Summary
Se presenta un protocolo que combina el aislamiento de células y de células enteras patch-clamp de registro para medir las propiedades eléctricas de la primaria células epiteliales disociadas de la cauda de la rata epididimidas. Este protocolo permite investigar las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales primarias para dilucidar adicionalmente el papel fisiológico del epidídimo.
Abstract
El epidídimo es un órgano esencial para la maduración de los espermatozoides y la salud reproductiva. El epitelio epidídimo consiste en tipos de células intrínsecamente conectados que son distintos no sólo en características moleculares y morfológicas sino también en propiedades fisiológicas. Estas diferencias reflejan sus diversas funciones, que en conjunto establecen el microambiente necesario para el desarrollo de espermatozoides post-testicular en el lumen epididimario. La comprensión de las propiedades biofísicas de las células epiteliales epididimales es crítica para revelar sus funciones en el esperma y la salud reproductiva, tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas. Mientras que sus propiedades funcionales aún no se han dilucidado completamente, las células epiteliales epididimales se pueden estudiar mediante la técnica de parche-clamp, una herramienta para medir los eventos celulares y las propiedades de membrana de células individuales. Aquí, describimos los métodos de aislamiento de células y de células enteras de pinza de sujeción de grabación a meaAsegúrese de las propiedades eléctricas de las células epiteliales disociadas primarias de la rata cauda epididimidos.
Introduction
El epidídimo en el tracto reproductor masculino es un órgano revestido con una capa de células epiteliales de mosaico. Al igual que en otros tejidos epiteliales, los diversos tipos celulares del epitelio epidídimo, incluyendo células principales, células claras, células basales y células de los sistemas inmunológico y linfático, trabajan de manera concertada para funcionar como la barrera en el frente del túbulo y como Células de apoyo para la maduración de los espermatozoides y la fisiología 1 , 2 , 3 . Por lo tanto, estas células epiteliales desempeñan un papel esencial en la salud reproductiva.
Las células epiteliales se consideran generalmente como células no excitables que son incapaces de generar potenciales de acción de todo o nada en respuesta a los estímulos despolarizantes, debido a la falta de canales de Na + o Ca 2 + con voltaje controlado 4 , 5 . Sin embargo, las células epiteliales expresan uniQue conjuntos de canales de iones y los transportadores que regulan sus funciones fisiológicas especializadas, como la secreción y el transporte de nutrientes [ 6] . Diferentes células epiteliales, por lo tanto, poseen características eléctricas características. Por ejemplo, las células principales expresan el CFTR para el transporte de fluidos y cloruros y expresan el TRPV6 para la reabsorción de calcio, mientras que las células claras expresan la bomba de protones V-ATPasa para la acidificación luminal 1 , 7 , 8 , 9 . Algunos transportadores y canales iónicos que regulan las características fisiológicas de las células epiteliales epididimales han sido reportados, pero las propiedades funcionales de las células epiteliales epididimales en gran parte aún no se conocen 10 , 11 , 12 , 13 .
WhOle-cell patch-clamp es una técnica bien establecida para examinar las propiedades intrínsecas de ambas células excitables y no excitables, y es particularmente útil para estudiar las funciones de células primariamente disociadas en muestras de células heterogéneas; La pinza de tensión se utiliza para medir las propiedades de la membrana pasiva y las corrientes iónicas de las células individuales 14 , 15 . Las propiedades de la membrana pasiva incluyen resistencia de entrada y capacitancia. El primer parámetro indica la conductancia intrínseca de la membrana, mientras que el segundo implica el área superficial de la membrana celular (una bicapa de fosfolípidos, donde están localizados los canales iónicos y los transportadores, que sirve como aislante fino que separa los medios extracelulares e intracelulares). La capacitancia de la membrana es directamente proporcional a la superficie de la membrana celular. Junto con la resistencia de la membrana que se refleja por la resistencia de entrada, la constante de tiempo de la membrana, wQue indica la rapidez con que el potencial de la membrana celular responde al flujo de las corrientes de los canales iónicos. A este respecto, al combinar las características de respuesta de corriente de una serie de etapas de tensión aplicadas a las células, se determinan las cinéticas biofísicas y las propiedades de las células 15 , 16 , 17 , 18 .
En el presente artículo se describen los procedimientos para aislar células epiteliales del epidídimo de cauda de rata y los pasos para medir las propiedades de membrana de diferentes tipos de células en la mezcla de células disociadas usando la abrazadera de parche de células enteras. Se muestra que las células epididimales principales exhiben propiedades electrofisiológicas de membrana distintas y que las conductancias pueden identificarse fácilmente a partir de otros tipos de células.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se llevan a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Shanghai, que cumplen con los requisitos locales e internacionales.
1. Animales Experimentales
- Utilizar ratas Sprague-Dawley macho adultas (~ 300-450 g) entre 8-12 semanas de edad. A esta edad en las ratas, los espermatozoides han llegado a la cauda epididimida.
2. Aislamiento de las células epiteliales de los epididimidos de la cauda de la rata
NOTA: Los siguientes pasos se realizan bajo condiciones no asépticas, a menos que se indique lo contrario.
- Preparación de instrumentos de disección y reactivos
- Desinfecte las herramientas de disección por inmersión en etanol al 70% y deje que se sequen al aire.
- Encienda el baño de calentamiento (32 ° C); Preparar y precalentar 500 ml de 1x medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) suplementado con 1% (v / v) de antibióticoTics (100 U / mL de penicilina y 100 μg / mL de estreptomicina final), y marcado como "RPMI (+ P / S 1: 100)". Realice este paso en una estación de trabajo controlada por flujo de aire limpio.
