Summary
本発明者らは、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を測定するために、細胞分離および全細胞パッチクランプ記録を組み合わせたプロトコルを提示する。このプロトコルは、副睾丸の生理的役割をさらに解明するために、初代副睾丸上皮細胞の機能的特性の調査を可能にする。
Abstract
精巣上体は、精子の成熟および生殖に関する健康に不可欠な器官である。副睾丸上皮は、分子および形態学的特徴だけでなく生理学的特性においても区別される複雑に連結された細胞型からなる。これらの違いは、精巣上体内腔における精巣後精子の発生に必要な微小環境を共に確立する多様な機能を反映している。副睾丸上皮細胞の生物物理学的特性の理解は、生理学的および病態生理学的条件下での精子および生殖器の健康におけるそれらの機能を明らかにするために重要である。それらの機能的特性はまだ完全に解明されていないが、副睾丸上皮細胞は、細胞事象および単一細胞の膜特性を測定するためのツールであるパッチクランプ技術を用いて研究することができる。ここでは、細胞単離法および全細胞パッチクランプ法を用いて、ラット尾部精巣上体からの一次解離上皮細胞の電気的特性を確認してください。
Introduction
男性生殖管の精巣上体は、モザイク上皮細胞の層で裏打ちされた器官である。他の上皮組織と同様に、主細胞、清澄な細胞、基底細胞および免疫系およびリンパ系からの細胞を含む種々の細胞型の副睾丸上皮は、尿細管最前線で障壁として機能するよう協調して働き、精子成熟および生理学1、2、3のための細胞を支持します。したがって、これらの上皮細胞は、リプロダクティブ・ヘルスに必須の役割を果たす。
上皮細胞は、一般による電圧依存性Na +またはCa 2+チャネル4,5の欠如に、刺激を脱分極に応答して、全か無かの活動電位を生成することができない非興奮性の細胞とみなされます。しかし、上皮細胞はユニ分泌および栄養輸送などの特殊な生理的役割を調節するイオンチャネルおよび輸送体のセット6 。したがって、異なる上皮細胞は、特徴的な電気的特性を有する。例えば、主細胞は、流体及び塩化物輸送のためにCFTRを発現し、明確な細胞が管腔酸性1、7、8、9のためのプロトンポンプV-ATPアーゼを発現するのに対し、カルシウム再吸収のためのTRPV6を発現します。精巣上体上皮細胞の生理機能を調節するいくつかのトランスポーターおよびイオンチャネルが報告されているが、精巣上体上皮細胞の機能的特性は、主として、まだ10、11、12、13には理解されていません。
Whオレ細胞パッチクランプ記録は、興奮性細胞および非興奮性細胞の両方の固有特性を調べるための確立された技術であり、異種細胞試料中の主に解離した細胞の機能を研究するのに特に有用である。電圧クランプは、受動膜特性と単セル14、15のイオン電流を測定するために使用されます。受動的膜特性には、入力抵抗および容量が含まれる。前者のパラメータは固有膜コンダクタンスを示し、後者は細胞膜の表面積（細胞外および細胞内の媒体を分離する薄い絶縁体として働く、イオンチャネルおよび輸送体が位置するリン脂質二重層）を意味する。膜容量は、細胞膜の表面積に正比例する。入力抵抗によって反映される膜抵抗と共に、膜時定数w細胞膜電位がイオンチャネル電流の流れにどのくらい速く応答するかを示す指標を決定することができる。この点で、セルに印加される電圧の一連の工程からの電流応答特性を組み合わせることによって、細胞の生物物理学的動態及び特性は15、16、17、18を決定します。
本論文では、ラット尾部精巣上体から上皮細胞を単離するための手順、および全細胞パッチクランプを用いて解離した細胞混合物中の異なる細胞型の膜特性を測定するための工程を記載する。精巣上体の主要細胞は明確な膜電気生理学的特性を示し、コンダクタンスは他の細胞型から容易に同定できることを示す。
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Protocol
全ての動物実験は、ShanghaiTech University Institutional Animal Care and Use Committeeのガイドラインに従って実施され、これは国内外の要件を満たすものである。
1.実験動物
- 成熟雄Sprague-Dawleyラット（約300〜450g）を8-12週齢の間に使用する。ラットのこの年齢で、精子は尾部精巣上体に到着した。
ラット・カウダ・エピジディミドからの上皮細胞の単離
注記：以下の手順は、特に明記しない限り、無菌条件下で実施します。
- 解剖器具および試薬の調製
