Summary
곤충 세포를 준비하고 mCD1d tetramers를 생성하는 재조합 mCD1d의 proteinand의 생산의 목적으로 baculovirus으로 그들을 감염하는 방법.
Abstract
CD1 단백질은 항원 제시 분자의 세 번째 클래스를 구성합니다. 그들은 noncovalently beta2 - microglobulin과 관련된 약 50 KDA glycosylated 무거운 사슬로 표현 세포 표면 glycoproteins입니다. 그들은 lipids보다는 펩티드를 바인딩합니다. 그들의 구조가 MHC 클래스 I 및 클래스 II의 항원 제시 분자로 CD1 단백질의 유사성을 확인했지만, mCD1d 홈은 비교적 좁은 깊이, 그리고 높은 소수성이며, 그것은 고전에 대한 설명 여러 얕은 주머니 대신에 두개의 바인딩 주머니를 가지고 MHC - 항원 제시 분자를 인코딩. 자신의 아미노산 시퀀스에 따라, 그러한 hydrobphobic 홈은 지질 항원의 바인딩을위한 이상적인 환경을 제공합니다.
자연 킬러 T (NKT) 세포는 바운드 또는 CD1d에 의해 제시 glycolipids을 인식하기 위해 TCR을 사용합니다. CD1 제시한 lipids에 반응 T 세포는 면역과 전염병에 대한 보호 및 종양 제거에 참여하고 있습니다. 따라서, 식별 정화하고, CD1 - 반응 NKT 세포의 반응을 추적하는 능력은 매우 중요합니다. CD1d와 알파 Galactosyl ceramide (A - Galcer)의 tetramers의 세대는 NKT 세포의 생물학에 상당한 통찰력을하고 있습니다. 다른 CD1 분자로부터 만들어진 Tetramers도 생성되었으며 이러한 새로운 시약이 크게 지질 기반 백신에 대한 반응을 모니터링 잠재적인 사용과 면역 질병 및 기타의 진단에 지질 반응 T 세포의 기능의 지식을 확대 트리 트먼트.
Protocol
마찬가지 세포를 해동
TN5 세포의 냉동 약병을 가지고, 37 ° C의 물을 욕조에 녹여. 25cm 2 TC 플라스크에 곤충 익스프레스 매체 5ml (Invitrogen, 카탈로그 번호 - 10486)를 추가합니다. 익스프레스 주민 글루타민없이 오는 것을 참고, 100X 글루타민 펜 strep 또는 1 다 미디어에 혼자 글루타민의 10ml를 추가해야합니다. 그것에 TN5 세포를 추가하고 27 ° C 배양기에서 30 분 알을 품다. 그런 다음, 플라스크의 바닥에 부착된 세포를 방해하지 않고 부드럽게 DMSO와 매체를 대기음. 신선한 매체의 5ml를 추가합니다.
II. 성장과 세포 확장
매일 세포를 모니터링합니다. 플라스크 거의 70% 합류하면, 양쪽에있는 술병을 닌가하여 정지 전지를 가져와 및 곤충 표현 매체 및 세포 배양의 5ml 21 ML 추가하여 175cm 2 플라스크에 세포를 전송합니다. 각 T175 플라스크은 최종 볼륨으로 25 - 30ml 중간 주변 있어야합니다. 합류 플라스크 (약 1,000,000 / ML CONC.) 필요에 따라 4분의 1 또는 5분의 1. 스플릿 세포의 자라다을하게하지 마십시오. 당신이 세포를 분리한다는 구절의 개수를 계산합니다. 그것이 세포 용해를 발생 세포의 노화가 발생할 수 있기 때문에 통로 번호 30여 성장하지 마십시오. 당신은 1,000,000 / ML의 농도에서 원하는 볼륨에 도달하면, 세포를 감염.
나는 일반적으로 보통 일흔 175cm 2 flasks 약에 금액 2-2.5 리터까지 성장. 25 / 30ml 플라스크, 5 1리터의 Erlenmeyer flasks의 약 수 있습니다. 각 플라스크에 400ml 500 ML
참고 : 하나 T - 175 플러그 인감 플라스크 또는 코닝 Erlenmeyer 플라스크에 세포를 성장하실 수 있습니다. Erlenmeyer Flasks의 성장 세포가 빠르고 쉽습니다.
III. 엔드 포인트 희석 방법으로 바이러스를 Titering
- 익스프레스 오 SFM 매체의 200ul에 플랫 바텀 96 잘 판에 잘 따라 플레이트 3000-5000 세포. 세포가 27 ° C 이상에서 30 분 정착하자.