- Preparar y precalentar 1x 500 ml de Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) que contiene aminoácidos no esenciales (0,1 mM) y piruvato de sodio (1 mM), y suplementado con 5-α-dihidrotestosterona (1 nM), 10% de bovino fetal Suero, 1% (v / v) de antibióticos (100 U / mL de penicilina y 100 mu g / ml de estreptomicina final) y se marcó como "Full-IMDM". Crear alícuotas de 50 ml y sellar con parafilm; Almacenar a 4 ° C. Use condiciones asépticas.
- Preparar una solución de digestión de la enzima colagenasa disolviendo colagenasa Tipo I y colagenasa Tipo II en RPMI (+ P / S 1: 100) dando como resultado 1 mg / ml de cada colagenasa en la solución. Filtrar a través de una membrana de 0,22 μm y marcar como "Solución de colagenasa". Mantener a temperatura ambiente (RT) hasta su uso. Ajustar el volumen de la solución enzimáticaSobre el peso de la enzima; El volumen mínimo requerido para ambos epididimidos de cauda de una sola rata es de 2 ml.
- Llenar un plato de 35 mm con RPMI (+ P / S 1: 100).
- Disección de los epidídimos de cauda de rata
- Sacrificar al animal utilizando pentobarbital sódico 85 mg / kg ip o utilizando una cámara de isoflurano hasta que el animal no responda a la estimulación de la pinza de la cola; Siga por dislocación cervical.
- Desinfecte el bajo vientre limpiándolo con etanol al 70%, empuje suavemente los dos testículos hasta el abdomen inferior y luego abra el abdomen inferior cerca del escroto.
- Recoger la grasa epididimal, diseccionar todos los órganos reproductivos (testículos, epididimidos y conductos deferentes) y sumergir en el plato con RPMI (+ P / S 1: 100).
- Transferir los órganos reproductores en el plato con RPMI (+ P / S 1: 100) a una estación de trabajo aséptica.
- Diseccionar los epididimidos de la cauda de los tejidos conectivos y grasos y el epiCápsula didymal. Coloque un epidídimo con ~ 0.2 ml de solución de colagenasa en un tubo de 1.5 ml. Realice este paso en una estación de trabajo controlada por flujo de aire limpio.
- Disociación de células individuales de los epidídimos de cauda de rata
- Cortar los epididimidos en la solución de colagenasa con tijeras finas hasta que el tejido se convierte en un líquido de tipo pasta. Enjuague las tijeras suavemente con el resto de la solución de enzima (~ 0,8 ml) en el tubo de 1,5 ml.
- Colocar el tubo en un termomixer de metal durante 30 min a 37 ° C con una velocidad de agitación de 1.000 rpm.
- Centrifugar la mezcla de enzima-tejido a 30 xg a RT durante 3 min y decantar el sobrenadante pegajoso que contiene principalmente el esperma.
- Resuspender el gránulo en 1 mL de IMDM completo para apagar toda la actividad enzimática. Transferir la suspensión celular a un tubo de 50 ml que contiene 49 ml de RPMI (+ P / S 1: 100).
NOTA: Opcionalmente, filtrar la suspensión celular a través de una membrana de malla de 100 μm con triturat constanteIon para evitar grandes agregados celulares. Sin embargo, no utilice un filtro de malla si la suspensión celular es necesaria para el crecimiento de monocapas de células. - Centrifugar la mezcla celular a 30 xg a RT durante 10 min; Decantar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento en 1 mL de IMDM completo con trituración suave durante al menos 5 minutos para disociar las células individuales de las mezclas de tejidos epididimales tratados con enzimas.
- Separación de células epiteliales de otras células bajo condiciones asépticas
- Cultivar la suspensión de células en una placa de Petri de 10 cm que contenga IMDM completo durante al menos 8 h o durante la noche, en una incubadora a 32ºC en CO _ { 2} al 5%.
- Prepare los cubreobjetos estériles por adelantado por inmersión en alcohol 100%. Secar al aire y sumergir en un pequeño volumen del medio de cultivo. Coloque los cubreobjetos en platos de cultivo de 6 cm o en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.
- A la mañana siguiente, cosecha las células epiteliales disociadas recolectando suavemente la célula suspenDe la placa de Petri, que consiste principalmente de células epiteliales. Centrifugar la suspensión de células a 30 xg a RT durante 5 min, y luego decantar el sobrenadante.
- Resuspenda el sedimento celular en ~ 2 mL de IMDM completo.
- Siembre 0,2 ml de la suspensión de células cosechadas en el centro de cada cubreobjetos estériles.
- Deje que la suspensión de células se asiente en la gotita de líquido durante al menos 10 minutos para permitir que las células se adhieran flojamente a los cubreobjetos de vidrio. Añadir con cuidado 1 ml de IMDM completo al borde de un plato de 10 cm, o 0,3 ml de IMDM completo a cada pocillo de una placa de 24 pocillos; No molestar a las células.
- Mantenga las células individuales aisladas en cubreobjetos en la incubadora a 32 ° C en CO 2 al 5% hasta que experimente el parche-abrazadera.
3. Soluciones de grabación y Micropipetas
NOTA: Para los experimentos de parche-abrazadera, use los mejores productos químicos y soluciones.
- Preparación de soluciones madre
- Autoclavear todas las botellas para almacenamiento de stock y filtrar todas las soluciones madre (excepto las soluciones corrosivas) y filtrar por membranas de 0,22 μm antes de usar.
