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Developmental Biology

एपिडीडिमिस से पृथक प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो चूहा कडा एपिडिडीमाइड से प्राथमिक पृथक उपकला कोशिकाओं के विद्युत गुणों को मापने के लिए कोशिका अलगाव और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को जोड़ती है। यह प्रोटोकॉल प्राथमिक एपिडिडिमल उपकला कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों की जांच के लिए एपिडीडिमिस की शारीरिक भूमिका को स्पष्ट करने की अनुमति देता है।

Abstract

एपिडीडिमिस शुक्राणु परिपक्वता और प्रजनन स्वास्थ्य के लिए आवश्यक अंग है। एपिडिडिमल एपिथेलियम में गहन रूप से जुड़े सेल प्रकार होते हैं जो न केवल आणविक और रूपवाचक सुविधाओं में ही होते हैं बल्कि शारीरिक गुणों में भी होते हैं। ये मतभेद उनके विविध कार्यों को दर्शाते हैं, जो एक साथ एपिडिडायमल लुमेन में वृषण के बाद के शुक्राणु विकास के लिए आवश्यक microenvironment स्थापित करते हैं। एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं के बायोफिजिकल गुणों की समझ, शल्यक्रिया और प्रजनन स्वास्थ्य दोनों में शारीरिक और पथभ्रंश दोनों स्थितियों के तहत उनके कार्यों को प्रकट करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि उनके कार्यात्मक गुणों को अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, एपिडिडीमल एपिथेलियल कोशिकाओं को पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है, एक सेल्यूलर घटनाओं को मापने के लिए एक उपकरण और एकल कोशिकाओं के झिल्ली गुण। यहां, हम सेल अलगाव के तरीकों और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को मेआ के लिए वर्णन करते हैंयकीन है कि चूहा cauda epididymides से प्राथमिक पृथक उपकला कोशिकाओं के विद्युत गुण

Introduction

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पुरुष प्रजनन पथ में एपिडीडिमिस एक अंग है जो मोज़ेक उपकला कोशिकाओं की परत के साथ खड़ा होता है। अन्य उपकला के ऊतकों की तरह, इम्युनोलॉजिकल और लसीका तंत्र से प्रमुख कोशिकाओं, स्पष्ट कोशिकाएं, बेसल कोशिकाएं और कोशिकाओं सहित एपिडिडाइमल एपिथेलियम के विभिन्न प्रकार के कोशिकाओं, ट्यूबू की अग्रिम पंक्ति में बाधा के रूप में कार्य करने के लिए एक ठोस तरीके से काम करते हैं शुक्राणु परिपक्वता और शरीर विज्ञान 1 , 2 , 3 के लिए सहायक कोशिकाएं इस प्रकार, उपकला कोशिकाओं प्रजनन स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।

उपकला कोशिकाओं को आम तौर पर गैर-उत्तेजक कोशिकाओं के रूप में माना जाता है जो वोल्टेज-गेटेड ना + या सीए 2 + चैनल 4 , 5 की कमी के कारण, उत्तेजनाओं को विवरणीकरण के जवाब में सभी-या-कोई भी ऐक्शन क्षमता उत्पन्न करने में असमर्थ हैं। हालांकि, उपकला कोशिकाओं को एकजुट दिखाई देता हैआयन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के सेट जो उनके विशेष शारीरिक भूमिकाओं को नियंत्रित करते हैं, जैसे कि स्राव और पोषक परिवहन परिवहन 6 । विभिन्न उपकला कोशिकाओं में विशेषता विद्युत गुण हैं। उदाहरण के लिए, प्रिंसिपल कोशिकाओं द्रव और क्लोराइड परिवहन के लिए सीएफटीआर को व्यक्त करते हैं और कैल्शियम रीबसॉर्पोरेशन के लिए टीआरपीवी 6 को व्यक्त करते हैं, जबकि स्पष्ट कोशिकाएं ल्यूमोनल अम्लीकरण 1 , 7 , 8 , 9 के लिए प्रोटॉन पंप वी-एटपेस को व्यक्त करती है। कुछ ट्रांसपोर्टर और आयन चैनल जो एपिडिडीमल इपिथियल सेल की शारीरिक विशेषताओं को विनियमित करते हैं, लेकिन एपिडिडीमल एपिथेलियल कोशिकाओं के कार्यात्मक गुणों को काफी हद तक अभी तक 10 , 11 , 12 , 13 नहीं समझा गया है।

कऑल-सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग, उत्तेजक और गैर-उत्तेजक दोनों कोशिकाओं के आंतरिक गुणों की जांच करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है, और विषम कोशिका नमूनों में मुख्य रूप से अलग-अलग कोशिकाओं के कार्यों के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है; वोल्टेज-क्लैम्प का उपयोग निष्क्रिय झिल्ली गुणों और एकल कोशिकाओं 14 , 15 के आयनिक धाराओं को मापने के लिए किया जाता है। निष्क्रिय झिल्ली गुणों में इनपुट प्रतिरोध और समाई शामिल हैं। पूर्व पैरामीटर आंतरिक झिल्ली प्रवाहकत्त्व को इंगित करता है, जबकि बाद में कोशिका झिल्ली (एक फॉस्फोलिपिड बिलेयर, जहां आयन चैनल और ट्रांसपोर्टर स्थित हैं, जो पतली इन्सुलेटर अलग-अलग और इंट्रासेल्युलर मीडिया को अलग करता है) की सतह क्षेत्र को दर्शाता है। झिल्ली का समाई सीधे सेल झिल्ली के सतह क्षेत्र के आनुपातिक होता है। झिल्ली प्रतिरोध के साथ जो इनपुट प्रतिरोध से परिलक्षित होता है, झिल्ली समय निरंतर, wहाइच संकेत करता है कि आयन चैनल धाराओं के प्रवाह को सेल झिल्ली संभावित प्रतिक्रिया कितनी तेजी से निर्धारित किया जा सकता है। इस संबंध में, कोशिकाओं पर लागू वोल्टेज चरणों की एक श्रृंखला से वर्तमान प्रतिक्रिया विशेषताओं को जोड़कर, कोशिकाओं के बायोफिजिकल कैनेटीक्स और गुण 15 , 16 , 17 , 18 निर्धारित किए जाते हैं।

वर्तमान पत्र में, हम चूहे कौडा एपिडीडिमिस से उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं और पूरे सेल पैच-क्लैंप का उपयोग करते हुए पृथक सेल मिश्रण में विभिन्न सेल प्रकारों के झिल्ली गुणों को मापने के लिए कदम। हम दिखाते हैं कि एपिडिडिमल प्रिंसिपल कोशिकाएं अलग-अलग झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का प्रदर्शन करती हैं और यह कि संचालन को अन्य सेल प्रकारों से आसानी से पहचाना जा सकता है।

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Protocol

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शंघाईटेक विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए जाते हैं, जो स्थानीय और अंतर्राष्ट्रीय आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।

1. प्रायोगिक पशु

  1. वयस्क पुरुष स्प्रेग-डावली चूहों (~ 300-450 ग्राम) का प्रयोग करें, जो 8-12 सप्ताह पुरानी है। चूहों में इस युग में, शुक्राणु पुलाव एपिडइडाइड में आ गए हैं।

2. चूहा कौडा एपीडिडाइमाइड से उपकला कोशिकाओं का अलगाव

नोट: निम्नलिखित कदम गैर-सच्ची शर्तों के तहत किए जाते हैं जब तक कि अन्यथा नहीं कहा गया हो।

