Summary
Wij presenteren een protocol dat celisolatie en volledige cilinder patch-clamp opname combineert om de elektrische eigenschappen van de primaire gedissocieerde epitheelcellen van de rat cauda epididymiden te meten. Dit protocol maakt het mogelijk om de functionele eigenschappen van primaire epididymale epitheelcellen te onderzoeken om de fysiologische rol van de epididymis verder te verduidelijken.
Abstract
De epididymis is een essentieel orgaan voor de rijping van volwassenen en de voortplantingsgezondheid. Het epididymale epithelium bestaat uit ingewikkeld verbonden celtypen die niet alleen verschillen in moleculaire en morfologische eigenschappen maar ook in fysiologische eigenschappen. Deze verschillen weerspiegelen hun uiteenlopende functies, die samen de noodzakelijke micro-omgeving opbouwen voor de ontwikkeling van post-testiculaire sperma in het epididymale lumen. Het begrip van de biofysische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen is cruciaal voor het onthullen van hun functies in sperma en voortplantingsgezondheid, zowel onder fysiologische als pathofysiologische omstandigheden. Hoewel hun functionele eigenschappen nog niet volledig moeten worden opgemerkt, kunnen de epididymale epitheliale cellen worden bestudeerd met behulp van de patch-clamp techniek, een hulpmiddel voor het meten van de cellulaire gebeurtenissen en de membraan eigenschappen van enkele cellen. Hier beschrijven we de methoden van celisolatie en full-cell patch-clamp opname naar meaZeker de elektrische eigenschappen van primaire gedissocieerde epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden.
Introduction
De epididymis in het mannelijke voortplantingsstelsel is een orgaan gevoerd met een laag mosaïcepitheelcellen. Zoals bij andere epitheliale weefsels werken de verschillende celtypes van het epididymale epithelium, inclusief hoofdcellen, duidelijke cellen, basale cellen en cellen uit de immunologische en lymfatische systemen, op een gecoördineerde manier om de barrière aan de voorkant van de buis te functioneren en als Ondersteunende cellen voor sperma rijping en fysiologie 1 , 2 , 3 . Zo spelen deze epitheelcellen een essentiële rol in de reproductieve gezondheid.
Epitheliale cellen worden in het algemeen beschouwd als niet-excitabele cellen die niet in staat zijn om alle of geen actiepotenties te genereren in reactie op depolariserende stimuli, door gebrek aan spanningsgated Na + of Ca 2+ kanalen 4 , 5 . Echter, epitheelcellen drukken uni uitQue sets van ionkanalen en transporteurs die hun gespecialiseerde fysiologische rollen regelen, zoals secretie- en voedingsvervoer 6 . Verschillende epitheelcellen beschikken over karakteristieke elektrische eigenschappen. De hoofdcellen drukken bijvoorbeeld de CFTR uit voor vloeistof- en chloridevervoer en expressie de TRPV6 voor calciumreabsorptie, terwijl de duidelijke cellen de protonpomp V-ATPase uitdrukken voor luminale verzuring 1 , 7 , 8 , 9 . Sommige transporters en ionenkanalen die de fysiologische eigenschappen van de epididymale epitheelcellen regelen, zijn gemeld, maar de functionele eigenschappen van epididymale epitheelcellen zijn grotendeels nog niet begrepen 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-cel patch-klem opname is een goed gevestigde techniek om de intrinsieke eigenschappen van beide excitabele en niet-excitabele cellen te onderzoeken en is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de functies van hoofdzakelijk gedissocieerde cellen in heterogene celmonsters; De spanningsclamp wordt gebruikt voor het meten van de passieve membraan eigenschappen en de ionische stromen van enkele cellen 14 , 15 . De passieve membraan eigenschappen omvatten input weerstand en capaciteit. De voormalige parameter geeft de intrinsieke membraanconductie aan, terwijl de laatste het oppervlak van het celmembraan impliceert (een fosfolipide bilayer, waar ionkanalen en transporteurs zich bevinden, die dienen als een dunne isolator die extracellulaire en intracellulaire media scheidt). De membraancapaciteit is direct evenredig aan het oppervlak van het celmembraan. Samen met de membraanweerstand die wordt weerspiegeld door de invoerweerstand, is de membraan tijdconstante, wWat aangeeft hoe snel het celmembraanpotentieel reageert op de stroom van ionenkanaalstromen, kan worden bepaald. In dit verband wordt door de combinatie van de huidige responseigenschappen van een reeks spanningstappen toegepast op de cellen, de biofysische kinetiek en eigenschappen van de cellen bepaald 15 , 16 , 17 , 18 .
In het onderhavige document beschrijven we de procedures voor het isoleren van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymis en de stappen voor het meten van de membraan eigenschappen van verschillende celletypes in het gedissocieerde celmengsel met behulp van de gehele cel patch-klem. We tonen aan dat de epididymale hoofdcellen verschillende membraanelektrophysiologische eigenschappen vertonen en dat de geleiders gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd uit andere celsoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de ShanghaiTech University, die voldoen aan de lokale en internationale eisen.
1. Experimentele dieren
- Gebruik volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (~ 300-450 g) tussen 8-12 weken oud. Op deze leeftijd in de ratten zijn de sperma in de cauda-epididymiden aangekomen.
2. Isolatie van epitheliale cellen uit Rat Cauda Epididymiden
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd onder niet-aseptische omstandigheden, tenzij anders vermeld.
