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Developmental Biology

부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

우리는 쥐 cauda epididymides에서 일차 해부 상피 세포의 전기적 특성을 측정하기 위해 세포 격리와 whole-cell patch-clamp recording을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 epididymis의 생리적 인 역할을 더 해명하기 위해 원발성 부고환 상피 세포의 기능적 특성을 조사 할 수있게합니다.

Abstract

부고환은 정자 성숙과 생식 건강에 필수적인 기관입니다. 부고환 상피 세포는 분자와 형태 학적 특징뿐 아니라 생리 학적 특성에서도 뚜렷한 복잡하게 연결된 세포 유형으로 구성됩니다. 이러한 차이점은 부고환 내강에서 사후 정자의 발달에 필요한 미세 환경을 함께 구성하는 다양한 기능을 반영한다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특성에 대한 이해는 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건 하에서 정자 및 생식 건강에서의 기능을 밝히는데 중요하다. 그들의 기능적 특성은 아직 완전히 밝혀지지는 않았지만, 부고환 상피 세포는 단일 세포의 세포 성질 및 막 특성을 측정하기위한 도구 인 패치 클램프 기술을 사용하여 연구 할 수있다. 여기서 우리는 세포 분리 및 전체 세포 패치 클램프 기록 방법에 대해 설명합니다쥐 cauda epididymides에서 일차 분리 된 상피 세포의 전기적 특성을 확인하십시오.

Introduction

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남성 생식 기관의 부고환은 모자이크 상피 세포 층이 늘어서있는 기관입니다. 다른 상피 조직에서와 마찬가지로, 주요 세포, 클린 세포, 기저 세포 및 면역계 및 림프계로부터의 세포를 포함하는 부고환 상피의 다양한 세포 유형은 세관 최전선에서 장벽으로서 기능하도록 협조 된 방식으로 작용하며, 정자 성숙 및 생리학을위한 세포 지원 1 , 2 , 3 . 따라서 이러한 상피 세포는 재생산 건강에 필수적인 역할을합니다.

상피 세포는 일반적으로 전위가없는 Na + 또는 Ca 2+ 채널이 없기 때문에 탈분극 자극에 반응하여 모든 또는 전혀 작용하지 않는 전위를 생성 할 수없는 비 흥분성 세포로 간주됩니다 4 , 5 . 그러나, 상피 세포는 유니분비 및 영양소 운반과 같은 전문화 된 생리적 인 역할을 조절하는 이온 채널 및 운반자 세트 6 . 따라서 상이한 상피 세포는 특징적인 전기적 특성을 갖는다. 예를 들어, 주요 세포는 유체 및 염화물 수송을위한 CFTR을 표현하고 칼슘 재 흡수를위한 TRPV6를 발현하지만, 맑은 세포는 내강 산성화 1 , 7 , 8 , 9에 대해 양성자 펌프 V-ATPase를 발현합니다. 부고환 상피 세포의 생리 학적 특징을 조절하는 일부 전달자와 이온 채널이보고되었지만 부고환 상피 세포의 기능적 성질은 아직 많이 밝혀지지 않았다 10 , 11 , 12 , 13 .

ㅁㅁ올 셀 패치 - 클램프 기록은 흥분성 및 비 흥분성 세포의 본질 특성을 조사하기위한 잘 확립 된 기술이며 특히 이종 세포 샘플에서 주로 해리 된 세포의 기능을 연구하는데 유용합니다. 전압 클램프는 단일 막 14 15 의 수동 막 특성 및 이온 전류를 측정하는 데 사용됩니다. 수동 막 특성에는 입력 저항 및 커패시턴스가 포함됩니다. 전자의 매개 변수는 고유 멤브레인 컨덕턴스를 나타내지 만, 후자는 세포막의 표면적 (이온 채널 및 운반자가있는 인지질 이중층, 세포 외 및 세포 내 매체를 분리하는 얇은 절연체로 사용됨)을 의미합니다. 막 커패시턴스는 세포막의 표면적에 직접적으로 비례합니다. 입력 저항에 의해 반사되는 멤브레인 저항과 함께 멤브레인 시정 수 which는 세포막 전위가 이온 채널 전류의 흐름에 얼마나 빨리 반응 하는지를 나타낼 수 있습니다. 이와 관련하여, 세포에 적용된 일련의 전압 단계로부터의 전류 응답 특성을 조합함으로써, 생물 물리학 적 동력학 및 세포의 특성이 15 , 16 , 17 , 18로 결정된다 .

본 논문에서는 rat cauda epididymis로부터 상피 세포를 분리하는 절차와 whole cell patch-clamp를 사용하여 해리 된 세포 혼합물에서 각기 다른 세포 유형의 막 특성을 측정하는 단계를 설명한다. 우리는 부고환의 주요 세포가 명확한 막 전기 생리학 적 성질을 나타내며 컨덕턴스가 다른 세포 유형으로부터 쉽게 확인 될 수 있음을 보여줍니다.

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Protocol

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모든 동물 실험은 지역 및 국제 요구 사항을 충족하는 ShanghaiTech University 기관 동물 사용 및 사용위원회의 지침에 따라 수행됩니다.

1. 실험 동물

  1. 8-12 주 사이에 성인 수컷 Sprague-Dawley 쥐 (~ 300-450 g)를 사용하십시오. 쥐의이 나이에, 정자는 cauda epididymides에 도착했습니다.

2. 쥐 Cauda Epididymides에서 상피 세포의 분리

참고 : 달리 명시되지 않는 한 무균 조건에서 다음 단계를 수행합니다.

