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Developmental Biology

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l'épididyme

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

Nous présentons un protocole qui combine l'isolation cellulaire et l'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour mesurer les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de cauda de rat. Ce protocole permet d'étudier les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymiques primaires afin d'élucider davantage le rôle physiologique de l'épididyme.

Abstract

L'épididyme est un organe essentiel pour la maturation du sperme et la santé reproductive. L'épithélium épididymal se compose de types cellulaires complexes qui sont distincts non seulement dans les caractéristiques moléculaires et morphologiques, mais aussi dans les propriétés physiologiques. Ces différences reflètent leurs diverses fonctions qui, ensemble, établissent le microenvironnement nécessaire pour le développement du sperme post-testiculaire dans la lumière épididymique. La compréhension des propriétés biophysiques des cellules épithéliales épididymatiques est essentielle pour révéler leurs fonctions dans le sperme et la santé reproductive, dans des conditions physiologiques et pathophysiologiques. Bien que leurs propriétés fonctionnelles n'aient pas encore été pleinement élucidées, les cellules épithéliales épididymatiques peuvent être étudiées à l'aide de la technique de patch-clamp, un outil pour mesurer les événements cellulaires et les propriétés membranaires des cellules individuelles. Ici, nous décrivons les méthodes d'isolement cellulaire et d'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour meaAssurez-vous que les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de la queue de rat.

Introduction

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L'épididyme dans le tractus reproducteur masculin est un organe doublé d'une couche de cellules épithéliales en mosaïque. Comme dans d'autres tissus épithéliaux, les différents types cellulaires de l'épithélium épididymal, y compris les cellules principales, les cellules claires, les cellules basales et les cellules des systèmes immunologiques et lymphatiques, fonctionnent de manière concertée pour fonctionner comme barrière à la ligne de front du tubule et en tant que Cellules de soutien pour la maturation du sperme et la physiologie 1 , 2 , 3 . Ainsi, ces cellules épithéliales jouent un rôle essentiel dans la santé reproductive.

Les cellules épithéliales sont généralement considérées comme des cellules non excitables qui ne permettent pas de générer des potentiels d'action tout ou rien en réponse à des stimuli dépolarisants, en raison du manque de canaux Na + ou Ca 2+ 4 , 5 de tension. Cependant, les cellules épithéliales expriment uniQuels ensembles de canaux ioniques et de transporteurs qui régulent leurs rôles physiologiques spécialisés, tels que la sécrétion et le transport d'éléments nutritifs 6 . Par conséquent, différentes cellules épithéliales possèdent des propriétés électriques caractéristiques. Par exemple, les cellules principales expriment le CFTR pour le transport des fluides et des chlorures et expriment le TRPV6 pour la réabsorption du calcium, tandis que les cellules claires expriment la pompe à protons V-ATPase pour l'acidification luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Certains transporteurs et canaux ioniques qui régulent les caractéristiques physiologiques des cellules épithéliales épididymatiques ont été rapportés, mais les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymatiques ne sont pas encore comprises 10 , 11 , 12 , 13 .

WhL'enregistrement de la pince à l'aide d'une cellule oléicole est une technique bien établie pour examiner les propriétés intrinsèques des cellules excitables et non excitables et est particulièrement utile pour étudier les fonctions des cellules principalement dissociées dans des échantillons cellulaires hétérogènes; La tension de serrage est utilisée pour mesurer les propriétés de la membrane passive et les courants ioniques des cellules individuelles 14 , 15 . Les propriétés de la membrane passive comprennent la résistance d'entrée et la capacité. Le premier paramètre indique la conductance de la membrane intrinsèque, tandis que ce dernier implique la surface de la membrane cellulaire (une bicouche de phospholipides, où se trouvent les canaux ioniques et les transporteurs, qui sert d'isolant mince séparant les milieux extracellulaires et intracellulaires). La capacité de la membrane est directement proportionnelle à la surface de la membrane cellulaire. Avec la résistance de la membrane qui est réfléchie par la résistance d'entrée, la constante de temps de la membrane, wCe qui indique la rapidité avec laquelle le potentiel de la membrane cellulaire répond au flux des courants des canaux ioniques, peut être déterminé. À cet égard, en combinant les caractéristiques de réponse actuelles d'une série d'étapes de tension appliquées aux cellules, la cinétique biophysique et les propriétés des cellules sont déterminées 15 , 16 , 17 , 18 .

Dans le présent document, nous décrivons les procédures d'isolement des cellules épithéliales à partir de l'épididyme de la queue du rat et les étapes pour mesurer les propriétés de la membrane de différents types de cellules dans le mélange de cellules dissociées en utilisant la pince à cellules entières. Nous montrons que les cellules principales épididymiques présentent des propriétés électrophysiologiques membranaires distinctes et que les conductances peuvent être facilement identifiées à partir d'autres types de cellules.

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Protocol

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Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées conformément aux directives du Comité d'aide et de soins aux animaux institutionnels de ShanghaiTech University, qui répondent aux exigences locales et internationales.

1. Animaux expérimentaux

  1. Utiliser des rats Sprague-Dawley mâles adultes (~ 300-450 g) entre 8-12 semaines. À cet âge chez les rats, les spermatozoïdes sont arrivés dans les épididymides de la cauda.

2. Isolation des cellules épithéliales des épididymides de Rat Cauda

REMARQUE: Les étapes suivantes sont effectuées dans des conditions non aseptiques, sauf indication contraire.

