Summary
Vi presenterar ett protokoll som kombinerar cellisolering och helcells patch-clamp-inspelning för att mäta de elektriska egenskaperna hos de primära dissocierade epitelcellerna från råtta cauda-epididymiderna. Detta protokoll möjliggör undersökning av de funktionella egenskaperna hos primära epididymepitelceller för att ytterligare belysa epididymis fysiologiska roll.
Abstract
Epididimis är ett viktigt organ för spermmognad och reproduktiv hälsa. Det epididymala epitelet består av intrikat kopplade celltyper som skiljer sig inte bara i molekylära och morfologiska särdrag utan även i fysiologiska egenskaper. Dessa skillnader speglar deras olika funktioner, som tillsammans skapar det nödvändiga mikromiljön för utveckling av post-testikulär spermier i epididymalumen. Förståelsen av de epididymala epitelcellernas biofysiska egenskaper är kritisk för att avslöja deras funktioner i spermier och reproduktiv hälsa, både under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Även om deras funktionella egenskaper ännu inte har klarlagts kan de epididymala epitelcellerna studeras med hjälp av patch-clamp-tekniken, ett verktyg för mätning av cellhändelser och membranegenskaper hos enskilda celler. Här beskriver vi metoderna för cellisolering och helcells patch-clamp-inspelning till meaSäkerligen de elektriska egenskaperna hos primära dissocierade epitelceller från råtta cauda-epididymiderna.
Introduction
Epididimis i den manliga reproduktiva kanalen är ett organ fodrad med ett lager av mosaikepitelceller. Liksom i andra epitelvävnader fungerar de olika celltyperna i det epididymala epitelet, inklusive huvudceller, klara celler, basala celler och celler från de immunologiska och lymfsystemen, på ett samordnat sätt för att fungera som barriären vid tubulefronten och som Stödande celler för spermmognad och fysiologi 1 , 2 , 3 . Sålunda spelar dessa epitelceller en viktig roll i reproduktiv hälsa.
Epitelceller betraktas allmänt som icke-excitativa celler som inte kan generera all-of-none-actionpotentialer som svar på depolariserande stimuli, på grund av brist på spänningsgrindade Na + eller Ca 2+ kanaler 4 , 5 . Epitelceller uttrycker emellertid uniQue satser av jonkanaler och transportörer som reglerar deras specialiserade fysiologiska roller, såsom utsöndring och näringstransporter 6 . Olika epitelceller har därför karakteristiska elektriska egenskaper. Exempelvis uttrycker huvudcellerna CFTR för flytande och kloridtransport och uttrycker TRPV6 för kalciumreabsorption, medan de klara cellerna uttrycker protonpumpen V-ATPas för luminal försurning 1 , 7 , 8 , 9 . Vissa transportörer och jonkanaler som reglerar de fysiologiska egenskaperna hos de epididymala epitelcellerna har rapporterats, men de funktionella egenskaperna hos epididymepitelceller är i stor utsträckning ännu inte insatta 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-cell-patch-clamp-inspelning är en väletablerad teknik för att undersöka de inneboende egenskaperna hos både excitativa och icke-excitativa celler och är särskilt användbart för att studera funktionerna hos primärt dissocierade celler i heterogena cellprover; Spänningsklemmen används för mätning av passiva membranegenskaper och jonströmmen hos enskilda celler 14 , 15 . De passiva membranegenskaperna innefattar ingående motstånd och kapacitans. Den tidigare parametern indikerar den inneboende membranledningen, medan den senare innebär cellmembranets yta (ett fosfolipid-dubbellager, där jonkanaler och transportörer är placerade, som tjänar som en tunn isolator som separerar extracellulärt och intracellulärt medium). Membrankapacitansen är direkt proportionell mot cellmembranets yta. Tillsammans med membranmotståndet som reflekteras av ingångsmotståndet, är membranstidskonstanten, wVilket indikerar hur snabbt cellmembranpotentialen reagerar på flödet av jonkanalströmmar, kan bestämmas. I detta avseende bestäms genom att kombinera de aktuella responsegenskaperna från en serie spänningssteg som appliceras på cellerna, bestäms de biofysiska kinetikema och egenskaperna hos cellerna 15 , 16 , 17 , 18 .
I det föreliggande papperet beskriver vi förfarandena för isolering av epitelceller från råtta cauda-epididymis och stegen för mätning av membranegenskaperna hos olika celltyper i den dissocierade cellblandningen med användning av helcellsplåstret. Vi visar att de epididymala huvudcellerna uppvisar distinkta membranelektrofysiologiska egenskaper och att konduktanserna lätt kan identifieras från andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs i enlighet med riktlinjerna för Institutionsdjurs- och användningskommittén för ShanghaiTech University, som uppfyller lokala och internationella krav.
1. Experimentella djur
- Använd vuxna manliga Sprague-Dawley-råttor (~ 300-450 g) mellan 8-12 veckor gamla. Vid denna ålder i råttorna har spermierna anlänt till cauda-epididymiderna.
2. Isolering av epitelceller från Rat Cauda Epididymider
OBS: Följande steg utförs under icke-aseptiska förhållanden om inget annat anges.