  1. 해부기구 및 시약 준비
    1. 해부 도구를 70 % 에탄올에 담가 소독하고 공기를 건조하게하십시오.
    2. 온난 욕을 켜십시오 (32 ° C); 1 % (v / v) 항체가 보충 된 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (RPMI) 500 mL를 준비하고 예열하십시오.tic (100 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 최종 스트렙토 마이신)로 표지하고 "RPMI (+ P / S 1 : 100)"로 표시 하였다. 깨끗한 공기 흐름 제어 작업장에서이 단계를 수행하십시오.
    3. 비 필수 아미노산 (0.1 mM)과 피루브산 나트륨 (1 mM)을 함유하고 5-α-dihydrotestosterone (1 nM), 10 % 태아 소를 첨가 한 1 x 500 mL Iscove Modified Dulbecco 's Medium (IMDM) 혈청, 1 % (v / v) 항생제 (100 U / mL 페니실린 및 100 ㎍ / mL 최종 스트렙토 마이신)로 표지하고, "Full-IMDM"으로 표지 하였다. parafilm으로 50 mL 분취 량을 만들고 밀봉하십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 무균 상태를 사용하십시오.
    4. 콜라게나 제 타입 I 및 콜라게나 제 타입 II를 RPMI (+ P / S 1 : 100)에 용해시켜 콜라게나 제 효소 분해 용액을 제조하여 용액 중의 각 콜라게나 제를 1 mg / mL로 만든다. 0.22 μm의 막을 통해 여과하고 "Collagenase Solution"으로 표시하십시오. 사용하기 전까지 실온 (RT)을 유지하십시오. 효소 용액의 부피 조절효소의 중량; 한 마리의 쥐에서 양 cauda epididymides에 필요한 최소한의 부피는 2 mL입니다.
    5. RPMI (+ P / S 1 : 100)로 35mm 접시를 채 웁니다.
  2. 쥐 cauda epididymides의 해부
    1. 동물이 꼬리 - 꼬집음 자극에 반응하지 않을 때까지 나트륨 pentobarbital 85 MG / kg의 IP를 사용하거나 isoflurane 챔버를 사용하여 동물을 희생; 자궁 경관 탈구로 따라 가라.
    2. 하복부를 70 % 에탄올로 소독하고 두 개의 고환을 하복부에 부드럽게 밀어 넣은 다음 하악 복부를 음낭 근처로 연다.
    3. epididymal fat을 집어 내고 생식 기관 (고환, epididymides 및 vas deferens) 전체를 해부하고 RPMI (+ P / S 1 : 100)로 접시에 담그십시오.
    4. RPMI (+ P / S 1 : 100)로 접시에있는 생식 기관을 무균 작동 스테이션으로 옮긴다.
    5. 결합 조직과 지방 조직 및 에피로부터 코다 (cauda) epididymides를 해부한다.didymal 캡슐. 1 mL의 부고환을 1.5 mL 튜브에 Collagenase Solution ~ 0.2 mL와 함께 놓습니다. 깨끗한 공기 흐름 조절 작업 스테이션에서이 단계를 수행하십시오.
  3. 쥐 cauda epididymides에서 단일 세포의 해리
    1. 조직이 풀과 같은 액체가 될 때까지 미세 가위를 사용하여 Collagenase Solution의 부고환을 잘라내십시오. 1.5 mL 튜브의 (~ 0.8 mL) 효소 용액으로 가위를 부드럽게 헹굽니다.
    2. 튜브를 금속 Thermomixer 위에 37 ℃에서 30 분 동안 놓고 1,000 rpm의 진동 속도로 놓습니다.
    3. RT에서 30 xg로 3 분간 효소 - 조직 혼합물을 원심 분리하고 대부분 정자가 들어있는 끈적 끈적한 상층 액을 버린다.
    4. 펠렛을 1 ML Full-IMDM에 Resuspend하여 모든 효소 활성을 끄십시오. 49 ML RPMI (+ P / S 1 : 100)가 들어있는 50 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하십시오.
      참고 : 선택 사항으로, 일정한 분무기가있는 100μm 메쉬 막을 통해 세포 현탁액을 걸러냅니다이온으로 큰 세포 집합체를 피할 수 있습니다. 그러나 성장 세포 monolayers에 대한 세포 현탁액이 필요한 경우 메쉬 필터를 사용하지 마십시오.
    5. 10 분 동안 실온에서 30 xg에서 세포 혼합물을 원심 분리하십시오; 상청액을 따라 내었다.
    6. 효소 처리 epididymal 조직 혼합물에서 단일 세포를 해리 적어도 5 분 동안 부드러운 발정과 1 ML 전체 IMDM에 펠렛을 Resuspend.
  4. 무균 상태에서 다른 세포의 상피 세포 분리
    1. 32 ° C 5 % CO 2 의 배양기에서 적어도 8 시간 또는 하룻밤 동안 Full-IMDM이 들어있는 10cm 페트리 접시에 세포 현탁액을 배양합니다.
    2. 100 % 알콜에 담그면 멸균 된 커버 슬립을 미리 준비하십시오. 공기를 건조시키고 소량의 배양액에 담그십시오. 6cm 문화 요리 또는 24 잘 접시의 단일 우물에 coverslips을 놓으십시오.
    3. 다음날 아침, 부드럽게 세포 suspen을 수집하여 dissociated 상피 세포를 수확대부분 상피 세포로 이루어져있는 페트리 접시의 시온. RT에서 30 xg로 5 분간 세포 현탁액을 원심 분리 한 다음 상층 액을 버린다.
    4. ~ 2 ML 전체 IMDM에 세포 펠렛을 Resuspend.
    5. 수확 한 세포 현탁액 0.2 ML 각 멸균 coverslip의 중심에 씨앗.
    6. 세포가 유리 coverslips에 느슨하게 고착 수 있도록 적어도 10 분 동안 액체 방울에 정착 세포하자. 조심스럽게 10 ML 접시의 가장자리에 1 ML 전체 IMDM을 추가하거나 0.3 ML 전체 IMDM 24 잘 접시의 각 우물에; 세포를 방해하지 마라.
    7. 패치 클램프 실험까지 32 % C 5 % CO 2 인큐베이터에서 coverslips에 고립 된 단일 세포를 유지.