  1. विच्छेदन उपकरणों और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 70% इथेनॉल में विसर्जन द्वारा विच्छेदन उपकरण कीटाणुरहित करें और उन्हें हवा में सूखा दें।
    2. वार्मिंग स्नान चालू करें (32 डिग्री सेल्सियस); 1x (वी / वी) एंटीबियो के साथ पूरक 1x रोसेवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट 1640 मध्यम (आरपीएमआई) के 500 एमएल तैयार और पूर्व गर्मटीआईसीआई (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन फाइनल), और "आरपीएमआई (+ पी / एस 1: 100)" के रूप में लेबल किया गया है। एक स्वच्छ हवा-प्रवाह नियंत्रित कार्य स्टेशन में यह कदम निष्पादित करें
    3. गैर-आवश्यक एमिनो एसिड (0.1 एमएम) और सोडियम प्यूरवेट (1 एमएम) वाले 1x 500 एमएल इकोवावे के संशोधित डल्बेकेडो के माध्यम (एमएमडीएम) को तैयार और पूर्व-गर्म, और 5-α-डाइहाइड्रोटेस्टोस्टेरोन (1 एनएम) के साथ पूरक, 10% भ्रूण गोजाइन सीरम, 1% (वी / वी) एंटीबायोटिक दवाओं (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन फाइनल), और "पूर्ण-आईएमडीएम" के रूप में लेबल। 50 एमएल aliquots बनाएँ और parafilm के साथ मुहर; 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें सड़न रोकनेवाला शर्तों का उपयोग करें
    4. RPMI (+ पी / एस 1: 100) में कोलेजनज़ टाइप I और कोलेजनज़ टाइप II को भंग करके एक कोलेजनेश एंजाइम पाचन समाधान तैयार करें जिसके परिणामस्वरूप समाधान में प्रत्येक कोलेजेनेस के 1 मिलीग्राम / एमएल का परिणाम होता है। 0.22 माइक्रोग्राम झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर करें और "कोलेजनेश सोल्यूशन" के रूप में चिह्नित करें। उपयोग होने तक कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें आधारित एंजाइम समाधान की मात्रा को समायोजित करेंएंजाइम के वजन पर; एक चूहे के दोनों पुच्छ एपीडिडाइड्स के लिए आवश्यक न्यूनतम मात्रा 2 एमएल है।
    5. आरपीएमआई (+ पी / एस 1: 100) के साथ एक 35 मिमी डिश भरें।
  2. चूहा कौडा एपिडिडीमाइड्स का विच्छेदन
    1. प्राणियों को पूंछ-चिपकने वाला उत्तेजना का जवाब नहीं देते जब तक जानवरों को सोडियम पेंटोबारबिटिल 85 मिलीग्राम / किग्रा आईपी या एक आइसोफ्लुरेन चैंबर का प्रयोग करके या तो का त्याग करें; ग्रीवा अव्यवस्था का पालन करें
    2. 70% इथेनॉल के साथ पोंछते हुए निचले पेट को निस्संकृत करें, धीरे से दो टेस्टोस को निचले पेट में ढक दें और फिर अंडकोश के पास के निचले पेट को खोलें।
    3. एपिडिडीमल वसा उठाएं, पूरे प्रजनन अंगों (टेस्टेस, एपिडिडाइड्स और वास डिफरेंस) काटना और आरपीएमआई (+ पी / एस 1: 100) के साथ पकवान में विसर्जित करें।
    4. आरपीएमआई (+ पी / एस 1: 100) के साथ पकवान में प्रजनन अंगों को एक एस्टीपिक वर्किंग स्टेशन में स्थानांतरित करें।
    5. संयोजी और फैटी टिश्यू और एपी से पुच्छ एपिडाइडाइड्स को बाहर निकालनाथाईलैंड कैप्सूल एक एपिडीडिमिस को ~ 0.2 एमएल के कोलेजनज़ सॉल्यूशन के साथ 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। इस चरण को एक स्वच्छ वायु प्रवाह नियंत्रित कार्य केंद्र में रखें।
  3. चूहे कुदा एपिडाइडाइड्स से एकल कोशिकाओं का पृथक्करण
    1. कोलेजनज़ सॉल्यूशन में एपिडीडिमाइड्स को ठीक कैंची का उपयोग करके कट करें जब तक कि ऊतक पेस्ट-जैसी द्रव नहीं हो जाता। 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में शेष (~ 0.8 एमएल) एंजाइम समाधान के साथ धीरे से कैंची कुल्ला।
    2. एक धातु थर्मोमिक्सर पर ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 आरपीएम की झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    3. 3 मिनट के लिए आरटी पर 30 ग्राम एंजाइम-टिशू मिश्रण को अपकेंद्रित्र और चिपचिपा सतह पर तैरने वाला पदार्थ छानना जिसमें अधिकतर शुक्राणु होते हैं
    4. 1 एमएल पूर्ण आईएमडीएम में सभी एंजाइमिक गतिविधि को बुझाने के लिए गोली को फिर से खोलें। 49 एमएल आरपीएमआई (+ पी / एस 1: 100) वाली 50 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन को स्थानांतरित करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, निरंतर ट्रिटुरैट के साथ 100 माइक्रोन जाल झिल्ली के माध्यम से सेल निलंबन को फ़िल्टर करेंआयन बड़ी, सेल समुच्चय से बचने के लिए। हालांकि, सेल मोनोलएयर बढ़ने के लिए सेल निलंबन की आवश्यकता होती है, तो एक जाल फ़िल्टर का उपयोग न करें।
    5. 10 मिनट के लिए आरटी पर 30 xg पर सेलुलर मिश्रण अपकेंद्रित्र; सतह पर तैरनेवाला छानना
    6. 1 एमएल पूर्ण आईएमडीएम में कम से कम 5 मिनट के लिए एंजाइमेटिक इलाज एपीडिडायमल ऊतक मिश्रण से अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए गोली को फिर से खोलें।
  4. सड़न रोकनेवाला स्थितियों के तहत अन्य कोशिकाओं से उपकला कोशिकाओं का पृथक्करण
    1. कम से कम 8 घंटे या रात भर के लिए 10 सेमी पेट्री डिश युक्त पूर्ण-आईएमडीएम वाले सेल पर सेल निलंबन, 5% सीओ 2 में 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में
    2. 100% अल्कोहल में विसर्जन द्वारा अग्रिम में बाँझ कंडोली तैयार करें वायु शुष्क और संस्कृति माध्यम की एक छोटी मात्रा में डुबकी। 6 सेमी संस्कृति व्यंजनों में या 24-अच्छी तरह से थाली के एकल कुएं में कन्स्पिटल्स को रखें।
    3. अगली सुबह, कोशिका निस्तब्धता से धीरे-धीरे इकट्ठा करके अलग-थलग उपकला कोशिका काटापेट्री डिश से सायन, जिसमें ज्यादातर उपकला कोशिकाएं होती हैं 5 मिनट के लिए आरटी पर 30 xg पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, और फिर सतह पर तैरनेवाला छानना
    4. ~ 2 एमएल पूर्ण-आईएमडीएम में सेल गोली resuspend
    5. प्रत्येक बाँझ कंडोली के केंद्र पर कटाई वाले सेल निलंबन के बीज 0.2 एमएल।
    6. सेल के निलंबन को कम से कम 10 मिनट के लिए तरल छोटी बूंद में व्यवस्थित करने दें, जिससे कि कोशिकाओं को कांच के कवरलिप का ढीला पालन करने की अनुमति मिल सके। 10 सेमी डिश के किनारे पर 1 एमएल फुल-आईएमडीएम को सावधानीपूर्वक जोड़ें, या एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कूल्हे में 0.3 एमएल फुल-आईएमडीएम; कोशिकाओं को परेशान मत करो
    7. पैच-क्लैंप प्रयोगों तक 5% सीओ 2 में 32 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में कवरलिप्स पर पृथक एकल कोशिकाओं को रखें।