- Preparar todas las soluciones madre antes de la RT y almacenar a 4 ° C: NaCl 5 M; 1 M KCl; MgCl $ ₂ $ 100 mM; CaCl _ { 2 } 100 mM; NaH $ ₂ $ PO $ ₄ $ 200 mM; 100 mM de EGTA (pH 7,0 con KOH). Manipular NaOH 5 M, HCl 1 M y 1 KOH de M como soluciones corrosivas.
- Preparación de solución de sal fisiológica de grabación externa estándar (PSS)
- Calentar las soluciones de stock a RT en la mañana de la grabación de patch-clamp.
- Pipeta los ingredientes de cada culata de acuerdo con el volumen final deseado, excepto CaCl 2, por ejemplo, para preparar 500 mL de PSS: NaCl 140 mM = 14 ml de 5M; 5 mM KCl = 2,5 ml de 1 M; 1,2 mM de MgCl $ ₂ $ = 6 ml de 100 mM; NaH _ { 2} PO _ { 4 } 1,2 mM = 3 ml de 200 mM.
- Añadir doble(DdH $ ₂ $ O) hasta el volumen final de 400 ml y se equilibra.
- Se pesan 0,9 g de glucosa y 1,19 g de HEPES y se disuelve completamente en la mezcla en solución.
- Añadir el caldo de CaCl $ ₂ $ (2,5 mM = 12,5 ml de 100 mM) con agitación.
- Añadir hasta el 99% del volumen final.
- Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH o HCl.
- Compruebe la osmolaridad y ajuste con NaCl 5 M o glucosa, si es necesario.
- Añadir ddH $ ₂ $ O al volumen final de 500 ml en un cilindro.
- Preparación de soluciones internas de micropipetas (soluciones basadas en K + a base de EGTA)
- Pesar o pipetear el volumen correcto de los reactivos de cada culata de acuerdo con el volumen final deseado y de la concentración, por ejemplo, para la preparación de 50 ml bajo EGTA K + basado en la solución intracelular a un volumen de ~ 30 ml ddH 2 O: 100 mM K-gluconato = 1,17 g; KCl 35 mM = 1,75 ml de 1 M; 2 mM de MgCl 2 = 1 mlDe 100 mM; EGTA 0,1 mM = 0,05 ml de 100 mM; HEPES 10 mM = 0,072 g.
- Añadir suficiente agua para ~ 95% del volumen final y permitir que la solución para equilibrar a RT. Asegúrese de que la solución es clara.
- Mientras se agita constantemente la solución, se ajusta el pH a 7,2 usando KOH.
- Pesar y añadir 0,078 g de Mg-ATP a la solución hasta que se disuelve completamente.
- Colocar la solución sobre hielo y utilizar una pequeña alícuota para la medición de la osmolaridad; Típicamente, las soluciones miden ~ 290 mOsmol y no necesita ajuste. Si la osmolaridad difiere significativamente de 280-295 mOsmol, prepare una nueva solución.
- Añadir ddH 2 O al volumen final.
- Se divide la solución en alícuotas de 500 μL, se filtra con un filtro de jeringa de 0,2 μm, se sella herméticamente y se almacena inmediatamente a ≤ -20 ° C.
- En la fecha del experimento de parche-abrazadera, descongelar una alícuota de solución intracelular sobre hielo y mantener enfriado durante el experimento de parche-abrazadera paraPrevenir la degradación.
- Tire de las pipetas de parche de los capilares de vidrio (siguiendo el manual del usuario del extractor de pipeta) para obtener tamaños de micropipeta con una resistencia de 5-10 M cuando se llena con solución intracelular.
4. Configuración del experimento Patch-Clamp y establecimiento de la configuración de células enteras con celdas
- Configuración del experimento de patch-clamp
- Encienda la instalación de la abrazadera de parche (computadora, amplificador controlado por ordenador, digitalizador, etc. )
- Abra el software de patch-clamp ( por ejemplo, AXON pCLAMP10 o HEKA PatchMaster) y configure los protocolos para las grabaciones electrofisiológicas. Ajuste el filtro para la señal a paso bajo a 1-3 kHz y el digitalizador a 10-20 kHz.
- Encienda la cámara, el micromanipulador y la fuente de luz.
- Cuando el amplificador controlado por computadora está encendido, conecte a tierra el cuerpo del experimentador tocando con las manos el aparejo de la abrazadera del remiendo que se ha puesto a tierra,Antes de tocar el headstage, para protegerlo de descargas eléctricas.
- Transferir las células epiteliales de cultivo en el cubreobjetos de vidrio a la cámara de registro llena de ~ 1 mL de PSS estándar a RT. Con cuidado, cambie el PSS de baño por lo menos dos veces usando una pipeta antes de cualquier experimento de parche.
NOTA: Opcionalmente, rellene el sistema de perfusión con PSS estándar u otra solución externa de acuerdo con el experimento planificado. Perfure la cámara de grabación montada en microscopio (RC-26G o RC-26GLP) con PSS varias veces a una velocidad de ~ 2 mL / min antes del inicio de los experimentos de parche-abrazadera. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas a lo largo del sistema de perfusión. - Ver y seleccionar las células bajo un microscopio invertido utilizando objetivos 10X y 40X equipados con un sistema óptico de contraste de interferencia diferencial. Busque grandes células aisladas aisladas para la grabación. Identificar las células epiteliales epididimales aisladas por su forma esférica con mIcrovilli en un extremo de las membranas y la distribución polarizada de los contenidos intracelulares ( Figura 1 ].
