Summary
אנו מציגים פרוטוקול המשלב בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק כדי למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל העיקרי ניתק מן epididymides cauda חולדה. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים ראשוניים אפידלימלי נוספת להבהיר את התפקיד הפיזיולוגי של האפידידימיס.
Abstract
האפידידימיס הוא איבר חיוני להבשלת הזרע ולבריאות הרבייה. אפיתל האפידידיום מורכב מסוגי תאים המחוברים בצורה מורכבת, אשר נבדלים לא רק בתכונות מולקולריות ומורפולוגיות אלא גם בתכונות פיזיולוגיות. הבדלים אלה משקפים את הפונקציות המגוונות שלהם, אשר יחד לבסס את microenvironment הצורך לפיתוח זרע שלאחר האשכים ב לומן האפידידימלי. ההבנה של המאפיינים הביופיזיים של תאי האפיתל האפידיאליים היא קריטית לחשיפת התפקודים שלהם בזרע ובבריאות, בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בעוד התכונות הפונקציונליות שלהם עדיין לא הובהר במלואו, תאים epithelial epididymal ניתן ללמוד באמצעות טכניקה טלאי תיקון, כלי למדידת האירועים הסלולר ואת המאפיינים קרום של תאים בודדים. כאן, אנו מתארים את שיטות בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק ל meaבטוח את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל ניתק העיקרי של עכברוש capid epididymides.
Introduction
אברידימיס בדרכי הרבייה הגברי הוא איבר מרופד בשכבת תאים אפיתל פסיפס. כמו ברקמות אפיתל אחרות, סוגי התאים השונים של האפיתל האפידידימלי, כולל תאים ראשיים, תאים ברורים, תאים ותאי בזל מהמערכות החיסוניות והלימפאטיות, פועלים באופן מתואם כדי לתפקד כמחסום בחזית הצינורית וכמו תאים תומכים עבור התבגרות הזרע ופיזיולוגיה 1 , 2 , 3 . לפיכך, תאים אלה אפיתל לשחק תפקיד חיוני בבריאות הרבייה.
תאים אפיתל נחשבים בדרך כלל כמו תאים שאינם נרגשים שאינם מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה כל או לא בתגובה בתגובה גירויים depolarizing, בשל היעדר מתח מגודרת Na + או Ca 2 + ערוצי 4 , 5 . עם זאת, תאים אפיתל להביע UniQue ערכות של תעלות יונים ו מובילים המסדירים תפקידים פיזיולוגיים מיוחדים שלהם, כגון הפרשת תחבורה המזינים 6 . תאים אפיתל שונים ולכן יש תכונות חשמליות אופייניות. לדוגמה, התאים העיקריים להביע את CFTR עבור התחבורה נוזלים כלור ולהביע את TRPV6 עבור סידן reabsorption, ואילו התאים ברורים להביע את המשאבה פרוטון V-ATPase לחומצה לומינלית 1 , 7 , 8 , 9 . כמה מובילים ערוצי יון המווסתים את התכונות הפיזיולוגיות של התאים אפיתל אפידלימלי דווחו, אבל המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים אפידרלי הם רובם לא הבנתי עדיין 10 , 11 , 12 , 13 .
מהOle-cell-clamp ההקלטה היא טכניקה מבוססת היטב לבחינת התכונות המהותיות של תאים נרגשים ולא נרגשים, והוא מועיל במיוחד עבור לימוד הפונקציות של תאים ניתק בעיקר דגימות הטרוגניות; מתח מהדק משמש למדידת המאפיינים קרום פסיבי וזרמים יוניים של תאים בודדים 14 , 15 . תכונות הממברנה הפסיבית כוללות התנגדות קלט וקיבולת. הפרמטר לשעבר מציין את מוליכות הממברנה המהותית, בעוד שהאחרון מרמז על פני השטח של קרום התא (bilayer phospholipid, שבו נמצאים תעלות יונים ומובילים, המשמש כמבודד דק המפריד בין תאי תאיים ותאיים תאיים). הקיבול של הממברנה הוא פרופורציונלי ישירות על פני השטח של קרום התא. יחד עם התנגדות הממברנה המשתקפת בהתנגדות הקלט, הזמן הקבוע של הממברנה, wHich מציין כמה מהר פוטנציאל קרום התא מגיב לזרימה של זרמי ערוץ יון, ניתן לקבוע. בהקשר זה, על ידי שילוב של מאפייני התגובה הנוכחית מסדרה של צעדים מתח החלים על התאים, הקינטיקה הביופיסיקלית המאפיינים של התאים נקבעים 15 , 16 , 17 , 18 .
במאמר הנוכחי, אנו מתארים את ההליכים לבידוד תאים אפיתל מ עכברוש cauda epididimis ואת הצעדים למדידת המאפיינים קרום של סוגי תאים שונים בתערובת התא ניתק באמצעות מהדק תיקון כל כולו. אנו מראים כי התאים העיקריים האפידידימלי התערוכה מאפיינים שונים electrophysiological קרום וכי מוליכות ניתן לזהות בקלות סוגי תאים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להנחיות של אוניברסיטת שנחאי TechTech טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, אשר למלא את הדרישות המקומיים והבינלאומיים.
1. בעלי חיים ניסיוניים
- השתמש הזכרים מבוגר עכברים Sprague-Dawley (~ 300-450 גרם) בין 8-12 שבועות. בעידן זה של חולדות, הזרע הגיעו eppididymides cauda.
2. בידוד של תאים אפיתל מ עכברוש Cauda Epididymides
הערה: השלבים הבאים מבוצעים בתנאים שאינם aseptic אלא אם צוין אחרת.
- הכנת מכשירים לנתיחה וריאגנטים
- לחטא את כלי לנתיחה על ידי טבילה באתנול 70% ולתת להם אוויר יבש.
- הפעל את אמבטיה ההתחממות (32 ° C); הכן מראש 500 מ"ל חם של 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 בינוני (RPMI) בתוספת 1% (v / v) antibioטיקים (100 U / מ"ל פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין הסופי), ו שכותרתו "RPMI (+ P / S 1: 100)". בצע את השלב הזה בתחנת עבודה נקייה של זרימת אוויר.