  1. Préparation d'instruments de dissection et de réactifs
    1. Désinfectez les outils de dissection par immersion dans de l'éthanol à 70% et laissez-les sécher à l'air.
    2. Allumez le bain chauffant (32 ° C); Préparer et préchauffer 500 ml de 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) complété par 1% (v / v) d'antibiotiqueTics (100 U / mL de pénicilline et 100 μg / ml de streptomycine finale) et étiquetés comme "RPMI (+ P / S 1: 100)". Effectuez cette étape dans un poste de travail contrôlé par un débit d'air propre.
    3. Préparer et préchauffer 1x 500 ml Le milieu Dulbecco Modifié d'Iscove (IMDM) contenant des acides aminés non essentiels (0,1 mM) et du pyruvate de sodium (1 mM) et additionné de 5-α-dihydrotestostérone (1 nM), 10% de bovin fœtal Sérum, antibiotiques à 1% (v / v) (100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine finale) et étiquetés comme "Full-IMDM". Créer des aliquotes de 50 mL et sceller avec du parafilm; Conserver à 4 ° C. Utiliser des conditions aseptiques.
    4. Préparer une solution de digestion enzymatique de la collagénase en dissolvant la collagénase Type I et la collagénase Type II dans le RPMI (+ P / S 1: 100), ce qui donne 1 mg / mL de chaque collagénase dans la solution. Filtrer par une membrane de 0,22 μm et marquer comme "solution de collagénase". Conserver à température ambiante (RT) jusqu'à l'utilisation. Ajuster le volume de la solution à base d'enzymeSur le poids de l'enzyme; Le volume minimal requis pour les deux épididyles de cauda d'un seul rat est de 2 ml.
    5. Remplissez un plat de 35 mm avec RPMI (+ P / S 1: 100).
  2. Dissection d'épididymides de cauda de rat
    1. Sacrifiez l'animal soit en utilisant du pentobarbital de sodium 85 mg / kg ip, soit en utilisant une chambre d'isoflurane jusqu'à ce que l'animal ne réponde pas à la stimulation de la queue-pincement; Suivre une dislocation cervicale.
    2. Désinfectez le bas de l'abdomen en essuyant avec de l'éthanol à 70%, poussez doucement les deux testicules vers le bas de l'abdomen, puis ouvrez le bas ventre près du scrotum.
    3. Ramassez la graisse épididymique, dissérez les organes reproducteurs entiers (testicules, épididymes et vas-déférents) et immergez le plat avec RPMI (+ P / S 1: 100).
    4. Transférer les organes reproducteurs dans le plat avec RPMI (+ P / S 1: 100) à un poste de travail aseptique.
    5. Dissectez les épididymides de la cauda des tissus conjonctifs et gras et de l'épopéeCapsule didytique. Placez une épididyme avec ~ 0,2 ml de solution de collagénase dans un tube de 1,5 ml. Formez cette étape dans une station de travail à circulation d'air propre.
  3. Dissociation de cellules uniques à partir d'épididymides de cauda de rat
    1. Coupez les épididymides dans la solution de collagénase en utilisant des ciseaux fins jusqu'à ce que le tissu devienne un fluide pâteux. Rincer doucement les ciseaux avec la solution enzymatique restante (~ 0,8 ml) dans le tube de 1,5 ml.
    2. Placer le tube sur un thermomixeur métallique pendant 30 min à 37 ° C avec une vitesse de trempe de 1000 tr / min.
    3. Centrifuger le mélange enzyme-tissu à 30 xg à la température ambiante pendant 3 min et décanter le surnageant collant qui contient principalement le sperme.
    4. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL de IMD-IMD complète pour étancher toute l'activité enzymatique. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml contenant 49 ml de RPMI (+ P / S 1: 100).
      REMARQUE: optionnellement, filtrer la suspension de cellules à travers une membrane de maille de 100 μm avec du triturat constantPour éviter d'importants agrégats cellulaires. Cependant, n'utilisez pas un filtre à mailles si la suspension cellulaire est nécessaire pour la croissance des monocouches cellulaires.
    5. Centrifuger le mélange cellulaire à 30 xg à la température ambiante pendant 10 min; Décanter le surnageant.
    6. Remettre en suspension la pastille dans 1 ml de IMD-IMD complète avec une trituration douce pendant au moins 5 minutes pour dissocier les cellules individuelles des mélanges de tissus épididymatiques traités par des enzymes.
  4. Séparation des cellules épithéliales d'autres cellules dans des conditions aseptiques
    1. Culturez la suspension cellulaire sur une boîte de Petri de 10 cm contenant Full-IMDM pendant au moins 8 h ou toute une nuit, dans un incubateur à 32 ° C dans 5% de CO 2 .
    2. Préparez des lamelles stériles à l'avance par immersion dans 100% d'alcool. Sécher à l'air et plonger dans un petit volume de milieu de culture. Placez les lamelles dans des boîtes de culture de 6 cm ou dans des puits individuels d'une assiette à 24 puits.
    3. Le matin suivant, récolter les cellules épithéliales dissociées en collectant doucement le suspen cellulaireÀ partir de la boîte de Petri, qui se compose principalement de cellules épithéliales. Centrifuger la suspension cellulaire à 30 xg à TA pendant 5 min, puis décanter le surnageant.
    4. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans ~ 2 mL Full-IMDM.
    5. Graisser 0,2 ml de la suspension de cellules récoltées sur le centre de chaque lamelle stérile.
    6. Laisser la suspension cellulaire s'installer dans la gouttelette liquide pendant au moins 10 minutes pour permettre aux cellules d'adhérer librement aux lamelles de verre. Ajoutez avec précaution 1 ml de IMDM intégral au bord d'un plat de 10 cm ou 0,3 mL de IMD-IMD complète à chaque puits d'une assiette à 24 puits; Ne pas déranger les cellules.
    7. Garder les cellules individuelles isolées sur les lamelles dans l'incubateur à 32 ° C dans 5% de CO 2 jusqu'à ce que les expériences de patch-clamp.