3. 녹음 솔루션 및 Micropipettes

참고 : 패치 클램프 실험의 경우 최상의 품질의 화학 물질과 용액을 사용하십시오.

  1. 원액 준비
    1. 스톡 저장을 위해 모든 병을 오토 클레이브하고 사용하기 전에 0.22 μm의 멤브레인을 통해 모든 스톡 용액 (부식성 용액 제외)을 걸러 낸다.
    2. 실온에서 미리 모든 원액을 준비하고 4 o C에서 보관하십시오 : 5 M NaCl; 1M KCl; 100 밀리미터의 MgCl 2; 100 mM의 CaCl2를; 200 밀리미터의 NaH 2 PO 4; 100 mM EGTA (pH 7.0, KOH). 부식성 용액으로 5 M NaOH, 1M HCl 및 1M KOH 스톡을 취급하십시오.
  2. 표준 외부 기록 생리 식염수 용액 (PSS)의 제조
    1. 패치 - 클램프 기록의 아침에 주식 솔루션을 RT로 따뜻하게합니다.
    2. CaCl 2를 제외하고 원하는 최종 부피에 따라 각 원료에서 피펫을 만듭니다. : PSS 500mL를 준비 할 때 : 140mM NaCl = 5M 14mL; 5 mM KCl = 2.5 mL의 1M; 100 mm의 1.2 밀리미터의 MgCl 2 = 6 ㎖; 200 mM의 1.2 밀리미터의 NaH 2 PO 4 = 3 ㎖.
    3. 더블 추가(ddH 2 O)를 최종 부피 400 mL가되도록 가하여 평형화한다.
    4. 0.9 g의 포도당과 1.19 g의 HEPES를 칭량하고 용액 혼합물에 완전히 용해시킨다.
    5. 교반과 함께 CaCl 2 주식 (2.5 MM = 12.5 ML 100 MM)을 추가합니다.
    6. 최종 볼륨의 99 %까지 추가하십시오.
    7. NaOH 또는 HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
    8. 삼투압을 확인하고 필요한 경우 5 M NaCl 또는 포도당을 사용하여 조정하십시오.
    9. 실린더에서 최종 용적 500 mL에 ddH 2 O를 첨가한다.
  3. 마이크로 피펫 내부 용액 준비 (저 EGTA K + 기반 용액)
    1. 원하는 최종 부피 및 농도에 따라 각 스톡에서 시약의 정확한 부피를 측량 또는 피펫 팅하십시오 ( 예 : ~ 30 mL의 부피로 50 mL 저 EGTA K + 기반 세포 내 용액 준비 용). ddH 2 O : 100 mM K- 글루코 네이트 = 1.17g; 35 mM KCl = 1M 1.75 mL; 2 밀리미터의 MgCl 2 = 1 mL의100 mM; 0.1 mM EGTA = 100 mM의 0.05 mL; 10 mM HEPES = 0.072 g.
    2. 최종 부피의 ~ 95 %에 물을 충분히 넣고 용액을 실온에서 평형을 유지하도록합니다. 솔루션이 명확한 지 확인하십시오.
    3. 용액을 계속 저어 주면서 KOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정한다.
    4. 0.078 g Mg-ATP가 녹아 완전히 용해 될 때까지 용액에 넣는다.
    5. 얼음 위에 용액을 놓고 삼투압 측정을 위해 작은 분액을 사용하십시오. 일반적으로 용액은 ~ 290 mOsmol을 측정하므로 조정할 필요가 없습니다. osmolarity가 280-295 mOsmol과 크게 다르면 새로운 해결책을 준비하십시오.
    6. 최종 부피에 ddH 2 O를 첨가한다.
    7. 용액을 500 μL 분취 액으로 나누고 0.2 μm 주사기 필터로 필터를 단단히 밀봉하고 즉시 -20 ° C 이하에서 보관하십시오.
    8. 패치 클램프 실험 날짜에 얼음 속의 세포 내 용액의 한 분량을 해동시키고 패치 클램프 실험 동안 차가운 상태로 유지한다.성능 저하를 방지하십시오.
  4. 유리 모세 혈관에서 패치 pipettes (피펫 풀러 사용자 설명서) 다음 5 - 10 M의 micropipette 크기를 얻기 위해 세포 내 솔루션으로 가득 때 당겨.