- baculovirus 주식 일련 희석하십시오. 하나는 잘 당 250ul를 사용하여, 96 음 U 바닥 접시의 한 줄에 10분의 1 희석을해야합니다. Dilutions은 익스프레스 다섯 SFM 매체에 만들어집니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 세포를 다른 dilutions의 고정 금액 (보통 20 UL)을 전송합니다.
- 27 7 일 동안 ° C에서 문화. 가장자리 행을의 증발을 방지하려면, parafilm와 접시의 가장자리를 바꿈.
- 칠일 후에 접시를 확인하고 바이러스의 어떤 희석은 50 % 감염을 제공 결정 -이 바이러스 농도에서 절반 우물이 감염됩니다.) 다음 pfu / ML (pfu - 플라크 형성 단위)로 표시됩니다 titer를 계산하는 수식을 사용합니다. 수식이 가장 baculovirus 설명서에서 찾을 수 있습니다.
IV. 세포를 감염
그것은 바이러스의 정확한 titer를 알고 매우 중요합니다. 바이러스 요구하는 금액을 추가합니다. 바이러스성 재고 준비 전지가 아니라 더 높은 뫄 바이러스는 변이의 생산 리드 (1pfu은 다섯 셀 1High)를 1보다 감염의 다중성 (뫄)에 감염되어야합니다. 단백질 생산, 일반적인 금액은 MO1 50-10 있습니다.
예 :
mCD1d baculovirus의 titer = 1X108 pfu / ML
추가 뫄 = 1 (바이러스를 증폭하기 위해) = 20X10 ^ 6 세포 / 술병 / 1X10 ^ 8 pfu / ML = 200 UL / 술병
뫄 = 5-10 (단백질 생산을위한) 20x10 들어 = 1ml에 2ml ^ 6 세포 / 술병
감염 후 4 일, 감염된 세포보세요. 그들은, 부동, 부어 성형 소세지를 분리해야합니다.
V. 복구 Supernatants
감염된 flasks에서 매체를 가지고, 250ml 파란 모자 팰컨 스피닝 병을로 전송할 수 있습니다. 그들은 autoclaved하고 활용할 수 있습니다. 200rpm 20 분, 4 ° C.에 골고루 병을 기입하고 Sorvall GSA 로터의 세포를 원심 분리기 뜨는를 수집하고 더 정화를위한 진행합니다.
VI. 재조합 mCD1d의 정화
- 150mM 인산 나트륨 버퍼에 투석과 농도 (산도 7.4)
- 니켈 - NTA 아가로 오스 크로마 토그래피함으로써, 150mM 인산 나트륨 200 MM Immidazole와 단백질 mCD1d + b2m을 elute
- Immidazole 없애 20mM 트리스 HCL pH8 버퍼를 사용하여 탈염 컬럼을 실행
- 나머지 오염 물질을 제거 MonoQ 칼럼을 사용하여 음이온 교환 크로마 토그래피를 실행합니다.
- YM 30 농축기 (Millipore)를 사용 1mg/ml에 집중
- 의 비라 효소 biotynlation는 제조 업체의 프로토콜 (욕망)에 따라 mCD1d
- 무료 비오틴은 식염수 (PBS), pH7.4를 버퍼 인산염을 사용 S200 열 (사이즈 제외 Chromatograpy)에 의해 제거됩니다. biotynlated 단백질 2 ~ 3 MGS의 평균 뜨는의 2리터에서 구할 수
- - Galcer CD1d tetramer 생산.
A - Galcer과 가용성 biotynlated CD1d - B2를 CD1d 분자를로드하기 위해서는m은 PBS에 0.5 % 트윈 -20, O.9 %의 나트륨 염화물에 녹아있는 한 Galcer 세 배 이상 초과 어금니와 실온에서 하룻밤 incubated입니다. 복합 streptavidin과 실온에서 4 시간 동안 잠복기 - Tetramers는 PE의 4 배 초과 어금니와 - Galcer 로드된 CD1d 단량체의 혼합에 의해 생성됩니다. 48시 스토어 ° C.
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Discussion
이 절차에서는, 그것은, 시작 성장, 곤충 세포를 감염하고 이러한 세포를 사용하여 baculovirus를 titer하는 방법을하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 세포의 유지 보수하고 baculovirus의 정확한 titer를 알고. 일단 CD1 tetramers를 생성, 그들은 glycolipid 반응 T 세포 분석을위한 강력한 도구로 사용할 수 있습니다. Baculovirus 시스템은 또한 MHC 클래스 II의 tetramers 때문에이 절차는 훨씬 광범위한 응용을 포함하는 재조합 단백질을 생산하기 위해 널리 사용됩니다.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