- Utilizando una jeringa de 1 ml (una aguja de microjeradura no metálica hecha en casa), llene una micropipeta con la solución interna (solución baja basada en EGTA K + , ver paso 3.3). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la micropipeta, lo que puede aumentar la resistencia de la micropipeta. Use una solución suficiente para que la solución interna sumerja el electrodo de alambre de plata revestido con cloruro dentro del soporte de la micropipeta.
- Monte la micropipeta en el soporte del electrodo y aplique una presión positiva baja (volumen de la jeringa de ~ 0,2 ml). Mantenga la baja presión positiva continua hasta tocar la membrana celular en los pasos posteriores.
- Establecimiento de la configuración de células enteras con celdas para grabaciones
- Sumerja la pipeta en la solución del baño a la velocidad más alta del micromanipulador. Encuentre la pipetaPunta en la pantalla conectada a la cámara digital; Reduzca la velocidad del micromanipulador al modo medio-alto.
- Compruebe rápidamente la resistencia de la micropipeta (5-10 MΩ) utilizando el comando de interfaz de adquisición de datos ( por ejemplo, "Membrane Test" en el sistema AXON) aplicando un paso de tensión ( por ejemplo, 5 mV durante 100 ms) generado por el amplificador controlado por ordenador. Cambie a una nueva micropipeta si la resistencia está significativamente fuera de este rango.
- Empezar a mover hacia abajo el objetivo montado en el microscopio; Guíe gradualmente la micropipeta hacia la celda seleccionada. Baje siempre el objetivo primero y luego baje la micropipeta hasta el plano de enfoque, hasta que la micropipeta esté por encima de la superficie central de la celda seleccionada.
- Cancelar el potencial de unión de líquidos entre la pipeta y las soluciones de baño a cero mediante el comando "offset de pipeta" en la interfaz del controlador del software.
- Configure el amplificador de controlY la prueba de membrana al modo "Baño".
- Foco fino para una visión más clara de la célula, luego baje gradualmente la micropipeta utilizando el micromanipulador a baja velocidad media.
- Cuando la micropipeta está cerca de la célula (demostrado por una disminución de la corriente cuando se dispara mediante el comando de prueba de membrana), retire inmediatamente la presión positiva baja y aplique una presión negativa débil (volumen de la jeringa de 0,1 ml) para formar la gigasa (> 1 GΩ) .
- Monitorear la resistencia con la prueba de membrana. Si la resistencia es> 500 MΩ pero <1 GΩ, aplique un potencial negativo (normalmente como el potencial de retención que se establece en -60 mV), lo que puede ayudar a formar el gigasal. Compensar la corriente transitoria capacitiva de la micropipeta.
- Si el sello es> 1 GΩ y estable (como se muestra en la interfaz del software), aplique una succión breve y fuerte para romper la membrana celular. No aplique una compensación por elY la capacitancia de la celda.
- Inmediatamente después de lograr una configuración de células enteras exitosa, aplique una etapa de hiperpolarización de 10 mV (5 trazas con intervalos de tiempo mínimos, duración de 20 ms, muestra de señal a 20 kHz) desde un potencial de retención de -60 mV.
- Cambie el modo de voltaje al modo de corriente cero y marque las lecturas de la interfaz de software o realice una grabación libre de huecos (10-60 s) para las lecturas de potencial de membrana de la celda.
- Cambiar rápidamente a y permanecer en el modo de voltaje y aplicar los protocolos de voltaje de acuerdo a los experimentos planificados y medir las respuestas actuales. La substracción no se aplica a la corriente de fuga intrínseca durante las grabaciones.
- Vigilar la estabilidad de las respuestas durante las grabaciones, o los diferentes parámetros de la célula. Por ejemplo, utilice la interfaz de comandos "Prueba de Membrana" para comprobar la resistencia de entrada (R i ), la resistencia en serie (R s ) y la celda(C m ) en la prueba de membrana en el modo "Célula" durante el cambio de protocolos.
NOTA: Las gotas repentinas en la resistencia de entrada son usualmente indicativas de un parche suelto, y un aumento dramático en la resistencia en serie puede ser indicativo de la obstrucción de la punta de la micropipeta por los organelos intracelulares o fragmentos de membrana. Durante la grabación, monitoree regularmente el lugar de la micropipeta para verificar si ocurre la deriva, lo que puede conducir a la pérdida del parche. Si la deriva es un problema, levante con cuidado la micropipeta y la celda de remiendo lejos del fondo de la cámara de registro. Este paso a veces puede conducir a la pérdida del parche, en cuyo caso, es necesario repetir el procedimiento de parche de sujeción de la célula completa.
5. Análisis de las propiedades electrofisiológicas pasivas de las células
- Después de obtener los datos de los experimentos de parche-abrazadera, abra los datos libres de huecos en el software Clampfit y mida la mediaPara el potencial de membrana en reposo para cada célula. Alternativamente, utilice el valor marcado de la tensión de corriente cero en el modo actual. Corregir los valores con el potencial de unión líquido (12,4 mV en este estudio).