- Framställning av dissektionsinstrument och reagenser
- Desinficera dissektionsverktygen genom nedsänkning i 70% etanol och låt dem lufttorka.
- Slå på uppvärmningsbadet (32 ° C); Förbered och förvarma 500 ml 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) kompletterat med 1% (volym / volym) antibioTics (100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin-slut) och märkt som "RPMI (+ P / S 1: 100)". Utför detta steg i en ren luftflödesstyrd arbetsstation.
- Förbered och förvarma 1 x 500 ml Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM) innehållande icke-essentiella aminosyror (0,1 mM) och natriumpyruvat (1 mM) och kompletterat med 5-a-dihydrotestosteron (1 nM), 10% fetalt bovint Serum, 1% (volym / volym) antibiotika (100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin-slut) och märkt som "Full-IMDM". Skapa 50 ml alikvoter och försegla med parafilm; Lagra vid 4 ° C. Använd aseptiska förhållanden.
- Förbered en kollagenas enzym digereringslösning genom att lösa kollagenas typ I och kollagenas typ II i RPMI (+ P / S 1: 100) vilket resulterar i 1 mg / ml av varje kollagenas i lösningen. Filtrera genom ett 0,22 μm membran och markera som "kollagenaslösning". Förvara vid rumstemperatur (RT) tills användning. Justera volymen av enzymlösningen baseradPå enzymets vikt Den minsta volymen som krävs för båda cauda-epididymiderna från en enda råtta är 2 ml.
- Fyll en 35 mm skål med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Dissektion av råtta cauda-epididymider
- Uppoffera djuret genom att antingen använda natriumpentobarbital 85 mg / kg ip eller använda en isoflurankammare tills djuret inte svarar mot svansstimulering; Följ av cervikal dislokation.
- Desinficera underlivet genom att torka med 70% etanol, tryck försiktigt de två testorna ner till underlivet och öppna sedan nedre delen av buken nära pungen.
- Plocka upp det epididymala fettet, dissekera hela reproduktionsorganen (testiklar, epididymider och vasdeferenser) och nedsänk i rätterna med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Överför reproduktionsorganen i skålen med RPMI (+ P / S 1: 100) till en aseptisk arbetsstation.
- Dissektera cauda-epididymiderna från bindväv och fettvävnader och epiDidymalkapsel. Placera en epididymis med ~ 0,2 ml kollagenaslösning i ett 1,5 ml rör. Formätta detta steg i en ren luftflödesstyrd arbetsstation.
- Dissociation av enskilda celler från råtta cauda-epididymider
- Skär epididymiderna i kollagenaslösningen med en fin sax tills vävnaden blir en pastaliknande vätska. Skölj saxen försiktigt med resten av (~ 0,8 ml) enzymlösning i 1,5 ml röret.
- Placera röret på en metalltermomixer under 30 minuter vid 37 ° C med en skakhastighet på 1000 rpm.
- Centrifugera enzymvävnadsblandningen vid 30 xg vid RT under 3 minuter och dekantera den klibbiga supernatanten som innehåller mestadels spermierna.
- Resuspendera pelleten i 1 ml Full-IMDM för att släcka all den enzymatiska aktiviteten. Överför cellsuspensionen till ett 50 ml rör innehållande 49 ml RPMI (+ P / S 1: 100).
OBS! Alternativt filtreras cellsuspensionen genom ett 100 μm mesh membran med konstant trituratJon för att undvika stora cellaggregat. Använd dock inte ett nätfilter om cellupphängning behövs för att odla cellmonolager. - Centrifugera den cellulära blandningen vid 30 xg vid RT under 10 minuter; Dekantera supernatanten.
- Resuspendera pelleten i 1 ml Full IMDM med försiktig triturering i minst 5 minuter för att dissociera enskilda celler från de enzymatiskt behandlade epididymala vävnadsblandningarna.
- Separation av epitelceller från andra celler under aseptiska förhållanden
- Kultur cellsuspensionen på en 10 cm petriskål med Full-IMDM under minst 8 h eller över natten, i en inkubator vid 32 ° C i 5% CO2.
- Förbered sterila täckglas i förväg genom nedsänkning i 100% alkohol. Lufttorka och doppa i en liten volym av odlingsmediet. Placera täckglasen i 6 cm odlingsrätter eller i enkla brunnar i en brunn med 24 brunnar.
- Nästa morgon skörda dissocierade epitelceller genom att försiktigt samla celluppsättningenSion från petriskålen, som består mestadels av epitelceller. Centrifugera cellsuspensionen vid 30 xg vid RT under 5 minuter och dekantera sedan supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i ~ 2 ml Full IMDM.
- Säd 0,2 ml av den skördade cellsuspensionen på mitten av varje steril täckglas.
- Låt cellsuspensionen sätta sig i vätskedroppen i minst 10 minuter för att låta cellerna löst hänga vid glasskyddet. Lägg försiktigt 1 ml Full IMDM i kanten av 10 cm fat eller 0,3 mL Full IMDM till varje brunn i en brunn med 24 brunnar. Stör inte cellerna.