3. Solutions d'enregistrement et micropipettes

REMARQUE: Pour les expériences de patch-clamp, utilisez les produits chimiques et les solutions de meilleure qualité.

  1. Préparation des solutions stock
    1. Autoclave toutes les bouteilles pour stocker et filtrer toutes les solutions stock (sauf les solutions corrosives) et filtrer à travers les membranes de 0,22 μm avant utilisation.
    2. Préparer toutes les solutions mères à l' avance à la température ambiante, et conserver à 4 ° C: NaCl 5 M; 1 M KCl; 100 mM de MgCl 2; CaCl 2 100 mM; NaH 2 PO 4 200 mM; EGTA 100 mM (pH 7,0 avec KOH). Manipuler 5 M de NaOH, 1 M HCl et 1 M de KOH en tant que solutions corrosives.
  2. Préparation de la solution de sel physiologique d'enregistrement externe standard (PSS)
    1. Réchauffez les solutions de stock à la RT le matin de l'enregistrement du patch-clamp.
    2. Pipettez les ingrédients de chaque produit en fonction du volume final souhaité, à l'exception du CaCl 2 , par exemple pour préparer 500 mL de PSS: NaCl 140 mM = 14 mL de 5M; KCl 5 mM = 2,5 ml de 1 M; 1,2 mM de MgCl2 = 6 ml de 100 mM; NaH 2 PO 4 1,2 mM = 3 ml de 200 mM.
    3. Ajouter le double- eau distillée (ddH 2 O) au volume final de 400 ml et équilibrée.
    4. Peser 0,9 g de glucose et 1,19 g d'HEPES et se dissoudre complètement dans le mélange de solution.
    5. Ajouter le stock de CaCl 2 (2,5 mM = 12,5 ml de 100 mM) sous agitation.
    6. Ajoutez jusqu'à 99% du volume final.
    7. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH ou du HCl.
    8. Vérifier l'osmolarité et ajuster en utilisant du NaCl 5 M ou du glucose, si nécessaire.
    9. Ajouter ddH 2 O au volume final de 500 ml dans un cylindre.
  3. Préparation de solutions internes à micropipettes (solutions EGTA à base de K + )
    1. Peser ou d'une pipette le volume correct des réactifs de chaque stock en fonction du volume final souhaité et de la concentration, par exemple pour la préparation de bas 50 mL EGTA K + à base de solution intracellulaire à un volume de ~ 30 mL ddH 2 O: 100 mM K-gluconate = 1,17 g; KCl 35 mM = 1,75 ml de 1 M; 2 mM de MgCl2 = 1 mlDe 100 mM; EGTA 0,1 mM = 0,05 ml de 100 mM; HEPES 10 mM = 0,072 g.
    2. Ajouter suffisamment d'eau pour ~ 95% du volume final et permettre à la solution d'équilibrer à la RT. Assurez-vous que la solution est claire.
    3. En remuant constamment la solution, ajuster le pH à 7,2 en utilisant KOH.
    4. Peser et ajouter 0,078 g de Mg-ATP à la solution jusqu'à dissolution complète.
    5. Placez la solution sur de la glace et utilisez une petite aliquote pour la mesure de l'osmolarité; En général, les solutions mesurent ~ 290 mOsmol et ne nécessitent pas d'ajustement. Si l'osmolarité diffère significativement de 280-295 mOsmol, préparez une nouvelle solution.
    6. Ajouter ddH 2 O au volume final.
    7. Divisez la solution dans des aliquotes de 500 μL, filtrez avec un filtre à seringue de 0,2 μm, fermez hermétiquement et stockez immédiatement à ≤ -20 ° C.
    8. À la date de l'expérience de patch-clamp, décongeler une partie de la solution intracellulaire sur la glace et garder la température pendant l'expérience de patch-clamp pourPrévenir la dégradation.
  4. Tirez les pipettes de patchs des capillaires en verre (suivant le manuel de l'utilisateur de l'extracteur de pipette) pour obtenir des tailles de micropipettes avec une résistance de 5-10 M lorsqu'elles sont remplies avec une solution intracellulaire.

