Summary
Un método para preparar las células de insectos y las infectan con el baculovirus con el propósito de la producción de proteínas recombinantes proteinand mCD1d generar tetrámeros mCD1d.
Abstract
CD1 proteínas constituyen una tercera clase de moléculas presentadoras de antígeno. Son glicoproteínas de superficie celular, expresado en aproximadamente 50 kDa glicosilada cadenas pesadas que son covalentemente asociados con beta2-microglobulina. Se unen los lípidos en lugar de péptidos. A pesar de su estructura confirma la similitud de las proteínas CD1 a MHC de clase I y clase II que presentan las moléculas de antígeno, la ranura mCD1d es relativamente estrecha, profunda y altamente hidrofóbica y tiene dos bolsillos vinculante en lugar de los bolsillos de varios superficiales descritas para las clásicas MHC- codifican moléculas presentadoras de antígeno. Con base en sus secuencias de aminoácidos, como un surco hydrobphobic proporciona un ambiente ideal para la unión de antígenos lipídicos.
El T asesinas naturales (NKT), las células utilizan su TCR de reconocer glicolípidos obligado o presentados por CD1d. Las células T reactivas a los lípidos presentados por CD1 han estado involucrados en la protección contra las enfermedades infecciosas y autoinmunes y el rechazo del tumor. Por lo tanto, la capacidad de identificar, purificar y hacer un seguimiento de la respuesta de CD1-reactiva de células NKT es de gran importancia. La generación de tetrámeros de alfa galactosil ceramida (a-GalCer) con CD1d tiene una visión significativa sobre la biología de las células NKT. Tetrámeros construido a partir de otras moléculas CD1 también se han generado y los nuevos reactivos han expandido enormemente el conocimiento de las funciones de las células T reactivas de lípidos, con uso potencial en el control de la respuesta a las vacunas basadas en lípidos y en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes y otras los tratamientos.
Protocol
I. Descongelar las células
Tome el frasco de helado de TN5 las células, y descongelar en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 5 ml de medio de insectos Express (Invitrogen, número de catálogo-10486) en el frasco de 25 cm TC 2. Tenga en cuenta que Express cinco viene sin glutamina, necesita agregar 10 ml de estreptococos pluma 100X glutamina o glutamina solo a 1 lt medios de comunicación. Añadir TN5 células en ella y se incuba durante 30 minutos en una incubadora de 27 ° C. Luego, se aspira el medio con DMSO suavemente sin molestar a las células unidas al fondo del frasco. Añadir 5 ml de medio fresco.
II. Crecimiento y expansión de las células
Monitorizar las células todos los días. Cuando frasco es de casi el 70% confluentes, llevar a las células en suspensión por golpear el frasco en ambos lados y la transferencia de las células de 175cm 2 frasco mediante la adición de 21 ml de insectos a medio expresar y 5 ml de cultivo celular. Cada frasco T175 debe tener alrededor de 25-30ml medio como un volumen final. Dividir frasco confluente (aproximadamente 1 millón / ml conc.) 1 / 4 o 1 / 5, según sea necesario. No deje crecer demasiado las células. Cuente el número de pasajes que se han separado de las células. No crecen en el paso número 30, ya que puede causar el envejecimiento de las células resultantes lisis celular. Al alcanzar el volumen deseado en la concentración de 1 millón / ml, infectar las células.
Yo por lo general crecen de 2 a 2,5 litros, que por lo general asciende a setenta y dos frascos de 175 cm y aprox. 25 a 30 ml frasco /, o cinco matraces Erlenmeyer de 1 litro y aprox. 400 ml a 500 ml cada frasco
Nota: puede crecer en las células T-175 frasco de sello de tapón o matraz Erlenmeyer Corning. Crecimiento de las células en matraces Erlenmeyer es más rápido y más fácil.
III. Titulación del virus por el método de dilución de punto final
- Placa de 3000-5000 células por pozo en el fondo plano placa de 96 pocillos en 200ul de medio expreso SFM cinco. Vamos a colocar las células a 27 ° C durante al menos 30 minutos.
- Hacer series de dilución de las acciones de baculovirus. Uno debe hacer dilución 1 / 10 en una línea de 96 y placa inferior U, con 250ul por pocillo. Diluciones se hacen en medio de la ordenación forestal sostenible expreso Cinco.