- Hålla de isolerade enstaka celler på täckglas i inkubatorn vid 32 ° C i 5% CO 2 tills patch-clamp-experiment.
3. Inspelningslösningar och mikropipetter
OBS! För patch-clamp-experimenten, använd kemikalier och lösningar av bästa kvalitet.
- Framställning av stamlösningar
- Autoklavera alla flaskor för lagring av lager och filtrera alla lagerlösningar (utom korrosiva lösningar) och filtrera genom 0,22 μm membran före användning.
- Förbered alla lagerlösningar i förväg vid RT, och lagra vid 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH 2 PO 4; 100 mM EGTA (pH 7,0 med KOH). Hantera 5 M NaOH, 1 M HCl och 1 M KOH lager som frätande lösningar.
- Förberedelse av standard extern inspelning fysiologisk saltlösning (PSS)
- Varm lagerlösningarna till RT på morgonen på patch-clamp-inspelningen.
- Pipett ingredienserna från varje lager enligt den önskade slutliga volymen, med undantag av CaCl2, t ex för framställning av 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml 1M; 1,2 mM MgCl2 = 6 ml av 100 mM; 1.2 mM NaH 2 PO 4 = 3 ml av 200 mM.
- Lägg till dubbla-distilled vatten (DDH 2 O) för att den slutliga volymen av 400 ml och jämvikt.
- Väg 0,9 g glukos och 1,19 g HEPES och lösa upp fullständigt i lösningsblandningen.
- Tillsätt CaCl 2- stammen (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) under omröring.
- Lägg till upp till 99% av slutvolymen.
- Justera pH till 7,4 med användning av NaOH eller HCl.
- Kontrollera osmolariteten och justera med 5 M NaCl eller glukos, om det behövs.
- Lägga DDH 2 O för att den slutliga volymen av 500 ml i en cylinder.
- Framställning av mikropipettinterna lösningar (låga EGTA K + -baserade lösningar)
- Väga eller pipettera den korrekta volymen av reagensen från varje lager i enlighet med den önskade slutliga volym och koncentration, t ex för framställning av 50 ml lågt EGTA K + -baserad intracellulär lösning till en volym av ~ 30 ml DDH 2 O: 100 mM K-glukonat = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml 1 M; 2 mM MgCb 2 = 1 mlAv 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
- Tillsätt tillräckligt med vatten för ~ 95% slutvolym och låt lösningen ligga i jämvikt vid RT. Se till att lösningen är klar.
- Medan ständigt omröring av lösningen, justera pH till 7,2 med användning av KOH.
- Väg och tillsätt 0,078 g Mg-ATP till lösningen tills det är helt upplöst.
- Placera lösningen på is och använd en liten alikvot för mätning av osmolaritet. Lösningarna mäter vanligen ~ 290 mOsmol och behöver inte justeras. Om osmolariteten skiljer sig avsevärt från 280-295 mOsmol, förbereda en ny lösning.
- Lägga DDH 2 O till slutlig volym.
- Dela lösningen i 500 μl alikvoter, filtrera med ett 0,2 μm sprutfilter, tätt försegla och omedelbart lagra vid ≤ -20 ° C.
- På dagen för patch-clamp-experimentet tina en alikvot av intracellulär lösning på is och hålla kyld under patch-clamp-experimentet tillFörhindra nedbrytning.
- Dra patchpipetterna från glaskapillärer (efter användarhandbok för pipettdragare) för att få mikropipettstorlekar med resistans 5-10 M när de fylls med intracellulär lösning.
4. Konfigurera patch-Clamp Experiment och etablera helcells konfiguration med celler
- Inställning av patch-clamp-experimentet
- Sätt på patch-clamp setup (dator, datorstyrd förstärkare, digitalizer, etc. )
- Öppna patch-clamp-programvaran ( t.ex. AXON pCLAMP10 eller HEKA PatchMaster) och ställ in protokoll för elektrofysiologiska inspelningar. Ställ in filtret för signalen till lågpass vid 1-3 kHz och digitaliseraren vid 10-20 kHz.
- Slå på kameran, mikromanipulatorn och ljuskällan.
- När den datorstyrda förstärkaren är på, mäter experimentörens kropp genom att röra med plåsterna, som är jordad,Innan du rör huvudet, för att skydda det mot elektriska stötar.
- Överför odlingsepitelcellerna på glasskyddet till inspelningskammaren fylld med ~ 1 ml standard PSS vid RT. Förbättra försiktigt badet PSS minst två gånger med en pipett före några patch-clamp-experiment.
Obs! Fyll perfusionssystemet med standard PSS eller annan extern lösning, enligt det planerade experimentet. Perfuse den mikroskopmonterade inspelningskammaren (RC-26G eller RC-26GLP) med PSS några gånger med en hastighet av ~ 2 ml / min innan du startar patch-clamp-experimenten. Se till att det inte finns några luftbubblor fastnade längs perfusionssystemet. - Visa och välj cellerna under ett inverterat mikroskop med hjälp av 10X och 40X-mål utrustade med ett differential-interferens-optiskt system. Leta efter stora enskilda isolerade celler för inspelning. Identifiera de isolerade epididymepitelcellerna genom sin sfäriska form med grov mMikrovilli på ena änden av membranen och polariserad fördelning av intracellulärt innehåll ( Figur 1 ).