- הכן מראש 1x500 מ"ל של Iscove השתנה Dulbecco בינוני (IMDM) המכיל חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 מ"מ) ו pyruvate נתרן (1 מ"מ), בתוספת 5-α-dihydrotestosterone (1 ננומטר), 10% שור עוברית סרום, 1% (v / v) אנטיביוטיקה (100 U / מ"ל פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין הסופי), ו שכותרתו "מלא IMDM". יצירת aliquots 50 מ"ל חותם עם parafilm; חנות ב 4 ° C. השתמש בתנאים aseptic.
- הכן פתרון קולגן enazyme עיכול על ידי המסת collagenase סוג אני ו collagenase סוג II ב RPMI (+ P / S 1: 100) וכתוצאה מכך 1 מ"ג / מ"ל של כל collagenase בפתרון. סינון דרך קרום 0.22 מיקרומטר ולסמן כמו "פתרון collagenase". שמור על טמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש. התאם את עוצמת הקול של פתרון האנזים מבוססעל משקל האנזים; את הכמות המינימלית הנדרשת עבור שני epididymides cauda מ חולדה אחת היא 2 מ"ל.
- ממלאים צלחת 35 מ"מ עם RPMI (+ P / S 1: 100).
- ניתוחים של עכברים
- להקריב את החיה על ידי או באמצעות pentobarbital נתרן 85 מ"ג / ק"ג IP או באמצעות תא isoflurane עד החיה אינה מגיבה לגירוי זנב זנב; עקוב אחר צוואר הרחם.
- לחטא את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם אתנול 70%, בעדינות לדחוף את שני האשכים למטה הבטן התחתונה, ולאחר מכן לפתוח את הבטן התחתונה ליד שק האשכים.
- לאסוף את השומן האפידידימלי, לנתח את כל אברי הרבייה (אשכים, epididymides, ו deferens ואס) ו לטבול בצלחת עם RPMI (+ P / S 1: 100).
- העברת אברי הרבייה בצלחת עם RPMI (+ P / S 1: 100) לתחנת עבודה aseptic.
- לנתח את epididymides cauda מן רקמות החיבור ואת השומן ואת epiקפסולת דידימאל. מניחים אחד עם אפרדימיס ~ 0.2 מ"ל של פתרון Collagenase ב 1.5 מ"ל tube.Perform בשלב זה בתנועה נקייה זרימת אוויר עבודה מבוקרת.
- דיסוציאציה של תאים בודדים מאפודידימידי חולדה
- חותכים את epididymides ב Collagenase פתרון באמצעות מספריים בסדר עד הרקמה הופך נוזל הדבק. שוטפים את המספריים בעדינות עם שאר (0.8 מ"ל) פתרון האנזים בצינור 1.5 מ"ל.
- מניחים את הצינור על thermomixer מתכת במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס במהירות רועדת של 1000 סל"ד.
- צנטריפוגה תערובת רקמות האנזים ב 30 xg ב RT במשך 3 דקות ו decant supernatant דביק המכיל בעיקר את הזרע.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל מלא IMDM להרוות את כל הפעילות האנזימטית. מעבירים את ההשעיה התא לצינור 50 מ"ל המכיל 49 מ"ל RPMI (+ P / S 1: 100).
הערה: לחלופין, לסנן את ההשעיה התא דרך קרום 100 מיקרומטר רשת עם triturat קבועיון להימנע גדולים, אגרגטים התא. עם זאת, אין להשתמש במסנן רשת אם ההשעיה התא נדרש לגידול monolayers התא. - צנטריפוגה תערובת הסלולר ב 30 xg ב RT במשך 10 דקות; לסלק את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 1 מ"ל מלא IMDM עם טחינה דקה במשך 5 דקות לפחות לנתק תאים בודדים מן תערובות רקמות האנזימטית טיפול.
- הפרדת תאים אפיתל מתאי אחרים בתנאים aseptic
- תרבות ההשעיה התא על צלחת 10 פטרי ס"מ המכיל Full-IMDM לפחות 8 שעות או לילה, באינקובטור ב 32 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 .
- הכן coverslips סטרילית מראש על ידי טבילה אלכוהול 100%. אוויר יבש לטבול בנפח קטן של המדיום התרבות. מניחים את coverslips ב 6 מנות תרבות ס"מ או בארות בודדות של צלחת 24 גם.
- למחרת, לקצור את התאים אפיתל מנותקים על ידי איסוף בעדינות את התאים התאSion מ צלחת פטרי, אשר מורכב בעיקר של תאים אפיתל. צנטריפוגה ההשעיה תא ב 30 xg ב RT במשך 5 דקות, ולאחר מכן decant supernatant.
- Resuspend תא גלולה ב ~ 2 מ"ל מלא IMDM.
- זרעים 0.2 מ"ל של ההשעיה תא שנקטפו אל מרכז כל coverslip סטרילית.
- בואו ההשעיה התא להתיישב טיפות נוזלי לפחות 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדלג באופן רופף coverslips זכוכית. בזהירות להוסיף 1 מ"ל מלא IMDM בקצה של צלחת 10 ס"מ, או 0.3 מ"ל מלא IMDM היטב כל צלחת 24-היטב; לא להפריע לתאים.
- שמור על תאים בודדים בודדים על coverslips באינקובטור ב 32 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עד ניסויים תיקון מהדק.
3. הקלטה פתרונות Micropipettes
הערה: עבור ניסויים קליק תיקון, להשתמש בכימיקלים באיכות הטובה ביותר ופתרונות.
- הכנת פתרונות מניות
- החיטוי כל הבקבוקים לאחסון מלאי לסנן את כל פתרונות המניה (למעט פתרונות קורוזיביים) ולסנן באמצעות 0.22 מיקרומטר קרום לפני השימוש.
