposição para calibração iPBS em buffer para um dos oito valores de pH. Círculos cinzento são preparados de forma 8 valores individuais. Quadrados pretos e as barras são mau ±SD... curva é ajuste de Boltzmann. E. dados mesmos como D normalizados tais essa proporção de fluorescência em pH 7,0 é 1.0. Curva é modificada curva sigmoidal (consulte a etapa 7.4, equação 1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Quantificação de ácido extrusão no epitélio do túbulo de Malpighi.
A. Widefield imagem de fluorescência SEpH (de pHerry) nas células principais de MT a anterior (à esquerda, conduzido pelo motorista capaR-GAL4 ) e células estreladas de MT a anterior (bem, conduzido por c724-GAL4). Observe que células estreladas são em forma de barra no segmento inicial, variável no segmento de transição e exibir projeções celulares distintas no segmento principal. Barra de escala = 100 µm. B. Calibrado mudanças de pH em resposta a um 20 s 40mm NH4Cl pulso nas regiões de interesse indicado em um (células principais do segmento transitório, células principais do segmento inicial e células estreladas do segmento transitório). Curvas tracejadas denotam única se encaixa exponencial aplicado para a fase de recuperação de ácido após NH4Cl retirada da qual derivam-se declarado deterioração constante (τ) valores. C. taxa de extrusão ácido (JH +) plotada como uma função pHi derivado a exponencial se encaixa na B. Consulte a etapa 8.3.1 JH + cálculo (equação 3). Curvas tracejadas são ajustes exponenciais aplicados a cada parcela de dados dentro da área de sobreposição de pHeu denotado pela caixa cinza. D. fluxo ácido plotado como uma função pHi derivado a exponencial se encaixa em B e a equação 5. Curvas tracejadas são ajustes exponenciais aplicados a cada parcela de dados dentro da área de sobreposição de pHeu denotado pela caixa cinza. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

iPBS NH4Cl pulso iPBS IPBS de calibração
NaCl 121,5 81,5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
Glicose 20 20 20
Buffer de HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES ou torneiras; 8.6
NaHCO3 10,24 10,24 0
NaH2PO4 (1h2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30.5
pH 6.8 6.8 Varia
Osmolaridade ± 5 350 ± 5 350 ± 5 350

Tabela 1: Soluções experimentais de voar.
iPBS soluções são preparadas à temperatura e pH é definido pela titulação com HCl e NaOH. Solução de calibração é titulada com HCl e NMDG. Tampão da solução de calibração é variada, com base no pH desejado [2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico (MES) para pH = 4.0-6.0; 4-ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) para pH = 6,5-7,5; N-[tris (hidroximetil) metil] -3-aminopropanesulfonic ácido (torneiras) para pH = 8.0-9.0]. Todos os valores em mM, exceto o pH (unitless) e osmolaridade (mmol/kg). Nigericin ações em DMSO é adicionado a soluções de calibração para uma concentração final de 10 µM imediatamente antes da utilização.

GEpHI Excitação (nm) Emissão (nm) pKum Notas
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 Grande escala linear, grande dobra (50 x) aumento na fluorescência sensíveis ao pH gama linear
Pt GFP42 390, 475 540 7.3 Validados para uso em células vegetais
Superecliptic pHluorin - mCherry fusão31 488, 556 530, 620 7.2 Produz mCherry desirmanada agregados em algumas células
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6.8 pH e Cl sensor. Atualizado ClopHensorN30 varient mostra menos agregação nos neurônios
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 Fusão de SEpH-mCherry atualizado com vinculador de ClopHensor
mNectarine44 558 578 6,9 Correção para fotobranqueamento é muitas vezes necessária
pHluorin245 395, 475 509 6,9 Variante de Ratiometric pHluorin12
PQV47 440, 585 610 7,8 Varient atualizado de long-Stokes turno mKeima49, compatível com a imagem de FLIM NIR 2-fóton
pHuji43 566 598 7.7 Variante do mApple; inferior a sensibilidade de pH esperado em algumas células
pHtomato46 550 580 7,8 Validado para rastrear endocitose vesicular, sensibilidade de pH cytocolic pobre
pHoran443 547 561 7.5 Proteína fluorescente laranja reforçada de sensíveis ao pH
SypHer-248 427, 504 525 8.1 Variante mais brilhante do ratiometric SypHer51, originalmente para medições mitocondriais

Tabela 2: Lista de GEpHIs citosólica publicado
Maxima de excitação, máximos de emissão e aparente pKum valores são aproximados e podem variar dependendo do sistema de expressão, técnica de imagem e método de calibração. FLIM = vida de fluorescência, microscopia de imagem. NIR = perto de infravermelho.