- Använd en 1 ml spruta (en hemmagjord nonmetallic microsyringe nål), fyll en mikropipett med den inre lösningen (låg EGTA K + -baserad lösning, se steg 3.3). Se till att det inte finns några luftbubblor i mikropipetten, vilket kan öka mikropipettens motstånd. Använd tillräcklig lösning så att den inre lösningen nedsänker den kloridbelagda silvertrådelektroden i mikropipetthållaren.
- Montera mikropipetten i elektrodhållaren och applicera ett lågt positivt tryck (~ 0,2 ml sprutvolym). Håll det låga positiva trycket kontinuerligt tills du rör cellmembranet i senare steg.
- Upprättande av helcells konfiguration med celler för inspelningar
- Sänk pipetten i badlösningen med högsta hastigheten på mikromekanipulatorn. Hitta pipettenTips på skärmen ansluten till digitalkameran; Sakta ner micromanipulatorns hastighet till mediumhögt läge.
- Kontrollera snabbt mikropipettmotståndet (5-10 MΩ) med hjälp av datainsamlingsgränssnittskommandot ( t.ex. "Membranstest" i AXON-systemet) genom att använda ett spänningssteg ( t.ex. 5 mV för 100 ms) som genereras från den datorstyrda förstärkaren. Byt till en ny mikropipett om resistansen ligger betydligt utanför detta intervall.
- Börja flytta ner målet som är monterat på mikroskopet. Styr gradvis mikropipetten mot den valda cellen. Sänk alltid objektet först och sänk sedan mikropipetten till fokusplanet tills mikropipetten ligger över mitten av den valda cellen.
- Avbryt vätskekopplingspotentialen mellan pipett- och badlösningarna till noll med hjälp av kommandot "pipette offset" i programvarans gränssnitt.
- Ställ in den datorstyrda förstärkaren commAndra till spänningsklämma och membranstestet till "bad" -läget.
- Fina fokus för en tydligare bild av cellen, sänk sedan gradvis mikropipetten med hjälp av mikromanipulatorn vid lågmediumhastigheten.
- När mikropipetten är nära cellen (visad av en minskad ström när den utlöses av membranstestkommandot), avlägsna det låga positiva trycket omedelbart och använd ett svagt negativt tryck (0,1 ml sprutvolym) för att bilda gigasal (> 1 GΩ) .
- Övervaka resistansen med membranprovet. Om motståndet är> 500 MΩ men <1 GΩ, använd en negativ potential (vanligtvis som hållpotentialen som är inställd på -60 mV), vilket kan hjälpa till att bilda gigasalen. Kompensera mikropipettens övergående kapacitiva ström.
- Om tätningen är> 1 GΩ och stabil (som visas i mjukvarans gränssnitt), applicera en kort och stark sug för att bryta cellmembranet. Applicera inte ersättning för seRies motstånd och cell kapacitans.
- Omedelbart efter att ha uppnått en lyckad helcells-konfiguration, applicera ett 10 mV hyperpolariseringssteg (5 spår med minimala tidsintervaller, 20 ms varaktighet, signalprov vid 20 kHz) från en hållarpotential på -60 mV.
- Växla spänningsmodus till nollströmsläge och markera avläsningarna från mjukvarubränssnittet eller utför en gapfri inspelning (10-60 s) för cellens membranpotentialläsning.
- Snabbkoppla tillbaka till och stanna i spänningsmodus och använd spänningsprotokoll enligt de planerade experimenten och mäta nuvarande svar. Subtraktion appliceras inte på den inneboende läckströmmen under inspelningarna.
- Övervaka stabiliteten hos svaren under inspelningarna eller cellens olika parametrar. Använd exempelvis kommandot gränssnittet "Membran Test" för att kontrollera ingångsmotståndet (R i ), seriemotståndet (R s ) och cellenmembran kapacitans (Cm) i membrantest hos "Cell" läget under omkopplaren protokoll.
OBS! Plötsliga droppar i ingångsresistens är vanligtvis indikativa för en lös patch och en dramatisk ökning av serieresistensen kan vara en indikation på mikropipettspetsstoppning genom de intracellulära organellerna eller membranfragmenten. Under inspelningen ska du regelbundet övervaka mikropipettplatsen för att kontrollera om drift uppstår, vilket kan leda till förlust av plåstret. Om drift är ett problem, lyft försiktigt mikropipetten och patchcellen bort från undersidan av inspelningskammaren. Detta steg kan ibland leda till förlusten av plåstret, i vilket fall det är nödvändigt att upprepa hela cell-patch-klämproceduren.
5. Analys av passiva elektrofysiologiska egenskaper hos celler
- Efter att ha erhållit data från patch-clamp-experimenten öppnar du gapfria data i Clampfit-programvaran och mäter medelvärdetVärde för vilande membranpotential för varje cell. Alternativt, använd värdet som markerat ner från nollströmsspänningen vid nuvarande läge. Korrigera värdena med vätskekopplingspotentialen (12,4 mV i denna studie).
