Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

doi: 10.3791/55700 Published: August 3, 2017

Summary

Sıçan kauda epididimidlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini ölçmek için hücre izolasyonunu ve tam hücreli yama klemp kayıtlarını birleştiren bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, primer epididimal epitel hücrelerinin işlevsel özelliklerinin araştırılmasına ve epididimin fizyolojik rolünün aydınlatılmasına izin verir.

Abstract

Epididimis, sperm olgunlaşması ve üreme sağlığı için vazgeçilmez bir organtır. Epididimal epitel, moleküler ve morfolojik özelliklerde değil aynı zamanda fizyolojik özelliklerde de farklı olan karmaşık bağlanmış hücre tiplerinden oluşur. Bu farklılıklar, epididimal lümende post-testiküler sperm gelişimi için gerekli mikro ortamı birlikte kuran çeşitli işlevlerini yansıtmaktadır. Epididimal epitel hücrelerinin biyofiziksel özelliklerinin anlaşılması, hem fizyolojik hem de patofizyolojik koşullar altında sperm ve üreme sağlığında işlevlerini ortaya çıkarmak açısından önemlidir. Fonksiyonel özellikleri henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, epididimal epitel hücreleri hücresel olayları ve tekli hücrelerin zar özelliklerini ölçmek için kullanılan bir araç olan patch-clamp tekniği kullanılarak incelenebilir. Burada, hücre izolasyonu ve mezaya tüm hücre yama-kelepçe kayıt yöntemlerini anlatacağızSıçan kauda epididimitlerinden primer dissosiye epitel hücrelerinin elektriksel özelliklerini kontrol edin.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Erkek üreme kanalındaki epididim, bir mozaik epitel hücresi tabakasıyla kaplı bir organtır. Diğer epitel dokularında olduğu gibi, epididimal epitelin çeşitli hücre tipleri, temel hücreler, berrak hücreler, bazal hücreler ve immünolojik ve lenfatik sistemlerdeki hücreler de dahil olmak üzere, uyumlu bir şekilde çalışırlar ve tüp ön hattında bariyer olarak işlev görürler. Sperm maturasyonu ve fizyolojisi için destekleyici hücreler 1 , 2 , 3 . Böylece, bu epitel hücreleri üreme sağlığında önemli bir rol oynamaktadır.

Epitelyal hücreler, voltaj kapılı Na + veya Ca 2+ kanalları 4 , 5'in yokluğundan dolayı depolarize edici uyaranlara yanıt olarak tamamen veya hiç aksiyon potansiyelleri oluşturamayan uyarılmayan hücreler olarak genelde kabul edilir. Bununla birlikte, epitelyal hücreler uni ifade ederQue iyon kanalları ve taşıyıcıları, salgı ve besleyici ulaşım gibi özel fizyolojik rollerini düzenler. 6 . Dolayısıyla farklı epitel hücreleri karakteristik elektriksel özelliklere sahiptir. Örneğin, başlıca hücreler, sıvı ve klorür taşınması için CFTR'yi ifade eder ve TRPV6'yı kalsiyum yeniden emilim için ekspres eder, buna karşın berrak hücreler lümen asidifikasyonu için 1 , 7 , 8 , 9 nolu proton pompa V-ATPaz'ını ifade eder. Epididimal epitel hücrelerin fizyolojik özelliklerini düzenleyen bazı taşıyıcı ve iyon kanalları rapor edilmiştir, ancak epididimal epitel hücrelerinin fonksiyonel özellikleri büyük ölçüde yapılmamış 10, 11, 12, 13 ile anlaşılmış değildir.

WhOle hücreli patch-clamp kayıt, hem uyarılabilir hem de uyarılmayan hücrelerin içsel özelliklerini incelemek için iyi bilinen bir tekniktir ve özellikle heterojen hücre numunelerinde ayrışmış hücrelerin işlevlerini incelemek için yararlıdır; Voltaj kelepçesi pasif membran özelliklerini ve tek hücrelerin 14 , 15 iyonik akımlarını ölçmek için kullanılır. Pasif membran özellikleri arasında giriş direnci ve kapasitans bulunur. Birinci parametre, hücre membranının yüzey alanını (iyon kanalları ve taşıyıcıların bulunduğu, hücre dışı ve hücre içi ortamı ayıran ince bir izolatör görevi gören bir fosfolipid çift katmanı) ima ettiğinde, iç membran iletkenliğini gösterir. Membran kapasitansı hücre zarı yüzey alanı ile doğru orantılıdır. Giriş direnci tarafından yansıtılan membran direnci ile birlikte, membran zaman sabiti, wHücre membran potansiyelinin iyon kanal akımlarının akışına ne kadar hızlı tepki verdiğini gösterir, belirlenebilir. Bu bağlamda, hücrelere uygulanan bir dizi voltaj kademesinden gelen akım yanıt karakteristiklerinin birleştirilmesiyle, hücrelerin biyofiziksel kinetiği ve özellikleri 15 , 16 , 17 , 18 olarak belirlenmiştir .