- 解離ツールを70％エタノールに浸して消毒し、空気乾燥させます。
- 温浴（32℃）を入れます。 1％（v / v）の抗生物質を補充した1x Roswell Park Memorial Institute 1640培地（RPMI）500mLを調製し、（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で標識し、「RPMI（+ P / S 1：100）」と表示した。この手順は、清潔なエアーフロー制御作業ステーションで行います。
- 非必須アミノ酸（0.1mM）およびピルビン酸ナトリウム（1mM）を含有し、5-α-ジヒドロテストステロン（1nM）、10％ウシ胎仔血清（1mM）を補充した1×500mLのイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM） 1％（v / v）抗生物質（100U / mLペニシリンおよび100μg/ mL最終ストレプトマイシン）で洗浄し、「Full-IMDM」として標識した。 50 mLアリコートを作り、パラフィルムで密封する。 4℃で保存する。無菌状態を使用する。
- コラゲナーゼタイプIおよびコラーゲナーゼタイプIIをRPMI（+ P / S 1：100）に溶解して、溶液中の各コラゲナーゼ1mg / mLを生じるように、コラゲナーゼ酵素消化溶液を調製する。 0.22μm膜を通してろ過し、「コラゲナーゼ溶液」としてマークする。使用するまで室温（RT）に保つ。酵素溶液の容量を調整する酵素の重量に対して; 1匹のラットの両方の尾副睾丸に必要な最小量は2mLである。
- RPMI（+ P / S 1：100）で35mmディッシュを満たす。
- ラット尾部精巣上体の解剖
- ペントバルビタールナトリウム85mg / kgを腹腔内投与するか、またはイソフルランチャンバーを使用して、動物が尾摘み刺激に応答しなくなるまで、動物を屠殺する。頚椎脱臼が続く。
- 下腹部を70％エタノールで拭いて消毒し、静かに2匹の精巣を下部腹部に押し込み、陰嚢近くの下部腹部を開きます。
- 精巣上体脂肪を拾い、全生殖器（精巣、精巣上体および精管）を摘出し、RPMI（+ P / S 1：100）で皿に浸す。
- RPMI（+ P / S 1：100）で皿の生殖器官を無菌作業ステーションに移す。
- 結合組織および脂肪組織からepididymidesを摘出し、epi異形カプセル。 1 mLの副睾丸を約0.2 mLのコラゲナーゼ溶液で1.5 mLのチューブに入れます。このステップを清潔な空気流量制御ワークステーションに行います。
- ラット尾部精巣上体から単細胞の解離
- 組織がペースト状の液体になるまで、細かいはさみを使用してコラゲナーゼ溶液中の精巣上体を切断する。はさみをゆっくりと1.5mLチューブの残りの（〜0.8mL）酵素溶液ですすぎます。
- チューブをメタルサーモミキサー上に37℃で30分間、1000rpmの振盪速度で置く。
- 酵素 - 組織混合物をRTで30xgで3分間遠心分離し、ほとんどが精子を含む粘着性の上清を傾瀉する。
- ペレットを1mLのFull-IMDMに再懸濁し、すべての酵素活性を消失させる。 49mLのRPMI（+ P / S 1：100）を含む50mLチューブに細胞懸濁液を移す。
注：必要に応じて、細胞懸濁液を100μmメッシュメンブレンに一定のトリチウムでろ過します大規模な細胞凝集を避けるためにイオン。ただし、増殖細胞単層の細胞懸濁液が必要な場合は、メッシュフィルターを使用しないでください。 - 室温で30分間、細胞混合物を10分間遠心分離する;上清を傾瀉する。
- 少なくとも5分間穏やかに磨り潰しながらペレットを1mL Full-IMDMに再懸濁し、酵素処理された副睾丸組織混合物から単一細胞を解離させる。
- 無菌条件下での他の細胞からの上皮細胞の分離
- Full-IMDMを含む10cmペトリ皿上で少なくとも8時間または一晩、細胞懸濁液を5％CO 2中の32℃のインキュベーター内で培養する。
- 100％アルコールに浸漬することにより、予め滅菌カバースリップを調製する。空気を乾燥させ、少量の培地に浸す。カバースリップを6cm培養皿または24ウェルプレートの単一ウェルに入れる。
- 翌朝、穏やかに細胞懸濁液を収集することによって解離した上皮細胞を回収する大部分は上皮細胞からなるペトリ皿からのものである。細胞懸濁液を室温で30xgで5分間遠心分離し、上清を傾瀉する。
- 〜2 mL Full-IMDMに細胞ペレットを再懸濁する。
- 採取した細胞懸濁液0.2mLを各無菌カバースリップの中心に置く。