3. रिकॉर्डिंग समाधान और माइक्रोपिपेट्स

नोट: पैच-दबाना प्रयोगों के लिए, सर्वोत्तम गुणवत्ता के रसायनों और समाधानों का उपयोग करें।

  1. स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. स्टॉक स्टोरेज के लिए सभी बोतल आटोक्लेव करें और सभी स्टॉक समाधान फिल्टर करें (संक्षारक समाधानों को छोड़कर) और 0.22-माइक्रोग्राम झिल्ली के उपयोग से पहले फिल्टर करें।
    2. आरटी पर अग्रिम में सभी स्टॉक समाधान तैयार करें, और 4 सी में स्टोर करें: 5 एम नाओएल; 1 एम केएलएल; 100 मिमी एमजीएल 2 ; 100 मिमी CaCl 2 ; 200 मिमी एनएएच 2 पीओ 4 ; 100 एमएम ईजीटीए (पीएच 7.0 कोहए के साथ) संक्षारक समाधान के रूप में 5 एम नाओएच, 1 एम एचसीएल और 1 एम कोह शेयरों को संभाल लें।
  2. मानक बाह्य रिकॉर्डिंग शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) की तैयारी
    1. पैच-दबाना रिकॉर्डिंग की सुबह आरटी पर स्टॉक समाधान गर्म।
    2. CaCl 2 को छोड़कर, वांछित अंतिम मात्रा के अनुसार प्रत्येक शेयर से सामग्री पिपेट करें, जैसे कि पीएमएस की 500 एमएल तैयार करने के लिए: 140 एमएम NaCl = 14 एमएल 5 एम; 5 एमएम केसीएल = 1 एम के 2.5 एमएल; 1.2 मिमी एमजीएल 2 = 100 एमएम का 6 एमएल; 1.2 मिमी एनएएच 2 पीओ 4 = 3 एमएल 200 एमएम
    3. डबल जोड़ें400 एमएल के अंतिम मात्रा के लिए डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीएच 2 ओ) और संतुलित बनाना।
    4. 0.9 जी ग्लूकोज और 1.1 9 जी एचईपीईज वजन करें और समाधान मिश्रण में पूरी तरह से भंग करें।
    5. सरगर्मी के साथ CaCl 2 स्टॉक (2.5 मिमी = 12.5 एमएल का 100 मिमी) जोड़ें।
    6. अंतिम मात्रा का 99% तक जोड़ें
    7. पीओएच को नाओएच या एचसीएल का प्रयोग करके 7.4 को समायोजित करें।
    8. Osmolarity की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो 5 एम NaCl या ग्लूकोज का उपयोग कर समायोजित करें।
    9. एक सिलेंडर में 500 एमएल की अंतिम मात्रा में डीडीएच 2 ओ जोड़ें।
  3. माइक्रोप्रोपेत आंतरिक समाधान की तैयारी (निम्न ईजीटीए के + आधारित समाधान)
    1. वांछित अंतिम मात्रा और एकाग्रता के अनुसार प्रत्येक स्टॉक से अभिकर्मकों की सही मात्रा को वजन या विंदित करना, उदा। 50 एमएल कम ईजीटीए के + + 30 मिलीलीटर डीडीएच 2 ओ: 100 एमएम के ग्लूकोनेट के वॉल्यूम पर इंट्रासेल्युलर समाधान तैयार करने के लिए = 1.17 जी; 35 एमएम केसीएल = 1.75 एमएल 1 एम; 2 मिमी एमजीएल 2 = 1 एमएल100 मिमी का; 0.1 मिमी ईजीटीए = 0.05 एमएल का 100 मिमी; 10 मिमी HEPES = 0.072 ग्राम
    2. अंतिम मात्रा के ~ 95% के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें और समाधान को आरटी पर संतुलित करने दें। सुनिश्चित करें कि समाधान स्पष्ट है।
    3. लगातार हल करने के दौरान, पीएच को 7.2 से कोह का उपयोग करके समायोजित करें।
    4. वजन में 0.078 ग्राम एमजी-एटीपी जोड़ें और इसे पूरी तरह भंग कर दें।
    5. बर्फ पर समाधान रखें और ओस्मिथोलिटी के माप के लिए एक छोटे से विभाज्य का उपयोग करें; सामान्यतया, समाधान ~ 2 9 एमओएसएमोल के उपायों और समायोजन की आवश्यकता नहीं है। यदि ओएसएमएलआरटीई 280-295 एमओएसएमोल से काफी अलग है, तो एक नया समाधान तैयार करें।
    6. अंतिम मात्रा में डीडीएच 2 ओ जोड़ें
    7. 500 μL aliquots में समाधान विभाजित, 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ फिल्टर, कसकर सील और तुरंत ≤ -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
    8. पैच-दबाना प्रयोग की तारीख में, बर्फ पर इंट्रासेल्युलर समाधान के एक विभाज्य को पिघलना और पैच-दबाना प्रयोग के दौरान ठंडा रहेंगिरावट को रोकने
  4. इंट्रासेल्युलर समाधान से भरे हुए 5-10 एम के प्रतिरोध के साथ माइक्रोप्रिपेट आकार प्राप्त करने के लिए गिलास केशिका से पैच पिपेट्स को खींचें (विंदुक खींचने वाले उपयोगकर्ता के मैनुअल के बाद)।

4. कक्षों के साथ पैच-क्लैंप प्रयोग और पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना करना