- הכן את כל פתרונות המניות מראש ב RT, חנות ב 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 מ"מ MgCl 2 ; 100 מ"מ CaCl 2 ; 200 מ"מ NaH 2 PO 4 ; 100 מ"מ EGTA (pH 7.0 עם KOH). ידית 5 M NaOH, 1 M HCl ו 1 M מניות KOH כמו פתרונות קורוזיביים.
- הכנת תקן חיצוני הקלטה פתרון מלח פיזיולוגי (PSS)
- חם את פתרונות המניה RT בבוקר של ההקלטה מהדק תיקון.
- פיפטה את החומרים מכל המניות על פי נפח הסופי הרצוי, למעט CaCl 2 , למשל להכנת 500 מ"ל של PSS: 140 מ"מ NaCl = 14 מ"ל של 5M; 5 מ"מ KCl = 2.5 מ"ל של 1M; 1.2 מ"מ MgCl 2 = 6 מ"ל של 100 מ"מ; 1.2 mM NaH 2 PO 4 = 3 מ"ל של 200 מ"מ.
- הוסף כפולמים מזוקקים (DDH 2 O) לנפח הסופי של 400 מ"ל ושיווי משקל.
- לשקול 0.9 גרם גלוקוז ו 1.19 גרם HEPES ו להמיס לחלוטין בתערובת הפתרון.
- הוסף את מלאי CaCl 2 (2.5 מ"מ = 12.5 מ"ל של 100 מ"מ) עם ערבוב.
- הוסף עד 99% מהנפח הסופי.
- התאם את pH 7.4 באמצעות NaOH או HCl.
- בדוק את osmolarity ולהתאים באמצעות 5 Na NaCl או גלוקוז, במידת הצורך.
- הוסף dDH 2 O לנפח הסופי של 500 מ"ל בצילינדר.
- הכנה של פתרונות פנימיים micropipette (נמוך EGTA K + מבוססי פתרונות)
- לשקול או פיפטה את הכמות הנכונה של ריאגנטים מכל המניות על פי נפח הסופי הרצוי וריכוז, למשל להכנת 50 מ"ל נמוך EGTA K + מבוסס פתרון תאיים בהיקף של ~ 30 מ"ל dDH 2 O: 100 מ"מ K-gluconate = 1.17 גרם; 35 מ"מ KCl = 1.75 מ"ל של 1 M; 2 מ"מ MgCl 2 = 1 מ"לשל 100 מ"מ; 0.1 מ"מ EGTA = 0.05 מ"ל של 100 מ"מ; 10 מ"מ HEPES = 0.072 גרם.
- הוסף מספיק מים עבור ~ 95% נפח סופי ולאפשר את הפתרון כדי לאזן ב RT. ודא שהפתרון ברור.
- בעוד כל הזמן ערבוב הפתרון, להתאים את ה- pH 7.2 באמצעות KOH.
- לשקול ולהוסיף 0.078 גרם MG-ATP לפתרון עד שהוא מומס לחלוטין.
- מניחים את הפתרון על הקרח ולהשתמש aliquot קטן למדידת osmolarity; בדרך כלל, הפתרונות אמצעים ~ 290 mOsmol ואינו צריך הסתגלות. אם osmolarity שונה באופן משמעותי 280-295 mOsmol, להכין פתרון חדש.
- הוסף dDH 2 O כדי נפח סופי.
- מחלקים את הפתרון לתוך 500 aliquots μL, מסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק, החותם בחוזקה מיד לאחסן ב ≤ -20 מעלות צלזיוס.
- ביום של ניסוי טלאי תיקון, להפשיר אחד aliquot של פתרון תאיים על הקרח ולשמור מקורר במהלך הניסוי תיקון מהדק ללמנוע השפלה.
- משוך את טפיחות תיקון מ נימי זכוכית (הוראות פיפטה המשתמש הבא של המדריך) כדי להשיג גדלים micropipette עם התנגדות של 5-10 M כאשר מלא פתרון תאיים.
4. הגדרת התיקון Clamp תיקון הקמת תא שלם תא עם תאים
- הגדרת הניסוי תיקון מהדק
- הפעל את ערכת מהדק התיקון (מחשב, מגבר הנשלט על ידי מחשב, Digitizer וכו ' )
- פתח את התוכנה תיקון מהדק ( למשל AXON pCLAMP10 או HEKA PatchMaster) ולהגדיר את הפרוטוקולים עבור הקלטות אלקטרו. הגדר את המסנן עבור האות כדי לעבור נמוך ב 1-3 קילוהרץ ו digitizer ב 10-20 קילוהרץ.
- הפעל את המצלמה, את המיקרו-מניפולטור ואת מקור האור.
- כאשר המגבר הנשלט על ידי המחשב מופעל, הניח את הגוף של הנסיין על ידי נגיעה בידיים של מתקן הידוק התיקון שנקבע,לפני נגיעה על הדוכן, כדי להגן עליו מפני זעזועים חשמליים.
- מעבירים את תאים אפיתל culturing על coverslip זכוכית לתא ההקלטה מלא ~ 1 מ"ל של תקן PSS ב RT. בזהירות לשנות את PSS רחצה לפחות פעמיים באמצעות פיפטה לפני כל תיקון קלימפ ניסויים.
הערה: יש למלא את מערכת הזלוף ב - PSS סטנדרטי או בפתרון חיצוני אחר בהתאם לניסוי המתוכנן. Perfuse מיקרוסקופ רכוב הקלטת תא (RC-26G או RC-26GLP) עם PSS כמה פעמים במהירות של ~ 2 מ"ל / דקה לפני תחילת הניסויים תיקון מהדק. ודא כי אין בועות אוויר לכודים לאורך מערכת זלוף. - הצג ובחר את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך תוך שימוש ביעדים 10X ו 40X מצויד הפרעה הפרש בניגוד מערכת אופטית. חפש תאים בודדים בודדים גדולים להקלטת. זיהוי תאים אפיתלתיים מבודדים eppidhelial על ידי צורה כדורית שלהם עם מ 'גסIcrovilli בקצה אחד של הממברנות והפצה מקוטבת של תוכן תאיים ( איור 1 ).