4. Configuration de l'expérience Patch-Clamp et établissement de la configuration de cellule intégrale avec des cellules

  1. Configuration de l'expérience patch-clamp
    1. Activez la mise en place de la pince (ordinateur, amplificateur contrôlé par ordinateur, numériseur, etc. )
    2. Ouvrez le logiciel de patch-clamp ( par exemple, AXON pCLAMP10 ou HEKA PatchMaster) et configurez les protocoles pour les enregistrements électrophysiologiques. Réglez le filtre pour que le signal passe bas à 1-3 kHz et le numériseur à 10-20 kHz.
    3. Allumez la caméra, le micromanipulateur et la source lumineuse.
    4. Lorsque l'amplificateur commandé par ordinateur est allumé, reliez le corps de l'expérimentateur en touchant avec les mains la plate-forme de pincement qui a été mise à la terre,Avant de toucher le headstage, afin de le protéger contre les chocs électriques.
    5. Transférer les cellules épithéliales de culture sur le lamelle de verre vers la chambre d'enregistrement remplie de ~ 1 mL de PSS standard à la RT. Modifiez soigneusement le PSS de bain au moins deux fois à l'aide d'une pipette avant toute expérience de patch-clamp.
      REMARQUE: En option, remplissez le système de perfusion avec un PSS standard ou une autre solution externe selon l'expérience prévue. Perfectionnez la caméra d'enregistrement montée au microscope (RC-26G ou RC-26GLP) avec PSS quelques fois à une vitesse de ~ 2 mL / min avant le début des expériences de patch-clamp. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air piégées le long du système de perfusion.
    6. Affichez et sélectionnez les cellules sous un microscope inversé en utilisant des objectifs 10X et 40X équipés d'un système optique à contraste interférentiel différentiel. Recherchez de grandes cellules isolées isolées pour l'enregistrement. Identifier les cellules épithéliales épididymatiques isolées par leur forme sphérique avec m rugueuxIcrovilli à une extrémité des membranes et une répartition polarisée des teneurs intracellulaires ( figure 1 ).
    7. À l'aide d'une seringue de 1 mL (aiguille non-métallique à micro-aiguille), remplissez une micropipette avec la solution interne (solution EGTA à base de K + , voir étape 3.3). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air dans la micropipe, ce qui peut augmenter la résistance de la micropipette. Utilisez une solution suffisante pour que la solution interne immerge l'électrode à fil argenté revêtue de chlorure dans le support de micropipette.
    8. Montez la micropipette dans le support d'électrode et appliquez une faible pression positive (volume de la seringue de 0,2 mL). Maintenez la faible pression positive continue jusqu'à ce que vous touchiez la membrane cellulaire dans les étapes ultérieures.
  2. Établissement de la configuration de cellules entières avec des cellules pour les enregistrements
    1. Immergez la pipette dans la solution de bain à la vitesse la plus élevée du micromanipulateur. Trouver la pipettePointe sur l'écran connecté à l'appareil photo numérique; Ralentissez la vitesse du micromanipulateur en mode moyen-haut.
    2. Vérifiez rapidement la résistance à la micropipette (5-10 MΩ) à l'aide de la commande d'acquisition de données ( p. Ex. «Test de membrane» dans le système AXON) en appliquant une étape de tension ( p. Ex. 5 mV pour 100 ms) générée à partir de l'amplificateur commandé par ordinateur. Passez à une nouvelle micropipe si la résistance est significativement hors de cette gamme.
    3. Commencez à descendre l'objectif monté sur le microscope; Guide graduellement la micropipette vers la cellule sélectionnée. Toujours abaisser l'objectif en premier, puis baisser la micropipette vers le plan de mise au point, jusqu'à ce que la micropipette soit au-dessus de la surface centrale de la cellule sélectionnée.
    4. Annuler le potentiel de jonction liquide entre la pipette et les solutions de bain à zéro en utilisant la commande "pipette offset" dans l'interface de commande du logiciel.
    5. Réglez l'amplificateur commandé par ordinateurPassez à la tension-clamp et au test de membrane au mode "Bath".
    6. Un accent précis pour une vue plus claire de la cellule, puis abaisser graduellement la micropipette en utilisant le micromanipulateur à basse vitesse moyenne.
    7. Lorsque la micropipette est proche de la cellule (démontrée par un courant réduit lorsqu'il est déclenché par la commande de test de membrane), retirez immédiatement la pression positive faible et appliquez une faible pression négative (0.1 mL de volume de la seringue) pour former le gigaseal (> 1 GΩ) .
    8. Surveillez la résistance avec le test de membrane. Si la résistance est> 500 MΩ mais <1 GΩ, appliquez un potentiel négatif (généralement comme le potentiel de maintien réglé à -60 mV), ce qui peut aider à former le gigaseal. Compenser le courant capacitif transitoire de la micropipette.
    9. Si le joint est> 1 GΩ et stable (comme indiqué dans l'interface du logiciel), appliquez une succion brève et forte pour briser la membrane cellulaire. Ne pas appliquer de compensation pour le seEt la capacité de la cellule.
    10. Immédiatement après avoir atteint une configuration réussie de cellule entière, appliquez une étape d'hyperpolarisation de 10 mV (5 traces avec des intervalles de temps minimaux, une durée de 20 ms, un échantillon de signal à 20 kHz) d'un potentiel de maintien de -60 mV.
    11. Passez le mode tension au mode courant zéro et marquez les lectures de l'interface logicielle ou effectuez un enregistrement sans espace (10-60 s) pour les lectures potentielles de la cellule de la cellule.
    12. Revenez rapidement et passez en mode tension et appliquez les protocoles de tension selon les expériences planifiées et mesurez les réponses actuelles. La soustraction n'est pas appliquée au courant de fuite intrinsèque pendant les enregistrements.
    13. Surveillez la stabilité des réponses pendant les enregistrements, ou les différents paramètres de la cellule. Par exemple, utilisez l'interface de commande "Membrane Test" pour vérifier la résistance d'entrée (R i ), la résistance en série (R s ) et la celluleCapacité de membrane (C m ) dans le test de membrane au mode "Cell" pendant le passage des protocoles.
      REMARQUE: Les gouttes soudaines dans la résistance d'entrée sont généralement indicatives d'un patch lâche, et une augmentation spectaculaire de la résistance en série peut être révélatrice d'un colmatage de la pointe de la micropipette par les organelles intracellulaires ou les fragments de membrane. Pendant l'enregistrement, surveillez régulièrement l'emplacement de la micropipette pour vérifier si la dérive se produit, ce qui peut entraîner la perte du patch. Si la dérive est un problème, soulevez soigneusement la micropipette et la cellule de recouvrement du fond de la chambre d'enregistrement. Cette étape peut parfois conduire à la perte du patch, auquel cas il est nécessaire de répéter la procédure de blocage de la cellule entière.