- 細胞懸濁液を液滴中に少なくとも10分間置いて、細胞をガラスカバースリップに緩く付着させる。注意深く10 mLディッシュの端に1 mL Full-IMDMを、または24ウェルプレートの各ウェルに0.3 mL Full-IMDMを加えます。細胞を乱さないでください。
- パッチクランプ実験まで32℃、5％CO 2インキュベーター内のカバーガラス上に単離された単一細胞を保つ。
3.記録液とマイクロピペット
注：パッチクランプ実験では、最高品質の化学物質と溶液を使用してください。
- ストック溶液の調製
- ストック保存用にすべてのボトルをオートクレーブし、使用前にすべてのストック溶液（腐食性溶液を除く）をろ過し、0.22μmメンブレンでろ過する。
- 全てのストックRTに予め溶液、及び4 O Cで保存準備：5 MのNaCl; 1M KCl; 100mM MgCl 2 ; 100mM CaCl 2 ; 200mM NaH 2 PO 4 ; 100mM EGTA（pH7.0、KOH）。腐食性溶液として5M NaOH、1M HClおよび1M KOHストックを取り扱う。
- 標準的な外部記録生理食塩水（PSS）の調製
- パッチクランプ記録の朝、ストック溶液を室温に温める。
- CaCl 2を除く所望の最終容量に従って、 例えば 500mLのPSSを調製するために、各ストックから成分をピペットで採取する：140mMのNaCl = 14mLの5M; 5mM KCl = 2.5mLの1M; 1.2mM MgCl 2 = 100mMの6mL; 1.2mMのNaH 2 PO 4 = 3mLの200mM。
- ダブルを追加（ddH 2 O）を最終容量400mLになるまで加え、平衡化する。
- 0.9gのグルコースおよび1.19gのHEPESを秤量し、溶液混合物中に完全に溶解させる。
- 撹拌しながらCaCl 2ストック（2.5mM = 100mMの12.5mL）を添加する。
- 最終体積の99％を追加します。
- NaOHまたはHClを用いてpHを7.4に調整する。
- 浸透圧を確認し、必要に応じて5M NaClまたはグルコースを用いて調整する。
- シリンダー中でddH 2 Oを500mLの最終容量に加える。
- マイクロピペット内部溶液の調製（低EGTA K +ベースの溶液）
- 所望の最終容量および濃度に従って、各ストックからの正しい量の試薬を計量またはピペットで採取する（ 例えば 、50mLの低EGTA K +ベースの細胞内溶液を約30mLの容量に調製するため）ddH 2 O：100mM K-グルコン酸= 1.17g; 35mM KCl = 1M 1.75mL; 2mM MgCl 2 = 1mL100mMの濃度; 0.1mMのEGTA = 0.05mLの100mM; 10mM HEPES = 0.072g。
- 〜95％の最終容量に十分な水を加え、溶液を室温で平衡させる。ソリューションがクリアであることを確認します。
- 溶液を絶えず攪拌しながら、KOHを用いてpHを7.2に調整する。
- 0.078gのMg-ATPを秤量し、完全に溶解するまで溶液に加える。
- 溶液を氷上に置き、浸透圧の測定に少量のアリコートを用いる。典型的には、溶液は〜290mOsmolを測定し、調整する必要はない。オスモル濃度が280-295mOsmolと著しく異なる場合は、新しい解決法を用意する。
- 最終容量にddH 2 Oを加える。
- 溶液を500μLアリコートに分け、0.2μmシリンジフィルターでろ過し、密封して直ちに-20℃以下で保存します。
- パッチクランプ実験の日付に、細胞内溶液の1つのアリコートを氷上で解凍し、パッチクランプ実験中に冷却したままにする。劣化を防ぐ。
- パッチピペットをガラス製の毛細管から引き出し（ピペットプラーユーザーズマニュアルに従ってください）、細胞内溶液で満たされたときに5-10Mの抵抗を有するマイクロピペットサイズを得る。
4.パッチクランプ実験のセットアップと細胞による全細胞構成の確立
- パッチクランプ実験のセットアップ
- パッチクランプセットアップ（コンピュータ、コンピュータ制御アンプ、デジタイザなど ）の電源を入れます。
- パッチクランプソフトウェア（ 例えば、 AXON pCLAMP10またはHEKA PatchMaster）を開き、電気生理学的記録のためのプロトコールを設定する。信号のフィルタを1~3 kHzでローパス、デジタイザを10~20 kHzに設定します。
- カメラ、マイクロマニピュレータ、光源の電源を入れます。
- コンピュータ制御アンプがオンになっているときは、接地されたパッチクランプリグを手で触れて実験者の身体を接地し、感電から保護するために、ヘッドステージに触れる前に。