- באמצעות מזרק 1 מ"ל (מחט מתוצרת עצמית microsyringe מתוצרת בית), למלא micropipette עם הפתרון הפנימי (נמוך EGTA K + בסיס הפתרון, ראה שלב 3.3). ודא כי אין בועות אוויר micropipette, אשר יכול להגדיל את ההתנגדות של micropipette. השתמש פתרון מספיק, כך את הפתרון הפנימי submersges מצופה כלוריד חוט כסף אלקטרודה בתוך בעל micropipette.
- הר micropipette את בעל האלקטרודה, וליישם לחץ חיובי נמוך (~ 0.2 מ"ל נפח מזרק). שמור על לחץ חיובי נמוך רציפה עד לגעת קרום התא בשלבים מאוחרים יותר.
- הקמת תצורה של תא שלם עם תאים להקלטות
- לטבול את פיפטה לתוך הפתרון אמבטיה במהירות הגבוהה ביותר של micromanipulator. מצא את פיפטהעצה במסך המחובר למצלמה הדיגיטלית; להאט את מהירות micromanipulator למצב בינוני גבוהה.
- בדוק במהירות את ההתנגדות micropipette (5-10 MΩ) באמצעות הפקודה ממשק רכישת נתונים ( למשל "בדיקת ממברנה" במערכת AXON) על ידי החלת צעד מתח ( למשל 5 mV עבור 100 אלפיות השנייה) שנוצר על ידי מגבר מבוקרת מחשב. שינוי micropipette חדש אם ההתנגדות היא משמעותית מחוץ לטווח זה.
- התחל להזיז את המטרה רכוב על המיקרוסקופ; בהדרגה להנחות את micropipette לכיוון התא הנבחר. תמיד להוריד את המטרה הראשונה, ולאחר מכן להוריד את micropipette אל המטוס של המיקוד, עד micropipette הוא מעל פני השטח המרכזי של התא הנבחר.
- ביטול פוטנציאל צומת נוזלי בין פיפטה ופתרונות אמבטיה לאפס באמצעות הפקודה "פיפטה לקזז" בממשק המפקד של התוכנה.
- הגדר את המגבר הנשלט באמצעות מחשבו אנדר כדי מתח מהדק ואת הממברנה הבדיקה למצב "אמבטיה".
- פיין להתמקד עבור תצוגה ברורה יותר של התא, ולאחר מכן בהדרגה להוריד את micropipette באמצעות micromanipulator במהירות בינונית נמוכה.
- כאשר micropipette קרוב לתא (שהוכח על ידי זרם ירד כאשר מופעלות על ידי הפקודה הבדיקה הממברנה), להסיר את הלחץ החיובי נמוך מיד להחיל לחץ שלילי חלש (נפח 0.1 מזרק מ"ל) כדי ליצור את gigaseal (> 1 GΩ) .
- צג את ההתנגדות עם הממברנה הבדיקה. אם ההתנגדות היא> 500 MΩ אבל <1 GΩ, יש ליישם פוטנציאל שלילי (בדרך כלל כבעלת הפוטנציאל החזק - 60 mV), אשר יכול לעזור ליצור את gigaseal. לפצות את זרם קיבולי חולף של micropipette.
- אם החותם הוא 1 GΩ ויציב (כפי שמוצג בממשק התוכנה), יש ליישם שאיבה קצרה וחזקה כדי לשבור את קרום התא. אין להחיל פיצוי עבור seRies ההתנגדות ואת קיבול התא.
- מיד לאחר השגת תצורה של תא שלם מוצלח, יש ליישם צעד 10 hypervolarizing 10 (5-עקבות עם מרווחי זמן מינימלי, 20 ms משך, מדגם אות ב 20 קילוהרץ) מ פוטנציאל החזקה של -60 mV.
- החלף את מצב המתח למצב אפס הנוכחי לסמן את הקריאות מממשק התוכנה או לבצע הקלטה ללא פער (10-60 שניות) על הקריאות פוטנציאל הממברנה של התא.
- לחזור במהירות ולהישאר במצב מתח וליישם את פרוטוקולי המתח על פי הניסויים המתוכננים ולמדוד את התגובות הנוכחיות. חיסור אינו מוחל על זרם הדליפה הפנימי במהלך ההקלטות.
- מעקב אחר יציבות התגובות במהלך ההקלטות, או הפרמטרים השונים של התא. לדוגמא, להשתמש בממשק הפקוד "מבחן ממברנה" כדי לבדוק את עמידות הקלט (i R), התנגדות הסדרה (ים R) ואת התאקרום קיבול (C מ ' ) במבחן הממברנה במצב "תא" במהלך הבורר של פרוטוקולים.
הערה: טיפות פתאומיות בהתנגדות הקלט מעידות בדרך כלל על תיקון רופף, ועלייה דרמטית בהתנגדות הסדרה עשויה להצביע על סתימת קצה המיקרופטים על ידי האברונים התוך תאיים או שברי הממברנה. במהלך ההקלטה, לפקח באופן קבוע את המיקום micropipette כדי לבדוק אם מתרחשת סחף, אשר עלול להוביל לאובדן התיקון. אם סחיפה היא בעיה, בזהירות להרים את micropipette ואת תא התיקון הרחק מהחלק התחתון של החדר ההקלטה. צעד זה עשוי לפעמים להוביל לאובדן התיקון, ובמקרה זה, יש צורך לחזור על כל התהליך תיקון טלאי תא.
5. ניתוח של נכסים אלקטרונים פסיביים של תאים
- לאחר קבלת הנתונים מן הניסויים מהדק תיקון, לפתוח את הנתונים ללא פער בתוכנת Clampfit ולמדוד את הממוצעערך עבור פוטנציאל קרום מנוחה לכל תא. לחלופין, השתמש בערך כפי מסומן למטה מתח הנוכחי אפס במצב הנוכחי. תקן את הערכים עם פוטנציאל צומת נוזלי (12.4 mV במחקר זה).