5. Analyse des propriétés électrophysiologiques passives des cellules

  1. Après avoir obtenu les données des expériences de patch-clamp, ouvrez les données sans espace dans le logiciel Clampfit et mesurez la moyenneValeur pour le potentiel de la membrane de repos pour chaque cellule. Alternativement, utilisez la valeur telle que décalée par rapport à la tension de courant nul dans le mode actuel. Corrigez les valeurs avec le potentiel de jonction liquide (12,4 mV dans cette étude).
  2. Ouvrir les données de l'étape d' hyperpolarisation 10 mV (AV) obtenu à partir d' une cellule, mesurer la différence de courant avant et pendant l'étape (Δ I STEP), et de calculer la résistance d'entrée (R i) en utilisant l'équation:
    L'équation 1
  3. Calculez la capacité de la cellule (C m , dans l'unité de pF) (utilisez les mêmes données de courant de l'étape d'hyperpolarisation de 10 mV en intégrant la surface totale sous le courant du condensateur de la membrane pendant le courant de désintégration transitoire initial élevé sur le déclencheur de l'étape de tension) Pour obtenir la valeur de la charge accumulée totale (Q, dans l'unité de pA • ms) de la cellule. Utilisez l'équation suivante:
    L'équation 2
  4. Calculez la valeur de la résistance de la série (R s ) pour chaque cellule en ajustant le courant transitoire initial de l'étape négative de 10 mV avec un algorithme exponentiel standard pour obtenir le courant de désintégration de la constante de temps ( T , en unité de ms) et utiliser le Équation suivante:
    L'équation 3

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Representative Results

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La procédure de digestion enzymatique décrite pour l'isolement des cellules épithéliales à partir des épididymides de la queue de rat est un protocole modifié de nos études précédentes 9 , 12 . Cette méthode produit un mélange de cellules simples avec une viabilité de plus de 90% et sans ampoule de surface ou volume de cellules gonflées. Le mélange cellulaire hétérogène se compose principalement de cellules principales, de cellules claires et de cellules basales, comme nous l'avons décrit précédemment 1 . Dans ce protocole, des échantillons relativement purs de cellules épithéliales épididymatiques peuvent être obtenus en cultivant les cellules dissociées primaires pendant une nuit sur une boîte de Petri pour permettre l'adhérence des cellules non épithéliales (telles que les fibroblastes et les cellules lisses) sur le plat, comme Démontré à la figure 1A (avant la récolte). Les types de cellules peuvent ensuite être distingués de façon préliminaire par leurs phénotypes au microscopeEt classés en fonction de leurs propriétés spécifiques de la membrane passive. Dans le mélange cellulaire dissocié, il existe un groupe de cellules qui ont des microvilles ou une membrane rugueuse à une extrémité de leur membrane de surface et des teneurs cellulaires polarisées; Ce sont les cellules principales ou les cellules claires ( figure 1B , flèches). Ces cellules épithéliales polarisées sont indiscernables par leurs caractéristiques morphologiques, mais peuvent être identifiées en fonction de leurs propriétés de la membrane passive et des réponses de conductance obtenues à partir des enregistrements de pince à cellules entières. L'autre groupe de cellules est de plus petite taille sans stéréocilia sur une extrémité de la membrane et aucun contenu cellulaire polarisé évident; Ceux-ci sont appelés les cellules non-microvilli, et se composent principalement de cellules basales ( Figure 1B , astérisques).

Les principales cellules épithéliales principales peuvent être distinguées des autres cellules par lesLes propriétés distinctes de la membrane passive ( Figure 2 ) et les modèles de courant ( Figure 3 ) en réponse au protocole de tension appliqué en utilisant la technique de patch-clamp de toute la cellule. Les propriétés électrophysiologiques membranaires passives des cellules peuvent aider à évaluer l'état de santé initial des cellules individuelles et des groupes de types cellulaires. Un résumé des diagrammes de points individuels de la capacité de la membrane (C m ), de la résistance d'entrée (R m ) et du potentiel de la membrane (V m ) de chaque groupe de cellules est donné dans la Figure 2A . Il n'y a pas de différence dans la constante de temps pour la capacité de la membrane parmi les différents types de cellules (~ 0.4 ms) (les données ne sont pas démontrées dans ce manuscrit). En utilisant la faible solution à base d'EGTA K + , la capacité moyenne de la membrane mesurée pour les cellules principales est de 9,4 0,5 pF (n = 32) et pour les cellules claires est de 9,7 1,9 pF (n = 12). La capacité de la membrane deLes cellules non microvilli sont de 5,2 0,8 pF (n = 17), ce qui est statistiquement plus petit que le principal et les capacités de membrane des cellules claires.

La résistance d'entrée des cellules principales de la figure 2A (panneau central) est de 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) et celle des cellules claires est de 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), ce qui est significativement plus faible (P <0,001) que Celle des cellules non-microvilli (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Comme représenté sur la figure 2A (panneau droit), le potentiel de la membrane à courant nul ( c'est-à - dire le potentiel de la membrane de repos V m ) a été mesuré peu de temps après avoir établi la configuration de la cellule entière et utilisé pour comparer les groupes après la correction avec le potentiel de jonction liquide (12.4 MV). Les cellules ont été regroupées régulièrement dans un PSS standard et ont été dialysées avec une solution de pipette à base d'EGTA à K + 0,1 mM contenant de l'ATP. LeurLe potentiel de membrane des cellules principales est de -26 ± 2 (n = 28), entre -51 mV et +1 mV, et le potentiel moyen de la membrane des cellules claires est de -30 ± 3 mV (n = 10), Entre-47 mV et -17 mV. Les cellules sans microvilli possèdent le potentiel de membrane moyen le plus élevé avec une valeur de -33 ± 5 mV (n = 17), entre -63 mV et -13 mV.

