Summary
Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.
Abstract
CD1 proteine costituiscono una terza classe di molecole presentanti l'antigene. Si tratta di glicoproteine della superficie cellulare, espresso in circa 50-kDa glicosilata catene pesanti che sono associati con noncovalently beta2-microglobulina. Si legano i lipidi piuttosto che peptidi. Anche se la loro struttura conferma la somiglianza dei CD1 proteine MHC di classe I e molecole di classe II che presentano l'antigene, il groove mCD1d è relativamente stretta, profonda e altamente idrofoba e ha due tasche vincolanti anziché le tasche diverse superficiale descritto per la classica MHC- codificati che presentano l'antigene molecole. In base al loro sequenze di aminoacidi, come un solco hydrobphobic fornisce un ambiente ideale per il legame di antigeni lipidici.
Il Natural Killer T (NKT) le cellule utilizzano per riconoscere il loro TCR glicolipidi legato o presentato da CD1d. Cellule T reattive di lipidi presentati da CD1 sono stati coinvolti nella protezione contro le malattie autoimmuni e infettive e nel rifiuto del tumore. Così, la capacità di identificare, purificare e tenere traccia la risposta del CD1-reattiva delle cellule NKT è di grande importanza. La generazione di tetrameri di alfa galattosiltransferasi ceramide (a-Galcer) con CD1d ha una visione significativa sulla biologia delle cellule NKT. Tetrameri costruite da altre molecole CD1 sono stati generati e questi nuovi reagenti hanno notevolmente ampliato la conoscenza delle funzioni di lipidi cellule T reattive, con un potenziale utilizzo nel monitoraggio della risposta ai vaccini a base di lipidi e nella diagnosi delle malattie autoimmuni e di altre trattamenti.
Protocol
I. Scongelare le cellule
Prendere il flacone ghiacciato di TN5 cellule, e scongelare in un bagno d'acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di media insetti Express (Invitrogen, numero di catalogo-10486) a 25 centimetri 2 fiasco TC. Si noti che cinque viene espresso senza Glutammina; bisogno di aggiungere 10 ml di streptococco penna 100X glutammina o glutammina da sola a 1 lt dei media. Aggiungi TN5 cellule in esso e incubare per 30 minuti in un incubatore 27 ° C. Poi, aspirare il terreno con DMSO delicatamente senza disturbare le cellule attaccato al fondo del pallone. Aggiungere 5 ml di terreno fresco.
II. Crescita ed espansione delle Cellule
Monitorare le cellule ogni giorno. Quando pallone viene quasi il 70% confluenti, portare le cellule in sospensione da sbattere il pallone su entrambi i lati e il trasferimento alle cellule di 175 centimetri 2 fiasco con l'aggiunta di 21 ml di insetti medio espresso e 5 ml di coltura cellulare. Ogni T175 fiasco dovrebbe avere circa 25-30ml mezzo come un volume finale. Split fiasco confluenti (circa 1 milioni / ml conc.) 1 / 4 o 1 / 5, se necessario. Non lasciate proliferare cellule. Contare il numero di passaggi che avete dividere le celle. Non crescere nel passaggio numero 30, perché può provocare l'invecchiamento delle cellule con conseguente lisi cellulare. Quando si raggiunge il volume desiderato alla concentrazione di 1 milioni / ml, infettare le cellule.
Io generalmente crescere fino a 2 a 2,5 litri, il che equivale di solito a settanta 175 centimetri 2 palloni e ca. 25 a beuta 30ml /, o cinque beute 1 litro e ca. 400 ml a 500 ml in ogni contenitore
Nota: Si può crescere sia le cellule di T-175 fiasco guarnizione o Corning beuta. Le cellule crescono in beute è più veloce e più facile.
III. Titolazione del virus con i metodi di diluizione End Point
- Piastra 3000-5000 cellule per bene in fondo piatto 96 pozzetti in 200ul di Express cinque medio SFM. Lasciate che le cellule stabilirsi a 27 ° C per almeno 30 minuti.
- Fai la diluizione seriale di magazzino baculovirus. Si dovrebbe fare diluizione 1 / 10 in una sola riga di 96 pozzetti fondo a U, con 250ul per bene. Diluizioni sono realizzati in Express Five medio SFM.
