Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall'epididimo

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

Presentiamo un protocollo che combina l'isolamento delle cellule e la registrazione delle patch-clamp a cellule intere per misurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi di cauda di cauda. Questo protocollo consente di indagare le proprietà funzionali delle cellule epitidimali epididimali primarie per illustrare ulteriormente il ruolo fisiologico dell'epididimo.

Abstract

L'epididimo è un organo essenziale per la maturazione dello sperma e la salute riproduttiva. L'epitelio epididimo è costituito da tipi cellulari connessi intricati e distinti non solo in termini molecolari e morfologici ma anche in proprietà fisiologiche. Queste differenze riflettono le loro diverse funzioni, che insieme stabiliscono il microambiente necessario per lo sviluppo spermatico post-testicolo nel lume epididimale. La comprensione delle proprietà biofisiche delle cellule epitidimali epiteliali è fondamentale per rivelare le loro funzioni nello sperma e nella salute riproduttiva, in condizioni sia fisiologiche che patofisiologiche. Mentre le loro proprietà funzionali devono ancora essere completamente chiarite, le cellule epitidimali epiteliali possono essere studiate usando la tecnica patch-clamp, uno strumento per misurare gli eventi cellulari e le proprietà delle membrane delle singole cellule. Qui descriviamo i metodi di isolamento delle cellule e la registrazione di patch-clamp a cellule intere a meaAssicurare le proprietà elettriche delle cellule epiteliali primarie dissociate dagli epididimidi cauda del caudali.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'epididimo nel tratto riproduttivo maschile è un organo allineato con uno strato di cellule epiteliali mosaiche. Come in altri tessuti epiteliali, i diversi tipi di cellule dell'epitelio epididimo, comprese le cellule principali, le cellule chiare, le cellule basali e le cellule dei sistemi immunologici e linfatici, funzionano in modo concertato per funzionare come barriera alla linea frontale tubulare e come Sostenere le cellule per la maturazione e la fisiologia dello sperma 1 , 2 , 3 . Così, queste cellule epiteliali svolgono un ruolo essenziale nella salute riproduttiva.

Le cellule epiteliali sono generalmente considerate come cellule non eccitabili che non sono in grado di generare potenziali d'azione di tutti o nessuno in risposta a stimoli depolarizzanti, a causa della mancanza di canali Na + o Ca 2+ a tensione 4 , 5 . Tuttavia, le cellule epiteliali esprimono uniQue set di canali ionici e trasportatori che regolano i loro ruoli fisiologici specializzati, come il secreto e il trasporto dei nutrienti 6 . Diverse cellule epiteliali quindi possiedono caratteristiche elettriche caratteristiche. Ad esempio, le cellule principali esprimono il CFTR per il trasporto di fluidi e cloruri e esprimono il TRPV6 per il riassorbimento del calcio, mentre le cellule chiare esprimono la pompa protonica V-ATPasi per l'acidificazione lumina 1 , 7 , 8 , 9 . Sono stati riportati alcuni trasportatori e canali ionici che regolano le caratteristiche fisiologiche delle cellule epitidimali epiteliali, ma le proprietà funzionali delle cellule epitidimali non sono ancora state ancora comprese 10 , 11 , 12 , 13 .

WhLa registrazione di patch-clamp di olea-cell è una tecnica ben consolidata per esaminare le proprietà intrinseche di cellule eccitabili e non-eccitabili ed è particolarmente utile per studiare le funzioni delle cellule principalmente dissociate in campioni di cellule eterogenee; Il morsetto di tensione viene utilizzato per misurare le proprietà passive della membrana e le correnti ioniche delle singole cellule 14 , 15 . Le proprietà passive della membrana includono la resistenza di ingresso e la capacità. L'ex parametro indica la conduttanza intrinseca della membrana, mentre quest'ultima implica la superficie della membrana cellulare (un bilayer di fosfolipidi, dove sono posizionati canali ionici e trasportatori), che funge da sottile isolante che separa i media extracellulari e intracellulari). La capacità della membrana è direttamente proporzionale alla superficie della membrana cellulare. Insieme alla resistenza della membrana che si riflette dalla resistenza di ingresso, la costante di tempo della membrana, wChe indica quanto velocemente il potenziale della membrana cellulare risponde al flusso delle correnti del canale ionico, può essere determinato. A questo proposito, combinando le caratteristiche di risposta di corrente da una serie di passi di tensione applicati alle cellule, le cinetiche biofisiche e le proprietà delle cellule sono determinate 15 , 16 , 17 , 18 .

Nel presente documento descriviamo le procedure per l'isolamento delle cellule epiteliali dal ratto cauda epididymis e le fasi per misurare le proprietà delle membrane di differenti tipi di cellule nella miscela cellulare dissociata usando il patch-clamp di tutta la cellula. Mostriamo che le cellule principali epididimali presentano proprietà elettrofisiologiche distinte delle membrane e che le conduttanze possono essere facilmente identificate da altri tipi di cellule.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tutti gli esperimenti su animali vengono eseguiti in conformità alle linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di ShanghaiTech, che soddisfano i requisiti locali e internazionali.

1. Animali sperimentali

  1. Usi i topi Sprague-Dawley maschi adulti (~ 300-450 g) tra i 8-12 settimane. A questa età nei ratti, gli spermatozoi sono arrivati ​​negli epididimidi cauda.

2. Isolamento delle cellule epiteliali da Rat Epididimide di Cauda

NOTA: Le seguenti operazioni vengono eseguite in condizioni non asettiche, salvo diversa indicazione.

