Summary
Um método para preparar células de insetos e infectá-las com baculovírus com a finalidade de produção de recombinantes proteinand mCD1d gerando tetrâmeros mCD1d.
Abstract
CD1 proteínas constituem uma terceira classe de moléculas apresentadoras de antígenos. Eles são glicoproteínas de superfície celular, expressos em aproximadamente 50 kDa glicosilada cadeias pesadas que são não covalentemente associados com beta2-microglobulina. Eles se ligam lipídios ao invés de peptídeos. Embora sua estrutura confirma a semelhança das proteínas CD1 ao MHC de classe I e moléculas de classe II apresentando antígeno, o sulco mCD1d é relativamente estreita, profunda e altamente hidrofóbico e tem dois bolsos de ligação em vez dos vários bolsos rasos descrito para o clássico MHC- codificados moléculas apresentadoras de antígenos. Com base em suas seqüências de aminoácidos, como um sulco hydrobphobic fornece um ambiente ideal para a ligação de antígenos lipídicos.
A Natural Killer T (NKT) usar suas células TCR a reconhecer glycolipids vinculado ou apresentados por CD1d. Células T reativas a lipídeos apresentado por CD1 estiveram envolvidos na proteção contra doenças auto-imunes e infecciosas e na rejeição do tumor. Assim, a capacidade de identificar, purificar e controlar a resposta do CD1-reativa de células NKT é de grande importância. A geração de tetrâmeros de alfa galactosyl ceramida (a-GalCer) com CD1d tem uma visão significativa sobre a biologia das células NKT. Tetrâmeros construído a partir de outras moléculas CD1 também têm sido gerados e estes novos reagentes têm expandido o conhecimento das funções das células lipídicas reativa T, com uso potencial no monitoramento da resposta ao lipídica baseado em vacinas e no diagnóstico de doenças auto-imunes e outras tratamentos.
Protocol
I. Descongele as células
Pegue o frasco frozen de TN5 células, e descongele-o em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 5ml de inseto médio Express (Invitrogen, catálogo número 10.486), em 25 centímetros frasco TC 2. Note-se que cinco expresso vem sem Glutamina; precisa adicionar 10ml de strep caneta 100X glutamina ou glutamina sozinha para uma mídia lt. Adicionar TN5 células dentro dele e incubar por 30 minutos em 27 ° C incubadora. Então, aspirado o meio com DMSO delicadamente, sem perturbar as células acoplado na parte inferior do balão. Adicionar 5 ml de meio fresco.
II. Crescendo e expandindo as células
Monitorar as células a cada dia. Quando frasco é quase 70% confluentes, trazer as células em suspensão batendo o frasco em ambos os lados e transferência das células para 175 centímetros 2 frasco, adicionando 21 ml de meio de expressar insetos e 5 ml de cultura de células. Cada frasco T175 deve ter em torno de 25-30ml meio como um volume final. Dividir frasco confluentes (aproximadamente 1.000 mil / ml conc.) 04/01 ou 05/01, conforme necessário. Não deixe que as células cresçam demais. Contar o número de passagens que você dividir as células. Não crescem mais de 30 número de passagem, pois pode causar envelhecimento das células resultantes lise celular. Quando você alcançar o volume desejado na concentração de 1 milhões / ml, infectar as células.
Eu geralmente crescem até 2 a 2,5 litros, o que geralmente eleva a setenta dois frascos de 175 centímetros e aprox. 25 a 30ml frasco / ou cinco frascos contendo 1 litro Erlenmeyer e aprox. 400ml e 500 ml em cada frasco
Nota: Você pode crescer tanto em células T-175 frasco de selo de ficha ou frasco Erlenmeyer Corning. Células cultivadas em frascos Erlenmeyer é mais rápido e mais fácil.
III. A titulação do vírus pelo método de diluição Ponto Final
- Placa de 3000-5000 células por poço em chapa plana inferior de 96 poços em 200ul de Express médio SFM cinco. Vamos resolver as células a 27 ° C por pelo menos 30 minutos.