- Abrir los datos procedentes de la etapa de hiperpolarización de 10 mV (? V) obtenido a partir de una célula, medir la diferencia de corriente antes de y durante la etapa (Δ I STEP), y calcular la resistencia de entrada (R i) utilizando la ecuación como:
- Calcule la capacitancia de la celda (C m , en la unidad de pF) (utilice los mismos datos actuales de la etapa de hiperpolarización de 10 mV integrando el área total bajo la corriente de condensador de membrana durante la corriente de decaimiento transitorio inicial elevada sobre el disparador de voltaje) Para obtener el valor de la carga acumulada total (Q, en la unidad de pA • ms) de la célula. Utilice la siguiente ecuación:
- Calcule el valor de la resistencia en serie (R s ) para cada celda ajustando la corriente transitoria inicial del paso negativo de 10 mV con un algoritmo exponencial estándar para obtener la corriente de decaimiento de constante de tiempo ( T , en unidad de ms) y utilice el valor Siguiente ecuación:
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Representative Results
El procedimiento de digestión enzimática descrito para el aislamiento de células epiteliales del epidídimo de cauda de rata es un protocolo modificado de nuestros estudios anteriores 9 , 12 . Este método produce una mezcla de células individuales con más del 90% de viabilidad y sin ampollas superficiales o volumen de células hinchadas. La mezcla heterogénea de células se compone principalmente de células principales, células claras y células basales, como hemos descrito anteriormente 1 . En este protocolo, se pueden obtener muestras relativamente puras de células epiteliales epididimales cultivando las células disociadas primarias durante una noche en una placa de Petri para permitir la adhesión de las células no epiteliales (tales como, fibroblastos y células lisas) en el plato, como Demostrado en la Figura 1A (antes de la cosecha). Los tipos de células pueden entonces ser preliminarmente distinguidos por sus fenotipos bajo el microscopioY se clasifican según sus propiedades específicas de la membrana pasiva. En la mezcla celular disociada, hay un grupo de células que tienen microvilosidades o una membrana rugosa en un extremo de su membrana superficial, y contenidos celulares polarizados; Éstas se denominan las células principales o las células de tipo transparente ( Figura 1B , flechas). Estas células epiteliales polarizadas son indistinguibles por sus características morfológicas, pero pueden ser identificadas de acuerdo con sus propiedades de membrana pasivas y respuestas de conductancia obtenidas a partir de las grabaciones de parche de sujeción de células enteras. El otro grupo de células es de menor tamaño sin estereocilia en un extremo de la membrana y ningún contenido celular polarizado obvio; Estos se denominan las células no microvilli, y consisten en la mayoría de las células basales ( Figura 1B , asteriscos).
Las células principales epiteliales primarias pueden distinguirse de otras células por la( Figura 2 ) y los patrones de corriente ( Figura 3 ) en respuesta al protocolo de voltaje aplicado utilizando la técnica de parche-pinza de células completas. Las propiedades electrofisiológicas de las células pasivas pueden ayudar a evaluar el estado de salud inicial de las células individuales y de los grupos de tipo celular. En la figura 2A se muestra un resumen de los gráficos de puntos individuales de la capacitancia de membrana (C m ), la resistencia de entrada (R m ) y el potencial de membrana (V m ) de cada grupo de células. No hay diferencia en la constante de tiempo para la capacitancia de membrana entre los diferentes tipos de células (~ 0,4 ms) (los datos no se demuestran en este manuscrito). Utilizando la solución baja basada en K + de EGTA, la capacidad media de membrana medida para las células principales es de 9,4 pm 0,5 pF (n = 32) y para las células de tipo claro es 9,7 pm 1,9 pF (n = 12). La capacidad de membrana deLas células no microvilli es de 5,2 0,8 pF (n = 17), que es estadísticamente menor que el principal y el claro-como las células de membrana capacitancias.
La resistencia de entrada de las células principales en la Figura 2A (panel del medio) es 1,1 ± 0,2 GΩ (n = 32) y la de las células claras es 2,2 ± 0,8 GΩ (n = 12), que es significativamente menor (P <0,001) que La de las células no microvilli (8,9 ± 2,1 GΩ, n = 17). Como se muestra en la Figura 2A (panel de la derecha), el potencial de membrana de corriente cero ( es decir, el potencial de membrana de reposo V $ _ { m } $) se midió poco después de establecer la configuración de células enteras y se usó para comparar los grupos después de la corrección con el potencial de unión líquida MV). Las células se bañaron rutinariamente en PSS estándar y se dializaron con 0,1 mM de solución de pipeta basada en EGTA K + que contenía ATP. EllosEl potencial de membrana de las células principales es -26 ± 2 (n = 28), entre -51 mV y +1 mV, y el potencial de membrana medio de las células de tipo transparente es de -30 ± 3 mV (n = 10), Entre -47 mV y -17 mV. Las células no microvilli poseen el potencial de membrana medio más alto con un valor de -33 ± 5 mV (n = 17), entre -63 mV y -13 mV.
La baja resistencia de entrada de las células principales sugiere que hay conductancias intrínsecas en estas células, pero podría indicar una fuga del sello entre la pipeta y las membranas celulares de parche. Para abordar esta preocupación, primero se excluyeron los datos de esas células con cambios repentinos (indicativos de una fuga de sello) de las propiedades eléctricas durante las grabaciones. A continuación, se analizó la correlación entre la resistencia de sellado en un umbral de 1 giga-ohmio con la resistencia de entrada, como se demuestra en la Figura 2B . El resultado fue un valor de correlación muy bajo (R $ ₂ $ ≈ 0,02). Esto sugiere que la resistencia al sellado tiene una influencia despreciable sobre la resistencia de entrada y que las propiedades eléctricas pasivas de las distintas células (como la baja resistencia de entrada de las células principales) son las propiedades intrínsecas de estas células.