- Voorbereiding van dissectie instrumenten en reagentia
- Desinfecteer de dissectie gereedschappen door onderdompeling in 70% ethanol en laat ze lucht drogen.
- Zet het verwarmingsbad (32 ° C) aan; Bereid en pre-warm 500 ml 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) aangevuld met 1% (v / v) antibioTics (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycin-eind) en gemerkt als "RPMI (+ P / S 1: 100)". Voer deze stap uit in een schoon luchtgestuurd werkstation.
- Bereid en pre-warm 1 x 500 ml Medium van het Iscove's Modified Dulbecco (IMDM) dat niet essentiële aminozuren bevat (0,1 mM) en natriumpyruvaat (1 mM) en aangevuld met 5-a-dihydrotestosteron (1 nM), 10% foetale runder Serum, 1% (v / v) antibiotica (100 U / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine-eind) en gemerkt als "Full-IMDM". Maak 50 ml porties en zegel met parafilm; Opslaan bij 4 ° C. Gebruik aseptische omstandigheden.
- Bereid een collageenzympresentieoplossing op door collagenase type I en collagenase type II op te lossen in RPMI (+ P / S 1: 100), wat resulteert in 1 mg / ml van elk collagenase in de oplossing. Filter door een 0,22 μm membraan en markeer als "Collagenase Solution". Houd bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik. Pas het volume van de enzymoplossing opOp het gewicht van het enzym; Het minimale volume dat nodig is voor beide cauda-epididymiden van een enkele rat is 2 ml.
- Vul een 35 mm schotel met RPMI (+ P / S 1: 100).
- Dissectie van rat cauda epididymiden
- Het dier opofferen door het gebruik van natriumpentobarbital 85 mg / kg ip of het gebruik van een isofluranekamer tot het dier niet reageert op staartknijpende stimulatie; Volg door cervicale dislocatie.
- De onderbuik desinfecteren door 70% ethanol te wrijven, duw de twee testes voorzichtig naar de onderbuik en open vervolgens de onderbuik bij het scrotum.
- Pak het epididymale vet op, ontleed de hele voortplantingsorganen (testes, epididymiden en vasdeferens) en doei met RPMI (+ P / S 1: 100) in de schotel.
- Breng de voortplantingsorganen in de schotel met RPMI (+ P / S 1: 100) naar een aseptisch werkstation.
- Ontleed de cauda epididymiden uit de bindweefsels en vetweefsels en de epiDidymale capsule. Plaats één epididymis met ~ 0,2 ml Collagenase Oplossing in een 1,5 ml buis.Performeer deze stap in een schoon luchtstroom besturingsstation.
- Dissociatie van enkele cellen uit rat cauda epididymiden
- Snijd de epididymiden in de Collagenase Oplossing door middel van fijne scharen totdat het weefsel een pastaachtige vloeistof wordt. Spoel de schaar voorzichtig met de rest van (~ 0,8 ml) enzymoplossing in de 1,5 ml buis.
- Plaats de buis op een metalen thermomixer gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een schudspoed van 1.000 rpm.
- Centrifugeer het enzym-weefsel mengsel bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten en dek de kleverige supernatant die meestal het sperma bevat.
- Resulteer de pellet in 1 ml Full-IMDM om alle enzymatische activiteit uit te schakelen. Breng de cel suspensie over naar een 50 ml buis die 49 ml RPMI (+ P / S 1: 100) bevat.
OPMERKING: Filter de celvering eventueel door een 100 μm maas membraan met constante trituratIon om grote, celaggregaten te vermijden. Gebruik echter geen maasfilter als celvering nodig is voor het groeien van celmonolagen. - Centrifugeer het cellulaire mengsel bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten; Dekant de supernatant af.
- Resulteer de pellet in 1 ml Full IMDM met zachte trituratie gedurende tenminste 5 minuten om enkele cellen van de enzymatische behandelde epididymale weefselmengsels te dissociëren.
- Separatie van epitheliale cellen uit andere cellen onder aseptische omstandigheden
- Kweek de celsuspensie op een 10 cm petrischaal met grote IMDM gedurende ten minste 8 uur of overnacht in een incubator bij 32 ° C in 5% CO2.
- Prepareer steriele deklips vooraf door onderdompeling in 100% alcohol. Luchtdroog en doop in een klein volume van het kweekmedium. Plaats de dekglazen in 6 cm kweekschotels of in enkele putjes van een 24-putjesplaat.
- De volgende ochtend, oogst de gedissocieerde epitheliale cellen door de cell suspen zachtjes te verzamelenZion uit de Petri schotel, die hoofdzakelijk bestaat uit epitheliale cellen. Centrifugeer de cel suspensie bij 30 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en dek het supernatant vervolgens af.
- Resuspendeer de celpellet in ~ 2 ml Full-IMDM.
- Zaai 0,2 ml van de geoogste cel suspensie in het midden van elke steriele deklaag.
- Laat de celsuspensie gedurende tenminste 10 minuten in de vloeibare druppel vestigen om de cellen los te houden aan de glazen deklagen. Voeg 1 ml Full-IMDM voorzichtig toe aan de rand van 10 cm schotel of 0,3 mL Full IMDM aan elke put van een 24-putjes plaat; Versteur de cellen niet.
- Houd de geïsoleerde enkele cellen op de deklips in de incubator bij 32 ° C in 5% CO 2 totdat de patch-clamp experimenten.
3. Opnamen Oplossingen en Micropipetten
OPMERKING: Gebruik de beste kwaliteit chemicaliën en oplossingen voor de patch-clamp experimenten.
