Summary
昆虫細胞を調製し、mCD1d四量体を生成する組換えmCD1d proteinandの生産を目的とバキュロウイルスとそれらを感染させる方法。
Abstract
CD1タンパク質は、抗原提示分子の第3のクラスを構成する。彼らは、非共有結合β2-ミクログロブリンに関連付けられている約50 - kDaのグリコシル化重鎖として表現される細胞表面の糖タンパク質です。彼らは脂質ではなく、ペプチドを結合する。それらの構造がMHCクラスIとクラスIIの抗原提示分子にCD1タンパク質の類似性を確認するものの、mCD1d溝は相対的に、狭く深く、そして非常に疎水性であり、それは古典的で説明したいくつかの浅いポケットの代わりに二つの結合ポケットを有するMHC -エンコードされた抗原提示分子。それらのアミノ酸配列に基づいて、そのようなhydrobphobic溝は脂質抗原の結合のための理想的な環境を提供します。
ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、CD1dによってバインドされるか提示糖脂質を認識するために彼らのTCRを使用してください。 CD1から提示された脂質に反応性T細胞は自己免疫と感染症予防にと腫瘍拒絶に関与してきた。したがって、識別、浄化とcd1 -反応性NKT細胞の応答を追跡する機能は非常に重要です。 CD1dによるアルファガラクトシルセラミド（α- GalCerを）の四量体の生成は、NKT細胞の生物学の重要な洞察を持っています。他のCD1分子から構成された四量体も生成されており、これらの新しい試薬を大幅に脂質反応性T細胞の機能の知識を拡大し、脂質ベースのワクチンに対する応答を監視することで、自己免疫疾患やその他の診断に利用できる可能性を治療法。
Protocol
I.は、セルを融解
TN5細胞の凍結バイアルを取る、そして37℃の水浴中で解凍します。 25センチメートル2 TCフラスコ内の昆虫エクスプレス培地（Invitrogen、カタログ番号- 10486）5mlを追加します。エクスプレス5人がグルタミンなしで来ることに注意してください。100Xグルタミンペンの連鎖球菌または1 LTのメディアに単独でグルタミン10mlのを追加する必要があります。それにTN5細胞を追加し、27℃インキュベーターで30分間インキュベートする。その後、フラスコの底に付着した細胞を乱すことなく静かにDMSOと培地を吸引除去する。新鮮培地5mlを追加します。
II。細胞の成長と拡大
毎日のセルを監視する。フラスコを約70％コンフルエントになると、両側にフラスコを叩いにより懸濁液中の細胞をもたらすと昆虫エクスプレス培地と細胞培養5mlの21 mlを加え175センチメートル2フラスコに細胞を移す。各T175フラスコは、最終的なボリュームとして25〜30ミリリットル培地で入力してください。コンフルエントフラスコを（約1万/ミリリットル濃）1 / 4、1 / 5必要に応じて分割する。細胞の生い茂るをさせてください。セルを分割している通路の数を数えます。それは細胞溶解を生じる細胞の老化を引き起こす可能性があるため、継代数30の上に成長しない。あなたは100万/ mlの濃度で目的のボリュームに達すると、細胞に感染。
私は一般的に通常seventy 175センチメートル2フラスコと約にのぼる2〜2.5リットル、最大成長する。 25 / 30ミリリットルフラスコ、または5つの1リットルの三角フラスコと約へ。各フラスコに400ミリリットルに500ミリリットル
注：どちらのT - 175プラグシールフラスコまたはコーニング三角フラスコで細胞を成長させることができる。三角フラスコで増殖する細胞は、速くて簡単です。
III。エンドポイント希釈法によるウイルスの力価測定
- エクスプレスfive SFM培地の200ulで平底96ウェルプレートにウェル当たりプレート3000から5000までの細胞。細胞は27℃で少なくとも30分間静しましょう。
- バキュロウイルスストックの連続希釈を行う。一つは、ウェル当たり250ulを使用して、96ウェルU底プレートの1行に1 / 10に希釈を行う必要があります。希釈液は、エクスプレスファイブSFM培地で作られています。
- マルチチャンネルピペットを用いて、細胞に様々な希釈の一定量（通常は20μlのを）転送する。