  1. Preparazione di strumenti di dissezione e reagenti
    1. Disinfettare gli strumenti di dissezione mediante immersione nel 70% di etanolo e lasciarli asciugare all'aria.
    2. Accendere il bagno di riscaldamento (32 ° C); Preparare e pre-riscaldare 500 ml di 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) integrato con 1% (v / v) antibio(100 U / mL penicillina e 100 μg / mL di streptomicina finale) e etichettato come "RPMI (+ P / S 1: 100)". Eseguire questo passaggio in una stazione di lavoro controllata con aria pulita.
    3. Preparare e preriscaldare 1x 500 mL di Medio Modulato Dulbecco (IMDM) Iscove contenente aminoacidi non essenziali (0,1 mM) e piruvato di sodio (1 mM) e integrato con 5-α-diidrotestosterone (1 nM), 10% di bovini fetali Siero, 1% (v / v) antibiotici (100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina finale) e etichettati come "Full-IMDM". Creare aliquote da 50 ml e sigillare con parafilm; Conservare a 4 ° C. Utilizzare condizioni asettiche.
    4. Preparare una soluzione di digestione dell'enzima di collagenasi sciogliendo collagenasi tipo I e collagenasi tipo II in RPMI (+ P / S 1: 100) ottenendo 1 mg / mL di ciascuna collagenasi nella soluzione. Filtro attraverso una membrana da 0,22 μm e contrassegnata come "Collagenase Solution". Tenere a temperatura ambiente (RT) fino all'uso. Regolare il volume della soluzione enzimatica basataSul peso dell'enzima; Il volume minimo richiesto per entrambi gli epididimidi cauda da un solo ratto è di 2 ml.
    5. Riempire un piatto da 35 mm con RPMI (+ P / S 1: 100).
  2. Dissezione di epididimide di cauda di caccia
    1. Sacrificare l'animale usando pentobarbital di sodio 85 mg / kg ip o utilizzando una camera di isoflurano fino a quando l'animale non risponde alla stimolazione a coda; Segui la dislocazione cervicale.
    2. Disinfettare l'addome inferiore pulendo con il 70% di etanolo, spingere delicatamente i due testicoli fino all'addome inferiore e quindi aprire l'addome inferiore vicino allo scroto.
    3. Raccogliere il grasso epididimo, disseccare tutti gli organi riproduttivi (testicoli, epididimidi e vas deferenti) e immergere nel piatto con RPMI (+ P / S 1: 100).
    4. Trasferire gli organi riproduttivi nel piatto con RPMI (+ P / S 1: 100) in una stazione di lavoro asettica.
    5. Disseccare i cauda epididimidi dai tessuti connettivi e grassi e dall'epiaCapsula didimale. Posizionare un'epididima con ~ 0,2 ml di soluzione collagenasi in un tubo da 1,5 ml. Pertanto questo passo in una stazione di lavoro controllata con aria libera.
  3. Dissociazione di singole cellule da epididimide di cauda di cauda
    1. Tagliare l'epididimide nella soluzione collagenasi utilizzando forbici fino a quando il tessuto diventa un liquido pasta. Sciacquare delicatamente le forbici con il resto della soluzione enzimatica (~ 0,8 mL) nel tubo da 1,5 mL.
    2. Mettere il tubo su un termomixer metallico per 30 minuti a 37 ° C con una velocità di scatto di 1.000 giri / min.
    3. Centrifugare la miscela di tessuto enzimatico a 30 xg a RT per 3 minuti e decantare il supernatante adesivo che contiene principalmente lo sperma.
    4. Resuspendere il pellet in 1 ml di Full-IMDM per abbattere tutta l'attività enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL contenente 49 mL RPMI (+ P / S 1: 100).
      NOTA: Facoltativamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso una membrana a maglia da 100 μm con triturat costantePer evitare grandi aggregati di cellule. Tuttavia, non utilizzare un filtro a maglia se è necessaria sospensione cellulare per aumentare i monostrati di cellule.
    5. Centrifugare la miscela cellulare a 30 xg a RT per 10 min; Decanta il surnatante.
    6. Resuspendere il pellet in 1 ml di Full-IMDM con triturazione delicata per almeno 5 min per dissociare singole cellule dalle miscele tissutali epididimali trattate enzimatiche.
  4. Separazione delle cellule epiteliali da altre cellule in condizioni asettiche
    1. Coltivare la sospensione cellulare su un piatto da 10 cm di Petri contenente Full-IMDM per almeno 8 ore o durante la notte, in un incubatore a 32 ° C in 5% CO 2 .
    2. Preparare in anticipo le copertine sterili mediante l'immersione in alcool al 100%. Asciugare l'aria e immergere in un piccolo volume del mezzo di coltura. Posizionare le copertine in piatti da 6 cm di coltura o in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
    3. La mattina successiva, raccogliere le cellule epiteliali dissociate raccolgendo delicatamente la sospensione cellulareSione dal piatto di Petri, costituito prevalentemente da cellule epiteliali. Centrifugare la sospensione cellulare a 30 xg a RT per 5 min e quindi decantare il surnatante.
    4. Resuspendere il pellet di cellule in ~ 2 mL di Full-IMDM.
    5. Sementa 0,2 ml della sospensione cellulare raccolta al centro di ogni coperchio sterile.
    6. Lasciare che la sospensione cellulare si depositi nella gocce di liquido per almeno 10 minuti per consentire alle cellule di aderire leggermente alle copertine di vetro. Aggiungete con attenzione 1 mL di Full-IMDM al bordo di un piatto da 10 cm o di 0,3 mL di Full-IMDM ad ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti; Non disturbare le celle.
    7. Mantenere le singole cellule isolate sui coperchi in incubatore a 32 ° C in 5% di CO 2 fino a quando gli esperimenti di patch-clamp.