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Discussion

O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificação de segmentos distintos de MT (Figura D). MTs saudáveis facilitam a calibração de pHerry e avaliação funcional, reduzindo a agregação de mCherry e rendendo muito mais consistente quantificação de ácido extrusão, respectivamente. Em alguns casos, evitando a agregação de mCherry não é possível pois as condições experimentais inerentemente podem danificar epitélios MT ou produzir significativa sobre-expressão do repórter fluorescente. Nesses casos, uma calibração de pseudo-ratiometric normalizados tais que a proporção de fluorescência 1.0 corresponde ao pHeu 7.0 e calibrações de ponto permite quantificação (Figura E). Tenha cuidado quando executar calibrações de ponto para evitar expor os elementos permanentes dos sistemas de imagem e perfusão para nigericin como o ionóforo aderir ao vidro e plástico. Calibração de pseudo-ratiometric mesmo não é possível para as circunstâncias em que uma manipulação experimental induz dano celular durante um experimento, ou seja, este dano causará um progressivo aparente aumento na fluorescência mCherry durante todo o experimento. Nestes casos mais tarde, o sinal de fluorescência SEpH pode ser usado com uma curva de calibração normalizado e aponte calibrações, com a ressalva de que a imagem já não corrigirá para artefatos de movimento e turnos focais.

GEpHIs carregar várias limitações gerais quando comparado a quantificação de pHeu com corantes fluorescentes. Retenção de tintura pode ser usada como um indicador da membrana integridade e célula saúde39, mas nenhum ensaio equivalente está disponível para uso GEpHIs. Como tal, a saúde de preparação deve ser monitorada através de meios independentes se danos celulares é previsível para confundir os resultados. GEpHIs potencialmente permitir imagens de preparações minimamente incomodado na vivo mas integridade tecido inerentemente limita manipulações experimentais e pode fazer ponto impossível de calibrações. Outra limitação específica inerente usando pHerry e outros indicadores de pH citosólico fluoróforo dual (tais como ClopHensor40) deriva da tendência dos dois fluorophores para alterar sua fluorescência independentemente um do outro e pHeu . RFP agregação artefatos são a manifestação mais significativa desta limitação, mas a quantificação também pode ser comprometida por fotobranqueamento de um ou ambos os fluorophores. Assim, imagem protocolos muito ser ajustado para minimizar fotobranqueamento, que pode levar a longos tempos de exposição e taxas de aquisição < 0.2 Hz. Long de tempos de exposição falhará ao relatório pH rápida desloca. SEpH fluorescência mostra a correlação linear de pHeu de pH 6,8-7,8 na maioria das preparações, mas a precisão de tais medições depende da precisão da técnica K+ nigericin/alto. Nigericin atua como um ionóforo /H K++ e calibração adequada depende desenroscada extracelular [K+] com intracelular [K+]. Estimativas de intracelular [K+] não estão disponíveis ou prontamente obteníveis para todos os sistemas experimentais. Precisão de quantificação pHeu só será tão confiável quanto estimativas de intracelular [K+], apesar de taxas de mudança relativa no pH será consistentes. Dada esta limitação e a relação inversa logarítmica de pH a intracelular [H+], é sempre preferível para reportar dados como taxas de variação no pHeu, taxa de extrusão ácido (JH +, Figura 6), ou fluxo de ácido (Figura 6), em vez de absolutas mudanças no pH eeu. Análise de dados como fluxo ácido tem o benefício adicionado de corrigir diferenças na superfície são a relação de volume entre tipos de células.

Várias advertências devem ser apreciadas quando dados interpretação do adulto voam preparação MT descrita neste protocolo. A distinção morfológica dos principais segmentos e inicial, transitório, é provável que uma simplificação da verdadeira diversidade de domínios funcionais e genéticas presentes no MTs2. Além disso, enquanto este protocolo é projetado para detectar a função de ácido transportadores basolateral é possível que o transporte apical pode influenciar medições de pHi também. Selar os ureteres quando montar os MTs (etapa 5.9) garante essa troca de solução principalmente ocorre na superfície basolateral mas movimento pará-celular e apical de íons ainda pode influenciar o pHi como transporte basolateral, finalmente, altera o lado citoplasmático do lúmen/citosólica gradientes de íons. Separação absoluta de apical e basolateral função pode ser realizada de forma independente perfusing o luminal e basolateral superfícies de MT, mas tais métodos são substancialmente mais tecnicamente exigentes que requerem cateterização da micropipeta41 .