- Öppna data från 10-mV hyperpolariseringssteget (AV) som erhållits från en cell, mäta strömskillnaden före och under steget (A I- steg ) och beräkna ingångsmotståndet (R i ) med ekvationen som:
- Beräkna cell kapacitans (Cm, i enhet av pF) (använda samma strömdata från 10-mV hyperpolariserande steg genom att integrera den totala arean under membranet kondensatorströmmen under den initiala transienta avklingning strömmen höjs på spänningen steget trigger), För att erhålla värdet av den totala ackumulerade laddningen (Q, i enheten av pA • ms) hos cellen. Använd följande ekvation:
- Beräkna värdet på seriemotståndet (R s ) för varje cell genom att passa den initiala transientströmmen från 10-mV-negativa steget med en standardexponentiell algoritm för att erhålla tidskonstantnedbrytningsströmmen ( T , i enhetsenhet ms) och använd Följande ekvation:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna enzymatiska digestionsförfarandet för isolering av epitelceller från råtta-cauda-epididymiderna är ett modifierat protokoll från våra tidigare studier 9 , 12 . Denna metod producerar en blandning av enkla celler med över 90% livskraft och utan ytan blåsor eller svullnad cellvolym. Den heterogena cellblandningen består huvudsakligen av huvudceller, klara celler och basala celler, såsom vi har beskrivit tidigare 1 . I detta protokoll kan relativt rena prov av epididymala epitelceller erhållas genom odling av de primära dissocierade cellerna över natten på en petriskål för att tillåta vidhäftning av icke-epitelcellerna (såsom fibroblaster och jämna celler) på skålen, såsom Demonstreras i figur 1A (före skörd). Celltyperna kan sedan preliminärt särskiljas av deras fenotyper under mikroskopetOch kategoriseras enligt deras specifika passiva membranegenskaper. I den dissocierade cellblandningen finns en grupp celler som har mikrovilli eller ett grovt membran i ena änden av deras ytmembran och polariserat cellulärt innehåll; Dessa benämns de primära cellerna eller de klarliknande cellerna ( Figur 1B , pilar). Dessa polariserade epitelceller är oskiljbara genom deras morfologiska särdrag men kan identifieras i enlighet med deras passiva membranegenskaper och konduktanssvar erhållna från hela cell-patch-clamp-inspelningarna. Den andra gruppen av celler är mindre i storlek utan stereokilier i ena änden av membranet och inget uppenbart polariserat cellulärt innehåll; Dessa benämns nej-mikrovilli-cellerna, och består huvudsakligen av basala celler ( Figur 1B , asterisker).
De primära epitheliella huvudcellerna kan särskiljas från andra celler avIr distinkta passiva membranegenskaper ( Figur 2 ) och strömmönster ( Figur 3 ) som svar på det applicerade spänningsprotokollet med användning av helcellsplåster-klämtekniken. Cellernas passiva membranelektrofi-fysiologiska egenskaper kan hjälpa till att bedöma den ursprungliga hälsostatusen hos enskilda celler och av celltypgrupper. En sammanfattning av de individuella punktdiagram av membranet kapacitans (Cm), ingångsmotstånd (R m) och membranpotentialen (V m) för varje cellgrupp ges i figur 2A. Det finns ingen skillnad i tidskonstanten för membrankapacitansen bland de olika celltyperna (~ 0,4 ms) (data visas inte i detta manuskript). Med den låga EGTA K + -baserade lösningen är den genomsnittliga uppmätta membrankapacitansen för huvudcellerna 9,4 0,5 pF (n = 32) och för de klara cellerna är 9,7 1,9 pF (n = 12). Membran kapacitansen avNej-mikrovilli-cellerna är 5,2 0,8 pF (n = 17), vilket är statistiskt mindre än huvudkroppen och de klara cellernas membrankapacitanser.
Huvudcellernas ingångsmotstånd i Figur 2A (mittpanel) är 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) och för clear cells är 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), vilket är signifikant lägre (P <0,001) än Den för nej-mikrovilli-cellerna (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Såsom visas i figur 2A (högra panelen), framnollströmsmembranpotential (dvs. den vilande membranpotential V m) mätt kort efter upprättandet konfigurationen hel-cell och används för att jämföra grupperna efter korrigeringen med flytande övergångspotentialen (12,4 mV). Celler badades rutinmässigt i standard PSS och dialyserades med 0,1 mM EGTA K + -baserad pipettlösning innehållande ATP. MEanmembranpotentialen hos huvudcellerna är -26 ± 2 (n = 28), mellan -51 mV och +1 mV, och den medelhöga cellens medelmembranpotential är -30 ± 3 mV (n = 10), Mellan-47 mV och -17 mV. De icke-mikrovilli cellerna har den högsta medelmembranpotentialen med ett värde av -33 ± 5 mV (n = 17), mellan -63 mV och -13 mV.