- פתח את הנתונים מ 10- mV hyperpolarizing צעד (ΔV) המתקבל מתא, למדוד את ההבדל הנוכחי לפני ובמהלך שלב (Δ I צעד ), ולחשב את ההתנגדות קלט (R i ) באמצעות המשוואה כמו:
- לחשב את קיבול התא (C מ ' , ביחידה של pF) (להשתמש בנתונים הנוכחי אותו מ 10-mV hyperpolarizing צעד על ידי שילוב השטח הכולל תחת קבלים הנוכחי קבלים במהלך זרם דעיכה הראשונית חולף הרים על ההדק צעד ההדק) כדי לקבל את הערך של סך הטעינה שנצברה (Q, ביחידה של pA • ms) של התא. השתמש במשוואה הבאה:
- חישוב הערך של התנגדות הסדרה (R s ) לכל תא על ידי התאמת הזרם הארעי הראשוני משלב השלילי של 10 mV עם אלגוריתם אקספוננציאלי סטנדרטי כדי להשיג את הזמן הנוכחי של ריקבון קבוע ( T , ביחידה של ms) ולהשתמש משוואה הבאה:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך העיכול האנזימי המתואר לבידוד של תאים אפיתל מן epididymides cauda חולדה הוא פרוטוקול שונה מן המחקרים הקודמים שלנו 9 , 12 . שיטה זו מייצרת תערובת של תאים בודדים עם מעל 90% הכדאיות וללא שלפוחיות פני השטח או נפח נפוח התא. תערובת תאים הטרוגנית מורכבת בעיקר של תאים עיקריים, תאים ברורים ותאי הבסיס, כפי שתיארנו בעבר 1 . בפרוטוקול זה, דגימות טהורות יחסית של תאים אפיתלתיים אפידרלי ניתן לקבל על ידי culturing התאים העיקריים ניתק בן לילה על צלחת פטרי כדי לאפשר הידבקות של תאים שאינם אפיתל (כגון, fibroblasts ותאי חלקה) על המנה, כמו הפגינו באיור 1A (לפני הקציר). סוגי התאים ניתן אז להפריד באופן ראשוני על ידי פנוטיפים שלהם מתחת למיקרוסקופו מסווג על פי המאפיינים הספציפיים שלהם ממברנה פסיבית. בתערובת התא ניתק, יש קבוצה של תאים שיש להם microvilli או קרום גס בקצה אחד של קרום השטח שלהם, ותוכן סלולרי מקוטב; אלה מכונים את התאים העיקריים או תאים ברורים כמו ( איור 1B , חיצים). תאים אלה אפיתל מקוטב הם נבדלים על ידי תכונות מורפולוגיות שלהם, אבל יכול להיות מזוהה על פי המאפיינים שלהם ממברנה פסיבית התגובות המוליכות המתקבל מן התא שלם קליפ הקלטות. קבוצה אחרת של תאים היא קטנה יותר עם גודל לא stereocilia על קצה אחד של הממברנה ולא ברור תוכן polarized הסלולר; אלה מכונים את התאים לא microvilli, והם מורכבים בעיקר תאים בזליים ( איור 1 ב , כוכביות).
התאים העיקריים אפיתל העיקרי ניתן להבחין בין תאים אחרים על ידיתכונות ייחודיות קרום פסיבי שונים ( איור 2 ) ואת הדפוסים הנוכחיים ( איור 3 ) בתגובה פרוטוקול מתח מיושם באמצעות טכניקה כל תיקון- clamp תיקון. תכונות קרום פסיבי electrophysiological של תאים יכולים לעזור להעריך את מצב הבריאות הראשונית של תאים בודדים של קבוצות סוג התא. סיכום של נקודות בודדות נקודה של קיבולת הממברנה (C מ ' ), את ההתנגדות קלט (R מ' ) ואת פוטנציאל הממברנה (V מ ' ) של כל קבוצת התא נתון באיור 2 א . אין הבדל בזמן קבוע עבור קיבול הממברנה בין סוגי תאים שונים (~ 0.4 ms) (הנתונים אינם מוצגים בכתב יד זה). באמצעות הפתרון הנמוך EGTA K + מבוסס, הקיבולת הממוצעת הנמדדת של הממברנה עבור התאים העיקריים היא 9.4 0.5 pF (n = 32) ועל התאים ברורים הוא 9.7 1.9 pF (n = 12). הקיבול של הממברנהאת התאים לא microvilli הוא 5.2 0.8 pF (n = 17), אשר קטן מבחינה סטטיסטית מאשר המנהלים וברורים כמו תאים קיבולי קרום.
התנגדות הקלט של תאים עיקריים בתרשים 2A (פאנל באמצע) היא 1.1 ± 0.2 GΩ (n = 32), וזה של התאים הברורים הוא 2.2 ± 0.8 GΩ (n = 12), שהוא נמוך משמעותית (P <0.001) מאשר זה של תאים no-microvilli (8.9 ± 2.1 GΩ, n = 17). כפי שמתואר בתרשים 2 א ' (פאנל ימין), הפוטנציאל של קרום האפס הנוכחי ( כלומר , פוטנציאל הממברנה במינון V m ) נמדד זמן קצר לאחר קביעת התצורה של כל התא ושימש להשוואת הקבוצות לאחר התיקון עם פוטנציאל צומת נוזלי (12.4 MV). תאים שטפו באופן שגרתי PSS סטנדרטיים dialyzed עם 0.1 מ"מ EGTA K + מבוסס פיפטה פתרון המכיל ATP. מפוטנציאל הממברנה של התאים העיקריים הוא -26 ± 2 (n = 28), בין -51 mV ל -1 mV, ופוטנציאל הממברנה הממוצע של התאים הברורים הוא 30 ± 3 mV (n = 10) בין 47 mV ו -17 mV. התאים ללא מיקרוביאלי מחזיקים בפוטנציאל הממברנה הגבוה ביותר עם ערך של -33 ± 5 mV (n = 17), בין -63 mV ל -13 mV.