3. Soluzioni di registrazione e micropipette

NOTA: Per gli esperimenti di patch-clamp, utilizzare le migliori sostanze chimiche e soluzioni di qualità.

  1. Preparazione di soluzioni di magazzino
    1. Autoclave tutte le bottiglie per l'immagazzinaggio di magazzino e filtrare tutte le soluzioni di magazzino (ad eccezione delle soluzioni corrosive) e filtrare con membrane da 0,22 μm prima dell'uso.
    2. Preparare in anteprima tutte le soluzioni di magazzino a RT e conservare a 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl 2; 100 mM CaCl 2; 200 mM NaH 2 PO 4 ; 100 mM EGTA (pH 7,0 con KOH). Maneggiare 5 M NaOH, 1 M HCl e 1 M KOH come soluzioni corrosive.
  2. Preparazione della soluzione salina fisiologica di registrazione esterna standard (PSS)
    1. Riscaldare le soluzioni di riserva a RT la mattina della registrazione di patch-clamp.
    2. Pipettare l'ingredienti da ogni stock in base al volume finale desiderato, tranne CaCl 2, ad esempio per preparare 500 mL di PSS: 140 mM NaCl = 14 mL di 5M; 5 mM KCl = 2,5 mL di 1 M; 1.2 mM MgCl 2 = 6 mL di 100 mM; 1,2 mM NaH 2 PO 4 = 3 ml di 200 mM.
    3. Aggiungi doppiaacqua -distilled (DDH 2 O) al volume finale di 400 mL ed equilibrata.
    4. Ponderare 0,9 g di glucosio e 1,19 g di HEPES e sciogliere completamente nella miscela di soluzione.
    5. Aggiungere il titolo CaCl 2 (2,5 mM = 12,5 ml di 100 mM) con agitazione.
    6. Aggiungi fino al 99% del volume finale.
    7. Regolare il pH a 7,4 utilizzando NaOH o HCl.
    8. Controllare l'osmolarità e regolare usando 5 M NaCl o glucosio, se necessario.
    9. Aggiungere ddH 2 O al volume finale di 500 mL in un cilindro.
  3. Preparazione di soluzioni interne a micropipette (basse soluzioni a base di EGTA K + )
    1. Pesare o pipettare il corretto volume dei reagenti ciascuno stock in base al volume finale desiderato e concentrazione, ad esempio per preparare 50 mL partire EGTA K + intracellulare sede soluzione ad un volume di circa 30 mL DDH 2 O: 100 mM K-gluconato = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 mL di 1 M; 2 mM MgCl 2 = 1 mLDi 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 mL di 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
    2. Aggiungere abbastanza acqua per ~ 95% del volume finale e permettere alla soluzione di equilibrare a RT. Assicurarsi che la soluzione sia chiara.
    3. Durante la miscelazione continua della soluzione, regolare il pH a 7,2 con KOH.
    4. Pesare e aggiungere 0,078 g di Mg-ATP alla soluzione fino a quando non viene completamente sciolto.
    5. Posizionare la soluzione sul ghiaccio e utilizzare una piccola aliquota per la misura dell'osmolarità; Tipicamente, le soluzioni misura ~ 290 mOsmol e non ha bisogno di aggiustamenti. Se l'osmolarità differisce significativamente da 280-295 mOsmol, preparare una nuova soluzione.
    6. Aggiungere ddH 2 O al volume finale.
    7. Dividere la soluzione in 500 μL di aliquote, filtrare con un filtro a siringa da 0,2 μm, sigillare e conservare immediatamente a ≤ -20 ° C.
    8. Alla data dell'esperimento patch-clamp, scongelare una aliquota di soluzione intracellulare sul ghiaccio e mantenerla refrigerata durante l'esperimento di patch-clamp perPrevenire il degrado.
  4. Tirare le pipette patch dai capillari di vetro (seguendo il manuale d'uso del puller pipetta) per ottenere dimensioni micropipette con resistenza di 5-10 M quando riempite con soluzione intracellulare.