- ガラスカバースリップ上の培養上皮細胞を、室温で〜1mLの標準PSSで満たされた記録チャンバーに移す。パッチクランプ実験の前に、入浴PSSをピペットで少なくとも2回慎重に交換してください。
注記：必要に応じて、計画された実験に従って標準PSSまたは別の外部ソリューションで潅流システムを満たします。パッチクランプ実験を開始する前に、顕微鏡マウントされた記録チャンバー（RC-26GまたはRC-26GLP）を〜2mL /分の速度で数回PSSで灌流する。灌流システムに沿って気泡が閉じ込められていないことを確認します。 - 差動干渉コントラスト光学系を備えた10倍および40倍対物レンズを使用して、倒立顕微鏡下で細胞を表示および選択する。大きな単一の単離された細胞を記録のために探す。単離された精巣上皮細胞を、球状の粗いmで同定する膜の一端にあるミクロビリと細胞内の内容物の分極分布（ 図1 ）。
- 1 mLシリンジ（自家製の非金属マイクロシリンジ針）を使用して、マイクロピペットに内部溶液（低EGTA K +ベースの溶液、ステップ3.3を参照）を充填する。マイクロピペットに気泡がないことを確認し、マイクロピペットの抵抗を高めることができます。内部溶液がマイクロピペットホルダー内の塩化物被覆銀ワイヤー電極を浸漬するのに十分な溶液を使用する。
- マイクロピペットを電極ホルダーに取り付け、低正圧（〜0.2 mLシリンジ容量）をかけます。後のステップで細胞膜に触れるまで、低陽性の圧力を続けてください。
- 録音用のセルで全セル構成を確立する
- ピペットをマイクロマニピュレーターの最高速度の浴溶液に浸します。ピペットを見つけるデジタルカメラに接続された画面の先端。マイクロマニピュレータの速度を中速モードにまで遅くします。
- 迅速にコンピュータ制御増幅器から発生する電圧ステップ（ 例えば 100ミリ秒5 MV）を適用することによって、データ収集インターフェースコマンド（軸索システムにおいて、例えば 「膜テスト」）を用いてマイクロピペットの抵抗（5-10MΩ）を確認。抵抗がこの範囲外に大きくなると、新しいマイクロピペットに変更してください。
- 顕微鏡に取り付けられた対物レンズを下ろし始めます。徐々にマイクロピペットを選択された細胞の方に導く。マイクロピペットが選択されたセルの中心面の上に来るまで、常に目的を下げてから、マイクロピペットを焦点面に下ろします。
- ソフトウェアのコマンダーインターフェースで「ピペットオフセット」コマンドを使用して、ピペットと浴の溶液間の液体接合電位をゼロに戻します。
- コンピュータ制御のアンプを設定する電圧クランプおよび膜試験から「バス」モードに移行する。
- 細胞のより明瞭な視野のために細かい焦点を合わせ、その後、低中速でマイクロマニピュレーターを用いて徐々にマイクロピペットを下げる。
- マイクロピペットが細胞に近接しているとき（メンブレン試験コマンドによってトリガーされたときに電流が減少することにより示される）、すぐに低陽性圧力を除去し、弱い負圧（0.1mLシリンジ容量）を適用して、 。
- メンブレンテストで抵抗を監視する。抵抗が500MΩ以上で1GΩ未満の場合は、負の電位（通常は-60 mVに設定された保持電位）を印加します。これはギガシールの形成を助けます。マイクロピペットの過渡的な容量性電流を補償する。
- シールが> 1GΩ以上で安定している場合（ソフトウェアインタフェースで示されているように）、細胞膜を破壊するために短時間で強く吸引してください。あなたのために補償を適用しないでください抵抗とセル容量を低減します。
- 成功した全細胞構成を達成した直後に、-60mVの保持電位から10mV過分極段階（最小時間間隔、20ms持続時間、20kHzでのシグナルサンプル）を適用する。
- 電圧モードをゼロ電流モードに切り替え、ソフトウェアインターフェースからの読み取り値をマークするか、または細胞の膜電位測定値のギャップフリー記録（10-60秒）を実行します。
- 電圧モードに素早く戻って電圧モードを維持し、計画された実験に従って電圧プロトコルを適用し、現在の応答を測定します。減算は、記録中に本来のリーク電流に適用されません。
- 記録中の応答の安定性、または細胞の異なるパラメータを監視する。たとえば、「膜試験」コマンドインターフェイスを使用して、入力抵抗（R i ）、直列抵抗（R s ）およびセルプロトコールの切り替え中の「細胞」モードでの膜試験における膜容量（C m ）。