- Bereiding van voorraadoplossingen
- Autoclaaf alle flessen voor voorraadopslag en filter alle voorraadoplossingen (behalve de corrosieve oplossingen) en filter voor 0.22 μm membranen voor gebruik.
- Bereid alle voorraadoplossingen vooraf bij de RT op en houd deze bij 4 ° C: 5 M NaCl op; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH 2PO 4; 100 mM EGTA (pH 7,0 met KOH). Hanteer 5 M NaOH, 1 M HC1 en 1 M KOH voorraden als corrosieve oplossingen.
- Voorbereiding van standaard externe opname fysiologische zoutoplossing (PSS)
- Warm de voorraadoplossingen op RT op de ochtend van de patch-klem opname.
- Pipetteer de ingrediënten van elk bestand volgens de gewenste eindvolume, met uitzondering CaCl2, bijvoorbeeld voor het bereiden van 500 ml PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5 M; 5 mM KCl = 2,5 ml 1M; 1,2 mM MgCl2 = 6 ml 100 mM; 1,2 mM NaH 2PO 4 = 3 ml 200 mM.
- Voeg dubbel toe-gedistilleerde water (DDH 2 O) om het uiteindelijke volume van 400 ml en equilibreren.
- Weeg 0,9 g glucose en 1,19 g HEPES en los volledig op in het oplosmengsel.
- Voeg de CaCl2 voorraad (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) toegevoegd.
- Voeg maximaal 99% van het uiteindelijke volume toe.
- Stel de pH op 7.4 met behulp van NaOH of HCI.
- Controleer de osmolariteit en pas zo nodig 5 M NaCl of glucose aan.
- Voeg DDH 2 O tot het eindvolume van 500 ml in een cilinder.
- Bereiding van micropipette interne oplossingen (lage EGTA K + -gebaseerde oplossingen)
- Weeg of pipet het juiste volume van de reagentia uit elke voorraad volgens het gewenste eindvolume en de concentratie, bijv. Voor het bereiden van 50 ml lage EGTA K + -basis intracellulaire oplossing tot een volume van ~ 30 ml ddH 2 O: 100 mM K-gluconaat = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 mLVan 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
- Voeg genoeg water toe voor ~ 95% van het uiteindelijke volume en laat de oplossing bij RT gelijkwaardigen. Zorg dat de oplossing helder is.
- Terwijl u de oplossing constant roert, pas de pH op met 7,2 met behulp van KOH.
- Weeg en voeg 0,078 g Mg-ATP toe aan de oplossing tot het volledig is opgelost.
- Plaats de oplossing op ijs en gebruik een kleine aliquot voor het meten van osmolariteit; Meestal meet de oplossingen ~ 290 mOsmol en hoeft geen aanpassing. Als de osmolariteit significant verschilt van 280-295 mOsmol, bereidt u een nieuwe oplossing voor.
- Voeg DDH 2 O tot de uiteindelijke volume.
- Verdeel de oplossing in 500 μl alikvoten, filter met een 0,2 μm spuitfilter, stevig dicht en onmiddellijk opslaan bij ≤ -20 ° C.
- Op de datum van het patch-clamp-experiment ontdooien één aliquot van de intracellulaire oplossing op ijs en blijf gekoeld tijdens het patch-klem experiment totVoorkoming van afbraak.
- Trek de patchpipetten uit glazen capillairen (volgens de gebruiksaanwijzing van de pipettrukker) om micropipetgroottes met een weerstand van 5-10 M te verkrijgen wanneer deze worden gevuld met een intracellulaire oplossing.
4. Het patch-clamp-experiment instellen en een volledige celconfiguratie instellen met cellen
- Het patch-clamp-experiment instellen
- Zet de patch-klem opstelling (computer, computer gestuurde versterker, digitizer, etc. )
- Open de patch-klem software ( bijvoorbeeld AXON pCLAMP10 of HEKA PatchMaster) en stel de protocollen voor elektrofysiologische opnamen op. Zet het filter voor het signaal naar een lage pas bij 1-3 kHz en de digitizer bij 10-20 kHz.
- Zet de camera, micromanipulator en lichtbron aan.
- Wanneer de computer gestuurde versterker aan is, gemalen het lichaam van de experimentator door met de handen aan te raken de patch-clamp rig die is geaard,Voordat u de hoofdtoon aanraakt, om deze te beschermen tegen elektrische schokken.
- Breng de cultiverende epitheelcellen op de glazen deklaag naar de opnamekamer gevuld met ~ 1 ml standaard PSS bij RT. Zorg dat u het PSS voorzichtig twee keer voorzichtig wijzigt met behulp van een pipet voor elke patch-clamp-experiment.
OPMERKING: Optioneel vul het perfusiesysteem met standaard PSS of een andere externe oplossing volgens het geplande experiment. Perfuseer de microscopische opnamekamer (RC-26G of RC-26GLP) met PSS enkele malen met een snelheid van ~ 2 mL / min voordat u de patch-clamp experimenten begint. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn die langs het perfusiesysteem worden gevangen. - Bekijk en selecteer de cellen onder een omgekeerde microscoop met behulp van 10X en 40X doelen die zijn uitgerust met een differentieel interferentie contrast optisch systeem. Zoek naar grote enkele geïsoleerde cellen voor opname. Identificeer de geïsoleerde epididymale epitheelcellen door hun bolvormige vorm met ruwe mIcrovilli aan het ene uiteinde van de membranen en gepolariseerde verdeling van intracellulaire inhoud ( Figuur 1 ).
