Summary
Vi presenterer en protokoll som kombinerer celleisolasjon og helcelle patch-clamp opptak for å måle de elektriske egenskapene til de primære dissocierte epitelceller fra rotte cauda-epididymider. Denne protokollen tillater undersøkelse av funksjonelle egenskaper til primære epididymepitelceller for å belyse epididymis fysiologiske rolle.
Abstract
Den epididymis er et viktig organ for spermmåling og reproduktiv helse. Det epididymale epitelet består av introduserte celletyper som er tydelige, ikke bare i molekylære og morfologiske egenskaper, men også i fysiologiske egenskaper. Disse forskjellene gjenspeiler deres mangfoldige funksjoner, som sammen etablerer det nødvendige mikromiljøet for utvikling av post-testikulær sperma i det epididymale lumen. Forståelsen av de biofysiske egenskapene til de epididymale epitelceller er kritisk for å avdekke sine funksjoner i sperm og reproduktiv helse under både fysiologiske og patofysiologiske forhold. Selv om deres funksjonsegenskaper ennå ikke har blitt fullstendig uttalt, kan de epididymale epitelceller studeres ved hjelp av patch-clamp-teknikken, et verktøy for måling av de mobile hendelsene og membranegenskapene til enkeltceller. Her beskriver vi metodene for celleisolasjon og full-celle patch-clamp-opptak til megaSikker på de elektriske egenskapene til primære dissocierte epitelceller fra rotte cauda-epididymider.
Introduction
Epididymene i den mannlige reproduktive delen er et organ foret med et lag av mosaikkepitelceller. Som i andre epitelvev, fungerer de forskjellige celletyper av det epididymale epitelet, inkludert hovedceller, klare celler, basale celler og celler fra immunologiske og lymfatiske systemer, på en samordnet måte for å fungere som barrieren ved tubulefronten og som Bærende celler for spermadyring og fysiologi 1 , 2 , 3 . Således spiller disse epitelceller en viktig rolle i reproduktiv helse.
Epitelceller betraktes generelt som ikke-exciterbare celler som ikke er i stand til å generere all-of-none-actionpotensialer som svar på depolariserende stimuli, på grunn av mangel på spenningsgated Na + eller Ca 2+ kanaler 4 , 5 . Imidlertid uttrykker epitelceller uniQue sett av ionkanaler og transportører som regulerer sine spesialiserte fysiologiske roller, som sekresjon og næringsmiddeltransport 6 . Forskjellige epitelceller har derfor karakteristiske elektriske egenskaper. For eksempel uttrykker de primære cellene CFTR for væske- og kloridtransport og uttrykker TRPV6 for kalsiumreabsorpsjon, mens de klare celler uttrykker protonpumpen V-ATPase for luminal surgjøring 1 , 7 , 8 , 9 . Noen transportører og ionkanaler som regulerer de fysiologiske egenskapene til de epididymale epitelceller har blitt rapportert, men de funksjonelle egenskapene til epididymepitelceller er i stor grad ikke forstått 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-celle patch-clamp opptak er en veletablert teknikk for å undersøke de inneboende egenskapene til både ekstreme og ikke-excitable celler, og er spesielt nyttig for å studere funksjonene til primært dissocierte celler i heterogene celleprøver; Spenningsklemmen brukes til å måle de passive membranegenskapene og ionstrømmene av enkeltceller 14 , 15 . De passive membranegenskapene inkluderer inngangsbestandighet og kapasitans. Den tidligere parameter indikerer den indre membranledningen, mens sistnevnte innebærer overflatearealet til cellemembranen (et fosfolipid-dobbeltlag hvor ionekanaler og transportører er plassert, som tjener som en tynn isolator som separerer ekstracellulært og intracellulært medium). Membrankapasitansen er direkte proporsjonal med cellemembranets overflateareal. Sammen med membranmotstanden som reflekteres av inngangsbestandigheten, vil membrantidskonstanten, wSom indikerer hvor raskt cellemembranpotensialet reagerer på strømmen av ionkanalstrømmer, kan bestemmes. I denne forbindelse, ved å kombinere de nåværende responskarakteristikkene fra en serie spenningstrinn som påføres cellene, bestemmes den biofysiske kinetikk og egenskaper av cellene 15 , 16 , 17 , 18 .
I foreliggende papir beskriver vi prosedyrene for isolering av epitelceller fra rotte cauda-epididymis og trinnene for måling av membranegenskapene til forskjellige celletyper i den dissocierte celleblandingen ved anvendelse av helcellepatchklemmen. Vi viser at de epididymale hovedcellene viser forskjellige membranelektrofysiologiske egenskaper og at konduktansene lett kan identifiseres fra andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk utføres i samsvar med retningslinjene fra Institutt for dyrepleie og bruk av ShanghaiTech University, som oppfyller de lokale og internasjonale kravene.
1. Eksperimentelle dyr
- Bruk voksne Sprague-Dawley-hanrotter (~ 300-450 g) mellom 8-12 uker gamle. På denne alderen hos rotter har sædene kommet i cauda-epididymidene.
2. Isolering av epitelceller fra rotte-Cauda-epididymider
MERK: Følgende trinn utføres under ikke-aseptiske forhold med mindre annet er angitt.