注：入力抵抗の急激な低下は、通常、緩いパッチを示し、直列抵抗の劇的な増加は、細胞内小器官または膜断片によるマイクロピペット先端の目詰まりを示し得る。記録中、マイクロピペットの位置を定期的に監視して、ドリフトが発生しているかどうかを確認します。これにより、パッチが失われる可能性があります。ドリフトが問題の場合は、マイクロピペットとパッチニングセルを一緒に持ち上げて、記録チャンバーの底から離してください。このステップでは、パッチが失われることがあります。この場合、セル全体のパッチクランプ手順を繰り返す必要があります。
5.細胞の受動電気生理学的性質の分析
- パッチクランプ実験からデータを得た後、Clampfitソフトウェアで空隙のないデータを開き、平均を測定する各細胞の休止膜電位の値。あるいは、現在のモードでゼロ電流電圧から下げた値を使用してください。液体接合電位（この研究では12.4mV）で値を補正する。
- 式などを用いて、入力抵抗（R i）を 、細胞から得られた10-mVの過分極工程（ΔV）からデータを開く（ΔIは ステップ ）の前、ステップ中の電流の差を測定し、計算します。
- セル容量（C m 、pF単位）を計算する（電圧ステップ・トリガで発生した最初の過渡減衰電流の間の膜コンデンサ電流の下の合計面積を積分することにより、10mV過分極ステップからの同じ電流データを使用する）。細胞の総蓄積電荷（pA・ms単位のQ）の値を得る。次の式を使用します。
- 10mVの負のステップからの初期過渡電流を標準指数アルゴリズムでフィッティングして時定数減衰電流（ T 、単位はms）を得ることによって、各セルの直列抵抗（R s ）の値を計算し、次の方程式：
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Representative Results
ラットカウダの精巣上体から上皮細胞を単離するための説明酵素消化手順は、我々の以前の研究9、12から修正されたプロトコルです。この方法は、90％以上の生存率を有し、表面ブリスターまたは膨潤した細胞容積のない単一細胞の混合物を産生する。我々は以前に1を記載しているように異種細胞混合物は、主に主細胞、明確な細胞および基底細胞からなります。このプロトコルでは、副睾丸上皮細胞の比較的純粋なサンプルは、ペトリ皿上で一次解離細胞を一晩培養して、非上皮細胞（線維芽細胞および平滑細胞など）を皿上に接着させることによって得ることができる。 図1A （収穫前）に示されている。細胞型は、顕微鏡下での表現型によって予備的に区別することができるそれらの特定の受動的な膜特性に従って分類される。解離した細胞混合物中には、それらの表面膜の一端に微絨毛または粗い膜を有し、偏極した細胞内容物を有する細胞群が存在する。これらは、主要細胞または透明な細胞と呼ばれる（ 図1B 、矢印）。これらの極性化した上皮細胞は、それらの形態学的特徴によって区別できないが、全細胞パッチクランプ記録から得られた受動的膜特性およびコンダクタンス応答に従って同定することができる。他の群の細胞は、膜の一端に立体虫症がなく、明らかに分極した細胞内容物もなく、サイズがより小さい。これらは非微小絨毛細胞と呼ばれ、主に基底細胞からなる（ 図1B 、アスタリスク）。
初代上皮細胞は他の細胞と区別することができます。全細胞パッチクランプ技術を用いた印加電圧プロトコルに応答して、明確な受動的膜特性（ 図2 ）および電流パターン（ 図3 ）を示す 。細胞の受動的膜電気生理学的特性は、個々の細胞および細胞タイプのグループの初期健康状態を評価するのに役立ち得る。各細胞群の膜容量（C m ）、入力抵抗（R m ）および膜電位（V m ）の個々のドットプロットの要約を図2Aに示す 。異なる細胞タイプ間で膜容量の時定数に差はありません（〜0.4ms）（データはこの原稿で示されていません）。低EGTA K +ベースの溶液を使用して、主要細胞の平均測定膜容量は9.4 ± 0.5pF（n = 32）であり、透明な細胞の場合、9.7±1.9pF（n = 12）である。膜の静電容量は非微絨毛細胞は、5.2±0.8pF（n = 17）であり、これは、主要なおよび透明な細胞膜の静電容量よりも統計的に小さい。
図2A （中央パネル）の主要セルの入力抵抗は1.1±0.2GΩ（n = 32）であり、クリアセルの入力抵抗は2.2±0.8GΩ（n = 12）であり、これは有意に低い（P <0.001） （8.9±2.1GΩ; n = 17）のものであった。 図2A （右のパネル）に示すように、ゼロ電流膜電位（ すなわち 、静止膜電位V m ）を、全細胞構成を確立した直後に測定し、補正後の群を液体接合電位（12.4 mV）。細胞を標準的なPSSで日常的に浸し、ATPを含む0.1mM EGTA K +ベースのピペット溶液で透析した。 m主細胞の膜電位は-51mV〜+ 1mVの間で-26±2（n = 28）であり、透明な細胞の平均膜電位は-30±3mV（n = 10）であり、 -47mVと-17mVの間である。非微絨毛細胞は、-63mVと-13mVとの間で、-33±5mV（n = 17）の値を有する最も高い平均膜電位を有する。