- Vul een micropipet met de interne oplossing met een 1 ml spuit (een zelfgemaakte nonmetallic microsurve naald) op (lage EGTA K + -basis oplossing, zie stap 3.3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipet zijn, wat de weerstand van de micropipet kan verhogen. Gebruik voldoende oplossing zodat de interne oplossing de chloride-coated zilverdraadelektrode onderdompelt in de micropipethouder.
- Monteer de micropipet in de elektrodehouder en gebruik een lage positieve druk (~ 0,2 ml spuitvolume). Houd de lage positieve druk continu totdat u het celmembraan in de latere stappen aanraakt.
- Het instellen van de volledige celconfiguratie met cellen voor opnames
- Dompel de pipet in de badoplossing met de hoogste snelheid van de micromanipulator. Zoek de pipetTip in het scherm dat is aangesloten op de digitale camera; Verlaag de micromanipulatorsnelheid naar de medium-hoge modus.
- Controleer snel de micropipetweerstand (5-10 MΩ) met behulp van de data acquisition interface commando ( bijv. "Membrane Test" in het AXON-systeem) door een spanningsstap ( bijv. 5 mV voor 100 ms) op te zetten die wordt gegenereerd door de computer gestuurde versterker. Vervang naar een nieuwe micropipette als de weerstand aanzienlijk buiten dit bereik ligt.
- Begin het doel op de microscoop te bewegen; Geleid geleidelijk de micropipette naar de geselecteerde cel. Verlaag eerst eerst het doel en laat de micropipette vervolgens naar het scherpvlak liggen totdat de micropipet boven het middenoppervlak van de geselecteerde cel ligt.
- Kanselleer het vloeibare koppelingspotentieel tussen de pipet- en badoplossingen op nul met behulp van de opdracht "pipette offset" in de commando-interface van software.
- Stel de computer gestuurde versterker commAnder aan de spanningsklem en de membraan test naar de "bad" modus.
- Fijne focus voor een duidelijker zicht op de cel, en verminder dan geleidelijk de micropipette met behulp van de micromanipulator bij de lage-gemiddelde snelheid.
- Wanneer de micropipet dicht bij de cel staat (aangetoond door een verminderde stroom bij het membraan test commando), verwijder de lage positieve druk onmiddellijk en gebruik een zwakke negatieve druk (0,1 ml spuitvolume) om de gigaseale (> 1 GΩ) te vormen .
- Monitor de weerstand met de membraan test. Als de weerstand> 500 MΩ maar <1 GΩ is, gebruik dan een negatief potentieel (meestal als het vasthoudpotentieel dat ingesteld is op -60 mV), die de gigaseal kan vormen. Vergoed de transiënte capacitieve stroom van de micropipet.
- Als de afdichting> 1 GΩ en stabiel is (zoals aangegeven in de softwareinterface), dient u een korte en sterke zuigkracht toe te passen om het celmembraan te breken. Vergoed geen vergoeding voor de verzekeringRies weerstand en de cel capaciteit.
- Onmiddellijk na het behalen van een succesvolle volledige celconfiguratie, gebruik een 10 mV hyperpolariserende stap (5 sporen met minimale tijdsintervallen, 20 ms duur, signaalmonster bij 20 kHz) van een vasthoudpotentieel van -60 mV.
- Zet de spanningsmodus in de nulstroommodus en merk de aflezingen van de softwareinterface af of voer een spleetloze opname (10-60 s) voor de membraanpotentiële aflezingen van de cel.
- Schakel snel terug en blijf in de spanningsmodus en pas de spanningsprotocollen aan volgens de geplande experimenten en meet de huidige reacties. Aftrekking wordt niet toegepast op de intrinsieke lekstroom tijdens de opnamen.
- Monitor de stabiliteit van de reacties tijdens de opnames, of de verschillende parameters van de cel. Gebruik bijvoorbeeld de "Membraanstest" commando-interface om de invoerweerstand (R i ), de serieweerstand (R s ) en de cel te controlerenMembraancapaciteit ( Cm ) in de membraantest bij de "Cell" -modus tijdens de switching of protocols.
OPMERKING: Plotselinge druppels in invoerresistentie geven gewoonlijk een losse patch aan, en een dramatische toename van de serieweerstand kan indicatief zijn voor de verstopping van de micropipette door de intracellulaire organellen of membraanfragmenten. Controleer tijdens de opname regelmatig de plaats van de micropipette om te controleren of er drift optreedt, wat kan leiden tot het verlies van de patch. Als drijfwerk een probleem is, lig de micropipette en de patchcel zorgvuldig op de bodem van de opnamekamer. Deze stap kan soms leiden tot het verlies van de patch, in welk geval het nodig is om de gehele cel patch-klem procedure te herhalen.
5. Analyse van passieve elektrofysiologische eigenschappen van cellen
- Nadat u de gegevens van de patch-clamp-experimenten hebt verkregen, open de kloofvrije data in de Clampfit-software en meet de gemiddeldeWaarde voor het rustmembraanpotentieel voor elke cel. Als alternatief gebruik u de waarde zoals aangegeven uit de nulpastespanning in de huidige modus. Corrigeer de waarden met het vloeibare verbindingspotentieel (12,4 mV in deze studie).