La Figura 3A es la respuesta de corriente típica registrada a partir de las células principales en condiciones casi fisiológicas con las células bañándose en solución salina fisiológica normal (PSS), dializada con una solución de pipeta baja basada en EGTA K y estimulada a partir de un potencial de retención de -60 mV A una serie de voltajes de prueba de 500 ms (que van desde -120 mV hasta +60 mV como se indica en el inserto de la figura 3B ). Los dos trazados en la Figura 3C muestran las respuestas de membrana de reposo típicas de una célula principal identificada bajo la pinza de corriente cero en presencia de, oAusencia de ATP en la solución de la pipeta. En presencia de ATP, el potencial de reposo es relativamente estable. Mientras que una hiperpolarización progresiva se observó cuando las células fueron dializadas con una solución de pipeta sin ATP. El potencial de membrana de reposo inicial medido al comienzo de la diálisis celular con soluciones de pipeta no muestra diferencia significativa en las células con o sin ATP ( Figura 3D ), lo que sugiere que los valores medidos estaban todavía intactos y mínimamente influenciados por las soluciones de pipeta.
Figura 1 : Características morfológicas de las células epiteliales epidídicas de la cauda de rata aisladas. ( A, B ) Ejemplos de células epiteliales aisladas de los epididimidos de cauda de rata antes ( A ) y después ( B ) re-cosecha de oveRnight en el plato antes de los experimentos de parche-clamp. Las flechas indican las células de microvellosidad, que consisten principalmente en las células principales y las células de tipo transparente. Los asteriscos indican las células no microvilli. Sólo se seleccionaron células individuales para la grabación de la abrazadera de parche. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Propiedades de la membrana pasiva de las células epiteliales del epidídimo caudal de una sola rata. ( A ) Parcelas de puntos de las propiedades de la membrana pasiva de las células epiteliales del epidídimo caudal de una sola rata. La solución de pipeta es baja en EGTA K + y la solución de baño es PSS estándar. ( B ) Análisis de correlación de la entrada resCon la resistencia de sellado de las celdas. NS : sin diferencias significativas, * P <0,05, ** P <0,01 *** P <0,001 diferencia significativa frente a controles apropiados usando ANOVA de una vía con prueba post-hoc de Bonferroni. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Corrientes de células enteras típicas en células principales epididimales individuales. ( A ) Las corrientes típicas de células enteras registradas a partir de células epiteliales epididimales individuales registradas en condiciones casi fisiológicas usando un protocolo de inducción de impulsos como se muestra en el inserto de panal B. La línea punteada indicó los niveles de corriente cero. ( B ) La relación corriente-voltaje de la corrienteEs medido en los puntos de tiempo indicados como en A. Los datos son las medias ± SEM de ocho células principales de al menos tres animales. ( C ) Trazados representativos del potencial de membrana de reposo de las células principales dializadas con una solución de pipeta, ya sea con ATP (+ ATP) o sin ATP (-ATP). ( D ) Gráfico de barras que no muestra diferencia significativa entre el potencial inicial de membrana en reposo de + ATP y -ATP. Los valores son medias ± SEM medidos en el momento que se indica en el panel C. Los números entre paréntesis dentro de las barras indican el número de células ensayadas de al menos tres animales. NS : no hay diferencia significativa. ( E ) Los análisis de correlación de la resistencia de sellado y la resistencia de entrada de todas las células, o sólo las células principales, frente a las membranas de reposo medidas en la pinza de corriente cero poco después del establecimiento de células enteras y las magnitudes de corriente medidas en la hiperpolarización Paso a -100 mV de la celebración pOtential Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este protocolo, la dispersión enzimática de los epididimidos de cauda de rata produjo consistentemente células epiteliales sanas. La calidad de las células epiteliales epididimales para los experimentos de parche-clamp depende de unos pocos pasos críticos en el protocolo. Por ejemplo, la centrifugación de la mezcla celular a una fuerza centrífuga baja (30 xg) es importante para eliminar los espermatozoides y el contenido luminal epidídimo; Las células epiteliales del epidídimo se vuelven insalubres en presencia de los espermatozoides en el cultivo celular. Además, cultivar la mezcla celular disociada en una placa de Petri durante varias horas es un paso importante para eliminar los fibroblastos y las células del músculo liso; Las células no epiteliales se adhieren más rápidamente en el plato de cultivo y, por lo tanto, dejando las células epiteliales en la suspensión, que pueden ser recolectadas por aspiración suave. Además, la digestión con colagenasa y la trituración con una pipeta de vidrio fino son los dos pasos importantes para liberarCélulas individuales durante el procedimiento de disociación celular. Finalmente, la digestión enzimática de las células epididimales es crítica para el experimento de parche-abrazadera porque la sub-digestión por actividad enzimática ineficiente o sobre-digestión por incubación prolongada puede interrumpir la formación de sello de giga-ohmio entre la pipeta y las membranas celulares.
En las mezclas de células, las células en forma de columnas más grandes con una membrana rugosa que lleva estereocilia en un extremo y distribución polarizada del contenido intracelular son presumiblemente las células principales o las células claras. Otras células que no poseen microvillos prominentes y contenidos de células polarizadas pueden incluir las células basales y algunas células del sistema inmunitario. Además de describir las características morfológicas básicas de las células epiteliales epididimales, este protocolo emplea el método de parche-mordaza de células enteras para medir la propiedad de la membrana pasiva de cada célula. Estas propiedades de la membrana permiten la distinciónLos tipos de células. Este método tiene algunas limitaciones tales como el lavado del contenido intracelular con la solución de la pipeta y las variaciones electrónicas en relación con las modificaciones de la arquitectura celular durante las grabaciones continuas 19 , 20 . Proporcionamos solamente los parámetros que medimos inmediatamente después del establecimiento de la configuración de la célula entera, que reflejan las condiciones iniciales, relativamente intactas de las células. Las propiedades pasivas de la membrana de cada célula incluyen la capacidad de la membrana, la resistencia de entrada y el potencial de membrana en reposo.