主要細胞の低い入力抵抗は、これらの細胞に固有のコンダクタンスがあることを示唆しているが、ピペットとパッチ細胞膜との間のシールの漏れを示す可能性がある。この懸念に対処するために、我々は最初に、記録中の電気特性の急激な変化（シール漏れを示す）を有するセルからデータを除外した。次に、 図2Bに示すように、1ギガオームのスレッショルドでのシール抵抗と入力抵抗との相関を分析しました。結果は、非常に低い相関値であった（R 2 ≒0.02）。これは、シーリング抵抗が入力抵抗に無視できる影響を及ぼし、様々なセルの報告された受動的電気特性（主セルの低入力抵抗など）がこれらのセルの固有の特性であることを示唆しています。
図3Aは、準生理学的条件下で主要細胞から記録された正常な生理学的塩溶液（PSS）中に浸漬し、低EGTA Kベースのピペット溶液で透析し、-60mVの保持電位から刺激した細胞の典型的な電流応答である一連の500ms試験電圧（ 図3Bの挿入図に示すように-120mV〜+ 60mVの範囲）に変換する。 図3Cの2つのトレースは、またはの存在下でゼロ電流クランプ下で同定された主要細胞の典型的な静止膜応答を示すピペット溶液中にATPが存在しない。 ATPの存在下では、静止電位は比較的安定である。一方、ATPを含まないピペット溶液で細胞を透析すると、進行性の過分極が観察された。ピペット溶液による細胞透析開始時に測定された最初の休止膜電位は、ATPありまたはなしで細胞に有意差を示さず（ 図3D ）、測定値はそのままでピペット溶液の影響をほとんど受けないことが示唆された。
図1 ：単離したラット尾部上皮細胞の形態学的特徴。 （ A、B ）ラット尾部精巣上体から単離された上皮細胞の例（ A ）および後（ B ）の再収穫パッチクランプ実験に先立ち、皿上で夜の培養を行った。矢印は、主に主要細胞と透明な細胞からなる微小絨毛細胞を示す。アスタリスクは無マイクロビリ細胞を示す。パッチクランプ記録のために選択された細胞は1つだけであった。スケールバー=10μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：単回ラット尾副睾丸上皮細胞の受動的膜特性。 （ A ）単回ラット尾副睾丸上皮細胞の受動的膜特性の点プロット。ピペット溶液は低EGTA K +ベースであり、入浴溶液は標準PSSである。 （ B ）入力resの相関分析セルのシール抵抗との関係。 NS ：有意差なし、* P <0.05、** P <0.01 *** Bonferroni post-hoc検定での一元配置ANOVAを用いた適切な対照との有意差p <0.001。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 ：単一の副睾丸原細胞における典型的な全細胞電流。 （ A ）単一の副睾丸上皮細胞から記録された典型的な全細胞電流を、準生理学的条件下で、パールBの挿入図に示すようなパルス誘発プロトコールを用いて記録した。点線はゼロ電流レベルを示した。 （ B ）電流応答の電流 - 電圧関係少なくとも3匹の動物からの8つの主要細胞の平均±SEMである。 （ C ）ATP（+ ATP）またはATP（-ATP）のいずれかを用いて、ピペット溶液で透析した主要細胞の静止膜電位の代表的な追跡。 （ D ）+ ATPおよび-ATPの初期静止膜電位の間に有意差を示さない棒グラフ。値は、パネルCに示された時点で測定された平均±SEMである。バー内の括弧内の数字は、少なくとも3匹の動物からの試験細胞の数を示す。 NS ：有意差なし。 （ E ）全細胞の確立直後のゼロ電流クランプで測定された休止膜に対する全細胞または主要細胞のみの封止抵抗および入力抵抗の相関分析および過分極時に測定された現在の大きさ保持pから-100mVまでステップする事実。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルにおいて、ラット尾部精巣上体の酵素的分散は、一貫して健常な上皮細胞を産生した。パッチクランプ実験のための副睾丸上皮細胞の質は、プロトコルのいくつかの重要なステップに依存する。