Summary
طريقة لتحضير خلايا الحشرات والعدوى لهم الفيروسة العصوية للغرض من إنتاج المؤتلف proteinand mCD1d توليد tetramers mCD1d.
Abstract
CD1 البروتينات تشكل الطبقة الثالثة من مستضد تقديم الجزيئات. هم جليكوبروتينات سطح الخلية ، كما عبر عنها سلاسل الثقيلة حوالي 50 كيلو دالتون الغليكوزيلاتي التي ترتبط مع noncovalently المكروغلوبولين beta2 -. انهم ربط الدهون بدلا من الببتيدات. على الرغم من بنيتها يؤكد تشابه البروتينات CD1 MHC إلى الصف الأول والجزيئات الدرجة الثانية تقديم المستضد ، الأخدود mCD1d ضيقة نسبيا ، وعميقة ، ومسعور جدا وفقد اثنين من جيوب ملزم بدلا من جيوب الضحلة الموصوفة لعدة الكلاسيكية MHC - ترميز مستضد تقديم الجزيئات. بناء على تسلسل هذه الأحماض الأمينية ، وهذا الأخدود hydrobphobic يوفر بيئة مثالية لربط مستضدات الدهون.
من الطبيعي القاتل T (NKT) استخدام الخلايا TCR على الاعتراف glycolipids ملزمة أو قدمها CD1d. وقد شاركت الخلايا التائية المتفاعلة إلى الدهون التي قدمها CD1 في الحماية ضد الأمراض المعدية والمناعة الذاتية ورفض في الورم. وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وتطهير ، وتتبع استجابة الخلية NKT CD1 التفاعل ذو أهمية كبيرة. جيل tetramers ألفا Galactosyl سيراميد (A - Galcer) مع CD1d وبصيرة هامة في بيولوجيا الخلايا NKT. Tetramers مصنوعة من جزيئات CD1 الأخرى كما تم إنشاؤها وهذه الكواشف الجديدة قد وسعت كثيرا من المعارف وظائف الخلايا التائية الدهون التفاعل ، مع إمكانية استخدامها في رصد استجابة لدهن المستندة إلى اللقاحات وفي تشخيص أمراض المناعة الذاتية وغيرها العلاجات.
Protocol
أولا ذوبان للخلايا
يأخذ قنينة TN5 المجمدة للخلايا ، وذوبان الجليد في حمام ماء C ° 37. إضافة 5ml المتوسطة عبر عن الحشرات (Invitrogen ، وأنواع ، عدد 10486) في دورق 25cm TC 2. علما بأن اكسبريس five يأتي دون الجلوتامين ، تحتاج إلى إضافة 10ML من بكتيريا القلم الجلوتامين 100X أو الجلوتامين وحدها إلى وسائل الإعلام ليتر 1. إضافة الى ذلك TN5 الخلايا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة 27 درجة مئوية. ثم نضح المتوسط مع DMSO بلطف من دون إزعاج الخلايا التي تعلق على الجزء السفلي من القارورة. إضافة 5ml المتوسطة الطازجة.
II. المتنامية والتوسع في خلايا
رصد خلايا في كل يوم. عندما القارورة ما يقرب من 70 ٪ متموجة ، وجعل الخلايا في التعليق من ضجيجا القارورة على كلا الجانبين ، ونقل الخلايا إلى 175cm 2 قارورة بإضافة 21 مل من التعبير عن الحشرات والمتوسطة 5ml للثقافة الخلية. وينبغي أن يكون كل قارورة T175 حوالي 25 - 30ml المتوسط كوحدة تخزين النهائي. انقسام قارورة متموجة (حوالي 1 مليون / مل اضرب.) 1 / 4 أو 1 / 5 حسب الحاجة. لا تدع الخلايا كسا الأرض. عد عدد من المقاطع التي لديك انقسام الخلايا. لا تنمو أكثر من عدد مرور 30 لأنه قد يسبب شيخوخة الخلايا الناتجة تحلل الخلية. عندما تصل إلى حجم المطلوب في تركيز 1 مل / مليون تصيب الخلايا.
أنا تنمو عادة ما يصل إلى 2 إلى 2.5 ليتر ، والذي يصل عادة إلى قوارير 175cm 2 وسبعين تقريبا. 25 إلى قارورة 30ml / أو خمسة مخروطي 1 لتر وقوارير تقريبا. 400ml الى 500 مل في كل قارورة
ملاحظة : إما يمكن أن تنمو في خلايا T - 175 سد القارورة الختم أو كورنينج دورق مخروطي. الخلايا المتنامية في قوارير مخروطي هو أسرع وأسهل.
III. Titering الفيروس عن طريق نقطة النهاية أسلوب التخفيف
- لوحة 3000-5000 الخلايا بشكل جيد في شقة في لوحة أسفل بشكل جيد في 96 200ul المتوسطة اكسبريس SFM الخمسة. السماح للخلايا تستقر عند 27 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- جعل المسلسل التخفيف من الأسهم الفيروسة العصوية. ينبغي للمرء أن يفعل 10/01 التخفيف في سطر واحد من 96 لوحة أسفل U جيدا ، وذلك باستخدام 250ul لكل بئر. يتم إجراء التخفيفات في المتوسط خمسة اكسبريس SFM.