Bu yazıda, fare kauda epididimisindeki epitel hücrelerinin izole edilmesi için prosedürleri ve tüm hücre yama kelepçesini kullanarak ayrışmış hücre karışımı içindeki farklı hücre tiplerinin membran özelliklerini ölçmek için gerekli adımları açıkladık. Epididimal ana hücrelerin farklı membran elektrofizyolojik özelliklerini sergilediğini ve iletkenliklerin diğer hücre türlerinden kolayca tespit edilebileceğini gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan deneyleri, yerel ve uluslararası gereklilikleri yerine getiren ŞangayTech Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülür.

1. Deney Hayvanları

  1. Yetişkin bir erkek Sprague-Dawley sıçanını (~ 300-450 g) 8-12 hafta arasında kullanın. Sıçanlarda bu yaşta, sperm cauda epididimidlere ulaştı.

2. Rat Cauda Epididimidlerinden Epitelyal Hücrelerin İzolasyonu

NOT: Aksi belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar, aseptik olmayan koşullar altında gerçekleştirilir.

  1. Diseksiyon cihazlarının ve reaktiflerin hazırlanması
    1. Diseksiyon araçlarını% 70 etanol içine daldırarak dezenfekte edin ve hava kurumasına izin verin.
    2. Isıtma banyosunu açın (32 ° C); 500 mL 1x Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 Orta (RPMI) ile% 1 (v / v) antibio takviyeli ve önceden ısıtınTikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin final) ve "RPMI (+ P / S 1: 100)" olarak etiketlendi. Bu adımı temiz hava akışı kontrollü bir çalışma istasyonunda gerçekleştirin.
    3. Gerekli olmayan amino asitler (0.1 mM) ve sodyum piruvat (1 mM) içeren ve 5-α-dihidrotestosteron (1 nM),% 10 sığır fetusu ile takviye edilmiş 1x500 ml Iscove Modifiye Dulbecco's Medium'ı (IMDM) hazırlayın ve önceden ısıtın Serum,% 1 (v / v) antibiyotikler (100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin finali) ve "Tam-IMDM" olarak etiketlendi. 50 mL'lik alikotlar oluşturun ve parafilm ile sızdırmaz hale getirin; 4 ° C'de saklayın. Aseptik koşulları kullanın.
    4. Solüsyondaki her bir kollajenazın 1 mg / mL'si ile sonuçlanan kolajenaz Tip I ve Tip II kolajenazı RPMI'de (+ P / S 1: 100) çözerek bir kollajenaz enzim sindirim solüsyonu hazırlayın. 0.22 μm membran boyunca filtre edin ve "Collagenase Solution" olarak işaretleyin. Kullanana kadar oda sıcaklığında (RT) tutun. Enzim çözeltisinin hacmini ayarlayınEnzimin ağırlığı üzerine; Tek bir sıçandan alınan her iki kuda epididimidi için gereken minimum hacim 2 mL'dir.
    5. RPMI ile 35 mm'lik bir çanak doldurun (+ P / S 1: 100).
  2. Sıçan kauda epididimidlerinin diseksiyonu
    1. Hayvanı ya sodyum pentobarbital 85 mg / kg ip kullanarak ya da hayvanın kuyruk tutma uyarısına tepki vermeyene kadar izofluran bölmesini kullanarak kurban edin; Servikal dislokasyonu takip eder.
    2. % 70 etanol ile silerek alt karınlarını dezenfekte edin, hafifçe alt test karınlarına doğru itin ve sonra skrotumun alt karnını açın.
    3. Epididimal yağ alın, tüm üreme organlarını (testis, epididimid ve vas deferens) inceleyin ve RPMI ile çanağa (+ P / S 1: 100) daldırın.
    4. Üreme organlarını RPMI (+ P / S 1: 100) ile çaydan bir aseptik çalışma istasyonuna aktarın.
    5. Bağlayıcı ve yağ dokularından ve epi'den gelen cauda epididimidleri ayırınDidimal kapsül. Bir epididimis ~ 0.2 mL Kollajenaz Çözeltisi ile 1.5 mL tüp içine yerleştirilir. Temiz bir hava akışı kontrollü çalışma istasyonunda bu adımı gerçekleştirin.
  3. Tek hücrelerin sıçan kauda epididimidlerinden ayrılması
    1. Doku yumuşak bir sıvı haline gelene kadar ince makas kullanarak Collagenase Solution içindeki epididimidleri kesin. Makasları 1.5 mL'lik tüp içindeki geriye kalan (~ 0.8 mL) enzim solüsyonuyla hafifçe durulayın.
    2. Tüp, bir metal termomikserin üzerine 30 dakika, 37 ° C'de 1000 rpm'de sallama hızı ile yerleştirilir.
    3. Enzim-doku karışımını oda sıcaklığında 30 xg'de 3 dakika santrifüjleyin ve daha çok sperm içeren yapışkan süpernatantı boşaltın.
    4. Tüm enzimatik aktiviteyi söndürmek için pelleti 1 mL Tam-IMDM'ye tekrar süspanse edin. 49 mL RPMI (+ P / S 1: 100) içeren 50 mL tüp hücre süspansiyonu aktarın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyonunu, sabit trituratlıIyonu büyük, hücre agrega önlemek için. Bununla birlikte, hücre süspansiyonunun büyüyen hücre tek tabakalarına ihtiyaç duyması halinde, örgü filtre kullanmayın.
    5. Hücresel karışımı 30 dakika oda sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjleyin; Süpernatanı boşaltın.
    6. Enzimatik tedavi edilen epididimal doku karışımlarından tekli hücreleri ayırmak için pelet 1 mL Full-IMDM'de en az 5 dakika nazik tritürasyon ile tekrar süspansiyon haline getirilir.
  4. Aseptik koşullar altında epitelyal hücrelerin diğer hücrelerden ayrılması
    1. % 0.5 CO 2'de 32 ° C'de bir kuluçka makinesinde, hücre süspansiyonunu tam-IMDM içeren 10 cm'lik bir Petri kabında en az 8 saat boyunca veya gece boyunca kültürleyin.
    2. % 100 alkole batırarak steril lamelleri önceden hazırlayın. Hava kurutun ve kültür ortamının küçük bir hacmine daldırın. Lamelleri 6 cm'lik kültür bulaşıkları içine koyun veya 24 delikli bir tabakın tekli oyuklarına yerleştirin.
    3. Ertesi sabah, ayrılmış epitel hücrelerini hücre süspansiyonunu hafifçe toplarken hasat edinÇoğunlukla epitel hücrelerinden oluşan Petri kabından alınır. RT'de 5 dakika boyunca 30 xg'de hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve sonra süpernatanı boşaltın.
    4. ~ 2 mL Tam IMDM'de hücre topağını tekrar süspanse edin.
    5. Her steril lamelin merkezine toplanan hücre süspansiyonu 0.2 mL'sini tohumlayın.
    6. Hücrelerin gevşek cam lamelleri yapışmasına izin vermek için hücre süspansiyonu sıvı damlacık en az 10 dakika yerleşsin. Dikkatle bir 24 delikli plakanın her kuyusuna 10 cm çanağın kenarında 1 mL Tam-IMDM'yi veya 0.3 mL Tam-IMDM'yi ilave edin; Hücreleri rahatsız etmeyin.
    7. Yama-kelepçe deneyleri kadar 32 inkübatör lamelleri üzerinde izole tek hücreler ° C% 5 CO 2 tutun.