- Fremstilling av disseksjonsinstrumenter og reagenser
- Desinfiser disseksjonsverktøyene ved nedsenkning i 70% etanol og la dem lufttørke.
- Slå på varmeren (32 ° C); Forbered og forvar 500 mL 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) supplert med 1% (v / v) antibioTics (100 U / ml penicillin og 100 ug / mL streptomycin-slutt) og merket som "RPMI (+ P / S 1: 100)". Utfør dette trinnet i en ren luftstrømstyrt arbeidsstasjon.
- Forbered og forvarm 1x 500 mL Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM) som inneholder ikke-essensielle aminosyrer (0,1 mM) og natriumpyruvat (1 mM), og suppleres med 5-a-dihydrotestosteron (1 nM), 10% føtalt bovint Serum, 1% (v / v) antibiotika (100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin-slutt) og merket som "Full-IMDM". Opprett 50 ml alikvoter og forsegle med parafilm; Lagre ved 4 ° C. Bruk aseptiske forhold.
- Klargjøre en kollagenase enzym fordøyelsesløsning ved å oppløse kollagenase type I og kollagenase type II i RPMI (+ P / S 1: 100) som resulterer i 1 mg / ml av hver kollagenase i oppløsningen. Filter gjennom en 0,22 μm membran og merk som "kollagenase løsning". Oppbevares ved romtemperatur (RT) til bruk. Juster volumet av enzymoppløsningen basertPå vekten av enzymet; Det minimale volumet som kreves for begge cauda-epididymider fra en enkelt rotte er 2 ml.
- Fyll en 35 mm tallerken med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Disseksjon av rotte cauda-epididymider
- Oppdyr dyret ved enten å bruke natriumpentobarbital 85 mg / kg ip eller ved bruk av et isoflurankammer til dyret ikke reagerer på hale-klemming Følg med cervikal dislokasjon.
- Desinfiser underkroken ved å tørke med 70% etanol, trykk forsiktig de to testene ned til underlivet, og åpne deretter underlivet i nærheten av skrotumet.
- Plukk opp det epididymale fettet, dissekér hele reproduktive organene (testikler, epididymider og vasdeferenser) og nedsenk i parabolen med RPMI (+ P / S 1: 100).
- Overfør reproduksjonsorganene i fatet med RPMI (+ P / S 1: 100) til en aseptisk arbeidsstasjon.
- Dissect cauda epididymides fra binde og fettvev og epiDidymal kapsel. Plasser en epididymis med ~ 0,2 ml kollagenaseoppløsning i en 1,5 ml tube.Perform dette trinnet i en ren luftstrømskontrollert arbeidsstasjon.
- Dissosiering av enkeltceller fra rotte cauda-epididymider
- Klipp epididymidene i kollagenaseoppløsningen ved hjelp av fin saks til vevet blir en pastalignende væske. Skyll saksen forsiktig med resten av (~ 0,8 ml) enzymoppløsning i 1,5 ml rør.
- Plasser røret på en metalltermomixer i 30 minutter ved 37 ° C med en rystelseshastighet på 1000 rpm.
- Sentrifuger enzym-vævsblandingen ved 30 xg ved romtemperatur i 3 minutter og dekanter den klissete supernatanten som inneholder det meste sperma.
- Resuspender pelleten i 1 ml Full IMDM for å slukke all enzymatisk aktivitet. Overfør cellesuspensjonen til et 50 ml rør som inneholder 49 ml RPMI (+ P / S 1: 100).
MERK: Filtrer suspensjonen ved hjelp av en 100 μm mesh membran med konstant trituratIon for å unngå store, celleaggregater. Bruk imidlertid ikke et maskefilter hvis cellesuspensjon er nødvendig for å vokse cellemonolagere. - Sentrifuger den cellulære blandingen ved 30 xg ved romtemperatur i 10 minutter; Dekanterer supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml Full IMDM med mild triturering i minst 5 minutter for å dissociere enkeltceller fra de enzymatisk behandlede epididymale vevblandingene.
- Separasjon av epitelceller fra andre celler under aseptiske forhold
- Kultur cellesuspensjonen på en 10 cm petriskål inneholdende full-IMDM i minst 8 timer eller over natten i en inkubator ved 32 ° C i 5% CO2.
- Forbered sterile deksler på forhånd ved nedsenkning i 100% alkohol. Lufttørke og dukkert i et lite volum av kulturmediet. Legg dekselplatene i 6 cm kulturretter eller i enkle brønner på en brønn med 24 brønner.
- Neste morgen, høst de dissocierte epitelceller ved forsiktig å samle cellestoppetSion fra petriskålen, som hovedsakelig består av epitelceller. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 30 xg ved romtemperatur i 5 minutter, og dekanter deretter supernatanten.
- Resuspender cellepellet i ~ 2 ml Full IMDM.
- Frø 0,2 ml av den høstede cellesuspensjonen på midten av hver steril deksel.
- La cellesuspensjonen slå seg ned i væskedråpet i minst 10 minutter for å tillate at celler løsner seg løst på glassdekselene. Legg forsiktig 1 mL Full IMDM i kanten av 10 cm tallerken, eller 0,3 mL Full IMDM til hver brønn på en 24-brønn plate; Ikke forstyrr celler.