4. Impostazione dell'esperimento Patch-Clamp e creazione di una configurazione intero a cellule

  1. Impostazione dell'esperimento patch-clamp
    1. Attivare il set di patch-clamp (computer, amplificatore controllato da computer, digitalizzatore, ecc. )
    2. Aprire il software patch-clamp ( ad es. AXON pCLAMP10 o HEKA PatchMaster) e impostare i protocolli per le registrazioni elettrofisiologiche. Impostare il filtro per il segnale a basso passaggio a 1-3 kHz e il digitalizzatore a 10-20 kHz.
    3. Accendere la fotocamera, il micromanipolatore e la sorgente luminosa.
    4. Quando l'amplificatore controllato dal computer è acceso, messa a terra il corpo dello sperimentatore toccando con mano la striscia di patch-clamp che è stata messa a terra,Prima di toccare il headstage, per proteggerlo da scosse elettriche.
    5. Trasferire le cellule epiteliali colturali sulla copertura in vetro alla camera di registrazione riempita di ~ 1 ml di standard PSS a RT. Cambiare attentamente il bagno PSS almeno due volte utilizzando una pipetta prima di ogni esperimento di patch-clamp.
      NOTA: Facoltativamente, riempire il sistema di perfusione con PSS standard o un'altra soluzione esterna in base all'esperimento previsto. Perfuse la camera di registrazione a microscopio (RC-26G o RC-26GLP) con PSS poche volte ad una velocità di ~ 2 mL / min prima di avviare gli esperimenti di patch-clamp. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate lungo il sistema di perfusione.
    6. Visualizzare e selezionare le celle sotto un microscopio invertito con obiettivi da 10x e 40x dotati di un sistema ottico di contrasto differenziale di disturbo. Cercare grandi singole celle isolate per la registrazione. Identificare le cellule epitidimali isolate per la loro forma sferica con mIcrovilli su un'estremità delle membrane e distribuzione polarizzata di contenuti intracellulari ( Figura 1 ).
    7. Utilizzando una siringa da 1 ml (un ago in microsiringa non metallica fatta in casa), riempire una micropipetta con la soluzione interna (basata su EGTA K + , vedere la fase 3.3). Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella micropipetta, che possono aumentare la resistenza della micropipetta. Utilizzare una soluzione sufficiente affinché la soluzione interna immerga l'elettrodo di filo d'argento rivestito con cloruro all'interno del porta micropipetta.
    8. Montare la micropipetta nel supporto dell'elettrodo e applicare una bassa pressione positiva (~ 0,2 ml di volume della siringa). Tenere la bassa pressione positiva continua fino a toccare la membrana cellulare nei passaggi successivi.
  2. Stabilire la configurazione di celle intere con le celle per le registrazioni
    1. Immergere la pipetta nella soluzione del bagno alla massima velocità del micromanipolatore. Trovate la pipettaPunta sullo schermo collegato alla fotocamera digitale; Rallentare la velocità del micromanipulator verso la modalità medio-alta.
    2. Controllare rapidamente la resistenza micropipetta (5-10 MΩ) utilizzando il comando dell'interfaccia di acquisizione dati ( ad es. "Test della membrana" nel sistema AXON) applicando una fase di tensione ( ad es. 5 mV per 100 ms) generata dall'amplificatore controllato dal computer. Cambiare su una nuova micropipetta se la resistenza è notevolmente fuori da questa gamma.
    3. Inizia a spostare verso il basso l'obiettivo montato sul microscopio; Gradualmente guidare la micropipetta verso la cella selezionata. Abbassare sempre l'obiettivo in primo luogo e quindi abbassare la micropipetta al piano di messa a fuoco, finché la micropipetta non supera la superficie centrale della cella selezionata.
    4. Annullare il potenziale di giunzione del liquido tra le pipette e le soluzioni dei bagni a zero utilizzando il comando "pipette offset" nell'interfaccia comandi del software.
    5. Impostare l'amplificatore comm controllato dal computerAnder al morsetto di tensione e la prova della membrana alla modalità "Bath".
    6. Messa a fuoco fine per una visione più chiara della cella, quindi gradualmente abbassare la micropipetta utilizzando il micromanipolatore a bassa e media velocità.
    7. Quando la micropipetta è vicina alla cella (dimostrata da una corrente diminuita quando viene attivata dal comando di prova a membrana), rimuovere immediatamente la bassa pressione positiva e applicare una pressione negativa negativa (0,1 ml di siringa volume) per formare il gigaseale (> 1 GΩ) .
    8. Monitorare la resistenza con il test della membrana. Se la resistenza è> 500 MΩ ma <1 GΩ, applicare un potenziale negativo (di solito come potenziale di mantenimento impostato a -60 mV), che può contribuire a formare il gigaseo. Compensare la corrente capacitiva transitoria della micropipetta.
    9. Se la tenuta è> 1 GΩ e stabile (come mostrato nell'interfaccia software), applicare una aspirazione corta e forte per rompere la membrana cellulare. Non applicare una compensazione per il seLa resistenza dei ries e la capacità cellulare.
    10. Immediatamente dopo aver raggiunto una configurazione di cella intero di successo, applicare un passo di iperpolarizzazione di 10 mV (5 tracce con intervalli di tempo minimi, durata di 20 ms, campione di segnale a 20 kHz) da un potenziale di holding di -60 mV.
    11. Passare la modalità di tensione alla modalità a zero corrente e contrassegnare le letture dall'interfaccia software o eseguire una registrazione senza interruzioni (10-60 s) per le letture potenziali della membrana della cella.
    12. Rapidamente tornare indietro e rimanere in modalità tensione e applicare i protocolli di tensione secondo gli esperimenti pianificati e misurare le risposte correnti. La sottrazione non viene applicata alla corrente di perdita intrinseca durante le registrazioni.
    13. Monitorare la stabilità delle risposte durante le registrazioni oi diversi parametri della cella. Ad esempio, utilizzare l'interfaccia di comando "Test a membrana" per controllare la resistenza di ingresso (R i ), la resistenza di serie (R s ) e la cellaCapacità di membrana (C m ) nel test della membrana in modalità "Cella" durante l'interruzione dei protocolli.
      NOTA: Le gocce improvvise nella resistenza di ingresso sono di solito indicative di una patch sciolta e un drammatico aumento della resistenza di serie può indicare la intasamento delle punte di micropipetta dagli organi intracellulari o da frammenti di membrana. Durante la registrazione, controllare regolarmente la posizione del micropipette per verificare se si verifica una deriva, che può portare alla perdita della patch. Se la deriva è un problema, sollevare attentamente la micropipetta e la cella di taglio lontano dalla parte inferiore della camera di registrazione. Questo passaggio può talvolta portare alla perdita della patch, nel qual caso, è necessario ripetere la procedura di patch-clamp intere cellule.