  1. पैच-क्लैम्प प्रयोग की स्थापना
    1. पैच-क्लैंप सेट अप करें (कंप्यूटर, कंप्यूटर-नियंत्रित एम्पलीफायर, डिजिसाइज़र, आदि ) चालू करें
    2. पैच-क्लैंप सॉफ्टवेयर खोलें ( जैसे एक्सन पीसीएलएएमपी 10 या हेकेए पैच मस्टर) और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए प्रोटोकॉल सेट करें। 1-3 kHz पर कम पास के संकेत के लिए फिल्टर और 10-20 kHz पर डिजिटाइज़र सेट करें
    3. कैमरे, माइक्रोमैनिपुलेटर और हल्का स्रोत चालू करें
    4. जब कम्प्यूटर-नियंत्रित एम्पलीफायर चालू हो रहा है, प्रयोगकर्ता के शरीर को पैच-क्लैम्प रिग के हाथों को छूकर जमीन पर रखा गया है,हेडस्टेज को छूने से पहले, इसे बिजली के झटके से बचाने के लिए
    5. आरटी पर मानक पीएसएस के ~ 1 एमएल से भरा रिकार्डिंग कक्ष में कांच के कवर पर संवर्धन उपकला कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। किसी पैच-दबाना प्रयोगों से पहले स्नान से पीएसएसएस कम से कम दो बार पिपेट का प्रयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, योजनाबद्ध प्रयोग के अनुसार छिड़काव प्रणाली मानक पीएसएस या किसी अन्य बाहरी समाधान के साथ भरें। पैच-क्लैंप प्रयोगों से शुरू होने से पहले ~ 2 एमएल / मिनट की गति से कुछ समय पीएससी के साथ माइक्रोस्कोप-माउड रिकॉर्डिंग चेंबर (आरसी -26 जी या आरसी -26 जीएलपी) का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि छिड़काव प्रणाली पर फंसे कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं।
    6. एक अंतर हस्तक्षेप विपरीत ऑप्टिकल प्रणाली के साथ सुसज्जित 10X और 40X उद्देश्यों का उपयोग कर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत कक्षों को देखें और चुनें। रिकॉर्डिंग के लिए बड़ी एकल पृथक कोशिकाओं को देखें। पृथक एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं को उनके गोलाकार आकार से मोटे तौर पर पहचानेंझिल्ली के एक छोर पर आईसीआरविली और इंट्रासेल्युलर सामग्रियों के ध्रुवीकृत वितरण ( चित्रा 1 )।
    7. एक 1 एमएल सिरिंज (एक घर से बनाई गई गैर-मेटालिक माइक्रोसिरीज सुई) का उपयोग करके, आंतरिक समाधान (कम ईजीटीए + + आधारित समाधान, चरण 3.3 देखें) के साथ एक माइक्रोप्रोपेट भरें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोपिपेट में कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं, जिससे माइक्रोप्रोपेट का प्रतिरोध बढ़ सकता है। पर्याप्त समाधान का उपयोग करें ताकि आंतरिक समाधान क्लोराइड-लेपित चांदी के तार इलेक्ट्रोड को माइक्रोप्रोप्ते धारक के भीतर डूब जाए।
    8. इलेक्ट्रोड धारक में माइक्रोप्रिटेस को माउंट करें, और कम सकारात्मक दबाव (~ 0.2 एमएल सिरिंज वॉल्यूम) लागू करें। बाद के चरणों में सेल झिल्ली को छूने तक लगातार कम सकारात्मक दबाव रखें।
  2. रिकॉर्डिंग के लिए कोशिकाओं के साथ पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना
    1. माइक्रोमैनिपुलेटर की उच्च गति पर स्नान समाधान में पिपेट को विसर्जित करें। विंदुक खोजेंडिजिटल कैमरा से जुड़े स्क्रीन में टिप; मध्यम-उच्च मोड में माइक्रोमनिपुलेटर की गति धीमा करें।
    2. कंप्यूटर-नियंत्रित एम्पलीफायर से उत्पन्न वोल्टेज चरण ( जैसे 100 एमएस के लिए 5 एमवी) को लागू करके डेटा अधिग्रहण इंटरफ़ेस कमांड ( जैसे एक्क्सोन सिस्टम में "झिल्ली परीक्षण") का उपयोग करके माइक्रोप्रिसेट प्रतिरोध (5-10 एमयू) को तुरंत जांचें। एक नई माइक्रोप्रोपेत में बदलें यदि प्रतिरोध इस सीमा से काफी बाहर है।
    3. खुर्दबीन पर लगाए गए उद्देश्य को नीचे ले जाने के लिए प्रारंभ करें; धीरे-धीरे चयनित सेल की ओर micropipette गाइड। हमेशा उद्देश्य को कम करें, और तब फोकस के विमान में माइक्रोप्रोपेट को कम करें, जब तक कि माइक्रोप्रिपेट चयनित सेल के केंद्र की सतह से ऊपर नहीं है।
    4. सॉफ़्टवेयर के कमांडर इंटरफ़ेस में "पिपेट ऑफसेट" कमांड का उपयोग करके विंदुक और स्नान समाधान के बीच तरल जंक्शन क्षमता को शून्य पर रोक दें।
    5. कंप्यूटर-नियंत्रित एम्पलीफायर कॉम सेट करेंऔर "वोल्टेज-दबाना" और "स्नान" मोड में झिल्ली परीक्षण के लिए।
    6. सेल के स्पष्ट दृष्टिकोण के लिए बेहतर ध्यान केंद्रित करें, फिर धीरे-धीरे कम-मध्यम गति पर माइक्रोप्रोप्टर का उपयोग करके माइक्रोप्रोपेट कम करें।
    7. जब माइक्रोप्रिटेस कोशिका के करीब होता है (झिल्ली परीक्षण कमान द्वारा ट्रिगर होने पर घटित वर्तमान द्वारा प्रदर्शित किया जाता है), तुरंत कम सकारात्मक दबाव को हटा दें और कमजोर नकारात्मक दबाव (0.1 एमएल सिरिंज मात्रा) को गिगासेल (> 1 जीयू) बनाने के लिए लागू करें ।
    8. झिल्ली परीक्षण के साथ प्रतिरोध की निगरानी करें। यदि प्रतिरोध है> 500 एम.यू. लेकिन <1 जीयू, नकारात्मक क्षमता (आमतौर पर धारण क्षमता जो -60 एमवी तक तय की जाती है) पर लागू होती है, जो कि जीजेसील बनाने में मदद कर सकती है। माइक्रिपिपेट के क्षणिक कैपेसिटिव वर्तमान को मुआवजा दें
    9. यदि सील> 1 जी और स्थिर है (जैसा कि सॉफ्टवेयर इंटरफेस में दिखाया गया है), सेल झिल्ली को तोड़ने के लिए संक्षिप्त और मजबूत सक्शन लागू करें। एसई के लिए मुआवजे पर आवेदन न करेंखून प्रतिरोध और सेल समाई।
    10. सफल सेल-सेल कॉन्फिगरेशन प्राप्त करने के तुरंत बाद, -60 एमवी की एक होल्डिंग क्षमता से 10 एमवी हाइपरपरॉलिविंग चरण (न्यूनतम समय अंतराल के साथ 5-निशान, 20 एमएस की अवधि, 20 किलोहर्ट्ज़ पर सिग्नल नमूना) लागू करें।
    11. शून्य-वर्तमान मोड में वोल्टेज-मोड को स्विच करें और सॉफ़्टवेयर इंटरफ़ेस से रीडिंग को चिह्नित करें या सेल के झिल्ली संभावित रीडिंग के लिए गैप-फ्री रिकॉर्डिंग (10-60 s) का प्रदर्शन करें।
    12. जल्दी से वापस स्विच करें और वोल्टेज मोड में रहें और नियोजित प्रयोगों के अनुसार वोल्टेज प्रोटोकॉल को लागू करें और वर्तमान प्रतिक्रियाओं को मापें। रिकॉटेक्शन रिकॉर्डिंग के दौरान आंतरिक रिसाव चालू करने के लिए लागू नहीं है।
    13. रिकॉर्डिंग के दौरान प्रतिक्रियाओं की स्थिरता या सेल के विभिन्न पैरामीटर की निगरानी करें। उदाहरण के लिए, इनपुट प्रतिरोध (आर आई ), श्रृंखला प्रतिरोध (आर एस ) और सेल की जांच करने के लिए "झिल्ली परीक्षण" कमांड इंटरफेस का उपयोग करेंप्रोटोकॉल के स्विच के दौरान "सेल" मोड पर झिल्ली परीक्षण में झिल्ली समाई (सी मी )।
      नोट: इनपुट प्रतिरोध में अचानक गिरावट आमतौर पर एक ढीली पैच का संकेत है, और श्रृंखला प्रतिरोध में एक नाटकीय वृद्धि इंट्रासेल्युलर ऑर्गेनेल या झिल्ली के टुकड़े द्वारा माइक्रोप्रिपेट टिप की दिक्कत का संकेत हो सकती है। रिकॉर्डिंग के दौरान, यह देखने के लिए कि क्या बहाव होता है, नियमित रूप से माइक्रोप्रिसेट स्थान पर निगरानी रखता है, जिससे पैच की हानि हो सकती है। यदि बहाव एक समस्या है, तो सावधानीपूर्वक रिकॉर्डिंग चैम्बर के नीचे से माइक्रोप्रिपेट और पैचिंग सेल को एक साथ उठाएं। यह कदम कभी-कभी पैच की हानि हो सकती है, इस मामले में, पूरे सेल पैच-दबाना प्रक्रिया को दोहराने के लिए आवश्यक है।

5. कोशिकाओं के निष्क्रिय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का विश्लेषण