4. 패치 클램프 실험 설정 및 셀로 전체 셀 구성 설정

  1. 패치 클램프 실험 설정하기
    1. 패치 클램프 설정 (컴퓨터, 컴퓨터 제어 증폭기, 디지타이저 )을 켜십시오 .
    2. 패치 클램프 소프트웨어 ( 예 : AXON pCLAMP10 또는 HEKA PatchMaster)를 열고 전기 생리 학적 기록을위한 프로토콜을 설정하십시오. 신호 필터는 1-3 kHz에서 로우 패스하고 디지타이저는 10-20 kHz에서 설정하십시오.
    3. 카메라, 마이크로 매니퓰레이터 및 광원을 켜십시오.
    4. 컴퓨터 제어 증폭기가 켜지면 접지 된 패치 클램프 장치를 손으로 만져 실험자 몸을 접지시키고,전기 충격으로부터 보호하기 위해 헤드 스테이지에 손을 대십시오.
    5. RT에서 표준 PSS ~ 1 ML로 가득 레코딩 챔버 유리 coverslip에 culturing 상피 세포를 전송합니다. 패치 클램프 실험 전에 조심스럽게 피펫을 사용하여 적어도 2 번 입욕 PSS를 변경합니다.
      참고 : 선택적으로 계획된 실험에 따라 표준 PSS 또는 다른 외부 솔루션으로 관류 시스템을 채 웁니다. 패치 - 클램프 실험을 시작하기 전에 현미경에 장착 된 기록 챔버 (RC - 26G 또는 RC - 26GLP)를 ~ 2mL / 분의 속도로 PSS로 몇 번 충만하십시오. 관류 시스템을 따라 갇힌 기포가 없는지 확인하십시오.
    6. 보기 및 차동 간섭 대비 광학 시스템을 갖춘 10X 및 40X 대물 렌즈를 사용하여 거꾸로 현미경에서 세포를 선택합니다. 녹음을 위해 큰 단일 고립 세포를 찾으십시오. 고립 된 부고환 상피 세포를 구형으로 거친 m으로 동정세포막의 한쪽 끝에있는 마이크로 빌리 (microvilli)와 세포 내 내용물의 분극 된 분포 ( 그림 1 ).
    7. 1 ML 주사기 (집에서 만든 nonmetallic microsyringe 바늘)를 사용하여 내부 솔루션 (낮은 EGTA K + 기반 솔루션, 단계 3.3 참조)와 micropipette을 작성하십시오. micropipette에 공기 방울이 없어야 micropipette의 저항력을 높일 수 있습니다. 내부 용액이 마이크로 피펫 홀더 내에 염화물로 코팅 된 은색 와이어 전극을 침몰 시키도록 충분한 용액을 사용하십시오.
    8. micropipette를 전극 홀더에 장착하고 낮은 양의 압력 (~ 0.2 ML 주사기 볼륨)을 적용합니다. 이후 단계에서 세포막을 만질 때까지 낮은 양성 압력을 계속 유지하십시오.
  2. 녹음 용 셀로 전체 셀 구성 설정
    1. micromanipulator의 최고 속도로 목욕 솔루션에 피펫을 담가. 피펫 찾기디지털 카메라에 연결된 화면의 팁; micromanipulator 속도를 중간 높이 모드로 천천히하십시오.
    2. 컴퓨터 제어 증폭기에서 생성 된 전압 단계 ( 예 : 5mV, 100ms)를 적용하여 데이터 획득 인터페이스 명령 ( 예 : AXON 시스템의 멤브레인 테스트)을 사용하여 마이크로 피펫 저항 (5 - 10MΩ)을 빠르게 점검하십시오. 저항이이 범위를 벗어나면 새로운 마이크로 피펫으로 변경하십시오.
    3. 현미경에 올려 놓은 목표물 아래로 움직이기 시작하십시오. 점차적으로 선택한 세포쪽으로 micropipette을 안내합니다. 먼저 피검자의 목적을 먼저 낮춘 다음, 마이크로 피펫이 선택된 셀의 중앙 표면 위에 올 때까지 초점면으로 마이크로 피펫을 내립니다.
    4. 소프트웨어의 지휘관 인터페이스에서 "pipette offset"명령을 사용하여 피펫과 목욕 용액 사이의 액체 접합 전위를 0으로 취소하십시오.
    5. 컴퓨터 제어 증폭기 통신 설정전압 - 클램프와 멤브레인 테스트를 "목욕"모드로 설정하십시오.
    6. 세포의 더 명확한 전망을위한 좋은 초점, 그리고 낮은 중간 속도로 micromanipulator를 사용하여 점차적으로 micropipette을 낮추십시오.
    7. micropipette가 세포에 가까울 때 (멤브레인 테스트 명령에 의해 트리거되었을 때 감소 된 전류로 나타남) 즉시 낮은 양성 압력을 제거하고 약한 음압 (0.1 mL 주사기 볼륨)을 적용하여 gigaseal (> 1 GΩ) .
    8. 멤브레인 테스트로 저항을 모니터링하십시오. 저항이 500MΩ 이상 1GΩ 미만인 경우 음극 전위 (일반적으로 -60mV로 설정된 유지 전위)를 적용하면 기가 제형을 형성하는 데 도움이됩니다. micropipette의 일시적인 용량 성 전류를 보상하십시오.
    9. 씰이 1 GΩ 이상이고 안정적이라면 (소프트웨어 인터페이스에서 볼 수 있듯이) 세포 멤브레인을 깨기 위해 간단하고 강한 흡입력을가하십시오. 그에게 보상을주지 마라.저항 및 셀 커패시턴스를 감소시킨다.
    10. 성공적인 전체 셀 구성을 달성 한 직후에 -60mV의 유지 전위에서 10mV 과분극 단계 (최소 시간 간격, 20ms 지속 시간, 20kHz 신호 샘플)를 적용하십시오.
    11. 전압 모드를 영 전류 모드로 전환하고 소프트웨어 인터페이스의 판독 값을 표시하거나 셀의 멤브레인 전위 판독 값에 대해 갭이없는 기록 (10-60 초)을 수행하십시오.
    12. 신속하게 다시 전압 모드로 전환하고 계획된 실험에 따라 전압 프로토콜을 적용하고 현재 응답을 측정합니다. 녹음 중에 내장 된 누설 전류에는 뺄셈이 적용되지 않습니다.
    13. 녹음 중에 응답의 안정성 또는 셀의 다른 매개 변수를 모니터링합니다. 예를 들어 "멤브레인 테스트"명령 인터페이스를 사용하여 입력 저항 (R i ), 직렬 저항 (R s ) 및 셀프로토콜 전환 동안 "셀"모드에서의 멤브레인 테스트에서의 멤브레인 커패시턴스 ( Cm ).
      참고 : 입력 저항의 갑작스런 하락은 일반적으로 느슨한 패치를 나타내며, 직렬 저항의 극적인 증가는 세포 내 세포 기관 또는 막 단편에 의한 마이크로 피펫 팁 막힘을 나타낼 수 있습니다. 기록하는 동안 정기적으로 마이크로 피펫 위치를 모니터링하여 표류가 발생하는지 확인하십시오. 이로 인해 패치가 손실 될 수 있습니다. 드리프트가 문제가되면 조심스럽게 마이크로 피펫과 패치 셀을 기록 챔버의 바닥에서 들어 올리십시오. 이 단계는 때로는 패치 손실을 초래할 수 있으며,이 경우 전체 셀 패치 클램프 절차를 반복해야합니다.