5. Analisi delle proprietà elettrofisiologiche passive delle cellule

  1. Dopo aver ottenuto i dati dagli esperimenti di patch-clamp, aprire i dati vuoti nel software Clampfit e misurare la mediaValore per il potenziale di membrana di riposo per ogni cella. In alternativa, utilizzare il valore contrassegnato dalla tensione di zero corrente nella modalità corrente. Correggere i valori con il potenziale di giunzione del liquido (12,4 mV in questo studio).
  2. Aprire i dati dalla fase di iperpolarizzazione da 10 mV (ΔV) ottenuti da una cella, misurare la differenza di corrente prima e durante il passo ( fase I ) e calcolare la resistenza di ingresso (R i ) utilizzando l'equazione come:
    Equazione 1
  3. Calcolare la capacità cellulare (C m , in unità di pF) (utilizzare gli stessi dati correnti dal passo di iperpolarizzazione 10-mv integrando l'area totale sotto la corrente del condensatore di membrana durante la corrente iniziale di decadimento iniziale sollevata sul trigger di tensione) Per ottenere il valore della carica totale accumulata (Q, in unità di pA • ms) della cella. Utilizzare la seguente equazione:
    Equazione 2
  4. Calcolare il valore della resistenza di serie (R s ) per ciascuna cella inserendo la corrente transitoria iniziale dal passo negativo di 10 mV con un algoritmo esponenziale standard per ottenere la corrente di decadimento della costante di tempo ( T , in unità di ms) e utilizzare il Seguente equazione:
    Equazione 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La procedura di digestione enzimatica descritta per l'isolamento delle cellule epiteliali provenienti dai rasi di epididimide cauda è un protocollo modificato dei nostri precedenti studi 9 , 12 . Questo metodo produce una miscela di singole cellule con più di 90% di vitalità e senza blister di superficie o volume di cellule gonfie. La miscela cellulare eterogenea è costituita principalmente da cellule principali, cellule chiare e cellule basali, come abbiamo descritto in precedenza 1 . In questo protocollo, campioni relativamente puro di cellule epitidimali epiteliali possono essere ottenute coltivando le prime cellule dissociate per via notturna su un piatto di Petri per consentire l'adesione delle cellule non epiteliali (come fibroblasti e cellule lisce) sul piatto, come Dimostrato nella figura 1A (prima del raccolto). I tipi cellulari possono quindi essere preliminarmente distinti dai loro fenotipi sotto il microscopioE classificati in base alle proprie proprietà passive della membrana. Nella miscela cellulare dissociata, vi è un gruppo di cellule che hanno microvilli o una membrana ruvida su una estremità della loro membrana superficiale e contenuti polarizzati cellulari; Queste sono definite le cellule principali o le cellule chiare ( figura 1B , frecce). Queste cellule epiteliali polarizzate sono indistinguibili dalle loro caratteristiche morfologiche ma possono essere identificate in base alle loro proprietà passive della membrana e alle risposte di conduttività ottenute dalle registrazioni patch-clamp intere cellule. L'altro gruppo di cellule è più piccolo in dimensioni, senza stereocilia su una estremità della membrana e nessun apparente cellulare cellulare polarizzato; Queste sono definite come le cellule no-microvilli e consistono principalmente di cellule basali ( figura 1B , asterischi).

Le principali cellule epiteliali primarie possono essere distinte da altre celluleIr proprietà di membrana passiva distinte ( Figura 2 ) e schemi correnti ( Figura 3 ) in risposta al protocollo di tensione applicato utilizzando la tecnica della patch-clamp a cellule intere. Le proprietà elettrofisiologiche delle membrane passive delle cellule possono aiutare a valutare lo stato di salute iniziale di singole cellule e di gruppi di cellule. Nella Figura 2A è riportata una sintesi dei singoli punti della capacità della membrana (C m ), della resistenza di ingresso (R m ) e del potenziale della membrana (V m ) di ciascun gruppo di cellule. Non c'è differenza nella costante di tempo per la capacità della membrana tra i vari tipi di cellule (~ 0.4 ms) (i dati non sono dimostrati in questo manoscritto). Utilizzando la bassa soluzione EGTA K + , la capacità media della membrana misurata per le cellule principali è di 9,4 0,5 pF (n = 32) e per le cellule chiare è 9,7 1,9 pF (n = 12). La capacità della membrana diLe cellule no-microvilli sono di 5,2 0,8 pF (n = 17), che è statisticamente più piccolo rispetto ai principali e alle capacità membrane delle cellule chiare.

La resistenza di ingresso delle celle principali della Figura 2A (pannello centrale) è di 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) e quella delle celle chiare è 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), significativamente inferiore (P <0,001) Quella delle cellule no-microvilli (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Come descritto nella figura 2A (pannello a destra), il potenziale di membrana della corrente zero ( vale a dire il potenziale di membrana di riposo V m ) è stato misurato poco dopo l'istituzione della configurazione delle cellule intere e utilizzato per confrontare i gruppi dopo la correzione con potenziale di giunzione liquido (12.4 mV). Le cellule venivano bagnate normalmente in standard PSS e dializzate con soluzione a pipetta 0,1 mM EGTA K + contenente ATP. Il mIl potenziale di membrana delle cellule principali è -26 ± 2 (n = 28), tra -51 mV e +1 mV e il potenziale di membrana medio delle cellule chiare è -30 ± 3 mV (n = 10) Tra -47 mV e -17 mV. Le cellule no-microvilli possiedono il potenziale di membrana medio più alto con un valore di -33 ± 5 mV (n = 17), tra -63 mV e -13 mV.

