Summary
שיטה להכנת תאים חרקים להדביק אותם עם baculovirus לצורך הייצור של proteinand רקומביננטי mCD1d יצירת tetramers mCD1d.
Abstract
CD1 חלבונים מהווים המחזור השלישי של אנטיגן הצגת מולקולות. הם פני התא גליקופרוטאינים, כפי שבאה לידי ביטוי שרשראות כבדות כ 50-kDa glycosylated המשויכים noncovalently עם microglobulin-Beta2. הם נקשרים שומנים ולא פפטידים. למרות המבנה שלהם מאשר את הדמיון של CD1 חלבונים MHC אני בכיתה ו הכיתה מולקולות II הצגת אנטיגן, mCD1d חריץ צר יחסית, עמוק, הידרופובי מאוד ויש לו שני כיסים מחייב במקום הכיסים רדוד מספר תיאר הקלאסית MHC- מקודד אנטיגן הצגת מולקולות. בהתבסס על רצפי אמינו חומצה שלהם, כגון חריץ hydrobphobic מספקת סביבה אידיאלית עבור הכריכה של אנטיגנים השומנים.
הרוצח טבעי T (NKT) תאים להשתמש TCR שלהם להכיר glycolipids חייב או שהציג CD1d. בתאי T תגובתי שומנים שהציג CD1 היו מעורבים הגנה נגד מחלות אוטואימוניות זיהומיות בבית דחייה הגידול. לפיכך, היכולת לזהות, לטהר, ולעקוב אחר תגובת התא NKT CD1-reactive היא בעלת חשיבות רבה. הדור של tetramers של אלפא Galactosyl ceramide (א-Galcer) עם CD1d יש תובנה משמעותית לתוך הביולוגיה של תאים NKT. Tetramers בנויים CD1 מולקולות אחרות יש גם שנוצר אלה ריאגנטים חדשים הרחיבו מאוד את הידע של הפונקציות של שומנים בדם תגובתי בתאי T, עם שימוש פוטנציאלי ניטור התגובה השומנים מבוסס חיסונים באבחון של מחלות אוטואימוניות אחרות טיפולים.
Protocol
I. ההפשרה תאים
קח את הבקבוקון קפוא של TN5 תאים, להפשיר אותה אמבטיה במים 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ"ל של מדיום אקספרס חרקים (Invitrogen, קטלוג מספר 10486) בבקבוק 2 25cm TC. שים לב אקספרס five מגיע ללא גלוטמין, צריך להוסיף 10 מ"ל של סטרפטוקוקוס עט גלוטמין גלוטמין 100x או לבד עד 1 ליטר התקשורת. הוסף TN5 תאים לתוכו דגירה במשך 30 דקות ב 27 מעלות צלזיוס חממה. ואז, לשאוב את המדיום עם DMSO בעדינות מבלי להפריע תאים המצורפת בתחתית הבקבוק. הוסף 5 מ"ל של מדיום טריים.
השנייה. גידול והרחבת תאים
צג התאים בכל יום. כאשר הבקבוק הוא כמעט 70% ומחוברות, להביא את התאים ההשעיה מדפיקות את הבקבוק משני הצדדים ולהעביר את התאים בקבוק 175cm 2 על ידי הוספת 21 מ"ל של מדיום לבטא חרקים ו 5 מ"ל של תרבית תאים. כל בקבוק T175 צריך מסביב בינוני 25-30 מ"ל נפח סופי. פיצול בקבוק ומחוברות (כ 1000000 / ml קונצרט כלשהו.) 04/01 או 05/01 לפי הצורך. אל תתנו לגדול יותר תאים. ספירת הקטעים שיש לך לפצל את התאים. אל לצמוח לאורך קטע מספר 30 כי זה עלול לגרום להזדקנות של תאים והתוצאה תמוגה התא. כאשר אתם מגיעים בנפח הרצוי בריכוז של 1 מ"ל / מיליון דולר, להדביק את התאים.
אני בדרך כלל גדלים 2-2.5 ליטר, אשר בדרך כלל כמויות עד שבעים 175cm 2 צלוחיות וכ. 25 עד 30 מ"ל בבקבוק / או חמש Erlenmeyer 1 ליטר צלוחיות וכ. 400ml ל -500 מ"ל בבקבוק אחד
הערה: אתה גם יכול לגדל תאים בקבוק T-175 תקע חותם או בקבוק קורנינג Erlenmeyer. התאים גדל Erlenmeyer צלוחיות הוא מהיר וקל יותר.