De primära cellernas låga ingångsresistens antyder att det finns inbyggda konduktanser i dessa celler, men det kan indikera läckage av tätningen mellan pipetten och patchcellsmembranen. För att ta itu med detta problem uteslutte vi först data från de cellerna med plötsliga förändringar (som indikerar att en tätningsläcka) av de elektriska egenskaperna under inspelningar. Därefter analyserade vi korrelationen mellan tätningsmotståndet vid ett tröskelvärde på 1 giga-ohm med ingångsmotståndet, vilket visas i figur 2B . Resultatet var ett mycket lågt korrelationsvärde (R 2 ≈ 0,02). Detta föreslår att tätningsmotståndet har försumbar inverkan på ingångsmotståndet och att de rapporterade passiva elektriska egenskaperna hos de olika cellerna (såsom den primära cellens låga ingående motstånd) är de egna egenskaperna hos dessa celler.
Figur 3A är det typiska nuvarande svaret som registreras från huvudcellerna under kvasi-fysiologiska betingelser med cellerna som badar i normal fysiologisk saltlösning (PSS), dialyseras med en låg EGTA K-baserad pipettlösning och stimuleras från en hållarpotential på -60 mV Till en serie på 500 ms testspänningar (från -120 mV till +60 mV som indikeras i insatsen i figur 3B ). De två spåren i figur 3C visar de typiska vilande membranresponserna hos en identifierad huvudcell under nollströmsklämman i närvaro av ellerFrånvaro av ATP i pipettlösningen. I närvaro av ATP är vilopotentialen relativt stabil. Medan en progressiv hyperpolarisering observerades när celler dialyserades med en pipettlösning utan ATP. Den initiala vilande membranpotentialen uppmätt vid celldialysens början med pipettlösningar visar ingen signifikant skillnad i cellerna med eller utan ATP ( Figur 3D ), vilket tyder på att de uppmätta värdena fortfarande var intakta och minimalt påverkades av pipettlösningarna.
Figur 1 : Morfologiska särdrag hos isolerade råtta cauda-epididymepitelceller. ( A, B ) Exempel på epitelcellerna isolerade från råtta cauda-epididymider före ( A ) och efter ( B ) återhämning av oveRnight kultur på maträtten innan patch-clamp experiment. Pilar indikerar mikrovilli-cellerna, som huvudsakligen består av de huvudsakliga cellerna och de klarliknande cellerna. Asterisker indikerar nej-mikrovilli-cellerna. Endast enstaka celler valdes för patch-clamp-inspelning. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2 : Passiva membranegenskaper av epididymepitelceller med enkel råtta. ( A ) Punkter av de passiva membranegenskaperna hos epidemiella epithelialceller med enkel råtta. Pipettlösningen är låg EGTA K + -baserad och badlösningen är standard PSS. ( B ) Korrelationsanalys av ingångsresanIstans med cellens tätningsmotstånd. NS : ingen signifikant skillnad, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 signifikant skillnad jämfört med lämpliga kontroller med enkelriktad ANOVA med Bonferroni post-hoc-test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3 : Typiska helcellsströmmar i enskilda epididymala huvudceller. ( A ) Typiska helcellsströmmar upptagna från enkla epididymala epitelceller inspelade under kvasi-fysiologiska förhållanden med användning av ett puls-framkallande protokoll såsom visas i insatsen av panal B. Den streckade linjen indikerade nollströmnivåerna. ( B ) Spänningsförhållandet för det aktuella svaretEs mätt vid de angivna tidpunkterna som i A. Data är medelvärdet ± SEM på åtta huvudceller från minst tre djur. ( C ) Representativa spårämnen av vilande membranpotential hos huvudcellerna dialyserade med en pipettlösning, antingen med ATP (+ ATP) eller utan ATP (-ATP). ( D ) Ett stapeldiagram som inte visar någon signifikant skillnad mellan den initiala vilemembranpotentialen för + ATP och -ATP. Värden är medelvärden ± SEM mätt vid den tid som anges i panel C. Antal i fästet i fälten anger antalet testade celler från minst tre djur. NS : ingen signifikant skillnad. ( E ) Korrelationsanalyser av tätningsmotståndet och ingångsmotståndet hos alla celler, eller endast de huvudsakliga cellerna, jämfört med vilemembran som mäts vid nollströmsklämman strax efter helcellsinrättningen och nuvarande magniteter mätta vid hyperpolariserande Steg till -100 mV från att hålla potential. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll gav den enzymatiska dispersionen av råtta cauda-epididymider konsekvent friska epitelceller. Kvaliteten hos de epididymala epitelcellerna för patch-clamp-experimenten är beroende av några kritiska steg i protokollet. Exempelvis är centrifugeringen av cellblandningen vid en låg centrifugalkraft (30 xg) viktig för att avlägsna spermatozoa och den epididymala luminala halten; De epididymala epitelcellerna blir ohälsosamma i närvaro av spermatozoa i cellodlingen. Dessutom odlar den dissocierade cellblandningen på en petriskål i flera timmar ett viktigt steg för att avlägsna fibroblasterna och de glatta muskelcellerna; Icke-epitelcellerna klistrar snabbare på odlingsskålen och lämnar sålunda epitelcellerna i suspensionen, som kan återhämtas genom försiktig aspiration. Vidare är kollagenas digestion och trituration med en fin glaspipett de två viktiga stegen att frigöraEnkla celler under celldissociationsförfarandet. Slutligen är den enzymatiska digestionen av epididymcellerna kritisk för patch-clamp-experimentet, eftersom underförtunning genom ineffektiv enzymatisk aktivitet eller överdjupning genom långvarig inkubation både kan störa giga-ohm-tätningsbildningen mellan pipetten och cellmembranen.