5. 세포의 수동 전기 생리 학적 특성 분석

  1. 패치 - 클램프 실험에서 데이터를 얻은 후 Clampfit 소프트웨어에서 gap-free 데이터를 열고 평균을 측정합니다각 세포에 대한 잔류 막 전위에 대한 값. 또는 전류 모드에서 제로 전류 전압에서 표시된 값을 사용하십시오. 액체 접합 전위 (이 연구에서는 12.4 mV)로 값을 보정하십시오.
  2. 셀에서 얻은 10-mV 과분극 단계 (ΔV)에서 데이터를 열고 단계 전 (Δ I 단계 ) 동안 전류 차이를 측정하고 방정식을 사용하여 입력 저항 (R i )을 계산합니다.
    방정식 1
  3. 셀 커패시턴스 ( Cm , pF 단위)를 계산합니다 (전압 스텝 트리거에서 발생한 초기 과도 전류 감소 동안 멤브레인 커패시터 전류 아래 총 면적을 통합하여 10mV 과분극 단계에서 동일한 전류 데이터 사용). 셀의 총 누적 된 전하량 (Q, pA • ms 단위)을 구하십시오. 다음 방정식을 사용하십시오.
    등식 2
  4. 시간 상수 쇠퇴 전류 ( T , ms / in)를 얻기 위해 표준 지수 알고리즘으로 10-mV 음 단계의 초기 과도 전류를 피팅하여 각 셀 직렬 저항 (R s ) 값을 계산하고 다음 방정식 :
    등식 3

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Representative Results

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래트의 카우 epididymides에서 상피 세포의 분리 기술의 효소 분해 과정은 이전 연구 9, 12에서 수정 된 프로토콜이다. 이 방법은 90 % 이상의 생존력과 표면 수포 나 부어 오름이없는 단일 세포의 혼합물을 생성합니다. 이질적인 세포 혼합물은 이전에 설명한 바와 같이 주로 주요 세포, 맑은 세포 및 기저 세포로 구성됩니다 1 . 이 프로토콜에서는, 부고화 상피 세포의 비교적 순수한 샘플은 접시에 비 상피 세포 (예 : 섬유 아 세포와 부드러운 세포)의 접착을 허용하기 위해 페트리 접시에 하룻밤 일차 해리 세포를 배양하여 얻을 수 있습니다 그림 1A (수확 전)에 나와 있습니다. 세포 유형은 현미경으로 그들의 표현형에 의해 예비 적으로 구별 될 수있다그들의 특정 수동 막 특성에 따라 분류된다. 해리 된 세포 혼합물에는 표층 막의 한쪽 끝에 미세 융모 (microvilli) 또는 거친 막 (membrane)이 있고 극성의 세포 내용물이있는 세포 군이있다. 이들은 주요 세포 또는 깨끗한 세포 ( 그림 1B , 화살표)라고합니다. 이러한 극성 상피 세포는 형태 학적 특징에 의해 구별 할 수 없지만 전체 세포 패치 클램프 기록에서 얻은 수동 막 특성 및 전도성 응답에 따라 식별 할 수 있습니다. 다른 그룹의 세포는 크기가 작아 막의 한쪽 말단에 고정도가없고 분명한 세포 성 내용물이 없습니다. 이들은 no-microvilli 세포라고 부르며, 대부분 기저 세포로 구성됩니다 ( 그림 1B , 별표).

1 차 상피 세포는 다른 세포와 구별 될 수있다.( 그림 2 ) 및 전류 패턴 ( 그림 3 )을 사용하여 전체 셀 패치 - 클램프 기술을 사용하여 적용된 전압 프로토콜에 응답합니다. 세포의 수동 막 전기 생리 학적 특성은 개별 세포 및 세포 유형 그룹의 초기 건강 상태를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 멤브레인 커패시턴스 (C를 m), 입력 저항 (R의 m) 각각의 셀 그룹의 막 전위 (V의 m)의 각각의 도트 플롯의 요약은도 2a에 주어진다. 서로 다른 세포 유형 (~ 0.4 ms) 사이에 막 정전 용량의 시간 상수에는 차이가 없습니다 (데이터는이 원고에서 설명하지 않음). 낮은 EGTA K + 기반 용액을 사용하면 주요 세포의 평균 막전 용량은 9.4 ± 0.5 pF (n = 32)이고 투명 세포의 경우 9.7 ± 1.9 pF (n = 12)이다. 막의 정전 용량no-microvilli 세포는 5.2 0.8 pF (n = 17)이며, 이것은 원칙적으로 세포막의 정전 용량보다 깨끗합니다.

그림 2A (중간 패널)의 주 셀의 입력 저항은 1.1 ± 0.2 GΩ (n = 32)이고 투명 셀의 입력 저항은 2.2 ± 0.8 GΩ (n = 12)이며 이는 매우 낮습니다 (P <0.001). (8.9 ± 2.1 GΩ, n = 17). 그림 2A (오른쪽 패널)에 표시된 바와 같이, 제로 전류 멤브레인 전위 ( , 휴식 멤브레인 전위 V m )는 전체 셀 구성을 확립 한 직후에 측정되었고, 보정 후 액체 접합 전위 (12.4 mV). 세포를 표준 PSS에서 일상적으로 목욕시키고 ATP가 함유 된 0.1 mM EGTA K + 기반 피펫 용액으로 투석 하였다. m주요 세포의 막 전위는 -51mV에서 +1mV 사이에서 -26 ± 2 (n = 28)이며, 투명 세포의 평균 막 전위는 -30 ± 3mV (n = 10)이며, -47mV와 -17mV 사이 비 - 미세 융모 세포는 -63 ± 5 mV (n = 17), -63 mV와 -13 mV 사이에서 가장 높은 평균 막 전위를 갖는다.