  1. पैच-दबाना प्रयोगों से डेटा प्राप्त करने के बाद, Clampfit सॉफ़्टवेयर में अंतर-मुक्त डेटा खोलें और मतलब को मापेंप्रत्येक सेल के लिए आराम झिल्ली की क्षमता के लिए मूल्य वैकल्पिक रूप से, मौजूदा मोड में शून्य-वर्तमान वोल्टेज से चिह्नित के रूप में मान का उपयोग करें। तरल जंक्शन क्षमता (इस अध्ययन में 12.4 एमवी) के साथ मूल्यों को सही करें
  2. सेल से प्राप्त 10 एमवी हाइपरपरॉलिविंग चरण (ΔV) से डेटा खोलें, चरण (Δ I चरण ) से पहले और उसके दौरान वर्तमान अंतर को मापें, और समीकरण का उपयोग करके इनपुट प्रतिरोध (आर आई ) की गणना करें:
    समीकरण 1
  3. सेल समाई की गणना (सी मीटर, पीएफ की इकाई में) (प्रारंभिक क्षणिक क्षय वर्तमान वोल्टेज कदम ट्रिगर पर उठाया दौरान झिल्ली संधारित्र वर्तमान के तहत कुल क्षेत्रफल को एकीकृत करके 10 mV hyperpolarizing कदम से ही मौजूदा डेटा का उपयोग), सेल के कुल संचित प्रभार (क्यू, पीए की एमएस) में मूल्य प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें:
    समीकरण 2
  4. समय-समय पर लगातार क्षय ( टी , एमएस की इकाई में) प्राप्त करने के लिए एक मानक घातीय एल्गोरिथ्म के साथ 10-एमवी नकारात्मक चरण से प्रारंभिक क्षणिक वर्तमान में फिटिंग द्वारा प्रत्येक सेल के लिए श्रृंखला प्रतिरोध (आर एस ) के मूल्य की गणना करें और निम्नलिखित समीकरण:
    समीकरण 3

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Representative Results

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चूहा पुच्छ epididymides से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए वर्णित एंजाइमी पाचन प्रक्रिया हमारे पिछले अध्ययनों 9, 12 से एक संशोधित प्रोटोकॉल है। इस पद्धति से 90% व्यवहार्यता के बिना और बिना सतह के फफोले या सूज सेल मात्रा के एकल कोशिकाओं के मिश्रण का उत्पादन होता है। विषम सेल मिश्रण मुख्य रूप से प्रमुख कोशिकाओं, स्पष्ट कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं में होते हैं, जैसा कि हमने पहले 1 वर्णित किया है। इस प्रोटोकॉल में, एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं के अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों को पेट्री डिश पर रातोंरात प्राथमिक विघटित कोशिकाओं को संवारने से प्राप्त किया जा सकता है, क्योंकि डिश में गैर-उपकला कोशिकाओं (जैसे कि फाइब्रोब्लैस्ट्स और चिकनी कोशिकाओं) के आसंजन को अनुमति देने के लिए चित्रा 1 ए (फसल के पहले) में प्रदर्शित तब सूक्ष्मदर्शी के तहत कोशिका प्रकार उनके फेनोटाइप द्वारा प्राथमिक रूप से प्रतिष्ठित हो सकते हैंऔर उनके विशिष्ट निष्क्रिय झिल्ली गुणों के अनुसार वर्गीकृत। अलग-अलग कोशिका मिश्रण में, कोशिकाओं का एक समूह होता है जो कि उनकी सतह झिल्ली के एक छोर पर microvilli या मोटा झिल्ली होता है, और सेलुलर सामग्री को ध्रुवीकृत करता है; इन्हें प्रमुख कोशिकाओं या स्पष्ट सारण कोशिकाओं ( चित्रा 1 बी , तीर) कहा जाता है। ये ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाएं उनके रूपात्मक विशेषताओं से अप्रभावी हैं लेकिन उनके निष्क्रिय झिल्ली गुणों और पूरे सेल पैच-दबाना रिकॉर्डिंग से प्राप्त प्रवाहकत्त्व प्रतिक्रियाओं के अनुसार पहचान की जा सकती है। झिल्ली के एक छोर पर कोशिकाओं का दूसरा समूह आकार में छोटा नहीं है और कोई स्पष्ट ध्रुवीकृत सेलुलर सामग्री नहीं है; इन्हें नो-माइक्रोविलि कोशिका कहा जाता है, और इनमें ज्यादातर बेसल कोशिकाएं होती हैं ( चित्रा 1 बी , तारांकन)।

प्राथमिक उपकला प्रमुख कोशिकाओं को अन्य कोशिकाओं से अलग किया जा सकता हैपूरे सेल पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके लागू वोल्टेज प्रोटोकॉल के जवाब में आईआर अलग-अलग निष्क्रिय झिल्ली गुण ( चित्रा 2 ) और वर्तमान पैटर्न ( चित्रा 3 )। कोशिकाओं के निष्क्रिय झिल्ली इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुण व्यक्तिगत कोशिकाओं और सेल प्रकार समूहों की प्रारंभिक स्वास्थ्य स्थिति का आकलन करने में मदद कर सकते हैं। झिल्ली समाई (सी मी ), इनपुट प्रतिरोध (आर मी ) और प्रत्येक कोशिका समूह की झिल्ली की क्षमता (वी मी ) के व्यक्तिगत डॉट भूखंडों का सारांश चित्र 2 ए में दिया गया है। विभिन्न सेल प्रकारों (~ 0.4 एमएस) के बीच झिल्ली समाई के लिए निरंतर समय में कोई अंतर नहीं है (डेटा इस पांडुलिपि में प्रदर्शित नहीं किया गया है) निम्न ईजीटीए के + आधार समाधान का उपयोग करना, प्रमुख कोशिकाओं के लिए औसत मापा झिल्ली समाई 9.4 0.5 पीएफ (एन = 32) है और स्पष्ट तरह की कोशिकाओं के लिए 9.7 1. 9 पीएफ (एन = 12) है। का झिल्ली समाईनो-माइक्रोविलि कोशिकाएं 5.2 0.8 पीएफ (एन = 17) हैं, जो कि प्रिंसिपल और स्पष्ट तरह की कोशिका झिल्ली कैपेसिटेंस से सांख्यिकीय रूप से छोटी होती हैं।

चित्रा 2 ए (मध्य पैनल) में प्रमुख कोशिकाओं के इनपुट प्रतिरोध 1.1 ± 0.2 GΩ (n = 32) हैं और स्पष्ट कोशिकाओं की तुलना 2.2 ± 0.8 GΩ (n = 12) है, जो कि काफी कम है (पी <0.001) से नो-माइक्रोविलि कोशिकाओं की (8.9 ± 2.1 जीओ; एन = 17) जैसा चित्रा 2 ए (दाएं पैनल) में दर्शाया गया है, शून्य-वर्तमान झिल्ली की क्षमता ( अर्थात विश्राम झिल्ली संभावित वी मी ) पूरी सेल विन्यास की स्थापना के बाद मापा गया था और तरल जंक्शन क्षमता के साथ सुधार के बाद समूहों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था (12.4 mV)। कोशिकाओं को मानक पीएसएस में नियमित रूप से स्नान किया गया था और एटीपी वाले 0.1 एमएम ईजीटीए के + डायजेड विंदुक समाधान के साथ डायल किया गया था। उन्हेंप्रिंसिपल कोशिकाओं की ईन झिल्ली क्षमता -26 ± 2 (एन = 28), -51 एमवी और +1 एमवी के बीच है, और स्पष्ट-तरह की कोशिकाओं का मतलब झिल्ली क्षमता -30 ± 3 एमवी (एन = 10) है, 47 एमवी और -17 एमवी के बीच नो-माइक्रोविलि कोशिकाओं में उच्चतम अर्थ झिल्ली क्षमता होती है -33 ± 5 mV (n = 17) के मूल्य के साथ -63 mV और -13 mV के बीच।