I cellblandningarna är cellerna i en större kolonnform med en grov membranbärande stereocilier i ena änden och polariserad fördelning av det intracellulära innehållet förmodligen de huvudsakliga cellerna eller de klara cellerna. Andra celler som inte har framträdande mikrovilli och polariserade cellinnehåll kan innefatta basala celler och vissa celler från immunsystemet. Förutom att beskriva grundläggande morfologiska särdrag hos epididymepitelceller använder detta protokoll hela cell-patch-clamp-metoden för att mäta passivmembranegenskapen hos varje cell. Dessa membranegenskaper möjliggör preliminär åtskillnad avCelltyperna. Denna metod har vissa begränsningar såsom utplåning av det intracellulära innehållet med pipettlösningen och elektroniska variationer i relation till de cellulära arkitekturmodifieringarna under kontinuerliga inspelningar 19 , 20 . Vi tillhandahåller endast de parametrar som vi mätt omedelbart efter etableringen av helcells konfigurationen, vilket återspeglar de initiala, relativt intakta förhållandena hos cellerna. De passiva membranegenskaperna hos varje cell innefattar membrankapacitansen, ingångsmotståndet och vilemembranpotentialen.
Den specifika kapacitansen hos cellmembran är allmänt överens om att vara 1 ^ F / cm ^ och detta gäller för celler (såsom immunceller och neuroner) med begränsad vikning på sina cellulära membran 16 , 18 . Den specifika kapacitanskonstanten tenderar emellertid att vara större för cellerna wI mer komplexa, cellulära arkitekturer, som epitelcellerna, som har många cellulära membranveck i olika fack. Rapporter visar att MDCK epithelialcellinjärvärdena är 4 μF / cm 2 och 3 μF / cm 2 för de apikala och basala membranspecifika kapacitanserna respektive 17 . I den aktuella studien är de uppmätta genomsnittliga membrankapacitanserna ~ 8 pF och ~ 12 pF för nej-mikrovilli-cellerna och de primära cellerna och clearliknande celler grupp ( dvs mikrovilli-celler). Med användning av den specifika kapacitansen 1 μF / cm 2 för våra beräkningar är de beräknade cellytorna 500 μm 2 och 1000 μm 2 för nej-mikrovilli celler respektive mikrovilli celler, vilket motsvarar diametrarna 13 μm och 18 um. Dessa uppskattningar är emellertid större än vad som förväntades baserat på cellstorlekarna under mikroskopet, vilka är ~ 81; m och ~ 12 | j, m för no-mikrovilli celler och mikrovilli-celler, respektive, och dessa celler är ca 2,4 | iF / cm 2 och 1,9 | iF / cm 2, respektive. Våra resultat indikerar att membranlandskapet hos icke-mikrovilli-celler är mer komplext än mikroviruscellerna, vilket överensstämmer med deras sekretions- och transportfunktioner.
Den specifika kapacitansen hos cellmembran är allmänt överens om att vara 1 ^ F / cm ^ och detta gäller för celler (såsom immunceller och neuroner) med begränsad vikning på sina cellulära membran 16 , 18 . Den specifika kapacitanskonstanten tenderar emellertid att vara större för celler med mer komplexa, cellulära arkitekturer, som epitelcellerna, som har många cellulära membranveck i olika fack. Rapporter visar att MDCK epithelialcellinjevärdena är 4 μF / cm 2 och 3 μF / cm 2 17 respektive 17 . I den aktuella studien är de uppmätta genomsnittliga membrankapacitanserna ~ 8 pF och ~ 12 pF för nej-mikrovilli-cellerna och de primära cellerna och clearliknande celler grupp ( dvs mikrovilli-celler). Med användning av den specifika kapacitansen 1 μF / cm 2 för våra beräkningar är de beräknade cellytorna 500 μm 2 och 1000 μm 2 för nej-mikrovilli celler respektive mikrovilli celler, vilket motsvarar diametrarna 13 μm och 18 um. Dessa uppskattningar är dock större än vad som förväntades baserat på cellstorlekarna under mikroskopet, är ~ 8 μm och ~ 12 μm för icke-mikrovilli celler respektive mikrovilli-celler, och dessa celler är bättre kompatibla med ett specifikt kapacitansvärde 2 ^ F / cm ^ . Detta tyder på att membranlandskapet hos epididymepitelceller är morE komplex än andra celltyper, vilket överensstämmer med deras sekretions- och transportfunktioner.