La faible résistance d'entrée des cellules principales suggère qu'il existe des conductances intrinsèques dans ces cellules, mais cela pourrait indiquer une fuite du joint entre la pipette et les membranes cellulaires patch. Pour répondre à cette préoccupation, nous avons d'abord exclu les données de ces cellules avec des changements brusques (indicatifs d'une fuite d'étanchéité) des propriétés électriques pendant les enregistrements. Ensuite, nous avons analysé la corrélation entre la résistance d'étanchéité à un seuil de 1 giga-ohm avec la résistance d'entrée, comme le montre la figure 2B . Le résultat était une très faible valeur de corrélation (R 2 ≈ 0,02). Cela suggère que la résistance d'étanchéité a une influence négligeable sur la résistance d'entrée et que les propriétés électriques passives rapportées des différentes cellules (telles que la faible résistance d'entrée des cellules principales) sont les propriétés intrinsèques de ces cellules.

La figure 3A est la réponse courante typique enregistrée à partir des cellules principales dans des conditions quasi physiologiques, les cellules se baignant dans une solution physiologique de sel physiologique (PSS), dialysées avec une solution de pipette à faible teneur en EGTA K et stimulées à partir d'un potentiel de maintien de -60 mV À une série de tensions de test de 500 ms (allant de -120 mV à +60 mV comme indiqué dans l'insert de la figure 3B ). Les deux tracés de la figure 3C montrent les réponses typiques de la membrane de repos d'une cellule principale identifiée sous la pince à courant nul dans la présence de, ouAbsence d'ATP dans la solution de pipette. En présence d'ATP, le potentiel de repos est relativement stable. Alors qu'une hyperpolarisation progressive a été observée lorsque les cellules ont été dialysées avec une solution de pipette sans ATP. Le potentiel initial de la membrane de repos mesuré au début de la dialyse cellulaire avec des solutions de pipettes ne montre aucune différence significative dans les cellules avec ou sans ATP ( Figure 3D ), ce qui suggère que les valeurs mesurées étaient encore intactes et minimisées par les solutions de pipette.

Figure 1
Figure 1 : Caractéristiques morphologiques des cellules épithéliales épididymatiques de la cauda de rat isolée. ( A, B ) Des exemples de cellules épithéliales isolées des épididymides de cauda de rat avant ( A ) et après ( B ) récolte d'oveRnight culture sur le plat avant les expériences de patch-clamp. Les flèches indiquent les cellules microvilli, qui se composent principalement des cellules principales et des cellules claires. Les astérisques indiquent les cellules non-microvilli. Seules des cellules individuelles ont été sélectionnées pour l'enregistrement de patch-clamp. Barre d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Propriétés de la membrane passive des cellules épithéliales épididymatiques de la queue de rat unique. ( A ) Plots ponctuels des propriétés membranaires passives des cellules épithéliales épididiémiques de la cauda de rat unique. La solution de pipettes est faible EGTA K + et la solution de baignade est un PSS standard. ( B ) Analyse de corrélation des réponses d'entréeAvec la résistance du joint des cellules. NS : pas de différence significative, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 différence significative par rapport aux contrôles appropriés en utilisant un ANOVA à sens unique avec un test post-hoc de Bonferroni. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3 : Courants typiques de cellules entières dans les cellules principales épididymiques simples. ( A ) Courants typiques de cellules entières enregistrés à partir de cellules épithéliales épididymatiques simples enregistrées dans des conditions quasi physiologiques en utilisant un protocole d'élimination des impulsions tel qu'indiqué dans l'encart du panal B. La ligne pointillée indiquait les niveaux de courant zéro. ( B ) La relation courant-tension de la responsabilité actuelleEs mesuré aux points de temps indiqués en A. Les données sont les moyennes ± SEM de huit cellules principales d'au moins trois animaux. ( C ) Des tracés représentatifs du potentiel de la membrane de repos des principales cellules dialysées avec une solution de pipette, soit avec ATP (+ ATP), soit sans ATP (-ATP). ( D ) Un graphique à barres ne montrant aucune différence significative entre le potentiel initial de la membrane de repos de + ATP et -ATP. Les valeurs sont des moyennes ± SEM mesurées au moment indiqué dans le panneau C. Les chiffres entre parenthèses dans les barres indiquent le nombre de cellules testées à partir d'au moins trois animaux. NS : pas de différence significative. ( E ) Les analyses de corrélation de la résistance du joint d'étanchéité et de la résistance d'entrée de toutes les cellules, ou des cellules principales seulement, par rapport aux membranes de repos mesurées à la pince de courant nul peu après l'établissement de la cellule entière et les grandeurs actuelles mesurées à l'hyperpolarisation Passer à -100 mV de tenir pOtentiel. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Dans ce protocole, la dispersion enzymatique des épididymides de cauda de rat a consisté à produire des cellules épithéliales saines. La qualité des cellules épithéliales épididymatiques pour les expériences de patch-clamp dépend de quelques étapes critiques du protocole. Par exemple, la centrifugation du mélange cellulaire à une faible force centrifuge (30 xg) est importante pour éliminer les spermatozoïdes et la teneur en luminescence épididymique; Les cellules épithéliales épididymiques deviennent malsaines en présence des spermatozoïdes dans la culture cellulaire. De plus, la culture du mélange cellulaire dissocié sur une boîte de Petri pendant plusieurs heures est une étape importante pour éliminer les fibroblastes et les cellules musculaires lisses; Les cellules non épithéliales adhèrent plus rapidement sur le plat de culture et, par conséquent, laissent les cellules épithéliales dans la suspension, ce qui peut être récolté par une aspiration douce. De plus, la digestion par la collagénase et la trituration avec une fine pipette en verre sont les deux étapes importantes à franchirCellules simples pendant la procédure de dissociation cellulaire. Enfin, la digestion enzymatique des cellules épididymatiques est essentielle pour l'expérience de patch-clamp car la sous-digestion par une activité enzymatique inefficace ou une sur-digestion par incubation prolongée peut à la fois perturber la formation d'un joint giga-ohm entre la pipette et les membranes cellulaires.