- Open de gegevens van de 10-mV hyperpolariserende stap (AV) die uit een cel is verkregen, meet het stroomverschil vóór en tijdens de stap (Δ I- stap ) en bereken de invoerweerstand (R i ) met de vergelijking als:
- Bereken de celcapacitantie ( Cm , in eenheid van pF) (gebruik dezelfde huidige data van de 10-mV hyperpolarisatiestap door het totale oppervlak onder de membraancondensatorstroom te integreren tijdens de initiële transient-decaystroom die op de spanningsstaptrekker wordt opgewekt) Om de waarde van de totale accumulatieve lading te verkrijgen (Q, in eenheid van pA • ms) van de cel. Gebruik de volgende vergelijking:
- Bereken de waarde van de serieweerstand (R s ) voor elke cel door de initiële transientstroom van de 10-mV negatieve stap te monteren met een standaard exponentieel algoritme om de tijdconstante vervalstroom ( T , in eenheid van ms) te verkrijgen en gebruik de Volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beschreven enzymatische spijsvertering procedure voor de isolatie van epitheliale cellen uit de rat cauda epididymiden is een gemodificeerd protocol uit onze eerdere studies 9 , 12 . Deze methode produceert een mengsel van enkelvoudige cellen met meer dan 90% levensvatbaarheid en zonder oppervlakte blaren of gezwollen celvolume. Het heterogene celmengsel bestaat voornamelijk uit hoofdcellen, duidelijke cellen en basale cellen, zoals eerder beschreven 1 . In dit protocol kunnen relatief zuivere monsters van epididymale epitheelcellen worden verkregen door de primaire gedisocieerde cellen overnacht op een Petri-schotel te kweek om de niet-epitheelcellen (zoals fibroblasten en gladde cellen) op de schotel toe te laten, zoals Aangetoond in figuur 1A (voor oogst). De celtypes kunnen dan voorlopig worden onderscheiden door hun fenotypes onder de microscoopEn gecategoriseerd volgens hun specifieke passieve membraan eigenschappen. In het gedissocieerde celmengsel is er een groep cellen die microvilli of een ruw membraan hebben op één uiteinde van hun oppervlakmembraan en gepolariseerde celinhoud; Deze worden de hoofdcellen of de heldere cellen genoemd ( figuur 1B , pijlen). Deze gepolariseerde epitheliale cellen zijn niet te onderscheiden door hun morfologische eigenschappen, maar kunnen worden geïdentificeerd volgens hun passieve membraan eigenschappen en geleidingsresponsen die worden verkregen uit de hele-cel patch-klem opnames. De andere groep cellen is kleiner in grootte zonder stereocilia aan het ene uiteinde van het membraan en geen duidelijke gepolariseerde cellulaire inhoud; Deze worden de no-microvilli cellen genoemd, en bestaan uit meestal basale cellen ( figuur 1B , sterretjes).
De primaire epitheliale hoofdcellen kunnen onderscheiden worden van andere cellen door deIr verschillende passieve membraan eigenschappen ( Figuur 2 ) en huidige patronen ( Figuur 3 ) in reactie op het toegepaste spanning protocol met behulp van de full-cell patch-clamp techniek. De elektrofysiologische eigenschappen van de passieve membraan van cellen kunnen helpen bij het beoordelen van de aanvankelijke gezondheidsstatus van individuele cellen en van celgroepen. Een samenvatting van de afzonderlijke dot plots van het membraan capaciteit (Cm), de ingangsweerstand (Rm) en de membraanpotentiaal (Vm) van elke celgroep wordt gegeven in figuur 2A. Er is geen verschil in de tijdconstante voor de membraancapaciteit tussen de verschillende celtypes (~ 0,4 ms) (gegevens worden niet aangetoond in dit manuscript). Met de lage EGTA K + -baseerde oplossing is de gemiddelde gemeten membraancapaciteit voor de hoofdcellen 9,4 0,5 pF (n = 32) en voor de heldere cellen is 9,7 1,9 pF (n = 12). De membraancapaciteit vanDe niet-microvilli cellen zijn 5,2 0,8 pF (n = 17), die statistisch kleiner is dan de principe en de heldere celmembraan capacitances.
De invoerweerstand van hoofdcellen in figuur 2A (middenpaneel) is 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) en die van de duidelijke cellen is 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), wat aanzienlijk lager is (P <0,001) dan Die van de niet-microvilli cellen (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Zoals weergegeven in figuur 2A (rechter paneel) werd de stroomloze membraanpotentiaal (de rust membraanpotentiaal Vm) kort gemeten na vaststelling van de whole-cell configuratie en gebruikt voor het vergelijken van de groepen na correctie vloeistofjunctiepotentiaal potentiaal (12,4 mV). Cellen werden routinematig gebad in standaard PSS en gedialyseerd met 0,1 mM EGTA K + -gebaseerde pipetoplossing die ATP bevatte. De mEan membraanpotentieel van de hoofdcellen is -26 ± 2 (n = 28), tussen -51 mV en +1 mV, en het gemiddelde membraanpotentiaal van de heldere cellen is -30 ± 3 mV (n = 10), Tussen-47 mV en -17 mV. De niet-microvilli cellen bezitten het hoogste gemiddelde membraanpotentiaal met een waarde van -33 ± 5 mV (n = 17), tussen -63 mV en -13 mV.