मूल कोशिकाओं के कम इनपुट प्रतिरोध से पता चलता है कि इन कोशिकाओं में आंतरिक चालन हैं, लेकिन यह विंदुक और पैच सेल झिल्ली के बीच मुहर के लीक से संकेत कर सकता है। इस चिंता का समाधान करने के लिए, हमने सबसे पहले उन कोशिकाओं के डेटा को रिकॉर्डिंग के दौरान विद्युत गुणों के अचानक परिवर्तन (सील रिसाव का संकेत) से बाहर रखा। फिर हमने इनपुट प्रतिरोध के साथ 1 गीगा-ओम की सीमा पर सील प्रतिरोध के बीच के संबंध का विश्लेषण किया, जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। परिणाम बहुत कम सहसंबंध मूल्य था (आर 2 ≈ 0.02)। इससे पता चलता है कि इनपुट प्रतिरोध पर सील प्रतिरोध का नगण्य प्रभाव पड़ता है, और विभिन्न कोशिकाओं (जैसे मूल कोशिकाओं के कम इनपुट प्रतिरोध) की रिपोर्ट के निष्क्रिय विद्युत गुण इन कोशिकाओं के आंतरिक गुण हैं।

चित्रा 3 ए सामान्य शारीरिक नमक समाधान (पीएसएस) में कोशिकाओं स्नान, कम ईजीटीए के-आधारित विंदुक समाधान के साथ डायल किया गया है और -60 एमवी की पकड़ क्षमता से उत्तेजित कोशिकाओं के साथ अर्ध-शारीरिक स्थितियों के तहत मूल कोशिकाओं के नीचे मूल कोशिकाओं से प्राप्त की जाने वाली विशिष्ट वर्तमान प्रतिक्रिया है 500 एमएस परीक्षण वोल्टेज की एक श्रृंखला के लिए ( चित्रा 3 बी की प्रविष्टि में दर्शाए गए अनुसार -120 एमवी से +60 एमवी तक)। चित्रा -3 सी में दो ट्रेसिंग की उपस्थिति में शून्य-वर्तमान क्लैंप के नीचे एक पहचान वाले प्रमुख कक्ष के ठेठ आराम झिल्ली प्रतिक्रिया दिखाती है, याविंदुक समाधान में एटीपी की अनुपस्थिति। एटीपी की उपस्थिति में, आराम की क्षमता अपेक्षाकृत स्थिर है। जबकि एक प्रगतिशील हाइपरपरॉलराइजेशन मनाया गया, जब कोशिकाओं को एटीपी के बिना एक विंदुक समाधान के साथ डायलिसिस किया गया। पिपेट समाधान के साथ सेल डायलिसिस की शुरुआत में मापा जाने वाला प्रारंभिक आराम झिल्ली क्षमता एटीपी ( चित्रा 3 डी ) के साथ या इसके बिना कोशिकाओं में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाती है, यह दर्शाता है कि मापा मूल्य अभी भी बरकरार थे और कम से कम पिपेट समाधानों से प्रभावित थे।

आकृति 1
चित्रा 1 : पृथक चूहे कौडा एपीडिडायमल उपकला कोशिकाओं की आकृति विज्ञान विशेषताएं। ( ए, बी ) उपकला कोशिकाओं के उदाहरण ( ) से पहले चूहे कौडा एपिडिडाइम्स से पृथक हो जाते हैं और बाद में ( बी ) ओवे की फिर से फसलपैच-दबाना प्रयोगों से पहले डिश पर रातोंरात संस्कृति। तीर microvilli कोशिकाओं, जो मुख्य रूप से प्रमुख कोशिकाओं और स्पष्ट तरह कोशिकाओं से मिलकर संकेत मिलता है। एस्टेरिस्क न-माइक्रोविलि कोशिकाओं को इंगित करते हैं। पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के लिए केवल एकल कक्षों का चयन किया गया था। स्केल बार = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2 : एकल चूहा cauda epididymal उपकला कोशिकाओं के निष्क्रिय झिल्ली गुण। ( ) एक चूहे कूडा एपिडिडीमल उपकला कोशिकाओं के निष्क्रिय झिल्ली गुणों के डॉट भूखंड। पिपेट समाधान कम है EGTA K + आधारित और स्नान समाधान मानक PSS है ( बी ) इनपुट रिस के सहसंबंध विश्लेषणकोशिकाओं के मुहर प्रतिरोध के साथ आस्तीन एनएस : कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं, * पी <0.05, ** पी <0.01 *** पी <0.001 महत्वपूर्ण अंतर बनाम उपयुक्त नियंत्रण Bonferroni पोस्ट-हॉक टेस्ट के साथ एक तरफा ANOVA का उपयोग करते हुए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3 : सिंगल एपीडिडायमल प्रिंसिपल कोशिकाओं में विशिष्ट पूरे सेल धाराएं। ( ) पैनाल बी के अंदरूनी रूप में दिखाए जाने वाले पल्स-एलिकिटिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए अर्ध-शारीरिक स्थितियों में दर्ज एकल एपीडिडायमल एपिथेलियल कोशिकाओं से दर्ज ठेठ पूरे सेल धाराएं। बिंदीदार रेखा से शून्य वर्तमान स्तरों को दर्शाया गया है। ( बी ) वर्तमान उत्तरदायित्व का मौजूदा वोल्टेज संबंधएस ए डेटा के रूप में निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर मापा जाता है, कम से कम तीन जानवरों से आठ प्रमुख कोशिकाओं का मतलब है ± SEM। ( सी ) एपीपी (+ एटीपी) या एटीपी (-एटीपी) के बिना, एक विंदुक समाधान के साथ डायल किया गया प्रिंसिपल कोशिकाओं के आराम झिल्ली की क्षमता के प्रतिनिधि ट्रेसिंग। ( डी ) + एटीपी और -एटीपी की प्रारंभिक आराम झिल्ली क्षमता के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा रहा है एक बार ग्राफ मान का अर्थ है ± एसईईएम, उस समय मापा जाता है जब पैनल में संकेत दिया जाता है। बार के भीतर ब्रैकेट में नंबर कम से कम तीन जानवरों से जांच की गई कोशिकाओं की संख्या दर्शाती है। एनएस : कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं ( ) सील प्रतिरोध और सभी कोशिकाओं के इनपुट प्रतिरोध का विश्लेषण, या केवल मुख्य कोशिकाओं, शून्य-वर्तमान दबाना पर मापा आराम झिल्ली बनाम, पूरे सेल की स्थापना के बाद और हाइपरपरॉलरिंग पर मापा वर्तमान परिमाण पी होने से -100 एमवी के लिए कदमotential। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल में, चूहे कौडा एपिडिडाइड्स के एंजाइमैटिक फैलाव ने स्वस्थ उपकला कोशिकाओं को लगातार मिलाया है। पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए एपिडिडिमल एपिथेलियल कोशिकाओं की गुणवत्ता प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर होती है। उदाहरण के लिए, शुक्राणुजोज़ और एपिडिडायमल ल्यूमिनियल कंटेंट को हटाने के लिए, कम केन्द्रापसारक बल (30 xg) पर सेल मिश्रण का केन्द्रोत्पादन महत्वपूर्ण है; कोशिका संस्कृति में शुक्राणुजोज़ा की उपस्थिति में एपिडिडीमल इपिथेलियल कोशिकाएं अस्वस्थ हो जाती हैं। इसके अलावा, कई घंटे के लिए पेट्री डिश पर अलग-अलग कोशिका मिश्रण को संवर्धन करने के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स और चिकनी पेशी कोशिकाओं को निकालने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है; गैर उपकला कोशिकाओं संस्कृति पकवान पर तेजी से पालन करते हैं और इस तरह, निलंबन में उपकला कोशिकाओं को छोड़कर, जो कोमल आकांक्षा द्वारा पुन: काटा जा सकता है। इसके अलावा, एक अच्छा कांच विंदुक के साथ collagenase पाचन और trituration रिहाई के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैंसेल पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान एकल कोशिकाओं। अंत में, एपिडिडिमल कोशिकाओं का एंजाइमैटिक पाचन पैच-क्लैंप प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि निष्क्रिय एनजीमाटिक गतिविधि या लंबे समय तक ऊष्मायन द्वारा अति-पाचन के तहत पाचन दोनों विंदुक और सेल झिल्ली के बीच गिगा-ओम सील गठन को बाधित कर सकते हैं।

