Summary
Une méthode pour préparer les cellules d'insectes et de les infecter avec le baculovirus à des fins de production de l'recombinante proteinand mCD1d générant tétramères mCD1d.
Abstract
CD1 protéines constituent une troisième classe de molécules présentatrices d'antigène. Ils sont des glycoprotéines de surface cellulaire, exprimée en environ 50 kDa glycosylée lourdes chaînes qui sont non covalente associée à béta2-microglobuline. Ils se lier aux lipides plutôt que les peptides. Bien que leur structure confirme la similitude des protéines CD1 du CMH de classe I et molécules de classe II présentant l'antigène, la rainure mCD1d est relativement étroite, profonde et hautement hydrophobe et il a deux poches de liaison au lieu de la faible profondeur des poches de plusieurs classiques décrites pour la MHC- codée molécules présentatrices d'antigène. Sur la base de leurs séquences d'acides aminés, une telle rainure hydrobphobic fournit un environnement idéal pour la fixation des antigènes lipidiques.
Le Natural Killer T (NKT), les cellules utilisent leur TCR à reconnaître glycolipides liés à ou présentés par CD1d. Les cellules T réactives aux lipides présentés par CD1 ont été impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et infectieuses et dans le rejet de la tumeur. Ainsi, la capacité d'identifier, purifier, et de suivre la réponse du CD1-réactive cellules NKT est de grande importance. La génération de tétramères d'alpha galactosyl céramide (une-GalCer) avec CD1d a aperçu significatif de la biologie des cellules NKT. Tétramères construits à partir d'autres molécules CD1 ont aussi été générés et ces nouveaux réactifs ont considérablement élargi les connaissances sur les fonctions des cellules T réactives de lipides, avec une utilisation potentielle dans le suivi de la réponse aux vaccins à base de lipides et dans le diagnostic des maladies auto-immunes et d'autres traitements.
Protocol
I. Décongeler les cellules
Prenez le flacon congelé des cellules TN5, et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C. Ajouter 5 ml d'insectes express moyennes (Invitrogen, numéro de catalogue 10486-) dans 25cm 2 flacon de CT. Notez que cinq express vient sans glutamine; besoin d'ajouter 10ml de streptocoque stylo 100X glutamine ou glutamine seule à une des médias lt. Ajouter TN5 cellules en elle et incuber pendant 30 minutes dans un incubateur à 27 ° C. Ensuite, aspirer le milieu avec du DMSO en douceur sans perturber les cellules attachées au fond du flacon. Ajouter 5 ml de milieu frais.
II. Croissance et l'expansion des cellules
Surveiller les cellules chaque jour. Lorsque flacon est près de 70% de confluence, mettre les cellules en suspension en tapant dans le ballon des deux côtés et le transfert aux cellules de 175cm 2 flacon en ajoutant 21 ml d'exprimer moyennes insectes et 5ml de culture cellulaire. Chaque flacon T175 devrait avoir autour de 25-30ml médium comme un volume final. Fractionner flacon confluence (environ 1 million / ml conc.) 1 / 4 ou 1 / 5 des besoins. Ne laissez pas envahir les cellules. Comptez le nombre de passages que vous avez fractionner les cellules. Ne pas pousser plus de 30 le nombre de passages, car il peut causer le vieillissement des cellules résultant lyse cellulaire. Lorsque vous atteignez le volume souhaité à la concentration de 1 million / ml, infectent les cellules.
J'ai généralement une croissance de 2 à 2,5 litres, ce qui équivaut généralement à soixante-dix 175cm 2 flacons et env. 25 à 30ml flacon / ou de cinq litres 1 erlenmeyers et env. 400ml à 500 ml dans chaque flacon
Note: Vous pouvez soit cultiver des cellules de T-175 flacon joint fiche ou Corning Erlenmeyer. Des cellules en croissance dans des erlenmeyers est plus rapide et plus facile.
III. Titrage du virus par la méthode de dilution End Point
- Assiette 3000-5000 cellules par puits dans le fond 96 plaque plane bien dans 200ul de milieu express GDF cinq. Laissez les cellules s'établir à 27 ° C pendant au moins 30 minutes.