La capacidad específica de las membranas celulares se acepta generalmente de 1 μF / cm 2 y esto es válido para las células (como las células inmunitarias y las neuronas) con plegado limitado en sus membranas celulares 16 , 18 . Sin embargo, la constante de capacitancia específica tiende a ser mayor para las células wCon arquitecturas celulares más complejas, como las células epiteliales, que tienen muchos pliegues de membrana celular en distintos compartimentos. Los informes indican que los valores de la línea de células epiteliales MDCK son 4 mF / cm 2 y 3 mF / cm 2 para las capacitancias específicas de la membrana apical y basal, respectivamente 17. En el presente estudio, las capacidades medias medias de la membrana son ~ 8 pF y ~ 12 pF para el grupo de células no microvillosas y las células principales y el grupo de células de tipo claro ( es decir , células de microvellosidad), respectivamente. Usando la capacitancia específica de 1 mF / cm 2 para nuestros cálculos, las áreas de la superficie celular estimados son 500 m 2 y 1.000 m 2 para las células no-microvellosidades y las células microvellosidades, respectivamente, que corresponde a los diámetros de 13 micras y 18 Μm. Sin embargo, estas estimaciones son mayores que lo que se esperaba basándose en el tamaño de las células bajo el microscopio, que son ~ 81; m y ~ 12 m para no-microvellosidades células y células microvellosidades, respectivamente, y estas células son alrededor de 2,4 mF / cm 2 y 1,9 mF / cm 2, respectivamente. Nuestros resultados indican que el paisaje de la membrana de las células no-microvilli es más complejo que el de las células micro-vellosidades, que es compatible con sus funciones de secreción y transporte.
La capacidad específica de las membranas celulares se acepta generalmente de 1 μF / cm 2 y esto es válido para las células (como las células inmunitarias y las neuronas) con plegado limitado en sus membranas celulares 16 , 18 . Sin embargo, la constante de capacitancia específica tiende a ser mayor para células con arquitecturas celulares más complejas, como las células epiteliales, que tienen muchos pliegues de membrana celular en distintos compartimentos. Los informes indican que los valores de la línea de células epiteliales MDCK son 4 mF / cm 2 y 3 mF / cm 2 17 . En el presente estudio, las capacidades medias medias de la membrana son ~ 8 pF y ~ 12 pF para el grupo de células no microvillosas y las células principales y el grupo de células de tipo claro ( es decir , células de microvellosidad), respectivamente. Usando la capacitancia específica de 1 mF / cm 2 para nuestros cálculos, las áreas de la superficie celular estimados son 500 m 2 y 1.000 m 2 para las células no-microvellosidades y las células microvellosidades, respectivamente, que corresponde a los diámetros de 13 micras y 18 Μm. Sin embargo, estas estimaciones son mayores que lo que se esperaba basándose en el tamaño de las células bajo el microscopio, son ~ 8 μm y ~ 12 μm para las células no microvilli y las células microvilli, respectivamente, y estas células son mejor compatibles con un valor de capacitancia específico 2 mF / cm 2. Esto sugiere que el paisaje de la membrana de las células epiteliales epididimales es morE complejo que otros tipos de células, lo cual es consistente con sus funciones de secreción y transporte.
En las grabaciones de células enteras, la conductancia de fugas a través de la membrana y en el sello entre la membrana y la pipeta contribuyeron ambas a las propiedades de membrana medidas. El sello tiene una resistencia significativamente mayor que la membrana, por lo que tiene una influencia mínima en la medición de las propiedades de la membrana pasiva, tales como la resistencia de entrada y el potencial de membrana de corriente cero. De acuerdo con esta noción, el análisis de correlación de la resistencia de sellado en un umbral de 1 giga-ohm contra la resistencia de entrada de cada célula dio como resultado un valor de ~ 0,02, lo que sugiere una influencia muy débil. Otros análisis de correlación de la resistencia de sellado o la resistencia de entrada frente a los potenciales de membrana de reposo o la magnitud de corriente medida a -100 mV también dieron valores bajos para todas las células ensayadas o para las células principales solamente. Nuestros resultados deMuestran que la resistencia de entrada de las células epididimales principales y de las células de tipo transparente es significativamente más baja que las células no microvílicas, proporcionando así un parámetro preliminar para el juicio para diferenciar los tipos de células. Estos resultados sugieren que la baja resistencia de entrada en las células principales es una propiedad fisiológica intrínseca de las células. Las células epiteliales individuales también poseen patrones de corriente distintos en respuesta a los protocolos aplicados ya las condiciones experimentales. Se observó que cada tipo de células definidas exhibieron patrones de corriente única bajo el mismo protocolo de voltaje aplicado. Un ejemplo mostrado en la Figura 3 demuestra las respuestas de corriente típicas registradas de las células principales en condiciones cuasi-fisiológicas, como se ha informado previamente 9 . Las características electrofisiológicas de cada tipo de célula especializada se diferencian fácilmente (los datos no se muestran en este documento). Sobre la base de estos parámetros,Los diferentes tipos de células pueden clasificarse aproximadamente en las células principales, las células de tipo transparente y las células no microvilílicas, como se describe en los resultados.