ההתנגדות קלט נמוך של התאים העיקריים עולה כי ישנם מוליכים מהותי תאים אלה, אבל זה יכול להצביע דולף של החותם בין פיפטה לבין קרום התא התיקון. כדי לטפל בבעיה זו, תחילה הוצאנו את הנתונים מהתאים הללו עם שינויים פתאומיים (המעידים על דליפת חותם) של התכונות החשמליות במהלך ההקלטות. לאחר מכן ניתחנו את המתאם בין התנגדות האיטום בסף של 1 giga-ohm עם התנגדות הקלט, כפי שמוצג באיור 2 ב . התוצאה הייתה ערך מתאם נמוך מאוד (R 2 ≈ 0.02). דבר זה מעיד על כך שלתנגדות האיטום יש השפעה זניחה על התנגדות הקלט, וכי התכונות החשמלות הפסיביות המדווחות של התאים השונים (כגון התנגדות הקלט הנמוכה של התאים העיקריים) הן התכונות המהותיות של תאים אלה.
איור 3A היא התגובה הנוכחית טיפוסי נרשם מהתאים העיקריים בתנאים מעין פיזיולוגיים עם התאים רחצה תמיסת מלח פיזיולוגית רגילה (PSS), dialyzed עם נמוך EGTA K מבוסס פיפטה פתרון מגורה מן הפוטנציאל מחזיק של -60 mV לסדרה של 500 ms בדיקות מתח (החל מ -120 mV ל +60 mV כפי שצוין בתוספת של איור 3 ב ). שני tracings באיור 3C להראות את תגובות טיפוסי מנוחה קרום של תא ראשי מזוהה תחת מהדק אפס הנוכחי בנוכחות, אוהיעדר ATP בפתרון פיפטה. בנוכחות ה- ATP, פוטנציאל המנוחה יציב יחסית. בעוד hyperpolarization מתקדמת נצפתה כאשר תאים היו dialyzed עם פתרון פיפטה ללא ATP. פוטנציאל קרום מנוחה ראשונית נמדדת בתחילת דיאליזה התא עם פתרונות פיפטה מראה שום הבדל משמעותי בתאים עם או ללא ATP ( איור 3 ), מה שמרמז כי הערכים נמדדו עדיין שלם מושפע מינימלית על ידי פתרונות פיפטה.
איור 1 : תכונות מורפולוגיות של עכברוש מבודד cauda epididymal תאים אפיתל. ( A, B ) דוגמאות של תאים אפיתל מבודדים מן עכברוש capid epididymides לפני ( א ) ואחרי ( ב ) הקציר מחדש של oveתרבות לילה על המנה לפני ניסויים מהדק תיקון. החצים מצביעים על תאים microvilli, אשר מורכב בעיקר של התאים העיקריים התאים ברורים. כוכביות לציין את התאים לא microvilli. רק תאים בודדים נבחרו עבור הקלטה של מהדק תיקון. סולם בר = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : מאפייני קרום פסיבי של עכברוש יחיד cauda epididymal תאים אפיתל. ( א ) מגרשים נקודה של המאפיינים קרום פסיבי של עכברוש יחיד cauda epididymal תאים אפיתל. הפתרון פיפטה נמוך EGTA K + מבוססי פתרון רחצה הוא תקן PSS. ( ב ) ניתוח קורלציה של קלט קלטIstance עם עמידות החותם של התאים. NS : ללא הבדל משמעותי, P <0.05, ** P <0.01 *** P <0.001 הבדל משמעותי לעומת בקרות מתאימות באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן Bonferroni פוסט-הוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 : זרמים אופייניים של כל התא בתאים ראשיים האפידידימלי. ( A ) זרמים אופייניים של תא שלם שנרשמו מתאי אפיתל יחיד אפידיאלית נרשמה בתנאים מעין פיזיולוגיים באמצעות פרוטוקול מעורר הדופק כפי שמוצג ב הבלעה של הפאנל B. הקו מנוקד הצביע על רמות אפס הנוכחי. ( ב ) יחסי המתח הנוכחי של התשובות הנוכחיותEs נמדד בנקודות הזמן המצוין כמו ב- A. הנתונים הם האמצעים ± SEM של שמונה תאים עיקריים משלושה בעלי חיים לפחות. ( ג ) נציג tracings של פוטנציאל קרום מנוחה של התאים העיקריים dialyzed עם פתרון פיפטה, או עם ATP (+ ATP) או ללא ATP (-ATP). ( ד ) תרשים בר מראה שום הבדל משמעותי בין פוטנציאל קרום מנוחה ראשונית של + ATP ו- ATP. ערכים הם אמצעים ± SEM נמדד באותו זמן, כי הוא ציין בלוח C. מספרים בתוך סוגר בתוך הסורגים מצביעים על מספר תאים שנבדקו לפחות שלושה בעלי חיים. NS : אין הבדל משמעותי. ( E ) ניתוח המתאם של עמידות החותם ואת ההתנגדות קלט של כל התאים, או התאים העיקריים בלבד, לעומת קרום המנוחה נמדד ב-אפס הנוכחי מהדק זמן קצר לאחר הקמת התא כולו ואת המגדלים הנוכחי נמדד היפרפולניזציה צעד ל -100 mV מ מחזיק pאקונומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, פיזור אנזימטית של epididymides cauda חולדה בעקביות הניב תאים אפיתל בריאים. איכות התאים אפיתל אפידלימלי עבור ניסויים מהדק תיקון תלוי במספר צעדים קריטיים בפרוטוקול. לדוגמה, צנטריפוגה של תערובת התא על כוח צנטריפוגלי נמוך (30 xg) חשוב להסרת spermatozoa ואת תוכן luminal epididymal; התאים אפיתל אפידלימלי להיות בריא בנוכחות הזרע בתרבות התא. בנוסף, culturing תערובת התא ניתק על צלחת פטרי במשך מספר שעות הוא צעד חשוב על מנת להסיר את fibroblasts ותאי השריר החלקים; התאים שאינם אפיתל לדבוק מהר יותר על צלחת התרבות ובכך, עוזב את התאים אפיתל ההשעיה, אשר ניתן מחדש שנקטפו על ידי שאיפה עדינה. יתר על כן, עיכול collagenase ו טחינה דקה עם פיפטה זכוכית בסדר הם שני שלבים חשובים כדי לשחררתאים בודדים במהלך הליך ניתוק התא. לבסוף, העיכול האנזימטי של התאים האפידידימליים הוא קריטי עבור הניסוי טלאי תיקון כי תת עיכול על ידי פעילות אנזימטית לא יעילה או יתר על ידי עיכול על ידי הדגירה ממושכת יכול גם לשבש את ג 'יגה אוהם היווצרות החותם בין פיפטה וקרום התא.