- 27 7日間° Cで培養。エッジの行からの蒸発を避けるために、パラフィルムでプレートの端を包む。
- 7日後、プレートをチェックし、ウイルスのどの希釈は50％の感染を与える決定する - このウイルスの濃度の半分の井戸が感染している）。その後pfu / mlの（PFU -プラーク形成単位）で表現される力価を、計算には次の式を使用してください。式は、ほとんどのバキュロウイルスのマニュアルに含まれています。
IV。細胞に感染
それは、ウイルスの正確な力価を知ることが非常に重要です。ウイルスの必要な量を追加。ウイルスストックの調製のために細胞は、ウイルスの変異の生産に1（ファイブ細胞を1Highする1pfu）高MOIリード以上ではないの感染多重度（MOI）で感染されるべきである。タンパク質生産のため、通常の量はMO1 50から10までです。
例：
mCD1dバキュロウイルスの力価= 1X108 pfu / mlの
追加MOI = 1（ウイルスを増幅する）= 20X10 ^ 6細胞/フラスコ/ 1X10 ^ 8 pfu / mlの= 200 UL /フラスコ
MOI = 5〜10（タンパク質の生産のための）20x10の場合= 1ミリリットルに2ミリリットル^ 6細胞/フラスコ
感染後4日目に、感染細胞を見てください。彼らは、切り離されたフローティング、腫れや成形ソーセージでなければなりません。
上清を回復V.
感染フラスコから培地を取る、と250ミリリットル青色キャップファルコンスピニングボトルに移す。彼らはオートクレーブして再利用することができます。 200rpm、20分間、4℃で均一にボトルを記入し、ソーバルGSAローターで細胞を遠心分離上清を収集し、さらに精製するために進んでください。
VI。組換えmCD1dの精製
- 150mmのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で透析し、濃度
- Ni - NTAアガロースクロマトグラフィーにより、150mmのナトリウムリン酸200 mMのImmidazoleと+ B2MをmCD1dタンパク質を溶出させる
- Immidazoleを取り除くために20mMのトリスHCl PH8緩衝液を用いて脱塩カラムを実行します。
- 残りの汚染物質を除去するためにMonoQカラムを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを実行します。
- YM 30コンセントレータ（Millipore）を用いて1mg/mlに集中する
- 製造業者のプロトコル（アビディティ）によるとmCD1dのBirAを酵素biotynlation
- 遊離ビオチンは、生理食塩水（PBS）、pH7.4の緩衝化リン酸を用いてS200カラム（サイズ排除Chromatograpy）によって除去される。 biotynlated蛋白質の2〜3 MGSの平均は、上清2リットルから得ることができた
- - GalCerをCD1d四量体の製造。
、- GalCerをして水溶性biotynlated CD1d - B2をCD1d分子をロードするためにmは、PBS中の0.5％ツイーン-20、O.9％塩化ナトリウムに溶解- GalCerを三倍モル過剰、室温で一晩インキュベートする。ストレプトアビジンと室温で4時間インキュベート - 四量体はPEの4倍モル過剰の- GalCerをロードしたCD1dモノマーを混合することにより生成されます。 48℃で保存する
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Discussion
この手順では、それは、開始の成長、昆虫細胞に感染し、これらの細胞を用いてバキュロウイルスの力価方法をする方法を示されています。この手順の最も重要な側面は、細胞の維持であり、バキュロウイルスの正確な力価を知ることができます。一度CD1四量体を生成して、それらが糖脂質反応性T細胞の解析のための強力なツールとして使用することができます。バキュロウイルスシステムは、この手順では、はるかに広い適用性を持つように、MHCクラスIIテトラマーを含む組換えタンパク質を生成するために広く使用されています。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