De lage invoerweerstand van de hoofdcellen suggereert dat er intrinsieke geleiders in deze cellen zijn, maar het kan aanwijzen dat het de verbinding tussen de pipet en de patch celmembranen lekt. Om deze bezorgdheid aan te pakken hebben we de gegevens van deze cellen eerst uitgesloten met plotselinge veranderingen (indicatief voor een afdichtlek) van de elektrische eigenschappen tijdens opnames. Vervolgens analyseerden we de correlatie tussen de afdichtingsweerstand bij een drempel van 1 giga-ohm met de invoerweerstand, zoals getoond in figuur 2B . Het resultaat was een zeer lage correlatiewaarde (R 2 ≈ 0,02). Dit suggereert dat de afdichtingsweerstand een verwaarloosbare invloed heeft op de inputweerstand en dat de gerapporteerde passieve elektrische eigenschappen van de verschillende cellen (zoals de lage invoerweerstand van de hoofdcellen) de intrinsieke eigenschappen van deze cellen zijn.
Figuur 3A is de typische huidige respons die onder quasi-fysiologische omstandigheden is opgenomen bij de hoofdcellen waarbij de cellen baden in normale fysiologische zoutoplossing (PSS), gedialyseerd met een lage EGTA K-gebaseerde pipetoplossing en gestimuleerd vanuit een vasthoudpotentieel van -60 mV Naar een reeks van 500 ms testspanningen (variërend van -120 mV tot +60 mV zoals aangegeven in het invoegstuk van figuur 3B ). De twee tracingen in Figuur 3C tonen de typische rustmembraanresponsen van een geïdentificeerde hoofdcel onder de nulstroomclamp in aanwezigheid van, ofAfwezigheid van ATP in de pipetoplossing. In aanwezigheid van ATP is het rustpotentieel relatief stabiel. Overwegende dat een progressieve hyperpolarisatie werd waargenomen wanneer cellen werden gedialyseerd met een pipetoplossing zonder ATP. Het initiële rustmembraanpotentieel gemeten aan het begin van de celdialyse met pipetoplossingen laat geen significant verschil zien in de cellen met of zonder ATP ( Figuur 3D ), wat suggereert dat de gemeten waarden nog steeds intact waren en minimaal beïnvloed werden door de pipetoplossingen.
Figuur 1 : Morfologische kenmerken van geïsoleerde epidheelcellen van de rat cauda epididymale cellen. ( A, B ) Voorbeelden van de epitheelcellen die zijn geïsoleerd uit de rat cauda-epididymiden vóór ( A ) en na ( B ) hervezing van oveRnight cultuur op de schotel voorafgaand aan de patch-clamp experimenten. Pijlen geven de microvilli-cellen aan, die voornamelijk bestaan uit de hoofdcellen en de heldere cellen. Sterretjes wijzen op de no-microvilli cellen. Alleen enkele cellen werden geselecteerd voor patch-klem opname. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Passieve membraan eigenschappen van epididymale epitheliale cellen met enkele rat. ( A ) Punten van de passieve membraan eigenschappen van epididymale epitheliale cellen met enkele rat. Pipetoplossing is laag EGTA K + -based en badoplossing is standaard PSS. ( B ) Correlatie analyse van de invoerresultaatIn plaats van de dichtheid van de cellen. NS : geen significant verschil, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 significant verschil versus passende controles met eenrichtings ANOVA met Bonferroni post-hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Typische gehele celstromen in enkele epididymale hoofdcellen. ( A ) Typische gehele celstromen die zijn opgenomen uit enkele epididymale epitheelcellen die onder quasi-fysiologische omstandigheden zijn opgenomen, waarbij een pulsuitdrukkingsprotocol wordt gebruikt, zoals getoond in de invoer van panal B. De stippellijn geeft de nulstroomniveaus aan. ( B ) De stroomspanning relatie van het huidige antwoordEs gemeten op de aangegeven tijdspunten zoals in A. Data zijn de middelen ± SEM van acht hoofdcellen van ten minste drie dieren. ( C ) Representatieve tracings van het restmembraanpotentiaal van de hoofdcellen gedialyseerd met een pipetoplossing, ofwel met ATP (+ ATP) of zonder ATP (-ATP). ( D ) Een staafdiagram die geen significant verschil toont tussen het initiële rustmembraanpotentieel van + ATP en -ATP. Waarden zijn betekenen ± SEM gemeten op het moment dat in paneel C wordt aangegeven. Cijfers in de beugel binnen de staven geven het aantal geteste cellen aan van tenminste drie dieren. NS : geen significant verschil. ( E ) Correlatieanalyses van de afdichtingsweerstand en de invoerweerstand van alle cellen, of alleen de hoofdcellen, tegenover de rustmembranen die kort na de volledige celinstelling worden gemeten bij de nulstroomclamp en de huidige magneten gemeten bij de hyperpolariserende Stap tot -100 mV van het vasthouden van potential. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol leverde de enzymatische dispersie van de rat-cauda-epididymiden consistente gezonde epitheelcellen. De kwaliteit van de epididymale epitheelcellen voor de patch-clamp experimenten is afhankelijk van een paar kritieke stappen in het protocol. Bijvoorbeeld, de centrifugatie van het celmengsel bij een lage centrifugale kracht (30 xg) is belangrijk voor het verwijderen van de spermatozoa en het epididymale luminale gehalte; De epididymale epitheelcellen worden ongezond in aanwezigheid van de spermatozoa in de celkweek. Daarnaast is het cultiveren van het gedissocieerde celmengsel gedurende enkele uren op een Petri-schotel een belangrijke stap om de fibroblasten en de gladde spiercellen te verwijderen; De niet-epitheelcellen hechten sneller op de kweekschotel en aldus verlaten de epitheelcellen in de suspensie, die opnieuw kan worden geoogst door zachte aspiratie. Bovendien zijn collagenase vertering en trituratie met een fijne glazen pipet de twee belangrijke stappen om te vrijkomenEnkele cellen tijdens de cel dissociatie procedure. Tenslotte is de enzymatische spijsvertering van de epididymale cellen kritisch voor het patch-clamp experiment, omdat ondervertering door inefficiënte enzymatische activiteit of oververtering door langdurige incubatie zowel de giga-ohm sealvorming tussen de pipet en celmembranen kunnen verstoren.