例えば、低遠心力（30×g）での細胞混合物の遠心分離は、精子および精巣上体内腔の内容物を除去するために重要である。精巣上体細胞は、細胞培養中の精子の存在下では不健康になる。さらに、解離した細胞混合物をペトリ皿上で数時間培養することは、線維芽細胞および平滑筋細胞を除去するための重要なステップである。非上皮細胞は培養皿上でより速く接着し、上皮細胞を懸濁液中に残し、穏やかな吸引によって再収穫することができる。さらに、コラゲナーゼ消化および細かいガラスピペットによる粉砕は、放出するための2つの重要なステップである細胞解離手順の間に単細胞である。最後に、非効率的な酵素活性による過小消化または長期インキュベーションによる過消化は、ピペットと細胞膜との間のギガオームシール形成を妨害する可能性があるため、精巣上体細胞の酵素消化がパッチクランプ実験にとって重要である。
細胞混合物では、一方の末端に立体虫を有し、細胞内の内容物の極性分布を有する粗い膜を有するより大きな柱状の細胞が、主細胞または透明細胞であると考えられる。顕著な微小絨毛および分極した細胞の内容物を持たない他の細胞には、基底細胞および免疫系由来のいくつかの細胞が含まれ得る。副睾丸上皮細胞の基本的な形態学的特徴を記述することに加えて、このプロトコールは全細胞パッチクランプ法を用いて各細胞の受動的膜特性を測定する。これらの膜特性は、細胞の種類。この方法は、ピペット溶液と連続録音19、20時セルラーアーキテクチャの変更に関連する電子ばらつきを有する細胞内内容物の洗い出しなどのいくつかの制限を有します。我々は、全細胞構成の確立直後に測定したパラメータのみを提供し、これは細胞の初期の比較的インタクトな状態を反映する。各セルの受動的膜特性には、膜容量、入力抵抗および休止膜電位が含まれる。
細胞膜の比容量は、一般に、1μF/ cm 2であることが合意され、これは、それらの細胞膜16,18上の限られた折り畳み有する（例えば、免疫細胞および神経細胞など）の細胞にも当てはまります。しかしながら、比静電容量定数は、セルw別個の区画に多くの細胞膜折り畳みを有する上皮細胞のような、より複雑な細胞構造を有する。 MDCK上皮細胞株の値はそれぞれ、17頂端および基底膜の特定の容量のために4μF/ cm 2で3μF/ cm 2であることをレポートを示しています。現在の研究では、測定された平均膜容量は、非微小絨毛細胞群および主要細胞および透明様細胞群（ すなわち、微小絨毛細胞）のそれぞれ〜8pFおよび〜12pFである。我々の計算のために1μF/ cm 2の比容量を用いて、推定の細胞表面領域は13ミクロンと18の直径に対応する、それぞれ、非微絨毛細胞および微絨毛細胞について500μmの2〜1,000μm2でありますμmである。しかし、これらの推定値は、顕微鏡下での細胞サイズに基づいて予測されたものよりも大きく、約81、mおよび約12μmであり、これらの細胞はそれぞれ約2.4μF/ cm 2および1.9μF/ cm 2である。本発明者らの結果は、非 - 毛嚢胞細胞の膜の造形が、それらの分泌および輸送機能と一致する微小絨毛細胞のそれよりも複雑であることを示す。
細胞膜の比容量は、一般に、1μF/ cm 2であることが合意され、これは、それらの細胞膜16,18上の限られた折り畳み有する（例えば、免疫細胞および神経細胞など）の細胞にも当てはまります。しかしながら、特異的容量定数は、別個の区画に多くの細胞膜折り畳みを有する上皮細胞のような、より複雑な細胞構造を有する細胞でより大きくなる傾向がある。報告は、MDCK上皮細胞株の値が4μF/ cm 2および3μF/ cm 2であることを示している 、17のために。現在の研究では、測定された平均膜容量は、非微小絨毛細胞群および主要細胞および透明様細胞群（ すなわち、微小絨毛細胞）のそれぞれ〜8pFおよび〜12pFである。我々の計算のために1μF/ cm 2の比容量を用いて、推定の細胞表面領域は13ミクロンと18の直径に対応する、それぞれ、非微絨毛細胞および微絨毛細胞について500μmの2〜1,000μm2でありますμmである。しかし、これらの見積もりは、顕微鏡下での細胞サイズに基づいて予想されたものよりも大きく、非微小絨毛細胞および微小絨毛細胞でそれぞれ約8μmおよび約12μmであり、これらの細胞は比静電容量値2μF/ cm 2である 。これは、副睾丸上皮細胞の膜の広がりがmorであることを示唆している他の細胞型よりも複雑であり、分泌および輸送機能と一致する。