주요 세포의 낮은 입력 저항은 이러한 세포에 본질적인 컨덕턴스가 있음을 암시하지만 피펫과 패치 세포막 사이의 씰이 새어 나왔음을 나타낼 수 있습니다. 이러한 우려를 해소하기 위해 우리는 처음에 녹음 중에 전기적 특성의 급격한 변화 (봉인 누설 표시)가있는 셀에서 데이터를 제외했습니다. 그런 다음 그림 2B 에서와 같이 입력 저항과 임계 값 1 기가 - 옴에서의 씰링 저항 간의 상관 관계를 분석했습니다. 결과는 매우 낮은 상관 값이었습니다 (R 2 ≈ 0.02). 이것은 씰링 저항이 입력 저항에 미치는 영향이 무시할 만하며 다양한 셀의 주요 수동 전기 특성 (주요 셀의 낮은 입력 저항과 같은)이이 셀의 본질적인 특성이라는 것을 암시합니다.

그림 3A 는 정상 생리 식염수 (PSS)에서 입욕하고, 낮은 EGTA K 기반 피펫 용액으로 투석하고 -60 mV의 유지 잠재력에서 자극 한 준 생리 조건 하에서 주요 세포로부터 기록 된 전형적인 전류 반응이다 일련의 500ms 시험 전압 ( 그림 3B 의 삽입물에 표시된대로 -120mV에서 + 60mV까지). 도 3C 의 2 개의 트레이스 (tracing)는, 존재하는 경우 제로 전류 클램프 하에서 식별 된 주요 셀의 전형적인 휴지 막 응답을 도시한다.피펫 용액에 ATP가없는 것. ATP의 존재 하에서 휴식 잠재력은 상대적으로 안정적입니다. 반면 ATP가없는 피펫 용액으로 세포를 투석하면 진행성과 분극화가 관찰됩니다. 피펫 용액으로 세포 투석 초기에 측정 한 초기 휴식 막 전위는 ATP가 있거나없는 세포에서 유의 한 차이가 없었으며 ( 그림 3D ), 이는 측정 된 값이 여전히 손상되지 않았으며 피펫 용액에 의해 최소한 영향을 받았다는 것을 암시합니다.

그림 1
그림 1 : 고립 된 쥐 cauda epididymal 상피 세포의 형태 학적 특징. ( A, B ) 쥐 cauda epididymides에서 분리 된 상피 세포의 예 ( A )와 after ( B ) ove의 재 수확패치 - 클램프 실험 이전에 접시에 밤 문화. 화살표는 주로 주요 세포와 깨끗한 세포로 구성된 미세 세포를 나타냅니다. 별표는 비 - 미세 세포를 나타냅니다. 패치 클램프 기록을 위해 단 하나의 셀만 선택되었습니다. 눈금 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 단일 쥐 cauda epididymal 상피 세포의 수동 막 속성. ( A ) 단일 쥐 cauda epididymal 상피 세포의 수동 막 속성의 점을 그려. Pipette solution은 EGTA K + 기반이며 입욕 용액은 표준 PSS입니다. ( B ) 입력 해상도의 상관 분석세포의 씰 저항에 대한 저항. NS : Bonferroni post-hoc test와 함께 one-way ANOVA를 사용하는 적절한 대조군에 비해 유의 한 차이가 없음. * P <0.05, ** P <0.01 *** P <0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 단일 부고환의 주요 세포에서 전형적인 전체 세포 전류. ( A ) 단일 부고환 상피 세포에서 기록 된 전형적인 전체 세포 전류는 파넬 B의 삽 입시에 나타난 바와 같이 펄스 추출 프로토콜을 사용하여 준 생리 조건에서 기록했다. 점선은 제로 전류 수준을 나타냈다. ( B ) 전류 응답의 전류 - 전압 관계A에서와 같이 지시 된 시점에서 측정 된 데이터. 데이터는 적어도 3 마리의 동물로부터의 8 가지 주요 세포의 평균 ± SEM이다. ( C ) ATP (+ ATP) 또는 ATP (-ATP)가없는 피펫 용액으로 투석 된 주 세포의 휴식 막 전위의 대표적인 추적. ( D ) + ATP와 -ATP의 초기 휴식 막 전위간에 유의 한 차이가없는 막대 그래프. 값은 패널 C에 표시된 시간에서 측정 한 평균 ± SEM이다. 막대 내의 괄호 안의 숫자는 적어도 3 마리의 동물로부터의 시험 된 세포의 수를 나타낸다. NS : 큰 차이는 없다. ( E ) 전체 세포 설립 직후의 제로 전류 클램프에서 측정 한 휴식 세포막과 모든 세포, 또는 주요 세포 만의 밀봉 저항과 입력 저항의 상관 분석 및 과분극에서 측정 한 전류 크기 보류 p에서 -100 mV까지 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜에서, 쥐 cauda epididymides의 효소 분산 일관되게 건강한 상피 세포를 생산. 패치 - 클램프 실험을위한 부고환 상피 세포의 품질은 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계에 달려있다. 예를 들어, 낮은 원심력 (30 xg)에서 세포 혼합물의 원심 분리는 정자 및 부고환 내강을 제거하는 데 중요합니다. 부고환 상피 세포는 세포 배양에서 정자가 있으면 건강하지 못하게된다. 또한, 해리 된 세포 혼합물을 페트리 접시에서 수 시간 동안 배양하는 것은 섬유 아세포 및 평활근 세포를 제거하기위한 중요한 단계이다; 비 - 상피 세포는 배양 접시에서 더 빨리 부착하여 현탁액에 상피 세포를 남겨 두며 상피 세포는 부드러운 흡인으로 다시 수확 할 수 있습니다. 또한 콜라게나 제 소화 및 미세 유리 피펫으로 분쇄하는 것은 두 가지 중요한 단계입니다.세포 분리 절차 동안 단일 세포. 마지막으로 부고환 세포의 효소 소화는 패치 - 클램프 실험에 중요하다. 왜냐하면 비효율적 인 효소 활성에 의한 과소 소화 또는 장기간 배양에 의한 과도한 소화가 피펫과 세포막 사이의 기가 옴 밀봉을 방해 할 수 있기 때문이다.