- Faire de dilution en série de stock de baculovirus. On devrait faire de dilution 1 / 10 dans une ligne de 96 puits plaque de fond en U, en utilisant 250ul par puits. Les dilutions sont faites en milieu express GDF Cinq.
- En utilisant une pipette multicanaux, le transfert d'un montant fixe (généralement 20 ul) de différentes dilutions pour les cellules.
- Culture à 27 ° C pendant 7 jours. Pour éviter l'évaporation à partir des lignes de pointe, envelopper les bords de la plaque avec du parafilm.
- Après 7 jours, vérifier la plaque et de déterminer ce qui donne de dilution du virus d'une infection de 50% - la moitié du puits à cette concentration de virus sont infectés). Ensuite, utilisez une formule pour calculer le titre, ce qui est exprimé en pfu / ml (UFP-unités formant la plaque). La formule se trouve dans la plupart des manuels de baculovirus.
IV. Infectant les cellules
Il est très important de connaître le titre exact du virus. Ajoutez la quantité requise de virus. Pour la préparation de stock viral des cellules infectées doivent être à une multiplicité d'infection (MOI) de pas plus de 1 (1pfu d'1High Cinq cellulaire) supérieur MOI mène à la production de mutations virales. Pour la production de protéines, la quantité habituelle est MO1 5-10.
Exemple:
Le titre de baculovirus mCD1d = 1X108 pfu / ml
Ajouter MOI = 1 (pour amplifier le virus) = 20X10 ^ 6 cellules / flacon / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / flacon
MOI = 5 à 10 (pour la production de protéines) = 1 ml à 2 ml Pour 20x10 ^ 6 cellules / flacon
Au jour 4, après l'infection, regarder les cellules infectées. Ils devraient être détachée, flottante, saucisses gonflées et formant.
Surnageants V. Récupération
Prenez la moyenne des flacons infectés, et transfert à 250ml bouteilles bouchon bleu Falcon Spinning. Ils peuvent être autoclavés et réutilisés. Remplissez les bouteilles de façon égale et centrifuger les cellules Sorvall GSA rotor à 200rpm, 20 minutes, 4 ° C. Recueillir le surnageant et procéder d'une purification supplémentaire.
VI. Purification de recombinaison mCD1d
- La dialyse et la concentration dans tampon phosphate de sodium 150 mM (pH 7,4)
- Par Ni-NTA agarose chromatographie, éluer la protéine mCD1d + B2M avec 150 mM de phosphate de sodium 200 mM Immidazole
- Exécuter colonne de dessalage en utilisant 20 mM Tris HCl pH8 tampon pour se débarrasser des Immidazole
- Exécuter chromatographie échangeuse d'anions en utilisant la colonne MonoQ pour éliminer les contaminants restants.
- Concentré à 1mg/ml utilisant YM 30 concentrateur (Millipore)
- BirA biotynlation enzymatique de mCD1d selon le protocole du fabricant (avidité)
- La biotine libre est éliminé par S200 colonne (Chromatographie d'exclusion stérique) à l'aide du tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4. Une moyenne de 2 à 3 mg de protéine biotynlated pourrait être obtenu à partir de 2 litre de surnageant
- Production d'un tétramère-GalCer CD1d.
Afin de charger molécule CD1d avec un GalCer-, soluble biotynlated CD1d-b2m est incubé une nuit à température ambiante avec trois fois excès molaire d'un GalCer-, dissous dans 0,5% de Tween -20 en PBS, chlorure de sodium O.9%. Tétramères sont générées par le mélange d'un-GalCer monomères chargés CD1d avec 4 excès molaire pli du PE - streptavidine conjuguée et incubation pendant 4 heures à température ambiante. Entreposer à 48 ° C.
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Discussion
Dans cette procédure, il est montré comment initier, grandir, infecter les cellules d'insectes et la façon de titrer la baculovirus utilisation de ces cellules. Les aspects les plus importants de cette procédure sont la maintenance des cellules et de connaître le titre exact de baculovirus. Une fois que vous avez généré CD1 tétramères, ils peuvent être utilisés comme un outil puissant pour l'analyse des glycolipides des cellules T réactives. Systèmes baculovirus sont également largement utilisées pour produire des protéines recombinantes, notamment CMH de classe II afin tétramères cette procédure a une application beaucoup plus large.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