- Utilizzando una pipetta multicanale, il trasferimento di un importo fisso (di solito 20 ul) di diluizioni diverse per le cellule.
- Cultura a 27 ° C per 7 giorni. Per evitare l'evaporazione dalle righe bordo, avvolgono i bordi del piatto con parafilm.
- Dopo 7 giorni, controllare il piatto e determinare quale diluizione del virus dà una infezione del 50% - la metà dei pozzi a questa concentrazione sono infetti da virus). Quindi utilizzare una formula per calcolare il titolo, che si esprime in pfu / ml (PFU-placca unità formanti). La formula si trova nei manuali più baculovirus.
IV. Infettare le cellule
E 'molto importante conoscere il titolo esatto del virus. Aggiungi quantità di virus. Validità per la preparazione virale delle cellule infette dovrebbero essere a molteplicità di infezione (MOI) di non più di 1 (1pfu a 1High Cinque cella) superiore MOI porta alla produzione di mutazioni virali. Per la produzione delle proteine, la quantità usuale è MO1 5-10.
Esempio:
Il titolo di baculovirus mCD1d = 1X108 pfu / ml
Aggiungi MOI = 1 (per amplificare il virus) = 20x10 ^ 6 cellule / fiasco / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / fiasco
MOI = 5 a 10 (per la produzione di proteine) = 1 ml a 2 ml Per 20x10 ^ 6 cellule / fiasco
Il 4 ° giorno dopo l'infezione, guardare le cellule infette. Dovrebbero essere distaccato, galleggianti, salsicce gonfie e formatura.
Surnatanti V. Recupero
Prendete il medium da fiaschi infetti, e trasferimento in bottiglie da 250 ml tappo blu Falcon Spinning. Possono essere sterilizzati in autoclave e riutilizzati. Riempire le bottiglie in modo uniforme e centrifugare le cellule in Sorvall GSA rotore a 200gpm, 20 minuti, 4 ° C. Raccogliere il surnatante e proseguire per un'ulteriore purificazione.
VI. Purificazione di ricombinante mCD1d
- Dialisi e concentrazione in un tampone di 150mm fosfato di sodio (pH 7,4)
- Da Ni-NTA Agarosio cromatografia, eluire la proteina mCD1d + B2M con 150mm Fosfato di sodio 200 mM Immidazole
- Esegui colonna Desalificazione con 20 mM Tris HCl pH8 tampone per sbarazzarsi di Immidazole
- Esegui cromatografia a scambio anionico utilizzando colonna MonoQ per eliminare le sostanze contaminanti rimanenti.
- Concentrato di 1mg/ml con YM 30 concentratore (Millipore)
- Biotynlation Bira enzimatica della mCD1d secondo il protocollo del produttore (Avidità)
- La biotina libera è eliminato da colonna S200 (esclusione Chromatograpy dimensione) con tampone fosfato (PBS), pH7.4. Una media di 2 a 3 mg di proteina biotynlated potrebbe essere ottenuto da 2 litri di surnatante
- Produzione di un-Galcer CD1d tetramero.
Per caricare molecola CD1d con-Galcer, solubile biotynlated CD1d-b2m è incubato per una notte a temperatura ambiente con tre volte l'eccesso molare di un-Galcer, disciolti in 0,5% di Tween -20 in PBS, cloruro di sodio O.9%. Tetrameri sono generati mediante miscela di a-Galcer monomeri caricato CD1d a 4 volte l'eccesso molare di PE - streptavidina coniugato e incubazione per 4 ore a temperatura ambiente. Conservare a 48 ° C.
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Discussion
In questa procedura, viene mostrato come iniziare, crescere, infettare cellule di insetto e come titolo il baculovirus utilizzando queste cellule. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono la manutenzione delle celle e di conoscerne il titolo esatto del baculovirus. Una volta che avete generato CD1 tetrameri, possono essere utilizzati come un potente strumento per l'analisi dei glicolipidi cellule T reattive. Baculovirus sistemi sono ampiamente utilizzati anche per la produzione di proteine ricombinanti, compresa tetrameri MHC di classe II in modo tale procedura ha una applicabilità molto più ampio.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