- Fazer diluição em série de ações de baculovírus. Se deve fazer 10/01 diluição em uma linha de 96 placa de fundo bem U, usando 250ul por poço. Diluições são feitas em meio expresso SFM Five.
- Usando uma pipeta multicanal, transferir um montante fixo (geralmente 20 ul) de diferentes diluições para as células.
- Cultura a 27 ° C por 7 dias. Para evitar a evaporação das linhas de ponta, enrole as bordas da placa com parafilme.
- Após 7 dias, verifique a placa e determinar qual a diluição do vírus dá uma infecção de 50% - metade dos poços nesta concentração de vírus são infectados). Em seguida, use uma fórmula para calcular o título, que se expressa na UFP / ml (UFP placa-unidades formadoras). A fórmula é encontrada na maioria dos manuais de baculovírus.
IV. Infectar as células
É muito importante saber o título exato do vírus. Adicionar a quantidade necessária de vírus. Para a preparação de viral das células deve estar infectado multiplicidade de infecção (MOI) não superior a 1 (1pfu para 1High Cinco celular) Superior MOI leva à produção de mutações virais. Para a produção de proteínas, a quantidade usual é MO1 5-10.
Exemplo:
A título de baculovírus mCD1d = 1X108 UFP / ml
Adicionar MOI = 1 (para amplificar o vírus) = 20x10 ^ 6 células / frasco / 1X10 ^ 8 UFP / ml = 200 ul / frasco
MOI = 5 a 10 (para a produção de proteína) = 1ml a 2ml Para 20x10 ^ 6 células / frasco
No 4 º dia após a infecção, olhe para as células infectadas. Eles devem ser individual, flutuantes, salsichas inchado e formando.
Os sobrenadantes V. Recuperar
Tomar a média de frascos infectados, e transferir para 250ml azul garrafas cap Falcon Spinning. Eles podem ser autoclavados e reutilizados. Preencher as garrafas uniformemente e centrifugar as células em Sorvall GSA rotor em 200 rpm, 20 minutos, 4 ° C. Recolher o sobrenadante e prossiga para posterior purificação.
VI. Purificação de antígeno recombinante mCD1d
- Diálise e concentração em tampão fosfato de sódio 150mm (pH 7,4)
- Por Cromatografia Agarose Ni-NTA, eluir a proteína mCD1d + B2M com 150mm de fosfato de sódio 200 mM Immidazole
- Executar coluna Dessalinização utilizando 20mM Tris Hcl PH8 buffer para se livrar de Immidazole
- Executar cromatografia de troca aniônica utilizando coluna MonoQ para eliminar os contaminantes restantes.
- Concentrar para 1mg/ml utilizando YM concentrador de 30 (Millipore)
- Bira biotynlation enzimática de mCD1d acordo com o protocolo do fabricante (avidez)
- A biotina livre é eliminado por S200 coluna (Chromatograpy exclusão de tamanho), utilizando tampão fosfato salino (PBS), pH7.4. Uma média de 2-3 mg de proteína biotynlated poderia ser obtido a partir de 2 litros de sobrenadante
- Produção de a-GalCer CD1d tetrâmero.
Para carregar CD1d molécula com um GalCer, solúvel biotynlated CD1d-b2m é incubada overnight em temperatura ambiente com três vezes o excesso molar de uma GalCer, dissolvido em 0,5% Tween -20 em PBS, Cloreto de Sódio O.9%. Tetrâmeros são geradas pela mistura de um-GalCer monômeros carregados CD1d com 4 vezes o excesso molar de PE - estreptavidina conjugados e incubar por 4 horas à temperatura ambiente. Armazenar a 48 ° C.
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Discussion
Neste procedimento, é mostrado como iniciar, crescer, infectar células de inseto e como título do baculovírus uso dessas células. Os aspectos mais importantes deste processo são a manutenção de células e de saber o título exato de baculovírus. Depois de ter gerado CD1 tetrâmeros, que pode ser usado como uma poderosa ferramenta para análise de células T glicolipídeo reativa. Sistemas de baculovírus também são amplamente utilizados para a produção de proteínas recombinantes, incluindo tetrâmeros de MHC classe II de modo que este procedimento tem uma aplicabilidade muito maior.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