In de celmengsels zijn de cellen in een grotere kolomvorm met een ruwe membraan-dragende stereocilia aan het ene uiteinde en gepolariseerde verdeling van de intracellulaire inhoud vermoedelijk de hoofdcellen of de duidelijke cellen. Andere cellen die geen prominente microvilli en gepolariseerde celinhoud bezitten, kunnen de basale cellen en sommige cellen van het immuunsysteem omvatten. Naast het omschrijven van de fundamentele morfologische kenmerken van epididymale epitheelcellen, gebruikt dit protocol de gehele cel patch-clamp methode om de passieve membraan eigenschap van elke cel te meten. Deze membraan eigenschappen zorgen voor voorlopig onderscheid vanDe celtypen. Deze methode heeft enkele beperkingen zoals uitwassen van de intracellulaire inhoud met de pipetoplossing en elektronische variaties in relatie tot de cellulaire architectuurwijzigingen tijdens continue opnamen 19 , 20 . Wij geven alleen de parameters die we onmiddellijk hebben gemeten na de oprichting van de volledige celconfiguratie, die de initiële, relatief intacte condities van de cellen weerspiegelen. De passieve membraan eigenschappen van elke cel omvatten de membraan capaciteit, de input weerstand en het rustmembraanpotentieel.
De specifieke capaciteit van celmembranen komt over het algemeen overeen met 1 μF / cm 2 en dit geldt voor cellen (zoals immuuncellen en neuronen) met beperkte vouw op hun cellulaire membranen 16 , 18 . De specifieke capaciteitskonstante lijkt echter groter voor cellen wMet meer complexe, cellulaire architecturen, zoals de epitheelcellen, die veel cellulaire membraanvouwen in verschillende compartimenten hebben. Rapporten geven aan dat de MDCK epitheliale cellijnwaarden 4 μF / cm 2 en 3 μF / cm 2 zijn voor respectievelijk 17 apical en basale membraan specifieke capaciteiten. In deze studie, de gemeten gemiddelde membraan capaciteiten zijn ~ 8 ~ pF en 12 pF voor de niet-microvilli cellen groep en de voornaamste cellen en heldere-achtige cellen groep (bijv microvilli-cellen), respectievelijk. Met behulp van de specifieke capaciteit van 1 μF / cm 2 voor onze berekeningen zijn de geschatte oppervlakken van de cellen 500 μm 2 en 1000 μm 2 voor de niet-microvilli cellen en de microvilli cellen respectievelijk, welke overeenkomt met de diameters van 13 μm en 18 urn. Deze schattingen zijn echter groter dan verwacht, gebaseerd op de celgroottes onder de microscoop, die ~ 8 zijn1; m en ~ 12 μm voor respectievelijk geen microvilli cellen en microvilli-cellen, en deze cellen zijn respectievelijk ongeveer 2,4 μF / cm 2 en 1,9 μF / cm 2 . Onze resultaten wijzen erop dat het membraan landschap van niet-microvilli cellen complexer is dan die van de micro-villi cellen, die in overeenstemming is met hun secretie- en transportfuncties.
De specifieke capaciteit van celmembranen komt over het algemeen overeen met 1 μF / cm 2 en dit geldt voor cellen (zoals immuuncellen en neuronen) met beperkte vouw op hun cellulaire membranen 16 , 18 . De specifieke capaciteitskonstante lijkt echter groter te zijn voor cellen met complexere, cellulaire architecturen, zoals de epitheelcellen, die veel cellulaire membraanvouwen in afzonderlijke compartimenten hebben. Rapporten geven aan dat de MDCK epitheliale cellijnwaarden 4 μF / cm 2 en 3 μF / cm 2 zijn 17 . In deze studie, de gemeten gemiddelde membraan capaciteiten zijn ~ 8 ~ pF en 12 pF voor de niet-microvilli cellen groep en de voornaamste cellen en heldere-achtige cellen groep (bijv microvilli-cellen), respectievelijk. Met behulp van de specifieke capaciteit van 1 μF / cm 2 voor onze berekeningen zijn de geschatte oppervlakken van de cellen 500 μm 2 en 1000 μm 2 voor de niet-microvilli cellen en de microvilli cellen respectievelijk, welke overeenkomt met de diameters van 13 μm en 18 urn. Deze schattingen zijn echter groter dan verwacht op basis van de celgroottes onder de microscoop, respectievelijk ~ 8 μm en ~ 12 μm voor niet-microvilli cellen en microvilli-cellen en deze cellen zijn beter compatibel met een specifieke capaciteitswaarde 2 μF / cm 2 . Dit suggereert dat het membraanlandschap van epididymale epitheelcellen mor isE complex dan andere celtypes, die consistent is met hun afscheiding en transportfuncties.
