Summary
一个方法，准备昆虫细胞和感染杆状病毒重组mCD1d mCD1d四聚体的proteinand生产的目的。
Abstract
CD1的蛋白质构成的抗原提呈分子的第三类。他们是细胞表面的糖蛋白，约50 kDa的糖基化，非共价与β2-微球蛋白重链表达。他们结合血脂，而不是肽。虽然它们的结构确认的CD1蛋白MHC I类和II类抗原呈现分子的相似性，mCD1d槽比较窄，深，高疏水性和它有两项具有约束力的口袋，而不是为经典所描述的几个浅口袋MHC编码的抗原提呈分子。根据其氨基酸序列，这样一个hydrobphobic槽提供了一个理想的环境脂质抗原结合。
自然杀伤T（NKT）细胞使用他们的TCR识别势必会或CD1d糖脂。已参与对保护自身免疫性疾病和传染病和肿瘤排斥反应的T细胞CD1所提出的血脂。因此，辨别能力，净化，并跟踪CD1反应NKT细胞的反应是非常重要的。 α-半乳糖神经酰胺（A - Galcer）与CD1d四聚体的生成NKT细胞生物学的重要见解。从其他CD1的分子构造的四聚体也已产生，这些新的试剂，极大地扩大了监测脂质为基础的疫苗的反应的潜在使用，并在自身免疫性疾病和其他的诊断的脂质反应性T细胞的功能的知识，治疗。
Protocol
一，解冻的细胞
TN5细胞的冷冻瓶，并在37℃水浴解冻。 25厘米2训练班烧瓶中加入5毫升昆虫快递培养基（Invitrogen公司的产品目录号10486）。注意表达五年没有谷氨酰胺;需要添加100X谷氨酰胺笔链球菌单独或谷氨酰胺1 LT媒体10毫升。添加到TN5细胞，并在29 ° C培养箱中孵育30分钟。然后，吸用DMSO中轻轻互不干扰烧瓶底部的细胞。添加新鲜培养基5毫升。
二。成长壮大的细胞
监控细胞的每一天。当烧瓶中近70％融合，敲打两边的容量瓶中，使悬浮液中的细胞和转移细胞175厘米2烧瓶中加入21毫升昆虫表达介质和细胞培养5毫升。每个T175烧瓶中应该有大约25 - 30ML作为最终体积中等。拆分融合瓶（约1万个/毫升浓度）1 / 4或1 / 5需要。不要让细胞过度生长。计数的一些段落，你有分裂细胞。不要增长，通过30号，因为它可能会导致老化的细胞产生的细胞裂解。当您达到所需的量，在1万/毫升的浓度感染的细胞。
我一般长大到2至2.5升，通常达七十175厘米约2瓶和。 25日至30毫升/容量瓶中，5个1公升的锥形瓶，约。在每个烧瓶400毫升至500毫升
注意：您既可以增加细胞中的T - 175插头密封瓶或康宁锥形瓶中。在锥形烧瓶中生长的细胞是更快，更容易。
三。滴定终点稀释法病毒
- 板3000-5000平底快递五个SFM培养基200ul 96孔板，每孔细胞。让细胞在27℃，至少30分钟解决。
- 杆状病毒股票连续稀释。人应该这样做一行96 ü底板的1 / 10稀释，每孔250ul。快运五SFM培养基稀释。
- 使用多道移液器，转让的不同稀释度的固定金额（通常为20 UL）的细胞。
- 文化在27 ° C为7天。为了避免从边缘行的蒸发，包装封口膜板边缘。
- 经过7天中，检查的板块，并确定给出了50％的感染病毒稀释 - 感染这种病毒的浓度的一半井）。然后使用一个公式来计算的滴度，这是PFU / ml的（PFU斑形成单位）表示。其计算公式为最杆状病毒手册。
四。感染的细胞
知道确切的病毒滴度，这是非常重要。添加所需的病毒数量。对于病毒备料的细胞被感染的多重感染（MOI），不超过1（1pfu 1High五单元）提高惯性导致病毒突变的生产。对于蛋白质的生产，通常金额MO1 5-10。
例如：
mCD1d杆状病毒滴度= 1X108 PFU / ml的
新增教学语言= 1（放大病毒）= 20 × 10 ^ 6细胞/烧瓶/ 1X10 ^ 8 PFU / ml的= 200 UL /烧瓶
MOI = 5至10（蛋白生产）= 1ml到2毫升对于20 × 10 ^ 6细胞/烧瓶
感染后第4天，在受感染的细胞。他们应该分离，漂浮，肿胀，形成香肠。
五，恢复上清液
从感染的烧瓶中，并转移到250毫升蓝帽猎鹰纺纱瓶。他们可高压灭菌和重用。均匀填充瓶子，并在Sorvall GSA转子离心细胞200rpm，20分钟后，4 ° C收集上清液，并进行进一步纯化。
六。纯化重组mCD1d
- 透析和150mm的磷酸钠缓冲液的浓度（pH值7.4）
- 经Ni - NTA琼脂糖层析，洗脱蛋白mCD1d + B2M与150mm的钠磷酸盐200毫米Immidazole
- 使用20mm的三盐酸PH8缓冲区Immidazole摆脱运行脱盐柱
- 运行使用阴离子交换层析MonoQ列，以消除剩余的污染物。
- 集中1mg/ml的使用YM 30选矿厂（Millipore公司）
- 比拉酶biotynlation的mCD1d根据制造商的协议（亲和力）
- S200列，用磷酸盐缓冲液（PBS），pH7.4的（体积排阻Chromatograpy）免费素被淘汰。平均2至3 biotynlated蛋白质MGS可以得到2升上清
- A - Galcer CD1d四聚体的生产。
为了加载一个Galcer CD1d分子，可溶性biotynlated CD1d - B2M是3倍摩尔A - Galcer超过0.5％吐温-20的PBS，O.9％氯化钠溶解，室温孵育过夜。四聚体的生成混合A - Galcer加载CD1d单体在室温为4小时4倍摩尔超过PE - 共轭链霉亲和孵化。储存在48 ° C。
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Discussion
在此过程中，它是如何启动，成长，感染昆虫细胞，以及如何滴度使用这些细胞的杆状病毒。在此过程中最重要的方面是细胞的维护和知道确切的杆状病毒滴度。一旦你已经产生了CD1的四聚体，它们可以被用来作为糖脂反应性T细胞的功能强大的分析工具。杆状病毒系统也广泛用于生产重组蛋白，包括MHC II类四聚体，所以此过程有一个更广泛的适用性。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
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- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