- Hold de isolerte enkeltcellene på deksel i inkubatoren ved 32 ° C i 5% CO 2 til patch-clamp-forsøkene.
3. Opptaksløsninger og mikropipetter
MERK: Bruk de beste kjemikalier og løsninger for patch-clamp-eksperimentene.
- Fremstilling av stamløsninger
- Autoklaver alle flasker for lagerlagring og filtrer alle lagerløsninger (unntatt korrosive løsninger) og filtrer gjennom 0,22 μm membraner før bruk.
- Forbered alle lagerløsninger på forhånd ved RT, og lagre ved 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH 2PO 4; 100 mM EGTA (pH 7,0 med KOH). Håndter 5 M NaOH, 1 M HC1 og 1 M KOH lager som korrosive løsninger.
- Forberedelse av standard ekstern opptak fysiologisk saltløsning (PSS)
- Varm lagerløsningene til RT om morgenen på patch-clamp-opptaket.
- Pipetter ingredienser fra hvert lager i henhold til den ønskede sluttvolum, med unntak av CaCl2, for eksempel for å fremstille 500 ml av PSS: 140 mM NaCl = 14 ml 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml 1M; 1,2 mM MgCl2 = 6 ml 100 mM; 1,2 mM NaH 2PO 4 = 3 ml av 200 mM.
- Legg til dobledestillert vann (DDH 2 O) til det endelige volum på 400 ml og likevekt.
- Veie 0,9 g glukose og 1,19 g HEPES og oppløs helt i løsningsblandingen.
- Tilsett CaCl 2- lageret (2,5 mM = 12,5 ml 100 mM) under omrøring.
- Legg til opptil 99% av sluttvolumet.
- Juster pH til 7,4 ved å bruke NaOH eller HCl.
- Kontroller osmolariteten og juster med 5 M NaCl eller glukose, om nødvendig.
- Legg DDH 2 O til sluttvolum på 500 ml i en sylinder.
- Fremstilling av mikropipette interne løsninger (lave EGTA K + -baserte løsninger)
- Vei eller pipette korrekte volum av reagensene fra hvert lager i henhold til den ønskede endelige volum og konsentrasjon, for eksempel for å fremstille 50 ml lav EGTA K + -basert intracellulær løsning til et volum på ~ 30 ml DDH 2 O: 100 mM K-glukonat = 1,17 g; 35 mM KCl = 1,75 ml 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 mLAv 100 mM; 0,1 mM EGTA = 0,05 ml 100 mM; 10 mM HEPES = 0,072 g.
- Tilsett nok vann til ~ 95% av sluttvolumet og la oppløsningen ligne i RT. Pass på at løsningen er klar.
- Mens du kontinuerlig rører oppløsningen, juster pH til 7.2 ved bruk av KOH.
- Vekt og tilsett 0,078 g Mg-ATP til løsningen til den er fullstendig oppløst.
- Plasser løsningen på is og bruk en liten alikvot til måling av osmolaritet; Vanligvis måler løsningene ~ 290 mOsmol og trenger ikke justering. Hvis osmolariteten varierer vesentlig fra 280-295 mOsmol, lag en ny løsning.
- Legg DDH 2 O til sluttvolum.
- Del oppløsningen i 500 μl alikvoter, filtrer med et 0,2 μm sprøytefilter, tett segl og lagre øyeblikkelig ved ≤ -20 ° C.
- På datoen for patch-clamp-eksperimentet tine en alikvot av intracellulær oppløsning på is og hold kjøl under patch-clamp-eksperimentet tilHindre nedbrytning.
- Trekk patchpipettene fra glasskapillærene (etter brukerhåndboken til pipetter) for å oppnå mikropipettstørrelser med motstand på 5-10 M når de fylles med intracellulær løsning.
4. Sette opp patch-clamp-eksperimentet og etablere helcellekonfigurasjon med celler
- Sette opp patch-clamp-eksperimentet
- Slå på patch-clamp-oppsettet (datamaskin, datamaskinstyrt forsterker, digitizer, etc. )
- Åpne patch-clamp-programvaren ( f.eks. AXON pCLAMP10 eller HEKA PatchMaster) og sett opp protokollene for elektrofysiologiske opptak. Still inn filteret for signalet til lavpass ved 1-3 kHz og digitalisereren ved 10-20 kHz.
- Slå på kameraet, mikromanipulatoren og lyskilden.
- Når den datamaskinstyrte forsterkeren er på, måler du forsøkspersonens kropp ved å røre med hendene på patch-clamp riggen som har blitt jordet,Før du berører hodet, for å beskytte det mot elektriske støt.
- Overfør dyrkningspitelceller på glassdekslet til opptakskammeret fylt med ~ 1 ml standard PSS ved RT. Forandre badet PSS forsiktig minst to ganger med en pipette før noen patch-clamp-eksperimenter.
MERK: Fyll perfusjonssystemet med standard PSS eller en annen ekstern løsning i henhold til det planlagte eksperimentet. Perfuse det mikroskopmonterte opptakskammeret (RC-26G eller RC-26GLP) med PSS noen ganger med en hastighet på ~ 2 mL / min før oppstart av patch-clamp-eksperimentene. Pass på at det ikke er noen luftbobler fanget langs perfusjonssystemet. - Se og velg cellene under et invertert mikroskop ved hjelp av 10X og 40X målene utstyrt med et differensial interferens-kontrast optisk system. Se etter store enkelt isolerte celler for opptak. Identifiser de isolerte epididymale epitelceller ved deres sfæriske form med grov mMikrofili på den ene enden av membranene og polarisert fordeling av intracellulært innhold ( figur 1 ).
- Bruk en 1 ml sprøyte (en hjemmelaget ikke-metallisk mikrosprøytenål), fyll en mikropipett med den interne løsningen (lav EGTA K + -basert løsning, se trinn 3.3). Pass på at det ikke er luftbobler i mikropipetten, noe som kan øke motstanden til mikropipetten. Bruk nok løsning slik at den interne løsningen nedsenker den kloridbelagte sølvtrådelektroden i mikropipettholderen.
- Monter mikropipetten i elektrodeholderen, og bruk et lavt positivt trykk (~ 0,2 ml sprøytevolum). Hold lavt positivt trykk kontinuerlig til du berører cellemembranen i de senere trinnene.
- Etablering av helcellekonfigurasjon med celler for opptak
- Dyp pipetten inn i badløsningen ved høyeste hastighet på mikromekanipulatoren. Finn pipettenTips på skjermen koblet til digitalkameraet; Senk mikromanipulatorhastigheten til medium høy modus.
- Kontroller raskt mikropipettmotstanden (5-10 MΩ) ved hjelp av dataoppkjøpsgrensesnittkommandoen ( f.eks. "Membranstest" i AXON-systemet) ved å bruke et spenningstrinn ( f.eks. 5 mV for 100 ms) generert fra den datamaskinstyrte forsterkeren. Bytt til en ny mikropipett hvis motstanden er betydelig utenfor dette området.
- Begynn å flytte målet som er montert på mikroskopet; Styr gradvis mikropipetten mot den valgte cellen. Senk alltid målet først, og senk deretter mikropipetten til fokusplanet, til mikropipetten er over senteroverflaten til den valgte cellen.
- Avbryt væskeforbindelsespotensialet mellom pipett- og badløsninger til null ved å bruke kommandoen "pipetteforskyvning" i kommandolinjegrensesnittet til programvare.
- Sett den datamaskinstyrte forsterkeren commAndre til spenningsklemmen og membrantesten til "bad" -modus.
- Fint fokus for en klarere visning av cellen, og senk deretter gradvis mikropipetten ved hjelp av mikromanipulatoren ved lavmediumhastigheten.
- Når mikropipetten er nær cellen (demonstrert av en redusert strøm når den utløses av membran testkommandoen), fjern det lave positive trykket umiddelbart og bruk et svakt negativt trykk (0,1 ml sprøytevolum) for å danne gigasealet (> 1 GΩ) .
- Overvåk motstanden med membranstesten. Hvis motstanden er> 500 MΩ, men <1 GΩ, gjelder et negativt potensial (vanligvis som holdepotensialet som er satt til -60 mV), som kan bidra til å danne gigaseal. Kompensere mikropipettens forbigående kapasitive strøm.
- Hvis forseglingen er> 1 GΩ og stabil (som vist i programvaregrensesnittet), bruk en kort og sterk suging for å bryte cellemembranen. Ikke bruk kompensasjon for sakenRies motstand og cellekapasitansen.
- Umiddelbart etter å ha oppnådd en vellykket helcellekonfigurasjon, bruk et 10 mV hyperpolariseringstrinn (5 spor med minimal tidsintervaller, 20 ms varighet, signalprøve ved 20 kHz) fra et holdpotensial på -60 mV.
- Bytt spenningsmodus til nullstrømsmodus og merk ned lesingene fra programvaregrensesnittet eller utfør et gapfritt opptak (10-60 s) for membranpotensielle målinger av cellen.
- Bytt raskt tilbake til og forbli i spenningsmodus og bruk spenningsprotokollene i henhold til de planlagte forsøkene og måle gjeldende svar. Subtraksjon brukes ikke på den inneboende lekkasjestrømmen under opptakene.
- Overvåk stabiliteten til svarene under opptakene, eller de forskjellige parametrene til cellen. For eksempel bruk kommandolinjen "Membran Test" for å sjekke inngangsmotstanden (R i ), seriemotstanden (R s ) og cellenMembran kapasitans ( Cm ) i membran testen i "Cell" modus under bryteren av protokoller.
MERK: Plutselige dråper i inngangsbestandighet er vanligvis indikativ for en løs patch, og en dramatisk økning i serieresistens kan være indikativ for mikropipettespissstopping av de intracellulære organeller eller membranfragmenter. Under opptak må du regelmessig overvåke mikropipettstedet for å kontrollere om driften oppstår, noe som kan føre til tap av patchen. Hvis drift er et problem, løft forsiktig mikropipetten og patchencellen bort fra bunnen av opptakskammeret. Dette trinnet kan noen ganger føre til tap av patchen, i hvilket tilfelle det er nødvendig å gjenta full-celle patch-klemme prosedyren.
5. Analyse av passive elektrofysiologiske egenskaper av celler
- Etter å ha hentet dataene fra patch-clamp-eksperimentene, åpne de gapfrie dataene i Clampfit-programvaren og måle gjennomsnittetVerdi for hvilemembranpotensialet for hver celle. Alternativt kan du bruke verdien som markert ned fra nullstrømspenningen ved gjeldende modus. Korrigere verdiene med væskeovergangspotensialet (12,4 mV i denne studien).
- Åpne dataene fra 10-mV hyperpolariseringstrinnet (AV) som er oppnådd fra en celle, måle gjeldende forskjell før og under trinnet (Δ I- trinn ), og beregne inngangsmotstanden (R i ) ved å bruke ligningen som:
- Beregn cellekapasitansen ( Cm , i pF-enhet) (bruk de samme nåværende dataene fra 10-mV hyperpolariseringstrinnet ved å integrere det totale arealet under membrankondensatorstrømmen under den første transient-avfallsstrømmen oppstått på spennings-trinnutløseren), For å oppnå verdien av den totale akkumulerte ladningen (Q, i enheten pA • ms) av cellen. Bruk følgende ligning:
- Beregn verdien av seriemotstanden (R s ) for hver celle ved å montere den initiale forbigående strømmen fra 10-mV-negative trinnet med en standard eksponensiell algoritme for å oppnå tidskonstantens forfallstrøm ( T , i enhet av ms) og bruk Følgende ligning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne enzymatiske fordøyelsesprosedyren for isolering av epitelceller fra rotte-cauda-epididymider er en modifisert protokoll fra våre tidligere studier 9 , 12 . Denne metoden produserer en blanding av enkeltceller med over 90% levedyktighet og uten overflateblister eller hovne cellevolum. Den heterogene celleblanding i hovedsak består av hovedceller, klare celler og basalceller, som vi har beskrevet tidligere 1. I denne protokollen kan relativt rene prøver av epididymepitelceller oppnås ved å dyrke de primære dissocierte celler over natten på en petriskål for å tillate adhesjon av de ikke-epitelceller (som fibroblaster og glatte celler) på parabolen, som Vist i figur 1A (før innhøsting). Celletyper kan da foreløpig skilles ut av deres fenotyper under mikroskopetOg kategorisert i henhold til deres spesifikke passive membranegenskaper. I den dissocierte celleblandingen er det en gruppe celler som har mikrovilli eller en grov membran på den ene enden av overflatemembranen og polariserte cellulære innhold; Disse kalles de viktigste cellene eller de klare cellene ( figur 1B , piler). Disse polariserte epitelceller er skiller seg ut av deres morfologiske egenskaper, men kan identifiseres i henhold til deres passive membranegenskaper og konduktansresponser oppnådd fra helcellens patch-clamp-opptak. Den andre gruppen av celler er mindre i størrelse uten stereokiliell på den ene enden av membranen og ingen åpenbart polarisert cellulært innhold; Disse kalles nei-microvilli-cellene, og består av hovedsakelig basale celler ( figur 1B , stjerner).
De primære epitheliale hovedcellene kan skille seg fra andre celler avIr forskjellige passive membranegenskaper ( figur 2 ) og nåværende mønstre ( figur 3 ) som svar på den anvendte spenningsprotokollen ved hjelp av helcelle-patch-klemmeteknikken. De passive membranelektrofiologiske egenskapene til cellene kan bidra til å vurdere den opprinnelige helsestatusen til individuelle celler og av celletypegrupper. En oppsummering av de enkelte dot plots av membranen kapasitans (C m), inngangsmotstand (Rm) og membranpotensialet (V m) i hver cellegruppe er gitt i Figur 2A. Det er ingen forskjell i tidskonstanten for membrankapasitansen blant de forskjellige celletyper (~ 0,4 ms) (data er ikke demonstrert i dette manuskriptet). Ved hjelp av den lave EGTA K + -baserte løsningen er gjennomsnittlig målt membrankapasitans for hovedcellene 9,4 0,5 pF (n = 32) og for de klare cellene er 9,7 1,9 pF (n = 12). Membran kapasitansen avNei-microvilli-cellene er 5,2 0,8 pF (n = 17), som er statistisk mindre enn prinsippen og de klare cellene membrankapasitanser.
Inndata-motstanden til de viktigste cellene i figur 2A (midtpanelet) er 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32), og for de klare cellene er 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), som er signifikant lavere (P <0,001) enn Det for nei-microvilli-cellene (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Som vist i figur 2A (høyre panel), ble null-strøm membranpotensial (dvs. det hvilende membranpotensial V m) målt kort etter etablering av helcelle-konfigurasjon og for å sammenligne gruppene etter korrigeringen med flytende koblingspotensial (12.4 mV). Celler ble rutinemessig badet i standard PSS og dialysert med 0,1 mM EGTA K + -basert pipettløsning inneholdende ATP. MEanmembranpotensialet til hovedcellene er -26 ± 2 (n = 28), mellom -51 mV og +1 mV, og middelmembranpotensialet for de klare cellene er -30 ± 3 mV (n = 10), Mellom-47 mV og -17 mV. No-microvilli-cellene har det høyeste middelmembranpotensialet med en verdi på -33 ± 5 mV (n = 17), mellom -63 mV og -13 mV.
Den lave inngangsmotstanden til de viktigste cellene antyder at det er indre konduktanser i disse cellene, men det kan indikere lekkasje av tetningen mellom pipetten og patchcellemembranene. For å løse denne bekymringen, ekskluderte vi først dataene fra de cellene med plutselige endringer (indikativ på tetningslekkasje) av de elektriske egenskapene under opptak. Da analyserte vi korrelasjonen mellom tetningsmotstanden ved en terskel på 1 giga-ohm med inngangsbestandigheten, som vist i figur 2B . Resultatet var en meget lav korrelasjonsverdi (R 2 ≈ 0,02). Dette tyder på at tetningsmotstanden har ubetydelig innflytelse på inngangsmotstanden, og at de rapporterte passive elektriske egenskapene til de forskjellige cellene (som for eksempel de lave inngangsmotstandene til de viktigste cellene) er de indre egenskapene til disse cellene.
Figur 3A er den typiske nåværende respons registrert fra hovedcellene under kvasi-fysiologiske forhold med cellene som bader i normal fysiologisk saltoppløsning (PSS), dialysert med en lav EGTA K-basert pipettløsning og stimulert fra et holdingspotensial på -60 mV Til en serie på 500 ms testspenninger (fra -120 mV til +60 mV som angitt i innsatsen i figur 3B ). De to tracings i figur 3C viser de typiske hvilemembranresponsene til en identifisert hovedcell under nullstrømsklemmen i nærvær av, ellerFravær av ATP i pipetteoppløsningen. I nærvær av ATP er hvilepotensialet relativt stabilt. Mens en progressiv hyperpolarisering ble observert når celler ble dialysert med en pipettløsning uten ATP. Det opprinnelige hvile-membranpotensialet målt ved begynnelsen av celledialysen med pipettløsninger viser ingen signifikant forskjell i cellene med eller uten ATP ( Figur 3D ), noe som tyder på at de målte verdiene fortsatt var intakte og minimalt påvirket av pipetteløsningene.
Figur 1 : Morfologiske egenskaper av isolerte rotte cauda epididymepitelceller. ( A, B ) Eksempler på epitelceller isolert fra rotte-cauda-epididymider før ( A ) og etter ( B ) gjenvekst av oveRnight kultur på parabolen før patch-clamp eksperimenter. Pilene indikerer mikrovilli-cellene, som hovedsakelig består av hovedcellene og de klare cellene. Stjerner angir nei-microvilli-cellene. Bare enkeltceller ble valgt for patch-clamp-opptak. Skalbjelke = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Passive membranegenskaper av enkelt-rotte cauda-epididymepitelceller. ( A ) Dot-plott av de passive membranegenskapene av enkelt-rotte cauda-epididymepitelceller. Pipettløsningen er lav EGTA K + -basert, og badeoppløsningen er standard PSS. ( B ) Korrelasjonsanalyse av input resIstand med selens motstandsdyktighet. NS : ingen signifikant forskjell, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 signifikant forskjell vs. passende kontroller ved bruk av enveis ANOVA med Bonferroni post-hoc test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 : Typiske helcellestrømmer i enkle epididymale primære celler. ( A ) Typiske helcellestrømmer registrert fra enkle epididymale epitelceller registrert under kvasi-fysiologiske betingelser ved bruk av en puls-fremkallingsprotokoll som vist i inngangen til panal B. Den stiplede linje indikerte nullstrømnivåene. ( B ) Strømspenningsforholdet for gjeldende responsEs målt ved de angitte tidspunktene som i A. Data er middelene ± SEM på åtte hovedceller fra minst tre dyr. ( C ) Representative tracings av hvilemembranpotensialet hos hovedcellene dialysert med en pipettløsning, enten med ATP (+ ATP) eller uten ATP (-ATP). ( D ) Et strekediagram som ikke viser noen signifikant forskjell mellom det initiale hvilemembranpotensialet for + ATP og -ATP. Verdier er middel ± SEM målt på det tidspunktet som er angitt i panel C. Tall i parentes i stolpene angir antall testede celler fra minst tre dyr. NS : ingen signifikant forskjell. ( E ) Korrelasjonsanalyser av tetningsmotstanden og inngangsmotstanden til alle cellene, eller kun de viktigste cellene, mot hvilemembrene målt ved nullstrømsklemmen kort etter helcelleinstitusjonen og de nåværende størrelsene målt ved den hyperpolariserende Trinn til -100 mV fra å holde potential. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen ga den enzymatiske dispersjonen av rotte-cauda-epididymider konsekvent sunne epitelceller. Kvaliteten på epididymepitelceller for patch-clamp-eksperimentene er avhengig av noen få kritiske trinn i protokollen. For eksempel er sentrifugeringen av celleblandingen ved en lav sentrifugalkraft (30 xg) viktig for fjerning av spermatozoa og det epididymale luminale innholdet; De epididymale epitelceller blir usunn i nærvær av spermatozoa i cellekulturen. I tillegg er dyrking av den dissocierte celleblandingen på en petriskål i flere timer et viktig trinn for å fjerne fibroblaster og glatte muskelceller; De ikke-epitelceller holdes hurtigere på dyrkningsretten og således forlater epitelceller i suspensjonen, som kan gjenhøstes ved forsiktig aspirasjon. Videre er kollagenasefordøyning og triturering med en fin glasspipett de to viktige trinnene for å frigjøreEnkeltceller under celledissociationsprosedyren. Endelig er den enzymatiske fordøyelsen av epididymceller kritisk for patch-clamp-eksperimentet, fordi under fordøyelsen ved ineffektiv enzymatisk aktivitet eller overfordøyelse ved langvarig inkubering kan både forstyrre giga-ohm-tetningsformasjonen mellom pipetten og cellemembranene.
I cellesammensetningene er cellene i en større, søyleformet form med en grov membranbærende stereocilia på den ene enden og polarisert fordeling av det intracellulære innholdet sannsynligvis hovedcellene eller de klare cellene. Andre celler som ikke har fremtredende mikrovilli og polariserte celleinnhold, kan inkludere basalceller og noen celler fra immunsystemet. I tillegg til å beskrive grunnleggende morfologiske trekk ved epididymepitelceller, benytter denne protokollen hele-cellepatch-klemmetoden for å måle den passive membranegenskapen til hver celle. Disse membranegenskapene tillater forundersøkelse avCelletyper. Denne metoden har noen begrensninger som utvasking av det intracellulære innholdet med pipettløsningen og elektroniske variasjoner i forhold til de mobile arkitekturendringer under kontinuerlig opptak 19 , 20 . Vi gir bare parametrene som vi målte umiddelbart etter etableringen av helcellekonfigurasjonen, som reflekterer de første, relativt intakte forholdene til cellene. De passive membranegenskapene til hver celle inkluderer membrankapasitansen, inngangsmotstanden og hvilemembranpotensialet.
Den spesifikke kapasitans av cellemembranene er generelt enige om å være en uF / cm 2, og dette gjelder for celler (slik som immunceller og nevroner) med begrenset folding på deres cellulære membraner 16, 18. Den spesifikke kapasitansekonstanten har imidlertid en tendens til å være større for celler wI mer komplekse, cellulære arkitekturer, som epitelceller, som har mange cellulære membranfold i forskjellige rom. Rapporter indikerer at MDCK epithelialcellelinjeverdiene er 4 μF / cm 2 og 3 μF / cm 2 for henholdsvis apikal og basal membranspesifikke kapasitanser, henholdsvis 17 . I den foreliggende studien er de målte gjennomsnittlige membrankapasitansene ~ 8 pF og ~ 12 pF for nei-mikrovilli-cellene og henholdsvis de viktigste cellene og klargjellige cellegrupper ( dvs. mikrovilli-celler). Ved bruk av den spesifikke kapasitansen på 1 μF / cm 2 for beregningene, er de estimerte celleoverflateområdene 500 μm 2 og 1000 μm 2 for nei-mikrovilli-celler og mikrovilli-celler, som tilsvarer diameterene på 13 μm og 18 um. Imidlertid er disse estimatene større enn forventet basert på cellestørrelsene under mikroskopet, som er ~ 81; m og ~ 12 mikrometer for ikke-microvilli celler og microvilli-celler, henholdsvis, og disse cellene er omtrent 2,4 uF / cm 2 og 1,9 uF / cm 2, henholdsvis. Våre resultater indikerer at membranlandskapet til ikke-mikrovilli-celler er mer komplisert enn mikroviruscellene, som er i samsvar med deres sekresjons- og transportfunksjoner.
Den spesifikke kapasitans av cellemembranene er generelt enige om å være en uF / cm 2, og dette gjelder for celler (slik som immunceller og nevroner) med begrenset folding på deres cellulære membraner 16, 18. Den spesifikke kapasitansekonstanten har imidlertid en tendens til å være større for celler med mer komplekse, cellulære arkitekturer, som epitelceller, som har mange cellulære membranfold i forskjellige rom. Rapporter indikerer at MDCK epithelialcellelinjeverdiene er 4 μF / cm 2 og 3 μF / cm 2 17 . I den foreliggende studien er de målte gjennomsnittlige membrankapasitansene ~ 8 pF og ~ 12 pF for nei-mikrovilli-cellene og henholdsvis de viktigste cellene og klargjellige cellegrupper ( dvs. mikrovilli-celler). Ved bruk av den spesifikke kapasitansen på 1 μF / cm 2 for beregningene, er de estimerte celleoverflateområdene 500 μm 2 og 1000 μm 2 for nei-mikrovilli-celler og mikrovilli-celler, som tilsvarer diameterene på 13 μm og 18 um. Imidlertid er disse estimatene større enn det som var forventet basert på cellestørrelsene under mikroskopet, henholdsvis ~ 8 μm og ~ 12 μm for ikke-mikrovilli-celler og mikrovilli-celler, og disse cellene er bedre kompatible med en bestemt kapasitansverdi 2 μF / cm 2 . Dette antyder at membranlandskapet til epididymepitelceller er morE kompleks enn andre celletyper, som er i samsvar med deres sekresjons- og transportfunksjoner.
I helcelleopptakene bidro lekkasjekonduktansen over membranen og ved forseglingen mellom membranen og pipetten både til de målte membranegenskaper. Tetningen har en betydelig høyere motstand enn membranen, og den har så liten innflytelse på måling av de passive membranegenskapene, slik som inngangsmotstanden og nullstrømsmembranpotensialet. I samsvar med dette begrepet resulterte korrelasjonsanalysen av tetningsmotstanden ved en terskel på 1 giga-ohm mot inngangsmotstanden for hver celle i en verdi på ~ 0,02, hvilket tyder på en svært svak innflytelse. Ytterligere korrelasjonsanalyser av enten seglmotstanden eller inngangsbestandigheten mot hvilemembranpotensialene eller den nåværende størrelsen målt ved -100 mV ga også lave verdier for alle testede celler eller bare for de viktigste cellene. Våre resultater deMonstre at inngangsmotstanden til de epididymale hovedcellene og de klare cellene er signifikant lavere enn nei-mikrovilli-cellene, og derved gir en foreløpig parameter for dommen for å differensiere celletyper. Disse resultatene antyder at den lave inntaksmotstanden i hovedcellene er en egen fysiologisk egenskap hos cellene. De enkelte epitelceller har også forskjellige nåværende mønstre som svar på de anvendte protokollene og eksperimentelle forhold. Vi observerte at hver definert celletype viste unike nåværende mønstre under den samme påførte spenningsprotokollen. Et eksempel er vist i Figur 3 viser det typiske strøm responsene innsamlet fra de primære cellene under kvasi-fysiologiske betingelser, som vi har rapportert tidligere ni. De elektrofysiologiske egenskapene til hver spesialisert celletype er lett differensiert (data er ikke vist i dette papiret). Basert på disse parametrene,De forskjellige celletyper kan grovt kategoriseres i hovedcellene, de klare cellene og nei-microvilli-celler, som beskrevet i resultatene.
Indgangsmotstanden er membranmotstanden som svar på det påførte potensielle trinnet (10 mV hyperpolariserende trinn i denne studien) fremkalt fra et holdpotensial på -60 mV. Dette gjenspeiler omfanget av åpen kanalaktivitet som svar på det anvendte potensialet. I denne forbindelse innebærer en lav motstand en høy inneboende "lekkasje" -konduktans av cellene, mens en høy motstand innebærer lukkede kanaler. Den lave inngangsmotstandsverdien i hovedcellene tilsvarer den fremtredende membranledningen, mens de klare cellene som har en liten konduktans ved testmembranpotensialet, innebærer deres moderate konduktans under opptaksforholdene. Den signifikant høye inngangsresistensen til nei-microvilli-cellene innebærer at de ikke har åpne kanaler i denne statusen. I null-cuRenterklemme, er de gjennomsnittlige hvilemembranpotensialene til de målte, isolerte epitelceller i området 26-33 mV for de tre cellegruppene. Disse verdiene er sammenlignbare med det rapporterte membranpotensialet (-30 mV) ved hjelp av mikroelektrode-metoden 21 . Imidlertid varierer de målte hvilepotensialene mye i individuelle celler (fra +3 mV til -63 mV) til tross for fravær av spontane spikepotensialer. Denne variasjonen kan gjenspeile samspillet mellom forskjellige ionkanalaktiviteter i forskjellige celletyper, som det koblede samspillet mellom TRPV6 og TMEM16A kanaler i hovedcellene, som vi har rapportert nylig 9 . Det er verdt å merke seg at når cellene ble dialysert med ATP pipetten, så vi ingen spontane elektriske potensialer i hovedcellene; Dette stemmer overens med klassifiseringen av epitelceller som ikke-eksklusiv 4 . En progressiv hyperpolarisering når cellene ble dialysert med piPette-løsning uten ATP kan ha reflektert det gradvise utseendet av en ATP-sensitiv kaliumstrøm. Det er blitt rapportert at ATP-sensitive kaliumkanaler uttrykkes i Golgi-apparatet i de viktigste cellene i rotteepididimis, og at uttømmingen av den intracellulære ATP fører til aktiveringen av K ATP- kanalene 14 , 22 . Denne observasjonen antyder at inkludering av ATP i pipettløsningen favoriserer de stabile fysiologiske forholdene til de epididymale hovedcellene.
Hele-celle patch-clamp teknikken er en veletablert metode som ofte brukes til å studere elektrofysiologi av spennende celler, som nevroner. I dette papiret viste vi at det også er et nyttig verktøy for karakterisering av bioelektriske egenskaper av ikke-excitable celler, som epitelceller. I tillegg tillater denne protokollen funksjonelle undersøkelser av primær isolert epididymAlle epitelceller for å belyse deres fysiologiske rolle i epididymiene. Denne studien gir noen foreløpige elektriske egenskaper til epitelceller isolert fra rotte cauda epididymis for å hjelpe fremtidige undersøkelser av den fysiologiske oppførselen til disse cellene og deres underliggende biologiske relevans i epididymiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Christopher Antos for nyttige kommentarer til teksten. Dette arbeidet ble støttet av oppstartsfinansiering fra ShanghaiTech University tildelt Winnie Shum og med finansiering fra National Natural Science Foundation of China (NNSFC nr. 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