GEpHIs apresentam muitas vantagens sobre os métodos convencionais de medição de pH, e estas forças são amplificadas quando combinada com a maleabilidade de genética e de baixo custo da drosófila MT preparação. Quantificação de pH historicamente confiou corantes fluorescentes, tais como 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 (ou complicada avaliação eletrofisiológica através de eletrodos íon-seletivos20 ,21. Como pHerry é codificada geneticamente, que pode ser expressa em populações celulares específicas pelos promotores específicos (como demonstrado aqui em células principais e células estreladas de MT, Figura 6) e é passível de uso em qualquer tecido sujeitas a transgênese, transfecção, ou infecção viral mediada. Corantes são limitados pelo custo das preparações individuais e protocolos de aplicação potencialmente complicada que não transmitem nenhuma especificidade celular em tecidos heterogêneos. Eletrodos íon-seletivos exigem equipamentos especializados para fabricação e medição, enquanto pHerry requer apenas widefield epifluorescente microscopia com convencional GFP e RFP filtro de moda. Uso de corantes e eletrodos exigem física bem como acesso óptico no tecido de interesse enquanto GEpHIs podem ser monitorados em tecidos recém-extraídos e ao longo do tempo na vivo. A oportunidade para geração de imagens ao vivo em preparações intactas é de particular interesse quando avaliar a fisiologia celular de pH regulamento como nenhuma outra tecnologia permite a quantificação de pH na presença de buferização endógena mecanismos.

A preparação de MT adulta Drosophila apresenta muitas características atraentes para aqueles interessados em transporte de regulamento e íon do pH celular. Criação de Drosophila é barata e ferramentas tais como construções de biosensor geneticamente codificado e inserções de expressão de RNAi estão prontamente disponíveis de uma variedade de centros de estoque (Bloomington Drosophila Stock Center na Universidade de Indiana; Viena Drosophila Research Center). Drosófila MTs são compostos por uma única camada de células epiteliais polarizadas, tornando-os ideais para investigação de transepitelial transporte de íons. Basolateral transporte pode ser facilmente analisada (como demonstrado aqui) mas uma avaliação completa de apical e basolateral íon movimento é possível com micropipeta canulação41. Além disso, a função de órgão ensaios como a secreção de Ramsay ensaio17 e a deposição de luminal de oxalato de cálcio18 são bem caracterizadas e permitam a correlação de fisiologia celular epitelial para modelos de secreção de fluidos e nefrolitíase, respectivamente. Enquanto esses recursos oferecem oportunidades para análise robusta, a baixo custo e ampla disponibilidade de microscopia epifluorescente torna o modelo Drosophila MT ideal para demonstrações de fisiologia celular e todo-órgão em laboratórios de ensino.

Domínio desses métodos permite a quantificação do Regulamento pHeu por basolateral H+ de fluxo em adultos MTs de Drosophila , uma acessíveis ainda robusto modelo do íon transepitelial de transporte. Uso de GEpHIs como pHerry pode ser facilmente adaptado para avaliar o Regulamento dei pH em outros tipos de células de invertebrados, cultivado pilhas mamíferas e preparações na vivo . Desenvolvimento de novos GEpHIs provavelmente seguirá o de indicadores de cálcio geneticamente codificado, com novas gerações abrangem o espectro visível e endereçamento atuais limitações como agregação artefatos30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs já foram usadas extensivamente para relatar a matriz mitocondrial pH50,51, e estratégias de segmentação subcellular existem para localizar biosensores para retículo endoplasmático52, núcleo 53, vesículas sinápticas12,,43e a superfície externa da membrana de plasma celular55 citoplasmática54 (ver tabela 2 para obter uma lista de reagentes publicados). Como tais ferramentas disponibilizadas eles permitirá integração vertical do Regulamento sub celular pH com outros aspectos da fisiologia celular, tais como manipulação de Ca2 + e sinalização intracelular e a função do órgão inteiro através de uma variedade de vertebrados e preparações de invertebrados.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH DK092408 e DK100227 de Mfr. AJR foi apoiado por T32-DK007013. Os autores desejam agradecer Dr. Julian A.T. Dow de CapaR-GAL4 e c724-GAL4 estoques de Drosophila . Agradecemos também o Jacob B. Anderson para obter assistência manutenção cruzamentos experimentais de voar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

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Bioquímica edição 126 transporte de íons pH intracelular epitélios túbulos de Malpighi drosófila repórter fluorescente indicador de pH geneticamente codificado regulamento de pH imagens ao vivo pHerry
PH intracelular de quantificação de óptica em <em>Drosophila melanogaster </em>túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado
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Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

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