ג. Titering וירוס על ידי שיטת נקודת הסיום דילול
- 3000-5000 פלייט לכל התאים היטב לתחתית צלחת שטוחה 96 היטב 200ul של המדיום five SFM Express. בואו התאים להתיישב 27 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
- הפוך את דילול המניות הסידורי של baculovirus. אחד צריך לעשות 1 / 10 דילול בשורה אחת של צלחת 96 U היטב לתחתית בעזרת 250ul לכל טוב. דילולים מתקבלות בינוני חמישה SFM Express.
- בעזרת טפטפת רב, להעביר סכום קבוע (בדרך כלל 20 ul) של דילולים שונים על התאים.
- תרבות ב 27 ° C למשך 7 ימים. כדי למנוע אידוי של שורות לקצה, לעטוף את הקצוות של צלחת עם parafilm.
- לאחר 7 ימים, לבדוק את הצלחת לקבוע אילו דילול של נגיף דלקת נותן 50% - במחצית בארות בריכוז זה וירוס נגועים). ואז להשתמש בנוסחה כדי לחשב את titer, המתבטא pfu / מ"ל (pfu-פלאק יחידות להרכיב). הנוסחה היא למצוא מדריכים baculovirus ביותר.
IV. הדבקה של תאים
חשוב מאוד לדעת את titer מדויק של הנגיף. הוסף את הכמות הנדרשת של הנגיף. להכנת מלאי ויראלי התאים צריך להיות נגוע על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של לא יותר מ 1 (1pfu כדי 1High חמש התא) גבוהה משרד הפנים מוביל הייצור של מוטציות ויראליות. עבור ייצור החלבון, הכמות הרגילה היא 50-10 MO1.
דוגמה:
כייל של baculovirus mCD1d = 1X108 pfu / ml
הוסף הפנים = 1 (כדי להגביר את הנגיף) = 20X10 ^ 6 תאים / בקבוק / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 UL / בקבוקון
משרד הפנים = 5 עד 10 (לייצור חלבון) = 1ml כדי 2ml עבור 20x10 ^ 6 תאים / בקבוקון
ביום 4 לאחר ההדבקה, מסתכל על תאים נגועים. הם צריכים להיות מנותקת, מרחפת, נקניקיות נפוחות יוצרים.
V. Supernatants שחזור
קחו את המדיום של צלוחיות נגוע, להעביר בקבוקי 250 מ"ל כחול כובע פלקון ספינינג. הם יכולים להיות autoclaved ולעשות בהם שימוש חוזר. מלאו את הבקבוקים באופן שווה צנטריפוגות התאים Sorvall GSA הרוטור ב 200rpm, 20 דקות, 4 ° C. אסוף את supernatant והמשך לטיהור נוסף.
VI. טיהור mCD1d רקומביננטי
- דיאליזה וריכוז במאגר סודיום פוספט 150mm (pH 7.4)
- על ידי Ni-agarose כרומטוגרפיה נ.ת. ע, elute החלבון mCD1d + b2m עם 150mm פוספט נתרן 200 mM Immidazole
- הפעלה באמצעות טור Desalting 20mm טריס HCL pH8 חיץ להיפטר Immidazole
- הפעל Exchange כרומטוגרפיה אניון באמצעות טור MonoQ לחסל את המזהמים הנותרים.
- להתרכז כדי 1mg/ml באמצעות י"מ 30 concentrator (Millipore)
- Biotynlation בירה האנזימטית של mCD1d על פי פרוטוקול של היצרן (רעבתנות)
- ביוטין חינם מסולק על ידי טור S200 (הרחקה Chromatograpy גודל) באמצעות בופר פוספט (PBS), pH7.4. ממוצע של 2 עד 3 מקלעים של חלבון biotynlated ניתן לקבל 2 ליטר של supernatant
- הפקה של-Galcer CD1d tetramer.
על מנת לטעון מולקולה CD1d עם-Galcer, מסיסים biotynlated CD1d-B2מ 'הוא מודגרות לילה עם עודף three טוחנת קיפול של Galcer-a, מומס 0.5% ב -20 Tween PBS, כלוריד הנתרן O.9% בטמפרטורת החדר. Tetramers נוצרים על ידי ערבוב של-Galcer מונומרים טעון CD1d עם עודף של פי 4 טוחנת PE - streptavidin מצומדות ו דוגרים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. חנות ב 48 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בהליך זה, הוא הראה כיצד ליזום, לגדול, להדביק תאים חרקים וכיצד titer baculovirus באמצעות תאים אלה. ההיבטים החשובים ביותר של הליך זה הם אחזקה של תאים לדעת את titer המדויק של baculovirus. ברגע שיש לך שנוצר CD1 tetramers, הם יכולים לשמש כלי רב עוצמה לניתוח glycolipid בתאי T תגובתי. מערכות Baculovirus משמשים גם נרחב כדי לייצר חלבונים רקומביננטי, כולל tetramers MHC Class II ולכן הליך זה יש תחולה רחבה הרבה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