La resistencia de entrada es la resistencia de la membrana en respuesta a la etapa de potencial aplicada (etapa de hiperpolarización de 10 mV en este estudio) obtenida a partir de un potencial de retención de -60 mV. Esto refleja la extensión de la actividad de canal abierto en respuesta al potencial aplicado. En este sentido, una baja resistencia implica una elevada "intrínseca" conductancia de las células, mientras que una alta resistencia implica canales cerrados. El bajo valor de resistencia de entrada en las células principales corresponde a la conductancia de membrana prominente, mientras que las células de tipo claro que poseen una pequeña conductancia en el potencial de membrana de ensayo implica su moderada conductancia en las condiciones de grabación. La resistencia a la entrada significativamente alta de las células no microvilli implica que no tienen canales abiertos en este estado. En el cero-cu, Los potenciales de membrana en reposo medios de las células epiteliales aisladas medidas están en el intervalo de 26-33 mV para los tres grupos celulares. Estos valores son comparables con el potencial de membrana informado (-30 mV) utilizando el método de microelectrodo [ 21] . Sin embargo, los potenciales de reposo medidos varían ampliamente en células individuales (de +3 mV a -63 mV) a pesar de la ausencia de potenciales espontáneos. Esta variación puede reflejar la interacción de las diferentes actividades de canales de iones en diversos tipos de células, como la interacción acoplada de TRPV6 y TMEM16A canales en las células principales, como hemos informado recientemente 9 . Vale la pena señalar que cuando las células se dializaron con la pipeta ATP, no se observaron potenciales eléctricos espontáneos en las células principales; Esto concuerda con la clasificación de las células epiteliales como no excitables [ 4] . Una hiperpolarización progresiva cuando las células se dializaron con el piPette sin ATP puede haber reflejado la aparición gradual de una corriente de potasio sensible al ATP. Se ha informado de que los canales de potasio sensibles al ATP se expresan en el aparato de Golgi de las células principales del epidídimo de rata y que el agotamiento del ATP intracelular conduce a la activación de los canales K ATP 14 , 22 . Esta observación sugiere que la inclusión de ATP en la solución de pipeta favorece las condiciones fisiológicas estables de las células epididimales principales.
La técnica de patch-clamp de células enteras es un método bien establecido que se utiliza comúnmente para estudiar la electrofisiología de células excitables, como las neuronas. En este trabajo, demostró que también es una herramienta útil para la caracterización de las propiedades bioeléctricas de células no excitables, como las células epiteliales. Además, este protocolo permite realizar investigaciones funcionales del epidídimo aislado primarioAl epiteliales para dilucidar su función fisiológica en el epidídimo. Este estudio proporciona algunas propiedades eléctricas preliminares de las células epiteliales aisladas de la cauda del epidídimo de la rata para ayudar a las investigaciones futuras del comportamiento fisiológico de estas células y su relevancia biológica subyacente en el epidídimo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias al Dr. Christopher Antos por sus útiles comentarios sobre el texto. Este trabajo fue apoyado por el financiamiento inicial de la Universidad de ShanghaiTech otorgado a Winnie Shum y por el financiamiento de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NNSFC N ° 31471370).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument of AXON system | |||
| Computer controlled amplifier | Molecular Devices - Axon | Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices - Axon | Digidata 1550 converter | |
| Microscope | Olympus | BX-61WI | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Instrument of HEKA system | |||
| Patch Clamp amplifier | Harvard Bioscience - HEKA | EPC-10 USB double | |
| Microscope | Olympus | IX73 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Recording chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-324C | |
| Other Instrument | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Recording Chamber | Warner Instruments | RC-26G or homemade chamber | |
| Borosilicate capillary glass with filament | Sutter Instrument / Harvard Apparatus | BF150-86-10 | |
| Vibration isolation table | TMC | 63544 | |
| Digital Camare | HAMAMASTU | ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU | |
| Reagents for isolation | |||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 22400089 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibca | 15140112 | |
| IMDM | ATCC | 30-2005 | |
| IMDM | Gibco | C12440500BT | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Collagenase II | Sigma | C6885 | |
| 5-α-dihydrotestosterone | Medchemexpress | HY-A0120 | |
| Fetal bovine serum | capricorn | FBS-12A | |
| Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm) | |||
| KCl, 35mM | Sigma/various | V900068 | |
| MgCl2 · 6H2O, 2mM | Sigma/various | M2393 | |
| EGTA, 0.1mM | Sigma/various | E4378 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| K-gluconate, 100mM | Sigma/various | P-1847 | |
| Mg-ATP, 3mM | Sigma/Various | A9187 | |
| The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm) | |||
| NaCl, 140mM | Sigma/various | V900058 | |
| KCl, 4.7mM | Sigma/various | V900068 | |
| CaCl2, 2.5mM | Sigma/various | V900266 | |
| MgCl2 · 6H2O, 1.2mM | Sigma/various | M2393 | |
| NaH2PO4, 1.2mM | Sigma/various | V900060 | |
| HEPES, 10mM | Sigma/various | V900477 | |
| Glucose, 10mM | Sigma/various | V900392 | |
| For pH adjustment | |||
| NaOH | Sigma/various | V900797 | Purity >=97% |
| KOH | Sigma/various | 60371 | Purity >=99.99% |
References
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