세포 혼합물에서, 한쪽 끝이 입체 음모를 가지며 세포 내 내용물의 분극 된 분포를 지닌 거친 막을 갖는 더 큰 원주 모양의 세포는 주요 세포 또는 맑은 세포 일 것으로 추정됩니다. 저명한 microvilli와 분극화 된 세포의 내용물을 가지고 있지 않은 다른 세포는 기저 세포와 면역계의 일부 세포를 포함 할 수 있습니다. 부고환 상피 세포의 기본적인 형태 학적 특징을 설명 할뿐만 아니라,이 프로토콜은 각 세포의 수동 막 특성을 측정하기 위해 전체 세포 패치 - 클램프 방법을 사용합니다. 이러한 멤브레인 속성은 사전 구별을 허용합니다.세포 유형. 이 방법은 20, 19 연속 기록 중에 셀룰러 아키텍처 수정 관련 피펫 용액 및 전자 변형을 세포 내 내용물의 유실 등의 몇 가지 제한을 갖는다. 우리는 전체 세포 구성의 수립 직후 측정 한 매개 변수만을 제공합니다.이 매개 변수는 세포의 상대적으로 초기 상태를 반영합니다. 각 세포의 수동 멤브레인 특성에는 멤브레인 커패시턴스, 입력 저항 및 휴식 멤브레인 전위가 포함됩니다.

세포막의 특정 커패시턴스는 일반적으로 1μF / cm 2로 동의되며 이는 세포막 ( 16 , 18 )에서 폴딩이 제한된 세포 (예 : 면역 세포 및 뉴런)에 적용됩니다. 그러나, 비유 전율 상수는 셀 w뚜렷한 구획에 많은 세포막 주름을 가지고있는 상피 세포와 같은 더 복잡한 세포 구조. 보고서는 MDCK 상피 세포주 값 4 μF / cm 2 각각 17 선단 및 기저막 특정 용량 3 μF / cm 2임을 나타낸다. 현재의 연구에서, 측정 된 평균 막 정전 용량은 비 - 미세 융모 세포 그룹 및 주요 세포 및 클리어 - 유사 세포 그룹 ( 즉, 미세 융모 세포)에 대해 ~ 8 pF 및 ~ 12 pF이다. 우리의 계산을 위해 1 μF / cm 2의 비유 전율을 사용하여, 추정 된 세포 표면적은 무 - 마이크로 빌리 세포와 마이크로 빌리 세포에서 각각 500 μm 2 와 1,000 μm 2 이며, 이는 13 μm와 18 μm의 직경에 해당한다 μm이다. 그러나, 이러한 견적은 ~ 8 ​​인 현미경에서의 셀 크기를 기반으로 예상 한 것보다 큽니다.1; m 및 ~ 12 ㎛의 미세 융모 무 세포 및 미세 융모 셀들 각각 이들 세포는 각각 대략 2.4 μF / cm2로 1.9 μF / ㎠이다. 우리의 결과는 비 - 미세 융모 세포의 막 조형이 미세 - 융모 세포의 막 조영보다 복잡하며, 이는 분비 및 수송 기능과 일치한다는 것을 나타낸다.

세포막의 특정 커패시턴스는 일반적으로 1μF / cm 2로 동의되며 이는 세포막 ( 16 , 18 )에서 폴딩이 제한된 세포 (예 : 면역 세포 및 뉴런)에 적용됩니다. 그러나 특정 커패시턴스 상수는 뚜렷한 구획에 많은 세포막 주름을 가진 상피 세포와 같이 더 복잡한 세포 구조를 가진 세포에서 더 커지는 경향이 있습니다. 보고에 의하면 MDCK 상피 세포주 값은 4 μF / cm 2 및 3 μF / cm 2 17 . 현재의 연구에서, 측정 된 평균 막 정전 용량은 비 - 미세 융모 세포 그룹 및 주요 세포 및 클리어 - 유사 세포 그룹 ( 즉, 미세 융모 세포)에 대해 ~ 8 pF 및 ~ 12 pF이다. 우리의 계산을 위해 1 μF / cm 2의 비유 전율을 사용하여, 추정 된 세포 표면적은 무 - 마이크로 빌리 세포와 마이크로 빌리 세포에서 각각 500 μm 2 와 1,000 μm 2 이며, 이는 13 μm와 18 μm의 직경에 해당한다 μm이다. 그러나 이러한 추정치는 현미경 하에서의 세포 크기에 기초하여 예측 된 것보다 크며, 각각 비 - 미세 융모 세포 및 미세 융모 세포에 대해 ~ 8㎛ 및 ~ 12㎛이며, 이들 세포는 특정 커패시턴스 값 2 μF / cm 2. 이것은 epididymal 상피 세포의 막 조경은 more는 다른 세포 유형보다 복잡하여 분비 및 수송 기능과 일치합니다.