- باستخدام ماصة الأقنية ، ونقل مبلغ ثابت (عادة 20 ماي) من التخفيفات المختلفة للخلايا.
- ثقافة حتى 27 درجة مئوية لمدة 7 أيام. لتجنب التبخر من حافة الصفوف ، والتفاف حواف الصفيحة مع parafilm.
- بعد 7 أيام ، والتحقق من لوحة وتحديد التخفيف من فيروس العدوى يعطي 50 ٪ -- نصف عدد المصابين بهذا المرض في هذه الآبار تركيز الفيروس). ثم استخدام صيغة لحساب عيار ، وهو ما يعبر عنه في pfu / مل (pfu - البلاك تشكيل وحدات). تم العثور على أدلة في الصيغة الأكثر الفيروسة العصوية.
رابعا. اصابة الخلايا
من المهم جدا أن نعرف بالضبط من عيار الفيروس. إضافة المبلغ المطلوب من الفيروس. وينبغي لإعداد المخزون الفيروسية تصاب الخلايا في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) لا تزيد عن 1 (1pfu 1High إلى خمسة الخلية) العالي وزارة الداخلية يؤدي إلى إنتاج الطفرات الفيروسية. لإنتاج البروتين ، والمبلغ المعتاد هو MO1 50-10.
على سبيل المثال :
وعيار من الفيروسة العصوية mCD1d = 1X108 pfu / مل
وزارة الداخلية إضافة = 1 (لتضخيم الفيروس) = 20X10 ^ 6 خلية / قارورة / 1X10 ^ 8 pfu / مل UL = 200 / القارورة
وزارة الداخلية = 5 إلى 10 (لإنتاج بروتين) = 1ml 2ml بالنسبة إلى 20x10 ^ 6 خلية / القارورة
في يوم 4 بعد العدوى ، وننظر إلى الخلايا المصابة. يجب فصل فيه ، العائمة ، والنقانق وتشكيل تورم.
خامسا استعادة Supernatants
تتخذ وسيلة من قوارير المصابة ، ونقل إلى اللون الأزرق زجاجات 250ml فالكون غطاء للغزل. ويمكن تعقيمها أنهم وإعادة استخدامها. تعبئة الزجاجات بالتساوي والخلايا في جهاز الطرد المركزي Sorvall GSA الدوار في 200rpm ، 20 دقيقة ، 4 درجات مئوية. جمع طاف والمضي قدما نحو المزيد من التنقية.
سادسا. تنقية المؤتلف mCD1d
- غسيل الكلى وتركيز الصوديوم في 150mM العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4)
- بواسطة الكروماتوجراف Agarose ني NTA ، أزل البروتين mCD1d + b2m مع 150mM الصوديوم Immidazole الفوسفات ملي +200
- تشغيل عمود التحلية باستخدام 20mM تريس هيدروكلورايد pH8 العازلة للتخلص من Immidazole
- تشغيل Exchange باستخدام الكروماتوغرافيا الأنيون MonoQ العمود للقضاء على الملوثات المتبقية.
- التركيز على استخدام 1mg/ml YM 30 المكثف (ميليبور)
- mCD1d البيرا biotynlation الأنزيمية وفقا لبروتوكول من الشركة المصنعة (الطمع)
- يتم التخلص من البيوتين S200 مجانا من العمود (حجم Chromatograpy الاستبعاد) باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ، pH7.4. ويمكن الحصول على المتوسط من 2 إلى 3 ملغ من البروتين biotynlated من 2 لتر من طاف
- إنتاج - Galcer CD1d tetramer.
من أجل تحميل جزيء CD1d مع Galcer ، ذوبان biotynlated CD1d - B2وبين عشية وضحاها م المحتضنة في درجة حرارة الغرفة مع فائض three المولي أضعاف من Galcer ، الذائبة في توين -20 بنسبة 0.5 ٪ في برنامج تلفزيوني ، O.9 ٪ كلوريد الصوديوم. Tetramers تتولد عن طريق خلط ل- Galcer تحميل مونومرات CD1d مع فائض 4 أضعاف من المولي PE -- streptavidin مترافق واحتضان لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. متجر في 48 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الإجراء ، فإنه يظهر كيفية بدء وينمون وتصيب خلايا الحشرات وكيفية عيار الفيروسة العصوية في استخدام هذه الخلايا. وأهم جوانب هذا الإجراء وصيانة الخلايا ومعرفة عيار الدقيق للالفيروسة العصوية. ذات مرة كنت قد ولدت CD1 tetramers ، يمكن استخدامها كأداة قوية لتحليل الخلايا التائية شحمي سكري على رد الفعل. كما تستخدم على نطاق واسع لأنظمة الفيروسة العصوية انتاج البروتينات المؤتلف ، بما في ذلك tetramers MHC الدرجة الثانية ولذلك فإن هذا الإجراء لديه تطبيقها على نطاق أوسع من ذلك بكثير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