सेल मिश्रण में, कोशिकाओं को एक बड़ा, स्तम्भकार आकार में एक छोर झिल्ली वाले स्टीरियोकोइलिया के साथ एक छोर पर और इंट्रासेल्युलर सामग्रियों के ध्रुवीकृत वितरण संभवतया प्रमुख कोशिकाओं या स्पष्ट कोशिकाएं हैं। अन्य कोशिकाओं के पास प्रमुख माइक्रोवोइली और ध्रुवीकृत कोशिका की सामग्रियां नहीं होती हैं, जिनमें प्रतिरक्षा प्रणाली से बेसल कोशिकाएं और कुछ कोशिकाएं शामिल हो सकती हैं। एपिडिडीमल एपिथेलियल कोशिकाओं की मूल आकृतिगत विशेषताओं का वर्णन करने के अलावा, यह प्रोटोकॉल प्रत्येक सेल की निष्क्रिय झिल्ली संपत्ति को मापने के लिए पूरे सेल पैच-क्लैंप पद्धति को नियोजित करता है। इन झिल्ली गुणों की प्राथमिक अंतर के लिए अनुमति देते हैंसेल प्रकार इस पद्धति में कुछ सीमाएं हैं जैसे विंदुक समाधान के साथ इंट्रासेल्युलर सामग्री के वाशिंगआउट और निरंतर रिकॉर्डिंग 19 , 20 के दौरान सेलुलर आर्किटेक्चर संशोधनों के संबंध में इलेक्ट्रॉनिक विविधताएं। हम केवल पैरामीटर प्रदान करते हैं जो हम पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन की स्थापना के तुरंत बाद मापते हैं, जो कोशिकाओं की प्रारंभिक, अपेक्षाकृत बरकरार परिस्थितियों को दर्शाते हैं। प्रत्येक कोशिका के निष्क्रिय झिल्ली गुणों में झिल्ली का समाई, इनपुट प्रतिरोध और आराम झिल्ली क्षमता शामिल है।

कोशिका झिल्ली का विशिष्ट समाई आम तौर पर 1 μF / cm 2 होने पर सहमत हो गया है और यह सेलुलर झिल्ली 16 , 18 पर सीमित तह के साथ कोशिकाओं (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स) के लिए सही है। हालांकि, विशिष्ट कैपेसिटन्स निरंतर कोशिकाओं के लिए अधिक से अधिक होने लगता हैअधिक जटिल, सेलुलर आर्किटेक्चर, जैसे उपकला कोशिकाएं, जिनमें अलग-अलग डिब्बों में कई सेलुलर झिल्ली की परत होती है। रिपोर्ट बताते हैं कि क्रमशः 17 , एमडीसीक उपकला कोशिका रेखा के मूल्य 4 μF / cm 2 और 3 μF / cm 2 क्रमशः शिखर और बेसल झिल्ली विशिष्ट कैपेसिटेंस के लिए होते हैं। वर्तमान अध्ययन में, मापा औसत झिल्ली कैपेसिटन्स क्रमशः नॉन-माइक्रोविलि कोशिका समूह के लिए ~ 8 पीएफ और ~ 12 पीएफ और मुख्य कोशिकाओं और स्पष्ट-समान कोशिका समूह ( यानी माइक्रोवेली-कोशिकाओं) हैं। हमारी गणना के लिए 1 μF / cm 2 के विशिष्ट समाई का उपयोग करते हुए, अनुमानित कोशिका की सतह के क्षेत्र क्रमशः नो माइक्रोविलि कोशिकाओं के लिए 500 माइक्रोन 2 और 1,000 माइक्रोन 2 हैं, जो 13 माइक्रोन और 18 के व्यास से मेल खाती हैं सुक्ष्ममापी। हालांकि, इन अनुमानों की तुलना माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कोशिकाओं के आकार के आधार पर की जाने वाली अपेक्षाओं से अधिक होती है, जो ~ 8 है1; एम और ~ 12 माइक्रोग्राम के लिए क्रमशः नो माइक्रोविलि कोशिकाओं और माइक्रोविलि-कोशिकाएं, और इन कोशिकाओं क्रमशः 2.4 μF / cm 2 और 1.9 μF / cm 2 हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि सूक्ष्म विली कोशिकाओं की तुलना में नो-माइक्रोवाइली कोशिकाओं का झिल्ली परिदृश्य अधिक जटिल है, जो उनके स्राव और परिवहन कार्यों के अनुरूप है।

कोशिका झिल्ली का विशिष्ट समाई आम तौर पर 1 μF / cm 2 होने पर सहमत हो गया है और यह सेलुलर झिल्ली 16 , 18 पर सीमित तह के साथ कोशिकाओं (जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं और न्यूरॉन्स) के लिए सही है। हालांकि, विशिष्ट समाई निरंतर अधिक जटिल, सेलुलर आर्किटेक्चर के साथ कोशिकाओं के लिए बड़ा होता है, जैसे उपकला कोशिकाएं, जिनमें अलग-अलग डिब्बों में कई सेलुलर झिल्ली की परत होती है। रिपोर्ट बताते हैं कि एमडीडी उपकला सेल लाइन मान 4 μF / cm 2 और 3 μF / cm 2 हैं 17 वर्तमान अध्ययन में, मापा औसत झिल्ली कैपेसिटन्स क्रमशः नॉन-माइक्रोविलि कोशिका समूह के लिए ~ 8 पीएफ और ~ 12 पीएफ और मुख्य कोशिकाओं और स्पष्ट-समान कोशिका समूह ( यानी माइक्रोवेली-कोशिकाओं) हैं। हमारी गणना के लिए 1 μF / cm 2 के विशिष्ट समाई का उपयोग करते हुए, अनुमानित कोशिका की सतह के क्षेत्र क्रमशः नो माइक्रोविलि कोशिकाओं के लिए 500 माइक्रोन 2 और 1,000 माइक्रोन 2 हैं, जो 13 माइक्रोन और 18 के व्यास से मेल खाती हैं सुक्ष्ममापी। हालांकि, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिका के आकारों के आधार पर अनुमान लगाए जाने वाले अनुमानों की तुलना में अधिक, क्रमशः नॉन-माइक्रोविलि कोशिकाओं और माइक्रोविलि-कोशिकाओं के लिए ~ 8 माइक्रोन और ~ 12 माइक्रोन हैं, और ये कोशिकाएं एक विशिष्ट समाई मूल्य के साथ बेहतर संगत हैं 2 μF / सेमी 2 इससे पता चलता है कि एपिडिडायमल एपिथेलियल कोशिकाओं का झिल्ली परिदृश्य, mor हैई कॉम्प्लेक्स की तुलना में अन्य सेल प्रकार, जो उनके स्राव और परिवहन कार्यों के अनुरूप है।