בתערובות התא, התאים בצורה עמודית גדולה יותר עם קרום מחוספס הנושא סטריאוסיליה בקצה אחד והפצה מקוטבת של התוכן התוך תאי הם ככל הנראה התאים העיקריים או התאים הברורים. תאים אחרים שאינם בעלי microvilli בולט ותוכן תאים מקוטב עשוי לכלול את התאים הבסיסיים וכמה תאים של המערכת החיסונית. בנוסף לתיאור תכונות מורפולוגיות בסיסיות של תאים אפיתלתיים אפידרלי, פרוטוקול זה מעסיק את כל התא תיקון שיטת מהדק כדי למדוד את המאפיין קרום פסיבי של כל תא. תכונות קרום אלה מאפשרים הבחנה ראשונית שלסוגי התאים. שיטה זו יש כמה מגבלות כגון לשטוף את התוכן תאיים עם פתרון פיפטה ו וריאציות אלקטרוניות ביחס שינויים אדריכלות הסלולר במהלך הקלטות רציפה 19 , 20 . אנו מספקים רק את הפרמטרים שאנו מדדים מיד לאחר הקמת תצורה של כל התא, אשר משקפים את התנאים הראשונים, שלם שלמים של התאים. המאפיינים קרום פסיבי של כל תא כוללים את הקיבול הממברנה, ההתנגדות קלט ואת הפוטנציאל קרום מנוחה.
הקיבול הספציפי של קרום התא מוסכם בדרך כלל להיות 1 μF / cm 2 וזה נכון לגבי תאים (כגון, תאים חיסוניים נוירונים) עם קיפול מוגבל על קרום התא שלהם 16 , 18 . עם זאת, קבוע הקיבול הספציפי נוטה להיות גדול יותר עבור תאים wIth ארכיטקטורות מורכבות יותר, הסלולר, כמו תאי אפיתל, שיש להם הרבה קרום התא הקפל בתאים נפרדים. דוחות מצביעים כי הערכים שורת תאים אפיתל MDCK הם 4 μF / ס"מ 2 ו 3 μF / ס"מ 2 עבור קיבולים ספציפיים קרום apical ואת הבסיס, בהתאמה 17. במחקר הנוכחי, הקיבולות הממוצעות של הממברנה הממוצעת הן ~ 8 pF ו- 12 pF עבור קבוצת התאים ללא מיקרוביילי והתאים העיקריים וקבוצות תאים ברורות ( כלומר , תאי מיקרוביליה), בהתאמה. באמצעות הקיבול הספציפי של 1 μF / ס"מ 2 עבור החישובים שלנו, השטח המשוער תא השטח הם 500 מיקרומטר 2 ו - 1000 מיקרומטר 2 עבור תאים לא microvilli ותאי microvilli, בהתאמה, אשר מתאים בקטרים של 13 מיקרומטר ו 18 Μm. עם זאת, הערכות אלה הם גדולים יותר מה היה צפוי על בסיס גדלים תאים מתחת למיקרוסקופ, אשר ~ 81, m ו ~ 12 מיקרומטר עבור תאים לא microvilli ו microvilli תאים, בהתאמה, תאים אלה הם כ 2.4 מיקרומטר / ס"מ 2 ו 1.9 μF / ס"מ 2 , בהתאמה. התוצאות שלנו מראות כי הנוף קרום של תאים לא microvilli מורכבת יותר מזו של תאים מיקרו וילי, אשר עולה בקנה אחד עם הפרשת שלהם פונקציות התחבורה.
הקיבול הספציפי של קרום התא מוסכם בדרך כלל להיות 1 μF / cm 2 וזה נכון לגבי תאים (כגון, תאים חיסוניים נוירונים) עם קיפול מוגבל על קרום התא שלהם 16 , 18 . עם זאת, קבוע הקיבול הספציפי נוטה להיות גדול יותר עבור תאים עם ארכיטקטורות סלולר מורכבות יותר, כמו תאי אפיתל, שיש להם מספר רב של קרום תאי קרום בתאים נפרדים. דיווחים מצביעים על כך MDCK ערכי תא אפיתל תאים הם 4 מיקרומטר / ס"מ 2 ו 3 μF / cm 2 17. במחקר הנוכחי, הקיבולות הממוצעות של הממברנה הממוצעת הן ~ 8 pF ו- 12 pF עבור קבוצת התאים ללא מיקרוביילי והתאים העיקריים וקבוצות תאים ברורות ( כלומר , תאי מיקרוביליה), בהתאמה. באמצעות הקיבול הספציפי של 1 μF / ס"מ 2 עבור החישובים שלנו, השטח המשוער תא השטח הם 500 מיקרומטר 2 ו - 1000 מיקרומטר 2 עבור תאים לא microvilli ותאי microvilli, בהתאמה, אשר מתאים בקטרים של 13 מיקרומטר ו 18 Μm. עם זאת, הערכות אלה הם גדולים יותר מאשר מה שהיה צפוי על פי גדלים התאים תחת המיקרוסקופ, הם ~ 8 מיקרומטר ~ 12 מיקרומטר עבור תאים לא microvilli ו microvilli תאים, בהתאמה, תאים אלה טובים יותר עם ערך קיבול מסוים 2 μF / cm 2 . זה מצביע על כך הנוף הממברנה של תאים אפיתלתיים האפידיאלי הוא מורE מורכבים מסוגי תאים אחרים, אשר עולה בקנה אחד עם הפרשת שלהם פונקציות התחבורה.