Dans les mélanges cellulaires, les cellules dans une forme plus grande et en forme de colonne avec une membrane rugueuse portant une stéréocilie à une extrémité et une distribution polarisée des teneurs intracellulaires sont vraisemblablement les cellules principales ou les cellules claires. D'autres cellules qui ne possèdent pas de microvillis proéminents et des contenus cellulaires polarisés peuvent inclure les cellules basales et certaines cellules du système immunitaire. En plus de décrire les caractéristiques morphologiques basiques des cellules épithéliales épididymatiques, ce protocole utilise la méthode de clampage de cellules entières pour mesurer la propriété de la membrane passive de chaque cellule. Ces propriétés de membrane permettent une distinction préliminaire deLes types de cellules. Cette méthode présente certaines limites telles que le lavage des contenus intracellulaires avec la solution de pipette et les variations électroniques par rapport aux modifications de l'architecture cellulaire pendant les enregistrements continus 19 , 20 . Nous fournissons uniquement les paramètres que nous avons mesurés immédiatement après l'établissement de la configuration de la cellule entière, qui reflètent les conditions initiales et relativement intactes des cellules. Les propriétés de la membrane passive de chaque cellule comprennent la capacité de la membrane, la résistance d'entrée et le potentiel de la membrane de repos.

La capacité spécifique des membranes cellulaires est généralement acceptée de 1 μF / cm 2 et cela est vrai pour les cellules (telles que les cellules immunitaires et les neurones) avec un pli limité sur leurs membranes cellulaires 16 , 18 . Cependant, la constante de capacité spécifique tend à être plus grande pour les cellules wAvec des architectures cellulaires plus complexes, comme les cellules épithéliales, qui ont de nombreux plis de membrane cellulaire dans des compartiments distincts. Les rapports indiquent que les valeurs de la ligne cellulaire épithéliale MDCK sont de 4 μF / cm 2 et 3 μF / cm 2 pour les capacités spécifiques de la membrane apical et basale, respectivement 17 . Dans la présente étude, les capacités moyennes mesurées de la membrane sont ~ 8 pF et ~ 12 pF pour le groupe de cellules non-microvilli et les cellules principales et les cellules claires comme les cellules ( c'est -à- dire les cellules microvilli), respectivement. En utilisant la capacité spécifique de 1 μF / cm 2 pour nos calculs, les surfaces estimées de la surface cellulaire sont de 500 μm 2 et 1000 μm 2 pour les cellules non microvilli et les cellules microvilli, respectivement, ce qui correspond aux diamètres de 13 μm et 18 Μm. Cependant, ces estimations sont supérieures à ce qui était prévu en fonction de la taille des cellules au microscope, qui sont ~ 81; m et ~ 12 μm pour les cellules non-microvilli et les cellules microvilli, respectivement, et ces cellules sont d'environ 2,4 μF / cm 2 et 1,9 μF / cm 2 , respectivement. Nos résultats indiquent que le paysage membranaire des cellules non-microvilli est plus complexe que celui des cellules micro-villi, ce qui correspond à leurs fonctions de sécrétion et de transport.

La capacité spécifique des membranes cellulaires est généralement acceptée de 1 μF / cm 2 et cela est vrai pour les cellules (telles que les cellules immunitaires et les neurones) avec un pli limité sur leurs membranes cellulaires 16 , 18 . Cependant, la constante de capacité spécifique tend à être plus grande pour les cellules avec des architectures cellulaires plus complexes, comme les cellules épithéliales, qui ont de nombreux plis de membrane cellulaire dans des compartiments distincts. Les rapports indiquent que les valeurs de la ligne cellulaire épithéliale MDCK sont de 4 μF / cm 2 et 3 μF / cm 2 17 . Dans la présente étude, les capacités moyennes mesurées de la membrane sont ~ 8 pF et ~ 12 pF pour le groupe de cellules non-microvilli et les cellules principales et les cellules claires comme les cellules ( c'est -à- dire les cellules microvilli), respectivement. En utilisant la capacité spécifique de 1 μF / cm 2 pour nos calculs, les surfaces estimées de la surface cellulaire sont de 500 μm 2 et 1000 μm 2 pour les cellules non microvilli et les cellules microvilli, respectivement, ce qui correspond aux diamètres de 13 μm et 18 Μm. Cependant, ces estimations sont supérieures à ce qui était prévu en fonction de la taille des cellules au microscope, sont ~ 8 μm et ~ 12 μm pour les cellules non-microvilli et les cellules microvilli, respectivement, et ces cellules sont mieux compatibles avec une valeur de capacité spécifique 2 μF / cm 2 . Cela suggère que le paysage membranaire des cellules épithéliales épididymatiques est morE complexes que les autres types de cellules, ce qui correspond à leurs fonctions de sécrétion et de transport.