La bassa resistenza di ingresso delle celle principali suggerisce che ci siano condutture intrinseche in queste cellule, ma potrebbe indicare la perdita della tenuta tra la pipetta e le membrane delle cellule patch. Per affrontare questa preoccupazione, abbiamo prima escluso i dati da queste cellule con cambiamenti improvvisi (indicativi di una perdita di tenuta) delle proprietà elettriche durante le registrazioni. Poi abbiamo analizzato la correlazione tra la resistenza di tenuta ad una soglia di 1 giga-ohm con la resistenza di ingresso, come dimostrato nella figura 2B . Il risultato è stato un valore di correlazione molto basso (R 2 ≈ 0,02). Ciò suggerisce che la resistenza di tenuta ha un'influenza trascurabile sulla resistenza di ingresso e che le proprietà elettriche passive delle diverse celle (come la bassa resistenza di ingresso delle cellule principali) sono le proprietà intrinseche di queste cellule.

La Figura 3A è la risposta tipica corrente registrata dalle cellule principali in condizioni quasi fisiologiche con le cellule che si bagna in soluzione salina fisiologica normale (PSS), dializzato con una bassa pipetta a base di EGTA K e stimolata da un potenziale di tenuta di -60 mV Ad una serie di tensioni di prova di 500 ms (da -120 mV a +60 mV come indicato nell'inserto di Figura 3B ). I due tracciati di Figura 3C mostrano le tipiche risposte della membrana di riposo di una cella principale identificata sotto il morsetto a corrente zero in presenza di, oAssenza di ATP nella soluzione pipetta. In presenza di ATP, il potenziale di riposo è relativamente stabile. Mentre è stata osservata un'iperpolarizzazione progressiva quando le cellule venivano dializzate con una soluzione di pipetta senza ATP. Il potenziale iniziale della membrana di riposo misurato all'inizio della dialisi cellulare con soluzioni pipette non mostra alcuna differenza significativa nelle cellule con o senza ATP ( Figura 3D ), suggerendo che i valori misurati siano ancora intatti e minimamente influenzati dalle soluzioni pipettate.

Figura 1
Figura 1 : Caratteristiche morfologiche delle cellule epiteliali epididimali cauda epidui. ( A, B ) Esempi di cellule epiteliali isolate dagli epididimidi del cauda di caccia prima di ( A ) e dopo ( B ) re-harvest di ovaCultura del resto sul piatto prima degli esperimenti di patch-clamp. Le frecce indicano le cellule microvilli, che sono costituite principalmente dalle cellule principali e dalle cellule chiare. Gli asterischi indicano le cellule no-microvilli. Solo le singole cellule sono state selezionate per la registrazione patch-clamp. Barra di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : Proprietà passive della membrana delle cellule epiteliali epididimali caudali. ( A ) Punti di punti delle proprietà delle membrane passive delle cellule epiteliali epididimali caudali singolo. La soluzione di pipetta è basata su EGTA K + e la soluzione da bagno è standard PSS. ( B ) Analisi di correlazione della resa di ingressoIstance con la resistenza alla tenuta delle cellule. NS : nessuna differenza significativa, * P <0.05, ** P <0.01 *** P <0.001 differenza significativa rispetto ai controlli appropriati usando ANOVA a senso unico con prova Bonferroni post-hoc. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 : Correnti tipiche delle cellule intere in singole cellule epididimali. ( A ) Le correnti tipiche delle cellule intere registrate da singole cellule epitidimali epiteliali registrate in condizioni quasi-fisiologiche usando un protocollo di impulso come mostrato nell'inserto di panal B. La linea tratteggiata indica i livelli di corrente zero. ( B ) La relazione corrente-tensione della risposta correnteEs misurati ai punti indicati in A. I dati sono i mezzi ± SEM di otto cellule principali da almeno tre animali. ( C ) Tracciati rappresentativi del potenziale di membrana riposo delle cellule principali dializzati con una soluzione di pipettazione, con ATP (+ ATP) o senza ATP (-ATP). ( D ) Un grafico a barre che non mostra alcuna differenza significativa tra il potenziale di membrana di riposo iniziale di + ATP e -ATP. I valori sono i valori ± SEM misurati all'ora indicata nel pannello C. I numeri nella parentesi all'interno delle barre indicano il numero di cellule testate da almeno tre animali. NS : nessuna differenza significativa. ( E ) Analisi di correlazione della resistenza del sigillamento e della resistenza di ingresso di tutte le cellule, o solo le cellule principali, rispetto alle membrane di riposo misurate al morsetto a corrente zero subito dopo l'insieme della cellula intera e le grandezze correnti misurate all'iperpolarizzante Passo a -100 mV dalla pressione potential. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In questo protocollo, la dispersione enzimatica dei cauda epididimidi di ratto ha fornito costantemente cellule epiteliali sane. La qualità delle cellule epitidimali epiteliali per gli esperimenti di patch-clamp dipende da alcuni passi critici del protocollo. Per esempio, la centrifugazione della miscela cellulare a bassa forza centrifuga (30 xg) è importante per eliminare lo spermatozoo e il contenuto lumino epididimo; Le cellule epitidimali epiteliali diventano insalubre in presenza degli spermatozoi nella coltura cellulare. Inoltre, la coltura della miscela cellulare dissociata su un piatto di Petri per diverse ore è un passo importante per rimuovere i fibroblasti e le cellule muscolari lisce; Le cellule non epiteliali si aderiscono più velocemente sul piatto di coltura e, quindi, lasciano le cellule epiteliali nella sospensione, che possono essere riciclate con aspirazione dolce. Inoltre, la digestione e la triturazione di collagenasi con una pipetta di vetro fine sono i due passi importanti da sbloccareSingole celle durante la procedura di dissociazione cellulare. Infine, la digestione enzimatica delle cellule epididimali è fondamentale per l'esperimento di patch-clamp, poiché la sottodimensione dell'attività enzimatica inefficiente o l'eccesso di digestione per l'incubazione prolungata possono entrambi interrompere la formazione di giga-ohm tra la pipetta e le membrane cellulari.