בכל ההקלטות התא, מוליך דליפה על פני הממברנה ועל החותם בין הממברנה פיפטה תרמו שניהם המאפיינים קרום נמדד. החותם יש התנגדות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר הממברנה, ולכן יש השפעה מינימלית על המדידה של המאפיינים קרום פסיבי, כגון התנגדות קלט ואת פוטנציאל קרום אפס הנוכחי. עולה בקנה אחד עם הרעיון הזה, ניתוח המתאם של התנגדות איטום על סף של 1 giga-ohm נגד התנגדות קלט של כל תא הביא ערך של 0.02, דבר המצביע על השפעה חלשה מאוד. ניתוח מתאם נוסף של התנגדות החותם או התנגדות קלט לעומת הפוטנציאלים קרום מנוחה או את גודל הנוכחי נמדד ב -100 mV גם נתן ערכים נמוכים עבור כל התאים שנבדקו או עבור התאים העיקריים בלבד. התוצאות שלנו deMonstrate כי ההתנגדות קלט של תאים ראשיים האפידידימלי ואת התאים ברורים כמו נמוך באופן משמעותי מאשר בתאי no-microvilli, ובכך לספק פרמטר ראשוני עבור פסק הדין על הבחנה בין סוגי תאים. תוצאות אלו מצביעות על כך שהתנגדות הקלט הנמוכה בתאים העיקריים היא תכונה פיזיולוגית מהותית של התאים. לתאי אפיתל אחת יש גם דפוסים הנוכחי הנוכחי בתגובה פרוטוקולים להחיל את תנאי הניסוי. שמנו לב כי כל סוג תא מוגדר הציג דפוסים עכשוויים ייחודיים תחת אותו פרוטוקול מתח מיושם. דוגמא שמוצגת באיור 3 הדגים התגובות הקיימות הטיפוסיות רשמו מתאי המנהלת בתנאים מעין-פיסיולוגי, כמו שכבר דווחה בעבר 9. המאפיינים האלקטרופיזיים של כל סוג תא מיוחד הם נבדלים בקלות (הנתונים אינם מוצגים במאמר זה). בהתבסס על פרמטרים אלה,סוגי תאים שונים ניתן לסווג בערך לתוך התאים העיקריים, תאים ברורים כמו תאים no-microvilli, כמתואר בתוצאות.
התנגדות הקלט היא התנגדות הממברנה בתגובה לשלב הפוטנציאלי החלים (10 mV hyperpolarizing צעד במחקר זה) נבע פוטנציאל החזקה של -60 mV. זה משקף את היקף הפעילות של הערוץ הפתוח בתגובה לפוטנציאל המיושם. בהקשר זה, התנגדות נמוכה מרמזת על מוליכות גבוהה "דליפה" של התאים, בעוד התנגדות גבוהה מרמזת על ערוצים סגורים. ערך התנגדות נמוך קלט בתאים העיקריים מתאים מוליך הממברנה הבולטת, ואילו תאים ברורים כמו בעלי מוליכות קטנה הפוטנציאל הממברנה הבדיקה מרמז על מוליכות מתונה שלהם בתנאי ההקלטה. התנגדות קלט גבוהה באופן משמעותי של תאים לא microvilli מרמז כי אין להם ערוצים פתוחים במצב זה. ב אפס cuרנט clamp, הפוטנציאל הממוצע של קרום מנוחה של תאים אפיתל נמדדים, מבודדים נמצאים בטווח של 26-33 mV עבור שלוש קבוצות תאים. ערכים אלה הם דומים עם פוטנציאל הממברנה דיווח (-30 mV) באמצעות שיטת microelectrode 21 . עם זאת, פוטנציאל המנוחה נמדד להשתנות באופן משמעותי בתאים בודדים (מ -3 mV ל -63 mV) למרות היעדר פוטנציאל ספייק ספונטנית. וריאציה זו עשויה לשקף את האינטראקציה של פעילויות ערוץ יון שונים בסוגי תאים שונים, כגון משחק הגומלין המצמד של TRPV6 וערוצי TMEM16A בתאים העיקריים, כפי שדיווחנו לאחרונה 9 . ראוי לציין כי כאשר התאים היו dialyzed עם פיפטה ATP, לא נצפו שום פוטנציאל חשמלי ספונטני בתאים העיקריים; זה מסכים עם סיווג של תאים אפיתל כמו לא מרגש 4 . היפרפולריזציה פרוגרסיבי כאשר התאים היו dialyzed עם piפתרון PET ללא ATP עשוי לשקף את המראה ההדרגתי של זרם אשלגן רגיש ATP. זה כבר דווח כי ערוצי אשלגן רגישים ATP באים לידי ביטוי במנגנון Golgi של התאים העיקריים של החולדה עכברוש וכי הידלדלות של ATP תאיים מוביל להפעלה של ערוצי K ATP 14 , 22 . תצפית זו עולה כי הכללת ATP בפתרון פיפטה מעדיף את התנאים הפיזיולוגיים יציבה של התאים העיקריים האפידידימלי.
הטכניקה כולה תיקון התבנית clamp היא שיטה מבוססת היטב כי הוא נפוץ ללמוד את electrophysiology של תאים נרגש, כגון נוירונים. במאמר זה, הראינו כי זה גם כלי שימושי עבור אפיון של תכונות bioelectrical של תאים שאינם נרגשים, כגון תאים אפיתל. בנוסף, פרוטוקול זה מאפשר חקירות תפקודית של האפידידים מבודדים העיקריתאי אפיתל כדי להבהיר עוד יותר את תפקידם הפיזיולוגי באפידידימיס. מחקר זה מספק כמה תכונות חשמליות ראשוניות של תאים אפיתל מבודד עכברוש cauda epididimis לסיוע החקירות העתידיות של התנהגות פיזיולוגית של תאים אלה ואת הרלוונטיות הביולוגית הבסיסית שלהם באפידידימיס.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר כריסטופר אנטוס על הערות מועילות על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מאוניברסיטת שנחאי-טק שהוענק לוויני שום ובמימון הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NNSFC מס '31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