全細胞記録では、膜を横切るリークコンダクタンスと膜とピペットの間のシールの両方が、測定された膜特性に寄与した。シールは膜よりもかなり高い抵抗を有しているので、入力抵抗およびゼロ電流膜電位などの受動的膜特性の測定に最小限の影響しか及ぼさない。この概念と一致して、各セルの入力抵抗に対する1ギガオームの閾値でのシール抵抗の相関分析は、〜0.02の値をもたらし、非常に弱い影響を示唆した。シール抵抗または入力抵抗対休止膜電位または-100mVで測定された電流強度のさらなる相関分析も、全ての試験細胞または主要細胞のみについて低い値を与えた。私たちの結果de精巣上体の主要細胞および透明な細胞の入力抵抗が非 - 微絨毛細胞よりも有意に低く、したがって細胞型を判別するための判断のための予備的パラメータを提供することを示す。これらの結果は、主要細胞における低い入力抵抗が細胞の固有の生理学的特性であることを示唆している。単一の上皮細胞はまた、適用されたプロトコールおよび実験条件に応答して異なる電流パターンを有する。我々は、それぞれの定義された細胞タイプが、同一の印加電圧プロトコルのもとで独特な電流パターンを示したことを観察した。我々は、以前9に報告したように、図3に示す例では、擬似生理的条件下で主細胞から記録された典型的な電流応答を示します。各特殊細胞型の電気生理学的特徴は容易に区別される（データはこの論文では示されていない）。これらのパラメータに基づいて、結果に記載されているように、異なる細胞タイプは、主要細胞、透明様細胞および無細胞であることに大別することができる。
入力抵抗は、-60mVの保持電位から引き出された印加電位ステップ（この研究では10mV過分極ステップ）に応答する膜抵抗である。これは、適用された可能性に応じたオープンチャネルの活動の程度を反映しています。この点に関して、低抵抗はセルの高い固有の「漏れ」コンダクタンスを意味し、高抵抗は閉じたチャネルを意味する。主要細胞における低い入力抵抗値は顕著な膜コンダクタンスに対応するが、試験膜電位で小さなコンダクタンスを有する透明な細胞は、記録条件下での適度なコンダクタンスを意味する。非マイクロビリ細胞の著しく高い入力抵抗は、この状態では開チャネルを有していないことを示唆している。ゼロ-cu測定された単離された上皮細胞の平均静止膜電位は、3つの細胞群について26〜33mVの範囲にある。これらの値は、微小電極法21を用いて報告された膜電位（-30mV）と同等である。しかしながら、測定された休止電位は、自発的なスパイク電位が存在しないにもかかわらず、個々のセル（+ 3mVから-63mV）で大きく変化する。我々は、最近9報告されているように、この変化は、主細胞におけるTRPV6とTMEM16Aチャネルの結合相互作用のような種々の細胞型における異なるイオンチャネル活動の相互作用を反映することができます。細胞をATPピペットで透析すると、主細胞に自発的な電位は観察されなかったことに留意することは価値がある。これは、非興奮性の4としての上皮細胞の分類に一致する。細胞がπで透析されたときの進行性の過分極ATPを含まないペレット溶液は、ATP感受性カリウム電流の漸進的な出現を反映している可能性がある。 ATP感受性カリウムチャネルは、細胞内ATPの枯渇は、K ATPチャンネル 14、22の活性化をもたらすことラット精巣上体の主細胞のゴルジ装置において発現していることが報告されています。この観察は、ピペット溶液中にATPを含めることが、精巣上体の主要細胞の安定した生理的条件を支持することを示唆している。
全細胞パッチクランプ技術は、ニューロンなどの興奮性細胞の電気生理学を研究するために一般的に使用されている確立された方法である。この論文では、上皮細胞などの非興奮性細胞の生物学的特性の特徴付けにも有用なツールであることを示しました。さらに、このプロトコールは、一次単離エピピディムの機能的調査を可能にする副睾丸におけるそれらの生理学的役割をさらに解明することができる。この研究は、これらの細胞の生理的挙動および副睾丸におけるそれらの根底にある生物学的関連性の将来的な調査を助けるために、ラット尾部精巣上体から単離された上皮細胞のいくつかの予備的電気特性を提供する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
私たちは、このテキストに関する有益なコメントをいただいたChristopher Antos博士に感謝します。この作業は、上海テクニカル大学（Winnie Shum）に授与された創立資金と、中国自然科学財団（NNSFC no。31471370）からの資金提供によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
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