Nelle miscele cellulari, le cellule in una forma più grande e colonna con una membrana ruvida che portano stereocilia su una estremità e la distribuzione polarizzata dei contenuti intracellulari sono presumibilmente le cellule principali o le cellule chiare. Altre cellule che non dispongono di microvilli prominenti e contenuti di cellule polarizzati possono includere le cellule basali e alcune cellule del sistema immunitario. Oltre a descrivere le caratteristiche morfologiche di base delle cellule epitidimali epiteliali, questo protocollo utilizza il metodo patch-clamp a cellule intere per misurare la proprietà passiva della membrana di ogni cellula. Queste proprietà della membrana permettono una distinzione preliminare diI tipi di celle. Questo metodo presenta alcune limitazioni come il lavaggio dei contenuti intracellulari con la soluzione pipettata e le variazioni elettroniche in relazione alle modifiche dell'architettura cellulare durante le registrazioni continue 19 , 20 . Forniamo solo i parametri che abbiamo misurato immediatamente dopo l'istituzione della configurazione cellulare intera, che riflette le condizioni iniziali, relativamente intatte delle cellule. Le proprietà membrane passive di ciascuna cella includono la capacità della membrana, la resistenza di ingresso e il potenziale di membrana di riposo.

La capacità specifica delle membrane cellulari è generalmente accettata per essere 1 μF / cm 2 e questo vale per le cellule (come le cellule immunitarie ei neuroni) con limitata piegatura sulle loro membrane cellulari 16 , 18 . Tuttavia, la specifica costanza di capacità è tesa ad essere maggiore per le cellule wCon più complesse architetture cellulari, come le cellule epiteliali, che hanno molte pieghe di membrana cellulare in compartimenti distinti. I rapporti indicano che i valori delle linee cellulari epiteliali MDCK sono 4 μF / cm 2 e 3 μF / cm 2 per le capacità specifiche della membrana apicale e basale, rispettivamente 17 . Nel presente studio, le capacità di membrana media misurate sono ~ 8 pF e ~ 12 pF per il gruppo di cellule no-microvilli e le cellule principali e gruppi di cellule chiare ( ossia microvilli-cellule) rispettivamente. Utilizzando la capacità specifica di 1 μF / cm 2 per i nostri calcoli, le superfici di superficie stimate sono di 500 μm 2 e 1.000 μm 2 per le cellule no-microvilli e le cellule microvilli corrispondenti ai diametri di 13 μm e 18 micron. Tuttavia, queste stime sono superiori a quelle previste sulla base delle dimensioni delle cellule sotto il microscopio, che sono ~ 81; m e ~ 12 micron per no-microvilli cellule e microvilli cellule, rispettivamente, e queste cellule sono circa 2,4 uF / cm 2 e 1,9 mF / cm 2, rispettivamente. I nostri risultati indicano che il paesaggio delle membrane di cellule no-microvilli è più complesso di quello delle cellule micro-villi, che è coerente con le loro funzioni di secrezione e trasporto.

La capacità specifica delle membrane cellulari è generalmente accettata per essere 1 μF / cm 2 e questo vale per le cellule (come le cellule immunitarie ei neuroni) con limitata piegatura sulle loro membrane cellulari 16 , 18 . Tuttavia, la costante di capacitanza specifica tende ad essere più grande per le cellule con più complesse architetture cellulari, come le cellule epiteliali, che hanno molte pieghe di membrana cellulare in compartimenti distinti. I rapporti indicano che i valori della linea cellulare epiteliale MDCK sono 4 μF / cm 2 e 3 μF / cm 2 17 . Nel presente studio, le capacità di membrana media misurate sono ~ 8 pF e ~ 12 pF per il gruppo di cellule no-microvilli e le cellule principali e gruppi di cellule chiare ( ossia microvilli-cellule) rispettivamente. Utilizzando la capacità specifica di 1 μF / cm 2 per i nostri calcoli, le superfici di superficie stimate sono di 500 μm 2 e 1.000 μm 2 per le cellule no-microvilli e le cellule microvilli corrispondenti ai diametri di 13 μm e 18 micron. Tuttavia, queste stime sono maggiori di quelle previste in base alle dimensioni delle cellule sotto il microscopio, sono ~ 8 μm e ~ 12 μm rispettivamente per le cellule microvilli e microvilli e queste cellule sono meglio compatibili con un valore specifico di capacità 2 μF / cm 2 . Ciò suggerisce che il paesaggio della membrana delle cellule epitidimali epiteliali è morComplesso di altri tipi di cellule, che è coerente con le loro funzioni di secrezione e trasporto.