Bij de hele celopnamen hebben de lekconductie over het membraan en bij de afdichting tussen het membraan en de pipet bijgedragen aan de gemeten membraan eigenschappen. De zeehond heeft een aanzienlijk hogere weerstand dan het membraan en heeft dus minimale invloed op de meting van de passieve membraan eigenschappen, zoals de ingangsbestendigheid en het nulstroommembraanpotentieel. In overeenstemming met deze opvatting resulteerde de correlatieanalyse van de afdichtingsweerstand bij een drempel van 1 giga-ohm tegen de invoerweerstand van elke cel een waarde van ~ 0,02, wat een zeer zwakke invloed voorstelde. Verdere correlatieanalyses van de zeehalsweerstand of de invoerweerstand versus de rustmembraanpotentiaal of de huidige grootte gemeten op -100 mV gaf ook lage waarden voor alle geteste cellen of alleen voor de hoofdcellen. Onze resultaten deTonen aan dat de invoerweerstand van de epididymale hoofdcellen en de duidelijk-achtige cellen significant lager is dan de geen-microvilli-cellen, waardoor een voorlopige parameter voor het oordeel voor het differentiëren van de celtypen wordt verschaft. Deze resultaten suggereren dat de lage invoerweerstand in de hoofdcellen een intrinsieke fysiologische eigenschap van de cellen is. De enkele epitheelcellen bezitten ook onderscheidende huidige patronen in reactie op de toegepaste protocollen en de experimentele omstandigheden. We constateren dat elk gedefinieerd celtype unieke stroompatronen onder hetzelfde toegepaste spanningprotocol vertoonde. Een voorbeeld getoond in figuur 3 toont de typische actuele reacties die zijn opgenomen uit de hoofdcellen onder quasi-fysiologische omstandigheden, zoals we eerder hebben gerapporteerd 9 . De elektrofysiologische kenmerken van elk gespecialiseerd celtype worden gemakkelijk gedifferentieerd (gegevens worden niet in dit document weergegeven). Op basis van deze parameters,De verschillende celtypes kunnen ruwweg worden ingedeeld in de hoofdcellen, de heldere cellen en de neutraal-microvilli-cellen, zoals beschreven in de resultaten.
De invoerweerstand is de membraanweerstand in reactie op de toegepaste potentiële stap (10 mV hyperpolariserende stap in deze studie) opgewekt uit een vasthoudpotentieel van -60 mV. Dit weerspiegelt de mate van open kanaalactiviteit in reactie op het toegepaste potentieel. In dit opzicht impliceert een lage weerstand een hoge intrinsieke lekconductie van de cellen, terwijl een hoge weerstand de gesloten kanalen impliceert. De lage invoerweerstandwaarde in hoofdcellen komt overeen met de prominente membraanconductie, terwijl de heldere cellen die een klein geleidingsvermogen bezitten bij het testmembraanpotentieel hun gematigde geleidbaarheid onder de opnameomstandigheden impliceert. De aanzienlijk hoge invoerweerstand van de niet-microvilli-cellen impliceert dat ze geen open kanalen hebben in deze status. In de nul-cuRrent klemmen, zijn de gemiddelde rustmembraanpotenties van de gemeten geïsoleerde epitheelcellen in het bereik van 26-33 mV voor de drie celgroepen. Deze waarden zijn vergelijkbaar met het gemelde membraanpotentiaal (-30 mV) met behulp van de micro-elektrode methode 21 . De gemeten rustmogelijkheden variëren echter sterk in individuele cellen (van +3 mV tot -63 mV) ondanks de afwezigheid van spontane spijkpotenties. Deze variatie kan de interactie van verschillende ionenkanaalactiviteiten in verschillende celtypes weerspiegelen, zoals de gekoppelde wisselwerking van TRPV6- en TMEM16A-kanalen in de hoofdcellen, zoals we onlangs hebben gerapporteerd 9 . Het is de moeite waard om op te merken dat wanneer cellen werden gedialyseerd met de ATP pipette, we geen spontane elektrische potenties in de hoofdcellen hebben waargenomen; Dit komt overeen met de classificatie van de epitheelcellen als niet-excitabel 4 . Een progressieve hyperpolarisatie wanneer de cellen gedialyseerd werden met de piPette oplossing zonder ATP kan de geleidelijke verschijning van een ATP-gevoelige kaliumstroom hebben weerspiegeld. Er is gemeld dat de ATP-gevoelige kaliumkanalen uitgedrukt worden in het Golgi-apparaat van de hoofdcellen van de ratepididymis en dat de uitputting van de intracellulaire ATP leidt tot de activering van K ATP- kanalen 14 , 22 . Deze observatie suggereert dat de opname van ATP in de pipetoplossing de stabiele fysiologische condities van de epididymale hoofdcellen bevordert.
De full-cell patch-clamp techniek is een gevestigde methode die vaak gebruikt wordt om de elektrofysiologie van excitabele cellen, zoals neuronen, te bestuderen. In dit document bleek dat het ook een handig hulpmiddel is voor de karakterisering van bio-elektrische eigenschappen van niet-excitabele cellen, zoals epitheliale cellen. Bovendien biedt dit protocol functionele onderzoeken van primaire geïsoleerde epididymAl epitheelcellen om hun fysiologische rol in de epididymis verder te verhelderen. Deze studie bevat enkele voorlopige elektrische eigenschappen van de epitheelcellen die zijn geïsoleerd uit rat cauda epididymis om de toekomstige onderzoeken van het fysiologische gedrag van deze cellen en hun onderliggende biologische relevantie in de epididymis te ondersteunen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Christopher Antos voor nuttige opmerkingen over de tekst. Dit werk werd ondersteund door startschotfinanciering van de ShanghaiTech University toegekend aan Winnie Shum en door de financiering van de National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