पूरे सेल रिकॉर्डिंग में झिल्ली और विंदुक के बीच मुहर के दोनों ओर झिल्ली के रिसाव प्रवाहकत्त्व दोनों मापा झिल्ली गुणों में योगदान दिया। मुहर झिल्ली की तुलना में काफी अधिक प्रतिरोधी है, और इसलिए निष्क्रिय झिल्ली गुणों जैसे कि इनपुट प्रतिरोध और शून्य-वर्तमान झिल्ली क्षमता की माप पर इसका न्यूनतम प्रभाव होता है। इस धारणा के अनुरूप, प्रत्येक सेल के इनपुट प्रतिरोध के खिलाफ 1 गीगा-ओम की दहलीज पर सील प्रतिरोध के सहसंबंध विश्लेषण का परिणाम ~ 0.02 का मूल्य हुआ, जो कि बहुत कमजोर प्रभाव का सुझाव देता है। आगे के संबंध में या तो सील प्रतिरोध या आराम प्रतिरोध झिल्ली की क्षमता के खिलाफ इनपुट प्रतिरोध या -100 एम वी पर मापा वर्तमान परिमाण का विश्लेषण भी सभी परीक्षण कोशिकाओं के लिए या केवल मुख्य कोशिकाओं के लिए कम मूल्य दिया। हमारे परिणाम डीएन्पीडिडिमल प्रिंसिपल कोशिकाओं के इनपुट प्रतिरोध और स्पष्ट तरह की कोशिकाओं को नो-माइक्रोविलि कोशिकाओं की तुलना में काफी कम है, इस प्रकार से सेल प्रकारों के अंतर के फैसले के लिए एक प्रारंभिक पैरामीटर प्रदान किया गया है। ये परिणाम बताते हैं कि प्रमुख कोशिकाओं में कम इनपुट प्रतिरोध कोशिकाओं की एक आंतरिक शारीरिक संपत्ति है। एकल उपकला कोशिकाओं को भी लागू प्रोटोकॉल और प्रयोगात्मक शर्तों के जवाब में विशिष्ट वर्तमान पैटर्न हैं। हमने देखा कि प्रत्येक परिभाषित सेल प्रकार एक ही लागू वोल्टेज प्रोटोकॉल के तहत अद्वितीय वर्तमान पैटर्न का प्रदर्शन किया। चित्रा 3 में दिखाया गया एक उदाहरण अर्ध-शारीरिक स्थितियों के तहत मूल कोशिकाओं से दर्ज विशिष्ट वर्तमान प्रतिक्रियाओं को दर्शाता है, जैसा हमने पहले 9 में बताया है । प्रत्येक विशेष सेल प्रकार की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विशेषताओं को आसानी से विभेदित किया जाता है (डेटा इस पत्र में नहीं दिखाया गया है)। इन मापदंडों के आधार पर,परिणामस्वरूप वर्णित विभिन्न कोशिका प्रकारों को मोटे तौर पर प्रमुख कोशिकाओं, स्पष्ट तरह की कोशिकाओं और नो-माइक्रोवाइली कोशिकाओं में वर्गीकृत किया जा सकता है।

इनपुट प्रतिरोध, संभावित संभावित कदम (इस अध्ययन में 10 एमवी हाइपरपरॉलिविंग चरण) के जवाब में झिल्ली प्रतिरोध है -60 एमवी की होल्डिंग क्षमता से प्राप्त किया गया। यह लागू क्षमता के जवाब में खुला चैनल गतिविधि की सीमा को दर्शाता है। इस संबंध में, कम प्रतिरोध से कोशिकाओं के एक उच्च आंतरिक "रिसाव" प्रवाहकत्त्व होता है, जबकि एक उच्च प्रतिरोध बंद चैनल का अर्थ है। प्रमुख कोशिकाओं में कम इनपुट प्रतिरोध मान प्रमुख झिल्ली प्रवाहकत्त्व से मेल खाती है, जबकि स्पष्ट झुकाव क्षमता पर एक छोटे प्रवाहकत्त्व वाले कोशिकाएं हैं, जो कि रिकॉर्डिंग शर्तों के तहत उनके मध्यम प्रवाहकत्त्व का मतलब है। नो-माइक्रोवाइली कोशिकाओं के महत्वपूर्ण रूप से उच्च इनपुट प्रतिरोध का अर्थ है कि उनके पास इस स्थिति में कोई खुला चैनल नहीं है। शून्य-घन मेंट्रैन्ट क्लैंप, मापा, पृथक उपकला कोशिकाओं के औसत आराम झिल्ली की क्षमता तीन सेल समूहों के लिए 26-33 एमवी की सीमा में हैं। इन मूल्यों को माइक्रोएलेक्ट्रोड विधि 21 का उपयोग करते हुए रिपोर्ट झिल्ली क्षमता (-30 एमवी) के साथ तुलनात्मक है। हालांकि, सहज स्पीक क्षमता की अनुपस्थिति के बावजूद, मापा आराम करने की क्षमता अलग-अलग कोशिकाओं में व्यापक रूप से भिन्न होती है (+ 3 mV से -63 mV तक)। यह भिन्नता विभिन्न सेल प्रकारों में विभिन्न आयन चैनल गतिविधियों की बातचीत को प्रदर्शित कर सकती है, जैसे कि प्रमुख कोशिकाओं में टीआरपीवी 6 और टीएमईएम 16 ए चैनलों के युग्मित पारस्परिक रूप से, जैसा हमने हाल ही में 9 की सूचना दी है। यह ध्यान देने योग्य है कि जब कोशिकाओं को एटीपी पिपेट के साथ डायलिसिस किया गया था, हमने मुख्य कोशिकाओं में कोई सहज विद्युत क्षमता नहीं देखी; यह उपकला कोशिकाओं के वर्गीकरण को गैर-उत्तेजनीय 4 के रूप में स्वीकार करता है एक प्रगतिशील हाइपरपरॉलराइजेशन जब कोशिकाओं को पीआई के साथ डायल किया गया थाएटीपी के बिना पट्टी समाधान एक एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम वर्तमान की क्रमिक उपस्थिति परिलक्षित हो सकता है। यह बताया गया है कि एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनलों को चूहा एपिडिडीमिस के प्रमुख कोशिकाओं के गोल्गी तंत्र में व्यक्त किया जाता है और इंट्रासेल्युलर एटीपी की कमी से एटीपी चैनल 14 , 22 के सक्रियण की ओर बढ़ जाता है। इस अवलोकन से पता चलता है कि पिपेट समाधान में एटीपी को शामिल करने से एपिडिडिमल प्रिंसिपल कोशिकाओं की स्थिर शारीरिक स्थितियों का समर्थन किया जाता है।

पूरे सेल पैच क्लैंप तकनीक एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है जो सामान्यतः उत्तेजक कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करती है, जैसे न्यूरॉन्स। इस पत्र में, हमने दिखाया है कि यह गैर-उत्तेजक कोशिकाओं के जैव-गुणक गुणों के लक्षण वर्णन के लिए भी एक उपयोगी उपकरण है, जैसे उपकला कोशिकाएं। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक पृथक एपिडिडीम के कार्यात्मक जांच को सक्षम करता हैएपिडीडिमिस में अपनी शारीरिक भूमिका को आगे स्पष्ट करने के लिए अल उपकला कोशिकाएं यह अध्ययन एपिडीडिमिस में इन कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार और उनके अंतर्निहित जैविक प्रासंगिकता की भविष्य की जांच के लिए चूहा कौडा एपिडीडिमिस से पृथक उपकला कोशिकाओं के कुछ प्रारंभिक विद्युत गुण प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम पाठ पर सहायक टिप्पणियों के लिए डॉ। क्रिस्टोफर एंटोस का धन्यवाद करते हैं। यह काम शंघाईटेक विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था जो विनी शम को सम्मानित किया गया था और चीन के नैशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (एनएनएसएफसी नंबर 31471370) के वित्त पोषण से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

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References

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एपिडीडिमिस से पृथक प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग
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Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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