Dans les enregistrements de cellules entières, la conductance de fuite à travers la membrane et à l'étanchéité entre la membrane et la pipette ont tous deux contribué aux propriétés de la membrane mesurée. Le joint présente une résistance significativement plus élevée que la membrane, et il a donc une influence minimale sur la mesure des propriétés de la membrane passive, telles que la résistance d'entrée et le potentiel de membrane à courant nul. Conformément à cette notion, l'analyse de corrélation de la résistance d'étanchéité à un seuil de 1 giga-ohm contre la résistance d'entrée de chaque cellule a donné une valeur de ~ 0,02, ce qui suggère une influence très faible. D'autres analyses de corrélation de la résistance d'étanchéité ou de la résistance d'entrée par rapport aux potentiels de la membrane de repos ou de la grandeur de courant mesurée à -100 mV ont également donné des valeurs faibles pour toutes les cellules testées ou uniquement pour les cellules principales. Nos résultats deMontrent que la résistance d'entrée des cellules principales épididymatiques et des cellules claires est significativement plus faible que les cellules non microvilli, fournissant ainsi un paramètre préliminaire pour le jugement pour différencier les types de cellules. Ces résultats suggèrent que la faible résistance d'entrée dans les cellules principales est une propriété physiologique intrinsèque des cellules. Les cellules épithéliales simples possèdent également des modèles de courant distincts en réponse aux protocoles appliqués et aux conditions expérimentales. Nous avons observé que chaque type de cellule définie présentait des modèles de courant uniques sous le même protocole de tension appliquée. Un exemple montré dans la figure 3 montre les réponses actuelles typiques enregistrées à partir des cellules principales dans des conditions quasi physiologiques, comme nous l'avons déjà signalé 9 . Les caractéristiques électrophysiologiques de chaque type de cellule spécialisé sont facilement différenciées (les données ne sont pas présentées dans cet article). Sur la base de ces paramètres,Les différents types de cellules peuvent être grossièrement classés dans les cellules principales, les cellules claires et les cellules non microvilli, comme décrit dans les résultats.

La résistance d'entrée est la résistance de la membrane en réponse à l'étape de potentiel appliquée (étape d'hyperpolarisation de 10 mV dans cette étude) provoquée par un potentiel de maintien de -60 mV. Cela reflète l'étendue de l'activité des canaux ouverts en réponse au potentiel appliqué. À cet égard, une faible résistance implique une forte conductance intrinsèque "de fuite" des cellules, alors qu'une haute résistance implique des canaux fermés. La faible valeur de résistance d'entrée dans les cellules principales correspond à la conductance de la membrane proéminente, tandis que les cellules claires qui possèdent une petite conductance au potentiel de la membrane de test impliquent leur conductance modérée dans les conditions d'enregistrement. La résistance d'entrée significativement élevée des cellules non microvilli implique qu'elles n'ont pas de canaux ouverts dans ce statut. Dans le zéro-cuLa force de serrage, les potentiels moyens de la membrane de repos des cellules épithéliales isolées mesurées se situent entre 26 et 33 mV pour les trois groupes cellulaires. Ces valeurs sont comparables au potentiel de membrane rapporté (-30 mV) en utilisant la méthode de microélectrode 21 . Cependant, les potentiels de repos mesurés varient considérablement dans les cellules individuelles (de +3 mV à -63 mV) malgré l'absence de potentiels de pointe spontanés. Cette variation peut refléter l'interaction de différentes activités de canaux ioniques dans différents types de cellules, comme l'interaction couplée des canaux TRPV6 et TMEM16A dans les cellules principales, comme nous l'avons signalé récemment 9 . Il est intéressant de noter que lorsque les cellules ont été dialysées avec la pipette ATP, nous n'avons observé aucun potentiel électrique spontané dans les cellules principales; Cela correspond à la classification des cellules épithéliales comme non excitables 4 . Une hyperpolarisation progressive lorsque les cellules ont été dialysées avec le piPette solution sans ATP peut avoir reflété l'apparition progressive d'un courant de potassium sensible à l'ATP. Il a été signalé que les canaux de potassium sensibles à l'ATP sont exprimés dans l'appareil de Golgi des principales cellules de l'épididyme de rat et que l'épuisement de l'ATP intracellulaire conduit à l'activation des canaux K ATP 14 , 22 . Cette observation suggère que l'inclusion de l'ATP dans la solution de pipette favorise les conditions physiologiques stables des cellules principales épididymatiques.

La technique de patch-clamp à cellules entières est une méthode bien établie qui est couramment utilisée pour étudier l'électrophysiologie des cellules excitables, comme les neurones. Dans cet article, nous avons montré qu'il s'agissait également d'un outil utile pour la caractérisation des propriétés bioélectriques des cellules non excitables, telles que les cellules épithéliales. En outre, ce protocole permet des études fonctionnelles de l'épididyme isolé primaireAl epithelial cells pour élucider davantage leur rôle physiologique dans l'épididyme. Cette étude fournit certaines propriétés électriques préliminaires des cellules épithéliales isolées à partir de l'épididyme de la cauda de rat pour aider les recherches futures du comportement physiologique de ces cellules et leur pertinence biologique sous-jacente dans l'épididyme.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Nous remercions Christopher Antos pour des commentaires utiles sur le texte. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de ShanghaiTech University attribués à Winnie Shum et par le financement de la National Natural Science Foundation of China (NNSFC n ° 31471370).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

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References

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Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l&#39;épididyme
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Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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