전체 세포 기록에서, 멤브레인을 가로 지르는 누설 컨덕턴스와 멤브레인과 피펫 사이의 밀봉 부 둘 다 측정 된 멤브레인 특성에 기여했습니다. 씰은 멤브레인보다 훨씬 더 높은 저항력을 가지므로 입력 저항 및 제로 전류 멤브레인 잠재력과 같은 수동 멤브레인 특성 측정에 최소한의 영향을 미칩니다. 이 개념과 일치하여 각 셀의 입력 저항에 대한 1 기가 - 옴 임계 값에서의 씰링 저항의 상관 관계 분석 결과 값은 ~ 0.02로 매우 약한 영향을 나타냅니다. 밀봉 저항 또는 입력 저항 대 휴식 막 전위 또는 -100 mV에서 측정 된 전류 크기의 추가 상관 관계 분석은 시험 된 모든 세포 또는 주 세포에 대해서도 낮은 값을 나타냈다. 우리의 결과 deepididymal 주 세포와 clear-like 세포의 입력 저항이 무 - microvilli 세포보다 현저히 낮아서 세포 유형을 구별하기위한 판단을위한 예비 매개 변수를 제공한다고 주장했다. 이러한 결과는 주요 세포의 낮은 입력 저항이 세포의 본질적인 생리 학적 특성임을 시사한다. 단일 상피 세포는 또한 적용된 프로토콜 및 실험 조건에 반응하여 별개의 전류 패턴을 갖는다. 우리는 각각의 정의 된 세포 유형이 동일한인가 전압 프로토콜 하에서 독특한 전류 패턴을 나타냄을 관찰했다. 우리는 이전에보고 한 바와 같이 (9)도 3에 나타낸 예는, 유사 - 생리적 조건 하에서 세포 주에서 기록 된 전형적인 전류 응답을 보여준다. 각 특수화 된 세포 유형의 전기 생리 학적 특성은 쉽게 구분됩니다 (데이터는이 백서에 표시되지 않음). 이러한 매개 변수를 기반으로,결과에 설명 된대로 다른 세포 유형을 대략 주 세포, 투명 세포 및 비 - 미세 세포로 분류 할 수 있습니다.

입력 저항은 -60 mV의 유지 포텐셜로부터 유도 된인가 된 전위 단계 (이 연구에서 10 mV 과분극 단계)에 대한 반응에서의 막 저항이다. 이것은 적용 가능성에 대한 개방 채널 활동의 정도를 반영합니다. 이와 관련하여, 낮은 저항은 셀의 고유 한 "누출"컨덕턴스를 의미하는 반면 높은 저항은 폐쇄 된 채널을 의미합니다. 주요 세포의 낮은 입력 저항 값은 탁월한 막 전도성에 해당하는 반면, 시험 막 전위에서 작은 전도도를 갖는 깨끗한 세포는 기록 조건 하에서 적당한 전도성을 의미합니다. 비 microvilli 세포의 현저하게 높은 입력 저항은이 상태에서 열린 채널이 없음을 의미합니다. 제로 - 큐에서3 가지 세포 군에서 측정 된 고립 상피 세포의 평균 휴식 막 전위는 26-33mV 범위에있다. 이 값은 microelectrode 방법 21을 사용하여보고 된 멤브레인 전위 (-30 mV)와 비교할 수 있습니다. 그러나 측정 된 휴식 잠재력은 자발적 스파이크 잠재력이 없음에도 불구하고 개별 세포에서 (+3 mV에서 -63 mV까지) 크게 다양합니다. 우리는 최근 9보고 같이이 변화는, 예컨대 주 셀과 TRPV6 TMEM16A 채널의 결합 상호 작용과 같은 다양한 종류의 세포에서 다른 이온 채널 활동의 상호 작용을 반영한다. 세포가 ATP 피펫으로 투석 될 때, 우리는 주요 세포에서 자발적 전위를 관찰하지 않았다는 것을 주목할 가치가있다. 이것은 비 흥분성 4 상피 세포의 분류와 일치한다. 세포가 파이로 투석 된 경우의 진행성 과분극ATP가없는 pette solution은 ATP에 민감한 칼륨 전류의 점진적인 출현을 반영했을 수도 있습니다. ATP- 민감성 칼륨 채널이 랫드 부고환의 주요 세포의 골지 조직에서 발현되고, 세포 내 ATP의 고갈은 K ATP 채널의 활성화를 유도한다는보고가있다 14 , 22 . 이러한 관찰은 피펫 용액에 ATP를 포함하면 부고환의 주요 세포의 안정된 생리 조건을 선호한다는 것을 시사한다.

전체 세포 패치 - 클램프 기술은 뉴런과 같은 흥분성 세포의 전기 생리학을 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 잘 확립 된 방법입니다. 이 논문에서는 상피 세포와 같은 비 흥분성 세포의 생체 전기 특성을 특성화하는 데 유용한 도구임을 보여 주었다. 또한,이 프로토콜은 일차 격리 epididym의 기능 조사를 가능하게합니다알 상피 세포가 부고환에서의 생리 학적 역할을 더욱 밝혀줍니다. 이 연구는 rat cauda epididymis로부터 격리 된 상피 세포의 예비적인 전기적 특성을 제공하여 이들 세포의 생리 학적 행동과 부고환에서의 생물학적 관련성에 대한 향후 연구를 돕고있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

본문에 대한 도움이되는 의견을 보내 주신 크리스토퍼 안토 스 박사님 께 감사드립니다. 이 작품은 위니 award에게 수여 된 상하이 테크 대학교 (ShanghaiTech University)로부터의 창업 자금과 중국 국립 자연 과학 재단 (NNSFC no. 31471370)의 자금 지원을 받았다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

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References

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부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록
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Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

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