Nelle registrazioni a cellule intere, la conduttanza di perdita attraverso la membrana e la tenuta tra la membrana e la pipetta hanno contribuito entrambe alle proprietà di membrana misurate. La guarnizione ha una resistenza significativamente superiore rispetto alla membrana e quindi ha una minima influenza sulla misura delle proprietà passive della membrana, come la resistenza di ingresso e il potenziale di membrana della corrente zero. Conformemente a questa nozione, l'analisi di correlazione della resistenza di tenuta ad una soglia di 1 giga-ohm contro la resistenza di ingresso di ciascuna cella ha portato un valore di ~ 0,02, suggerendo un'influenza molto debole. Ulteriori analisi di correlazione della resistenza alla tenuta o della resistenza di ingresso rispetto ai potenziali della membrana di riposo o all'ampiezza corrente misurata a -100 mV hanno anche dato bassi valori per tutte le cellule sperimentate o per le sole cellule principali. I nostri risultati deMostrano che la resistenza di ingresso delle cellule principali epididimali e delle cellule chiare è significativamente inferiore alle cellule no-microvilli, fornendo così un parametro preliminare per la valutazione per differenziare i tipi cellulari. Questi risultati suggeriscono che la bassa resistenza di ingresso nelle cellule principali è una proprietà fisiologica intrinseca delle cellule. Le singole cellule epiteliali dispongono inoltre di pattern di corrente distinti in risposta ai protocolli applicati e alle condizioni sperimentali. Abbiamo osservato che ogni tipo di cellule definito presentavano schemi di corrente univoco sotto lo stesso protocollo di tensione applicata. Un esempio mostrato in Figura 3 mostra le risposte correnti tipiche registrate dalle principali cellule in condizioni quasi fisiologiche, come abbiamo già riportato 9 . Le caratteristiche elettrofisiologiche di ogni tipo di cellula specializzata sono facilmente differenziate (i dati non sono mostrati in questo documento). Sulla base di questi parametri,I diversi tipi di cellule possono essere classificati approssimativamente nelle cellule principali, nelle cellule chiare e nelle cellule no-microvilli, come descritto nei risultati.

La resistenza di ingresso è la resistenza della membrana in risposta al passo potenziale applicato (step di iperpolarizzazione 10 mV in questo studio) ottenuto da un potenziale di tenuta di -60 mV. Questo riflette l'estensione dell'attività di canale aperto in risposta al potenziale applicato. A questo proposito, una bassa resistenza implica un'elevata conduttanza "di perdita" intrinseca delle cellule, mentre un'elevata resistenza implica canali chiusi. Il basso valore di resistenza di ingresso nelle celle principali corrisponde alla conduttanza prominente della membrana, mentre le cellule chiare, che possiedono una piccola conducibilità al potenziale di membrana di prova, implicano una moderata conducibilità nelle condizioni di registrazione. La resistenza di ingresso notevolmente elevata delle cellule no-microvilli implica che non dispongano di canali aperti in questo stato. Nello zero-cu, I potenziali mediali della membrana riposizionata delle cellule epiteliali misurate e isolate si trovano nell'intervallo 26-33 mV per i tre gruppi cellulari. Questi valori sono comparabili con il potenziale di membrana riportato (-30 mV) utilizzando il metodo del microelettrodo 21 . Tuttavia, i potenziali di riposo misurati variano notevolmente in singole cellule (da +3 mV a -63 mV) nonostante l'assenza di potenzialità di spettacolo spontaneo. Questa variazione può riflettere l'interazione delle diverse attività del canale ionico in vari tipi di cellule, come l'interazione combinata dei canali TRPV6 e TMEM16A nelle principali cellule, come abbiamo recentemente riportato 9 . Vale la pena notare che quando le cellule venivano dializzate con la pipetta ATP, non abbiamo osservato potenziali elettrici spontanei nelle cellule principali; Questo concorda con la classificazione delle cellule epiteliali come non-eccitabili 4 . Una iperpolarizzazione progressiva quando le cellule venivano dializzate con il piLa soluzione pette senza ATP può avere riflesso l'aspetto graduale di una corrente di potassio sensibile al ATP. È stato riferito che i canali di potassio sensibili all'ATP sono espressi nell'apparato Golgi delle cellule principali dell'epididimo del ratto e che l'esaurimento dell'ATP intracellulare porta all'attivazione dei canali K ATP 14 , 22 . Questa osservazione suggerisce che l'inclusione di ATP nella soluzione di pipetta favorisce le condizioni fisiologiche stabili delle cellule principali epididimali.

La tecnica della patch-clamp a cellule intere è un metodo ben consolidato che è comunemente usato per studiare l'elettrofisiologia di cellule eccitabili, come i neuroni. In questo lavoro abbiamo dimostrato che è anche uno strumento utile per la caratterizzazione delle proprietà bioelettriche di cellule non-eccitabili, come le cellule epiteliali. Inoltre, questo protocollo consente di effettuare indagini funzionali di epididim isolato primariLe cellule epiteliali al fine di chiarire ulteriormente il loro ruolo fisiologico nell'epididimo. Questo studio fornisce alcune proprietà elettriche preliminari delle cellule epiteliali isolate da cauda epididymis per aiutare le indagini future del comportamento fisiologico di queste cellule e della loro rilevanza biologica sottostante nell'epididimo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo il dottor Christopher Antos per i commenti utili sul testo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università di ShanghaiTech assegnati a Winnie Shum e dai finanziamenti della National Science Foundation di Cina (NNSFC n.331471370).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32, (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141, (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80, (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2, (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4, (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135, (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148, (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52, (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125, (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275, (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102, (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74, (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83, (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263, (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79, (2), 253-261 (2008).
Registrazioni Patch-clamp intere cellule delle cellule epiteliali primarie isolate dall&#39;epididimo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter