Summary
Apresentamos um protocolo que combina o isolamento celular e a gravação de grampos-grampos de células inteiras para medir as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato. Este protocolo permite a investigação das propriedades funcionais das células epiteliais primárias epidídmicas para elucidar ainda mais o papel fisiológico do epidídimo.
Abstract
O epidídimo é um órgão essencial para a maturação do esperma e a saúde reprodutiva. O epitélio epididimétrico consiste em tipos de células intrinsecamente conectados que são distintos, não apenas em características moleculares e morfológicas, mas também em propriedades fisiológicas. Essas diferenças refletem suas diversas funções, que juntos estabelecem o microambiente necessário para o desenvolvimento do esperma pós-testicular no lúmen epidídimo. A compreensão das propriedades biofísicas das células epiteliais epididimais é fundamental para revelar suas funções no esperma e na saúde reprodutiva, em condições fisiológicas e fisiopatológicas. Embora suas propriedades funcionais ainda não tenham sido totalmente elucidadas, as células epiteliais epididimais podem ser estudadas usando a técnica de patch-clamp, uma ferramenta para medir os eventos celulares e as propriedades da membrana de células isoladas. Aqui, descrevemos os métodos de isolamento celular e gravação de grampos-grampos de células inteiras para meaCom certeza as propriedades elétricas das células epiteliais dissociadas primárias dos epidídimos da cauda do rato.
Introduction
O epidídimo no trato reprodutivo masculino é um órgão alinhado com uma camada de células epiteliais de mosaico. Como em outros tecidos epiteliais, os vários tipos de células do epitélio epidídmico, incluindo células principais, células claras, células basais e células dos sistemas imunológico e linfático, trabalham de forma concertada para funcionar como a barreira na linha de frente do túnete e como a Células de suporte para a maturação do esperma e fisiologia 1 , 2 , 3 . Assim, essas células epiteliais desempenham um papel essencial na saúde reprodutiva.
As células epiteliais são geralmente consideradas como células não excitáveis que são incapazes de gerar potenciais de ação tudo-ou-nenhum em resposta a estímulos despolarizantes, devido à falta de canais de Na + ou Ca 2+ com tensão gaseada 4 , 5 . No entanto, células epiteliais expressam uniQue conjuntos de canais iônicos e transportadores que regulam seus papéis fisiológicos especializados, como secreção e transporte de nutrientes 6 . Diferentes células epiteliais, portanto, possuem propriedades elétricas características. Por exemplo, as células principais expressam o CFTR para o transporte de fluidos e cloretos e expressam o TRPV6 para a reabsorção de cálcio, enquanto que as células claras expressam a V-ATPase da bomba de protões para a acidificação luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Alguns transportadores e canais iónicos que regulam as características fisiológicas das células epiteliais epididimais têm sido relatados, mas as propriedades funcionais das células epiteliais epididimais ainda não foram ainda compreendidas 10 , 11 , 12 , 13 .
WhA gravação de grampos e grampos de células oleicas é uma técnica bem estabelecida para examinar as propriedades intrínsecas de ambas as células excitáveis e não excitantes e é particularmente útil para estudar as funções de células primariamente dissociadas em amostras de células heterogêneas; A tensão-braçadeira é usada para medir as propriedades da membrana passiva e as correntes iónicas de células simples 14 , 15 . As propriedades da membrana passiva incluem resistência de entrada e capacitância. O parâmetro anterior indica a condutância da membrana intrínseca, enquanto a última implica a área superficial da membrana celular (uma bicamada de fosfolipídios, onde se localizam os canais iónicos e os transportadores, que serve como um isolador fino que separa a mídia extracelular e intracelular). A capacitância da membrana é diretamente proporcional à superfície da membrana celular. Juntamente com a resistência da membrana que é refletida pela resistência de entrada, a constante de tempo da membrana, wO que indica quão rápido o potencial da membrana celular responde ao fluxo de correntes dos canais iónicos, pode ser determinado. A este respeito, ao combinar as características de resposta atuais de uma série de etapas de tensão aplicadas às células, a cinética biofísica e as propriedades das células são determinadas 15 , 16 , 17 , 18 .
No presente trabalho, descrevemos os procedimentos para isolar células epiteliais do epidídimo de cauda de rato e os passos para medir as propriedades da membrana de diferentes tipos de células na mistura de células dissociadas usando o grampo de grampo inteiro. Mostramos que as células principais epididimais apresentam propriedades eletrofisiológicas da membrana distintas e que as condutas podem ser facilmente identificadas a partir de outros tipos de células.
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Protocol
Todos os experimentos com animais são realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Uso e Cuidados de Animais Institucionais da Universidade Shanghai-Tech, que cumprem os requisitos locais e internacionais.
1. Animais experimentais
- Use ratos Sprague-Dawley machos adultos (~ 300-450 g) entre 8 a 12 semanas de idade. A esta idade nos ratos, o esperma chegou aos epidídimos da cauda.
2. Isolamento de células epiteliais de Epididímides de Cauda de Rato
NOTA: As seguintes etapas são realizadas em condições não assépticas, salvo indicação em contrário.
- Preparação de instrumentos de dissecação e reagentes
- Desinfecte as ferramentas de dissecação por imersão em etanol a 70% e deixe secar ao ar.
- Ligue o banho de aquecimento (32 ° C); Preparar e pré-aquecer 500 mL de 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI) suplementado com 1% (v / v) de antibióticoTiques (100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de final de estreptomicina) e rotulados como "RPMI (+ P / S 1: 100)". Execute esta etapa em uma estação de trabalho controlada por fluxo de ar limpo.
- Preparar e pré-aquecer 1x 500 mL de Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) contendo aminoácidos não essenciais (0,1 mM) e piruvato de sódio (1 mM) e suplementado com 5-a-di-hidrotestosterona (1 nM), 10% de bovino fetal Soro, antibióticos a 1% (v / v) (100 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de final de estreptomicina) e rotulados como "IMDM completo". Crie alíquotas de 50 mL e selar com parafilme; Armazenar a 4 ° C. Use condições assépticas.
- Prepare uma solução de digestão com enzimas colagenase dissolvendo colagenase tipo I e colagenase Tipo II em RPMI (+ P / S 1: 100) resultando em 1 mg / mL de cada colagenase na solução. Filtra através de uma membrana de 0,22 μm e marca como "Solução de colagenasa". Mantenha a temperatura ambiente (RT) até o uso. Ajustar o volume da solução enzimática com baseSobre o peso da enzima; O volume mínimo necessário para ambos os epidídimos de cauda de um único rato é de 2 mL.
- Preencha um prato de 35 mm com RPMI (+ P / S 1: 100).
- Dissecção de epidídimos de cauda de ratos
- Sacrifique o animal usando o pentobarbital de sódio 85 mg / kg ip ou usando uma câmara de isoflurano até que o animal não responda à estimulação da compressão da cauda; Acompanhar a deslocação cervical.
- Desinfecte a parte inferior do abdômen limpando com 70% de etanol, empurre os dois testículos para baixo até o abdômen e, em seguida, abra a parte inferior do abdômen perto do escroto.
- Pegue a gordura epidídima, disseca todos os órgãos reprodutivos (testículos, epidídimas e deferentes) e mergulhe no prato com RPMI (+ P / S 1: 100).
- Transfira os órgãos reprodutores no prato com RPMI (+ P / S 1: 100) para uma estação de trabalho asséptica.
- Disse os epidídimos da cauda dos tecidos conectivos e gordurosos e do epiCápsula didymal. Coloque um epidídimo com ~ 0,2 mL de solução de colagenaçao em um tubo de 1,5 mL. Aperte este passo em uma estação de trabalho controlada por fluxo de ar limpo.
- Dissociação de células únicas de epidídimos de cauda de rato
- Corte os epidídimos na Solução de Collagenase usando tesouras finas até o tecido se tornar um fluido semelhante a pasta. Enxágüe a tesoura suavemente com o resto da solução de enzima (~ 0,8 mL) no tubo de 1,5 mL.
- Coloque o tubo em um termomixer de metal durante 30 min a 37 ° C com uma velocidade de agitação de 1.000 rpm.
- Centrifugar a mistura de enzimas e tecidos a 30 xg à TA por 3 min e decantar o sobrenadante pegajoso que contém principalmente o esperma.
- Ressuspender o sedimento em 1 mL de IMDM completo para apagar toda a atividade enzimática. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mL contendo 49 mL de RPMI (+ P / S 1: 100).
NOTA: Opcionalmente, filtre a suspensão celular através de uma membrana de malha de 100 μm com triturat constantePara evitar grandes agregados celulares. No entanto, não use um filtro de malha se a suspensão celular for necessária para o crescimento de células monocamadas. - Centrifugar a mistura celular a 30 xg à TA por 10 min; Decanta o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 1 ml de IMDM completo com trituração suave durante pelo menos 5 minutos para dissociar células únicas das misturas de tecido epidídmico tratado enzimáticamente.
- Separação de células epiteliais de outras células em condições assépticas
- Cultive a suspensão celular em uma placa de Petri de 10 cm contendo Full-IMDM durante pelo menos 8 h ou durante a noite, em uma incubadora a 32 ° C em 5% de CO 2 .
- Prepare lamínulas esterilizadas com antecedência por imersão em 100% de álcool. Ar seco e mergulhar em um pequeno volume do meio de cultura. Coloque os lamínulas em pratos de cultura de 6 cm ou em poços simples de uma placa de 24 poços.
- Na manhã seguinte, colhe as células epiteliais dissociadas coletando suavemente o suspen celularA partir da placa de Petri, que consiste principalmente em células epiteliais. Centrifugar a suspensão celular a 30 xg à TA por 5 min, e depois decantar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento celular em ~ 2 mL Full-IMDM.
- Semear 0,2 mL da suspensão de células colhidas no centro de cada lamínula esterilizada.
- Deixe a suspensão celular se depositar na gota de líquido durante pelo menos 10 minutos para permitir que as células aderem vagamente aos lamínulas de vidro. Adicione com cuidado 1 ml de IMDM completo na ponta de 10 cm de prato ou 0,3 mL de IMDM completo em cada poço de uma placa de 24 poços; Não perturbe células.
- Mantenha as células solteiras isoladas em lamínulas na incubadora a 32 ° C em 5% de CO 2 até as experiências de patch-clamp.
3. Soluções de gravação e micropipetas
NOTA: Para as experiências de patch-clamp, use produtos químicos e soluções de melhor qualidade.
- Preparação de soluções de estoque
- Autoclave todas as garrafas para armazenamento de estoque e filtre todas as soluções de estoque (exceto as soluções corrosivas) e filtre através de membranas de 0,22 μm antes de usar.
- Prepare todas as soluções de estoque antecipadamente na RT e armazene a 4 o C: NaCl 5 M; 1 M KCl; 100 mM de MgCl 2; 100 mM de CaCl 2; 200 mM de NaH 2 PO 4; EGTA 100 mM (pH 7,0 com KOH). Manusear 5 M NaOH, 1 M HCl e 1 M KOH como soluções corrosivas.
- Preparação de solução de sal fisiológica de registro externo padrão (PSS)
- Aqueça as soluções de estoque para a RT na manhã da gravação do patch-clamp.
- Pipetar os ingredientes a partir de cada unidade de acordo com o volume final desejado, com excepção de CaCl2, por exemplo, para a preparação de 500 mL de PSS: NaCl a 140 mM = 14 mL de 5M; KCl 5 mM = 2,5 mL de 1M; 1,2 mM de MgCl 2 = 6 ml de 100 mM; 1,2 mM de NaH 2 PO 4 = 3 mL de 200 mM.
- Adicionar o dobro- água destilada (ddH 2 O) até o volume final de 400 mL e equilibrar.
- Pesar 0,9 g de glicose e 1,19 g de HEPES e dissolver completamente na mistura de solução.
- Adicionar o estoque de CaCl2 (2,5 mM = 12,5 mL de 100 mM) com agitação.
- Adicione até 99% do volume final.
- Ajuste o pH para 7,4 utilizando NaOH ou HCl.
- Verifique a osmolaridade e ajuste usando NaCl 5 M ou glicose, se necessário.
- Adicione ddH 2 O ao volume final de 500 mL em um cilindro.
- Preparação de soluções internas de micropipetas (baixas soluções baseadas em EGTA K + )
- Pesar ou pipetar o volume correto dos reagentes de cada estoque de acordo com o volume e a concentração final desejados, por exemplo , para preparar 50 mL de solução intracelular baixa em EGTA K + com um volume de ~ 30 mL de ddH 2 O: K-gluconato de 100 mM = 1,17 g; KCl 35 mM = 1,75 mL de 1 M; 2 mM de MgCl 2 = 1 mLDe 100 mM; EGTA 0,1 mM = 0,05 mL de 100 mM; HEPES 10 mM = 0,072 g.
- Adicione água suficiente para ~ 95% do volume final e permita que a solução se equilibre na RT. Certifique-se de que a solução está clara.
- Ao mexer constantemente a solução, ajuste o pH para 7,2 usando KOH.
- Pesar e adicionar 0,078 g de Mg-ATP à solução até que seja completamente dissolvido.
- Coloque a solução no gelo e use uma pequena alíquota para medir a osmolaridade; Tipicamente, as soluções medem ~ 290 mOsmol e não precisam de ajuste. Se a osmolaridade difere significativamente de 280-295 mOsmol, prepare uma nova solução.
- Adicione ddH 2 O ao volume final.
- Divida a solução em alíquotas de 500 μL, filtre com um filtro de seringa de 0,2 μm, feche e feche imediatamente a ≤ -20 ° C.
- Na data do experimento de patch-clamp, descongelar uma alíquota de solução intracelular no gelo e manter a temperatura ambiente durante o experimento de patch-clamp paraEvitar a degradação.
- Puxe as pipetas de remendo dos capilares de vidro (seguindo o manual do usuário do extrator de pipeta) para obter tamanhos de micropipetas com resistência de 5-10 M quando preenchidos com solução intracelular.
4. Configurando o Patch-Clamp Experiment e estabelecendo a configuração de células inteiras com células
- Configurando o experimento de patch-clamp
- Ligue a configuração do patch-clamp (computador, amplificador controlado por computador, digitalizador, etc. )
- Abra o software patch-clamp ( por exemplo, AXON pCLAMP10 ou HEKA PatchMaster) e configure os protocolos para gravações eletrofisiológicas. Defina o filtro para o sinal passar baixo a 1-3 kHz e o digitalizador a 10-20 kHz.
- Ligue a câmera, micromanipulador e fonte de luz.
- Quando o amplificador controlado pelo computador está ligado, aplique o corpo do experimentador tocando com as mãos o equipamento de grampos e grampos que foi aterrado,Antes de tocar o headstage, para protegê-lo de choques elétricos.
- Transfira as células epiteliais de cultura no lamínula de vidro para a câmara de gravação preenchida com ~ 1 mL de PSS padrão à RT. Altere cuidadosamente o PSS de banho pelo menos duas vezes usando uma pipeta antes de qualquer experimento de patch-clamp.
NOTA: Opcionalmente, preencha o sistema de perfusão com PSS padrão ou outra solução externa de acordo com a experiência planejada. Perfogue a câmara de gravação montada no microscópio (RC-26G ou RC-26GLP) com PSS algumas vezes a uma velocidade de ~ 2 mL / min antes do início das experiências de patch-clamp. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas ao longo do sistema de perfusão. - Visualize e selecione as células sob um microscópio invertido com objetivos 10X e 40X equipados com um sistema óptico de contraste de interferência diferencial. Procure grandes células isoladas isoladas para gravação. Identificar as células epiteliais epididimais isoladas por sua forma esférica com m ásperoIcrovilli em uma extremidade das membranas e distribuição polarizada de conteúdo intracelular ( Figura 1 ).
- Usando uma seringa de 1 mL (uma agulha de microondas não metálicas), preencha uma micropipeta com a solução interna (solução baixa baseada em EGTA K + , ver passo 3.3). Certifique-se de que não há bolhas de ar na micropipeta, o que pode aumentar a resistência da micropipeta. Use solução suficiente para que a solução interna submerja o eletrodo de arame de prata revestido com cloreto dentro do suporte de micropipetas.
- Monte a micropipleta no suporte do eletrodo e aplique uma baixa pressão positiva (volume de seringa de 0,2 mL). Mantenha a pressão positiva baixa contínua até tocar a membrana celular nas etapas posteriores.
- Estabelecendo configuração de células inteiras com células para gravações
- Mergulhe a pipeta na solução do banho à velocidade máxima do micromanipulador. Encontre a pipetaDica na tela conectada à câmera digital; Desacelere a velocidade do micromanipulador para o modo médio-alto.
- Verifique rapidamente a resistência da micropipleta (5-10 MΩ) usando o comando da interface de aquisição de dados ( por exemplo, "Teste de Membrana" no sistema AXON), aplicando um passo de tensão ( por exemplo, 5 mV por 100 ms) gerado a partir do amplificador controlado por computador. Mude para uma nova micropipeta se a resistência estiver significativamente fora desse intervalo.
- Comece a deslocar o objetivo montado no microscópio; Guie gradualmente a micropipeta em direção à célula selecionada. Abaixe sempre o objetivo primeiro e, em seguida, abaixe a micropipeta para o plano de foco, até que a micropipeta esteja acima da superfície central da célula selecionada.
- Cancelar o potencial de junção de líquido entre as soluções de pipeta e banho para zero usando o comando "Pipette offset" na interface de comando do software.
- Defina o comando amplificador controlado por computadorE para a tensão-braçadeira e a prova de membrana para o modo "Banho".
- Foco para uma visão mais clara da célula, depois baixe gradualmente a micropipeta usando o micromanipulador na velocidade baixa-média.
- Quando a micropipeta está próxima da célula (demonstrada por uma corrente diminuída quando acionada pelo comando de teste da membrana), remova a pressão positiva baixa imediatamente e aplique uma pressão negativa fraca (0,1 mL de volume da seringa) para formar o gigaseal (> 1 GΩ) .
- Monitorize a resistência com o teste de membrana. Se a resistência for> 500 MΩ, mas <1 GΩ, aplique um potencial negativo (geralmente como o potencial de retenção definido para -60 mV), que pode ajudar a formar o gigaseal. Compensar a corrente capacitiva transitória da micropipeta.
- Se a vedação for> 1 GΩ e estável (como mostrado na interface do software), aplique uma sucção breve e forte para quebrar a membrana celular. Não aplique uma compensação pelo seE a capacitância celular.
- Imediatamente após alcançar uma configuração bem sucedida de células inteiras, aplique um passo de hiperpolarização de 10 mV (5 traços com intervalos de tempo mínimos, 20 ms de duração, amostra de sinal a 20 kHz) a partir de um potencial de espera de -60 mV.
- Mude o modo de tensão para o modo de corrente zero e marque as leituras da interface do software ou execute uma gravação sem espaço (10-60 s) para as leituras de potencial da membrana da célula.
- Volte rapidamente e permaneça no modo de tensão e aplique os protocolos de tensão de acordo com as experiências planejadas e mire as respostas atuais. A subtração não é aplicada à corrente de vazamento intrínseca durante as gravações.
- Monitorize a estabilidade das respostas durante as gravações ou os diferentes parâmetros da célula. Por exemplo, use a interface de comando "Membrane Test" para verificar a resistência de entrada (R i ), a resistência da série (R s ) e a célulaCapacitância de membrana (C m ) no teste de membrana no modo "Celda" durante a troca de protocolos.
NOTA: gotas súbitas na resistência de entrada são geralmente indicativas de um remendo solto, e um aumento dramático na resistência da série pode ser indicativo de obstrução da ponta da micropipeta pelas organelas intracelulares ou fragmentos de membrana. Durante a gravação, monitore regularmente o local da micropipette para verificar se ocorre a deriva, o que pode levar à perda do patch. Se a deriva for um problema, levante cuidadosamente a micropipeta e a célula de remendo longe da parte inferior da câmara de gravação. Este passo às vezes pode levar à perda do patch, caso em que é necessário repetir o procedimento de grampo-grampo de células inteiras.
5. Análise das propriedades eletrofisiológicas passivas das células
- Depois de obter os dados das experiências de patch-clamp, abra os dados livres de lacunas no software Clampfit e mire a médiaValor para o potencial de membrana em repouso para cada célula. Alternativamente, use o valor como marcado para baixo a partir da tensão de corrente zero no modo atual. Corrija os valores com potencial de junção líquida (12,4 mV neste estudo).
- Abra os dados a partir do passo hiperpolarizante 10-mV (? V) obtido a partir de uma célula, medir a diferença de corrente antes e durante o passo (Δ eu passo), e calcular a resistência de entrada (R i) utilizando a equação como:
- Calcule a capacitância da célula (C m , na unidade de pF) (use os mesmos dados atuais do passo de hiperpolarização de 10 mV integrando a área total sob a corrente do capacitor de membrana durante a corrente de decaimento do transiente inicial levantada sobre o gatilho da etapa de tensão) Para obter o valor da carga total acumulada (Q, na unidade de pA • ms) da célula. Use a seguinte equação:
- Calcule o valor da resistência da série (R s ) para cada célula ajustando a corrente transitória inicial do passo negativo de 10 mV com um algoritmo exponencial padrão para obter a corrente de decaimento da constante de tempo ( T , na unidade de ms) e use a Seguinte equação:
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Representative Results
O procedimento de digestão enzimática descrito para o isolamento de células epiteliais dos epidídimos de cauda de rato é um protocolo modificado de nossos estudos anteriores 9 , 12 . Este método produz uma mistura de células individuais com mais de 90% de viabilidade e sem bolhas de superfície ou volume de células inchadas. A mistura celular heterogênea consiste principalmente de células principais, células claras e células basais, como descrevemos anteriormente 1 . Neste protocolo, as amostras relativamente puras de células epiteliais epididimais podem ser obtidas cultivando as células primárias dissociadas durante a noite numa placa de Petri para permitir a adesão das células não epiteliais (tais como, fibroblastos e células lisas) no prato, como Demonstrado na Figura 1A (antes da colheita). Os tipos de células podem então ser preliminarmente distinguidos por seus fenótipos ao microscópioE categorizados de acordo com suas propriedades específicas da membrana passiva. Na mistura celular dissociada, há um grupo de células que possuem microvilosidades ou uma membrana áspera em uma extremidade de sua membrana de superfície e conteúdo celular polarizado; Estas são chamadas de células principais ou células claras ( Figura 1B , setas). Essas células epiteliais polarizadas são indistinguíveis por suas características morfológicas, mas podem ser identificadas de acordo com suas propriedades da membrana passiva e respostas de condutância obtidas a partir das gravações de grampos-grampos de células inteiras. O outro grupo de células é de tamanho menor sem esterexônica em uma extremidade da membrana e sem conteúdo celular polarizado óbvio; Estas são denominadas células não-microvillis e consistem principalmente em células basais ( Figura 1B , asteriscos).
As principais células principais epiteliais podem ser distinguidas de outras células peloAs propriedades da membrana passiva distinta ( Figura 2 ) e os padrões de corrente ( Figura 3 ) em resposta ao protocolo de tensão aplicada usando a técnica de grampo-grampo de toda a célula. As propriedades eletrofisiológicas da membrana passiva das células podem ajudar a avaliar o estado de saúde inicial das células individuais e dos grupos de células. Um resumo das parcelas de pontos individuais da capacitância da membrana (C m ), a resistência de entrada (R m ) e o potencial da membrana (V m ) de cada grupo celular são dados na Figura 2A . Não há diferença na constante de tempo para a capacitância da membrana entre os diferentes tipos de células (~ 0.4 ms) (os dados não são demonstrados neste manuscrito). Usando a solução baixa com base em EGTA K + , a capacitância medida média da membrana para as células principais é 9,4 0,5 pF (n = 32) e para as células claras é de 9,7 1,9 pF (n = 12). A capacitância da membrana deAs células não microvillíis são de 5.2 0.8 pF (n = 17), que é estatisticamente menor do que as capacidades de membrana das células principais e claras.
A resistência de entrada das células principais na Figura 2A (painel do meio) é de 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) e a das células claras é de 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), o que é significativamente menor (P <0,001) do que A das células não-microvilli (8,9 ± 2,1 GΩ; n = 17). Conforme ilustrado na Figura 2A (painel direito), o potencial de membrana de corrente zero ( ou seja, o potencial de membrana em repouso V m ) foi medido logo após o estabelecimento da configuração de células inteiras e usado para comparar os grupos após a correção com o potencial de junção líquida (12.4 MV). As células foram banhadas rotineiramente em PSS padrão e dialisadas com solução de pipeta à base de EGTA K + 0,1 mM contendo ATP. ElesO potencial de membrana ean das células principais é -26 ± 2 (n = 28), entre -51 mV e +1 mV, e o potencial médio da membrana das células claras é de -30 ± 3 mV (n = 10), Entre-47 mV e -17 mV. As células não-microvilli possuem o maior potencial médio de membrana com um valor de -33 ± 5 mV (n = 17), entre -63 mV e -13 mV.
A baixa resistência de entrada das células principais sugere que existem condutâncias intrínsecas nessas células, mas pode indicar vazamento da vedação entre a pipeta e as membranas celulares patch. Para resolver essa preocupação, primeiro excluímos os dados dessas células com mudanças repentinas (indicativas de vazamento de vedação) das propriedades elétricas durante as gravações. Em seguida, analisamos a correlação entre a resistência de vedação em um limiar de 1 giga-ohm com a resistência de entrada, conforme demonstrado na Figura 2B . O resultado foi um valor de correlação muito baixo (R 2 ≈ 0,02). Isto sugere que a resistência de vedação tem influência insignificante sobre a resistência de entrada e que as propriedades elétricas passivas relatadas das várias células (como a baixa resistência de entrada das células principais) são as propriedades intrínsecas dessas células.
A Figura 3A é a resposta atual típica registrada das células principais em condições quase fisiológicas, com as células se banhando em solução de sal fisiológica normal (PSS), dialisadas com uma solução de pipeta baixa com EGTA K e estimuladas a partir de um potencial de retenção de -60 mV Para uma série de tensões de teste de 500 ms (variando de -120 mV a +60 mV como indicado na inserção da Figura 3B ). Os dois traçados na Figura 3C mostram as respostas típicas da membrana de repouso de uma célula principal identificada sob o grampo de corrente zero na presença de, ouAusência de ATP na solução de pipeta. Na presença de ATP, o potencial de repouso é relativamente estável. Enquanto uma hiperpolarização progressiva foi observada quando as células foram dialisadas com uma solução de pipeta sem ATP. O potencial de membrana de repouso inicial medido no início da diálise celular com soluções de pipeta não mostra diferença significativa nas células com ou sem ATP ( Figura 3D ), sugerindo que os valores medidos ainda estavam intactos e minimamente influenciados pelas soluções de pipeta.
Figura 1 : Características morfológicas de células epiteliais epididimais de cauda isolada de ratos. ( A, B ) Exemplos de células epiteliais isoladas dos epidídimos de cauda de rato antes ( A ) e após ( B ) re-colheita de oveCulinária de noite no prato antes das experiências de patch-clamp. As setas indicam as células microvélicas, que consistem principalmente nas células principais e nas células claras. Os asteriscos indicam as células não-microvilli. Somente células únicas foram selecionadas para gravação de patch-clamp. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Propriedades da membrana passiva das células epiteliais epididimais de uma única cauda de rato. ( A ) Parcelas das propriedades da membrana passiva das células epiteliais epididimais de uma única cauda de rato. A solução de pipeta é baixa EGTA K + e a solução de banho é padrão PSS. ( B ) Análise de correlação da entrada resCom a resistência do vedante das células. NS : nenhuma diferença significativa, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 diferença significativa versus controles apropriados usando ANOVA unidirecional com teste Bonferroni pós-hoc. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Correntes de células inteiras típicas em células principais epididimais únicas. ( A ) Correntes de células inteiras típicas registradas a partir de células epiteliais epididimais isoladas registradas em condições quase fisiológicas usando um protocolo de liberação de pulso como mostrado na inserção do panal B. A linha pontilhada indicou os níveis de corrente zero. ( B ) A relação corrente-tensão da responsabilidade atualÉ medido nos pontos de tempo indicados como em A. Os dados são a média ± SEM de oito células principais de pelo menos três animais. ( C ) Traços representativos do potencial de membrana em repouso das células principais dialisadas com uma solução de pipeta, com ATP (+ ATP) ou sem ATP (-ATP). ( D ) Um gráfico de barras que não mostra diferença significativa entre o potencial da membrana de repouso inicial de + ATP e -ATP. Os valores são médias ± SEM medidas no momento indicado no painel C. Os números entre colchetes dentro das barras indicam o número de células testadas de pelo menos três animais. NS : nenhuma diferença significativa. ( E ) Análises de correlação da resistência do selo e a resistência de entrada de todas as células, ou apenas as células principais, em comparação com as membranas de repouso medidas na braçadeira de corrente zero logo após o estabelecimento da célula inteira e as magnitudes atuais medidas na hiperpolarização Passo para -100 mV de manter pOtencial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste protocolo, a dispersão enzimática dos epidídimos de cauda de ratos produziu consistentemente células epiteliais saudáveis. A qualidade das células epiteliais epidídmicas para as experiências de grampos e grampo depende de alguns passos críticos no protocolo. Por exemplo, a centrifugação da mistura celular com baixa força centrífuga (30 xg) é importante para remover os espermatozóides e o conteúdo luminal epidídmico; As células epiteliais epididimais tornam-se pouco saudáveis na presença dos espermatozóides na cultura celular. Além disso, cultivar a mistura de células dissociadas em uma placa de Petri durante várias horas é um passo importante para remover os fibroblastos e as células do músculo liso; As células não epiteliais aderem mais rapidamente no prato de cultura e, assim, deixando as células epiteliais na suspensão, que podem ser recobradas por aspiração suave. Além disso, a digestão com colagenase ea trituração com uma pipeta de vidro fino são as duas etapas importantes para a liberaçãoCélulas individuais durante o procedimento de dissociação celular. Finalmente, a digestão enzimática das células epididimais é crítica para o experimento de grampo-grampo porque a sub-digestão por atividade enzimática ineficiente ou sobre-digestão por incubação prolongada pode tanto perturbar a formação de vedação giga-ohm entre a pipeta e as membranas celulares.
Nas misturas celulares, as células em uma forma maior, em coluna, com uma membrana áspera que possui estereocilia em uma extremidade e a distribuição polarizada do conteúdo intracelular são presumivelmente as células principais ou as células claras. Outras células que não possuem proeminentes microvillis e conteúdos de células polarizadas podem incluir células basais e algumas células do sistema imunológico. Além de descrever características morfológicas básicas das células epiteliais epididimais, este protocolo emprega o método de grampo-grampo inteiro para medir a propriedade da membrana passiva de cada célula. Essas propriedades da membrana permitem a distinção preliminar deOs tipos de células. Este método possui algumas limitações, como lavagem do conteúdo intracelular com a solução de pipeta e variações eletrônicas em relação às modificações da arquitetura celular durante as gravações contínuas 19 , 20 . Nós fornecemos apenas os parâmetros que medimos imediatamente após o estabelecimento da configuração de células inteiras, que refletem as condições iniciais e relativamente intactas das células. As propriedades da membrana passiva de cada célula incluem a capacitância da membrana, a resistência de entrada e o potencial da membrana em repouso.
A capacitância específica das membranas celulares geralmente é aceita como sendo 1 μF / cm 2 e isso é válido para células (como células imunes e neurônios) com dobradura limitada em suas membranas celulares 16 , 18 . No entanto, a constante de capacitância específica tende a ser maior para células wArquiteturas celulares mais complexas, como as células epiteliais, que possuem muitas dobras de membrana celular em compartimentos distintos. Os relatórios indicam que os valores da linha celular epitelial MDCK são de 4 μF / cm 2 e 3 μF / cm 2 para as capacitâncias específicas da membrana apical e basal, respectivamente 17 . No presente estudo, as capacitâncias de membrana médios medidos são ~ 8 pF e ~ 12 pF para o grupo de células não-microvilosidades e o grupo de células principais e as células claro semelhantes (ou seja, microvilosidades-células), respectivamente. Usando a capacitância específica de 1 μF / cm 2 para nossos cálculos, as áreas estimadas de superfície celular são 500 μm 2 e 1.000 μm 2 para as células não-microvilli e as células microvilas, respectivamente, o que corresponde aos diâmetros de 13 μm e 18 Μm. No entanto, essas estimativas são maiores do que o esperado com base nos tamanhos das células sob o microscópio, que são ~ 81; m e ~ 12 mm para não-microvilosidades células e células microvilosidades, respectivamente, e estas células são cerca de 2,4 uF / cm 2 e 1,9 uF / cm 2, respectivamente. Nossos resultados indicam que a paisagem da membrana das células não-microviliares é mais complexa do que a das células micro-vilões, o que é consistente com suas secreções e funções de transporte.
A capacitância específica das membranas celulares geralmente é aceita como sendo 1 μF / cm 2 e isso é válido para células (como células imunes e neurônios) com dobradura limitada em suas membranas celulares 16 , 18 . No entanto, a constante de capacitância específica tende a ser maior para células com arquiteturas celulares mais complexas, como as células epiteliais, que possuem muitas dobras de membrana celular em compartimentos distintos. Os relatórios indicam que os valores da linha celular epitelial MDCK são 4 μF / cm 2 e 3 μF / cm 2 17 . No presente estudo, as capacitâncias de membrana médios medidos são ~ 8 pF e ~ 12 pF para o grupo de células não-microvilosidades e o grupo de células principais e as células claro semelhantes (ou seja, microvilosidades-células), respectivamente. Usando a capacitância específica de 1 μF / cm 2 para nossos cálculos, as áreas estimadas de superfície celular são 500 μm 2 e 1.000 μm 2 para as células não-microvilli e as células microvilas, respectivamente, o que corresponde aos diâmetros de 13 μm e 18 Μm. No entanto, essas estimativas são maiores do que o esperado com base nos tamanhos de células no microscópio, são ~ 8 μm e ~ 12 μm para células não microvilli e células microvilli, respectivamente, e essas células são melhor compatíveis com um valor de capacitância específico 2 μF / cm 2 . Isso sugere que a paisagem da membrana das células epiteliais epididimais é morE complexo do que outros tipos de células, o que é consistente com suas funções de secreção e transporte.
Nas gravações de células inteiras, a condutância de vazamento através da membrana e na vedação entre a membrana e a pipeta contribuíram para as propriedades da membrana medida. O selo tem uma resistência significativamente maior do que a membrana e, portanto, tem influência mínima na medida das propriedades da membrana passiva, como a resistência de entrada e o potencial de membrana de corrente zero. Consistente com essa noção, a análise de correlação da resistência de vedação em um limite de 1 giga-ohm contra a resistência de entrada de cada célula resultou em um valor de ~ 0,02, sugerindo uma influência muito fraca. Outras análises de correlação da resistência de vedação ou da resistência de entrada versus os potenciais de membrana em repouso ou a magnitude atual medida a -100 mV também proporcionaram valores baixos para todas as células testadas ou apenas para as células principais. Nossos resultados deMostram que a resistência de entrada das células principais epididimais e das células claras é significativamente menor do que as células não-microvilli, proporcionando assim um parâmetro preliminar para o julgamento para diferenciar os tipos de células. Estes resultados sugerem que a baixa resistência de entrada nas células principais é uma propriedade fisiológica intrínseca das células. As células epiteliais únicas também possuem padrões de corrente distintos em resposta aos protocolos aplicados e às condições experimentais. Observamos que cada tipo de célula definida apresentava padrões de corrente únicos sob o mesmo protocolo de tensão aplicada. Um exemplo mostrado na Figura 3 demonstra as respostas atuais típicas registradas das células principais em condições quase fisiológicas, como já relatamos 9 . As características eletrofisiológicas de cada tipo celular especializado são prontamente diferenciadas (os dados não são mostrados neste artigo). Com base nesses parâmetros,Os diferentes tipos de células podem ser grosseiramente categorizados nas células principais, as células claras e as células não-microvilli, conforme descrito nos resultados.
A resistência de entrada é a resistência da membrana em resposta ao passo de potencial aplicado (etapa de hiperpolarização de 10 mV neste estudo) induzida por um potencial de retenção de -60 mV. Isso reflete a extensão da atividade de canal aberto em resposta ao potencial aplicado. A este respeito, uma baixa resistência implica uma elevada condutância intrínseca de "vazamento" das células, enquanto uma alta resistência implica canais fechados. O baixo valor da resistência de entrada nas células principais corresponde à condutância da membrana proeminente, enquanto que as células claras que possuem uma pequena condutância no potencial de membrana de teste implicam sua condutância moderada nas condições de gravação. A resistência de entrada significativamente alta das células não-microvilli implica que não possuem canais abertos nesse estado. No zero-cuBraçadeira rura, os potenciais de membrana de repouso médios das células epiteliais isoladas medidas estão na faixa de 26-33 mV para os três grupos celulares. Esses valores são comparáveis ao potencial de membrana relatado (-30 mV) usando o método do microeletrodo 21 . No entanto, os potenciais de repouso medidos variam amplamente em células individuais (de +3 mV a -63 mV) apesar da ausência de potenciais de espiga espontâneos. Essa variação pode refletir a interação de diferentes atividades do canal iónico em vários tipos de células, como a interação acoplada dos canais TRPV6 e TMEM16A nas células principais, como relatamos recentemente 9 . Vale ressaltar que, quando as células foram dialisadas com a pipeta ATP, não observamos potenciais elétricos espontâneos nas células principais; Isso concorda com a classificação das células epiteliais como não excitante 4 . Uma hiperpolarização progressiva quando as células foram dialisadas com o piA solução Pette sem ATP pode refletir a aparência gradual de uma corrente de potássio sensível a ATP. Foi relatado que os canais de potássio sensíveis a ATP são expressos no aparelho de Golgi das células principais do epidídimo de rato e que a depleção do ATP intracelular leva à ativação dos canais K ATP 14 , 22 . Esta observação sugere que a inclusão de ATP na solução de pipeta favorece as condições fisiológicas estáveis das células principais epididimais.
A técnica de grampo-grampo de células inteiras é um método bem estabelecido que é comumente usado para estudar eletrofisiologia de células excitáveis, como neurônios. Neste trabalho, mostramos que ele também é uma ferramenta útil para a caracterização de propriedades bioelétricas de células não excitáveis, como células epiteliais. Além disso, este protocolo permite investigações funcionais do epidídimo isolado primárioCélulas epiteliais para elucidar ainda mais o seu papel fisiológico no epidídimo. Este estudo fornece algumas propriedades elétricas preliminares das células epiteliais isoladas do epidídimo da cauda do rato para ajudar as investigações futuras do comportamento fisiológico dessas células e sua relevância biológica subjacente no epidídimo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Christopher Antos por comentários úteis sobre o texto. Este trabalho foi apoiado por fundos de inicialização da Universidade ShanghaiTech concedidos a Winnie Shum e pelo financiamento da National Natural Science Foundation of China (NNSFC nº 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
- Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
- Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
- Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
- Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
- Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
- Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
- Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
- Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
- Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
- Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
- Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
- Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
- Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
- Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
- Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
- Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
- Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
- Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
- Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
- Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280 (1976).
- Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).