I hela cellinspelningarna bidrog läckningskonduktansen över membranet och vid tätningen mellan membranet och pipetten både till de uppmätta membranegenskaperna. Tätningen har ett signifikant högre motstånd än membranet och har sålunda minimal inverkan på mätningen av passiva membranegenskaper, såsom ingångsmotståndet och nollströmmembranpotentialen. I överensstämmelse med detta begrepp resulterade korrelationsanalysen av tätningsmotståndet vid ett tröskelvärde på 1 giga-ohm mot ingångsmotståndet hos varje cell till ett värde av ~ 0,02 vilket antyder ett mycket svagt inflytande. Ytterligare korrelationsanalyser av antingen tätningsmotståndet eller ingångsmotståndet mot vilopmiljöpotentialerna eller den aktuella storleken uppmätt vid -100 mV gav också låga värden för alla testade celler eller endast för huvudcellerna. Våra resultat deBelysa att ingångsmotståndet hos de epididymala huvudcellerna och de klarliknande cellerna är signifikant lägre än nej-mikrovilli-cellerna, vilket således tillhandahåller en preliminär parameter för domen för differentiering av celltyperna. Dessa resultat tyder på att den låga insignalmotståndet i de primära cellerna är en egen fysiologisk egenskap hos cellerna. De enskilda epitelcellerna har också tydliga strömmönster som svar på de tillämpade protokollen och de experimentella förhållandena. Vi observerade att varje definierad celltyp uppvisade unika strömmönster under samma applicerade spänningsprotokoll. Ett exempel som visas i Figur 3 visar de typiska strömresponserna som registrerats från huvudcellerna under kvasi-fysiologiska förhållanden, som vi tidigare rapporterat 9 . De elektrofysiologiska egenskaperna hos varje specialiserad celltyp är lätt differentierade (data visas ej i detta dokument). Baserat på dessa parametrar,De olika celltyperna kan grovt kategoriseras i huvudcellerna, de klara cellerna och de nej-mikrovilli cellerna, som beskrivs i resultaten.
Inmatningsmotståndet är membranmotståndet som svar på det applicerade potentialsteget (10 mV hyperpolariseringssteg i denna studie) framkallat från en hållarpotential på -60 mV. Detta återspeglar omfattningen av öppen kanalaktivitet som svar på den applicerade potentialen. I detta avseende innebär ett lågt motstånd en hög inneboende "läckande" ledning av cellerna, medan ett högt motstånd innebär slutna kanaler. Det låga ingångsmotståndsvärdet i huvudceller motsvarar den framträdande membranskonduktansen, medan de klarliknande cellerna som har en liten konduktans vid testmembranpotentialen innebär en måttlig konduktans under inspelningsförhållandena. Den signifikanta höga ingångsmotståndet hos nej-mikrovilli-cellerna innebär att de inte har några öppna kanaler i denna status. I noll-cuRrentklämma, är de genomsnittliga vilande membranpotentialerna hos de uppmätta isolerade epitelcellerna i intervallet 26-33 mV för de tre cellgrupperna. Dessa värden är jämförbara med den rapporterade membranpotentialen (-30 mV) med användning av mikroelektrodmetoden 21 . De uppmätta vilopotentialerna varierar emellertid mycket i enskilda celler (från +3 mV till -63 mV) trots frånvaron av spontana spikpotentialer. Denna variation kan spegla samspelet mellan olika jonkanalaktiviteter i olika celltyper, såsom det sammankopplade samspelet mellan TRPV6 och TMEM16A-kanaler i huvudcellerna, som vi nyligen rapporterat 9 . Det är värt att notera att när cellerna dialyserades med ATP-pipetten observerades inga spontana elektriska potentialer i huvudcellerna. Detta överensstämmer med klassificeringen av epitelcellerna som icke-excentrisk 4 . En progressiv hyperpolarisation när cellerna dialyserades med piPette-lösning utan ATP kan ha återspeglat det gradvisa utseendet på en ATP-känslig kaliumström. Det har rapporterats att de ATP-känsliga kaliumkanalerna uttrycks i Golgi-apparaten i de primära cellerna hos råtta-epididymis och att uttömningen av den intracellulära ATP leder till aktiveringen av K ATP- kanalerna 14 , 22 . Denna observation föreslår att införandet av ATP i pipettlösningen gynnar de stabila fysiologiska förhållandena hos de epididymala huvudcellerna.
Hela cellen patch-clamp tekniken är en väletablerad metod som vanligtvis används för att studera elektrofysiologi av excitativa celler, såsom neuroner. I detta dokument visade vi att det också är ett användbart verktyg för karakterisering av bioelektriska egenskaper hos icke-excitativa celler, såsom epitelceller. Dessutom möjliggör detta protokoll funktionella undersökningar av primär isolerad epididymAlla epitelceller för att ytterligare belysa deras fysiologiska roll i epididymis. Denna studie ger några preliminära elektriska egenskaper hos epitelcellerna isolerade från råtta cauda epididymis för att hjälpa framtida undersökningar av de fysiologiska beteendet hos dessa celler och deras underliggande biologiska relevans i epididymis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Christopher Antos för användbara kommentarer om texten. Det här arbetet stöddes av startandefinansiering från ShanghaiTech University tilldelat Winnie Shum och med finansiering från National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