- Con una pipeta multicanal, la transferencia de una cantidad fija (por lo general 20 ul) de diferentes diluciones de las células.
- La cultura a 27 ° C durante 7 días. Para evitar la evaporación de las filas de borde, envuelva los bordes de la placa con parafilm.
- Después de 7 días, verifique la placa y determinar la dilución de virus que da una infección en un 50% - la mitad de los pozos en esta concentración de virus están infectados). A continuación, utilice una fórmula para calcular el título, que se expresa en ufp / ml (PFU-unidades formadoras de placa). La fórmula se encuentra en los manuales de la mayoría de los baculovirus.
IV. Infectando las células
Es muy importante saber el título exacto del virus. Añadir la cantidad necesaria de virus. Para la preparación del stock viral de las células deben estar infectadas a una multiplicidad de infección (MOI), de no más de 1 (1pfu a 1High Cinco celular) MOI superior lleva a la producción de mutaciones virales. Para la producción de proteínas, la cantidad normal es de 10.5 MO1.
Ejemplo:
El título de baculovirus mCD1d = 1x108 ufp / ml
Añadir MOI = 1 (para amplificar el virus) = 20X10 ^ 6 células / frasco / 1x10 ^ 8 ufp / ml = 200 ul / frasco
MOI = 5 a 10 (para la producción de proteínas) = 1 ml a 2 ml por 20x10 ^ 6 células / frasco
El día 4 después de la infección, mirar las células infectadas. Deben ser individual, salchichas flotantes, se inflaman y forman.
V. Recuperación de los sobrenadantes
Tomar el medio de los frascos de infectados, y la transferencia de 250 ml botellas de color azul tapa Falcon Spinning. Pueden ser esterilizados en autoclave y reutilizado. Llenar las botellas de manera uniforme y centrifugar las células en Sorvall GSA rotor a 200 rpm, 20 minutos, 4 ° C. Recoger el sobrenadante y proceder para una mayor purificación.
VI. Purificación de proteínas recombinantes mCD1d
- Diálisis y concentración en tampón fosfato de sodio 150 mM (pH 7,4)
- De Ni-NTA agarosa cromatografía, eluir la proteína mCD1d + b2m con 150 mM de fosfato sódico 200 mM Immidazole
- Ejecutar columna de la desalación con 20 mM Tris-HCl pH 8 buffer para deshacerse de Immidazole
- Ejecutar cromatografía de intercambio aniónico con columna MonoQ para eliminar los contaminantes restantes.
- Concentrado a 1mg/ml utilizando YM 30 concentrador (Millipore)
- Biotynlation BirA enzimática de mCD1d acuerdo con el protocolo del fabricante (avidez)
- La biotina libre se elimina por la columna S200 (Chromatograpy de exclusión de tamaño) con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4. Un promedio de 2 a 3 mg de proteína biotynlated se podría obtener de dos litros de sobrenadante
- Producción de un tetrámero-GalCer CD1d.
Para cargar molécula CD1d con un GalCer, soluble biotynlated CD1d-b2m se incubaron durante la noche a temperatura ambiente, con tres veces superior a molar de un GalCer, disuelto en Tween 0,5% y el 20 en PBS, O.9% de cloruro de sodio. Tetrámeros se generan por la mezcla de uno-GalCer monómeros cargados CD1d con 4 veces superior a molar del PE - estreptavidina conjugada y la incubación durante 4 horas a temperatura ambiente. Almacenar a 48 ° C.
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Discussion
En este procedimiento, se muestra cómo iniciar, crecer, infectar células de insecto y cómo el título de la baculovirus uso de estas células. Los aspectos más importantes de este procedimiento son el mantenimiento de las células y saber el título exacto de baculovirus. Una vez que se han generado CD1 tetrámeros, que puede ser utilizado como una herramienta poderosa para el análisis de glicolípido las células T reactivas. Sistemas de baculovirus también se utilizan ampliamente para producir proteínas recombinantes, incluyendo tetrámeros de MHC de clase II por lo que este procedimiento tiene una aplicación mucho más amplia.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