3. Kayıt Çözümleri ve Mikroipipetler

NOT: Yama-kelepçe deneyleri için en kaliteli kimyasalları ve çözeltileri kullanın.

  1. Stok solüsyonlarının hazırlanması
    1. Stok depolaması için tüm şişeleri otoklavda tutun ve tüm stok solüsyonlarını (korozif solüsyonlar hariç) filtreleyin ve kullanılmadan önce 0.22 μm membranlardan süzün.
    2. Tüm stok solüsyonlarını oda sıcaklığında önceden hazırlayın ve 4 o C'de saklayın: 5 M NaCl; 1 M KCI; 100 mM MgCl2; 100 mM CaCl2; 200 mM NaH2? 4; 100 mM EGTA (KOH ile pH 7.0). Korozif çözümler olarak 5 M NaOH, 1 M HC1 ve 1 M KOH stokları kullanın.
  2. Standart harici kayıt fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) hazırlanması
    1. Yama-kelepçe kayıt sabahında stok solüsyonlarını RT'ye ısıtın.
    2. CaCl2 haricinde istenen son hacmine göre, her stok malzemeyi Pipet, PSS 500 mL hazırlanması için, örneğin: 140 mM NaCI 5M = 14 mi; 5 mM KC1 = 2.5 mL İM; 100 mM, 1.2 mM MgCl2 = 6 mi; 200 mM, 1.2 mM NaH2? 4 = 3 mi.
    3. Çift ekle-distilled su (GKD 2 O) son 400 mL hacim ve denge.
    4. 0.9 g glikoz ve 1.19 g HEPES tartılır ve çözelti karışımında tamamen çözülür.
    5. Karıştırılarak CaCl2 stoku (2.5 mM = 100 mM 12.5 mL) eklenir.
    6. Nihai cildin% 99'unu ekleyin.
    7. NaOH veya HC1 kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
    8. Ozmolariteyi kontrol edin ve gerekirse 5 M NaCl veya glükoz kullanarak ayarlayın.
    9. Bir silindir içinde, 500 mL son hacme O GKD 2 ekleyin.
  3. Mikropipet iç çözeltilerinin hazırlanması (düşük EGTA K + temelli çözümler)
    1. 100 mM K-glukonat: tartılır ve istenen son hacim ve konsantrasyona bağlı olarak her bir stok reaktifler doğru birim pipet, ~ 30 mL GKD 2 O bir hacme kadar 50 mL düşük EGTA K + merkezli bir Hücre-içi solüsyon hazırlamak için, örneğin = 1,17 g; 35 mM KC1 = 1.75 mL 1 M; 2 mM MgCl2 = 1 mL100 mM; 0.1 mM EGTA = 0.05 mL, 100 mM; 10 mM HEPES = 0.072 g.
    2. Nihai hacmin ~% 95'ine yeterli su ekleyin ve çözeltinin oda sıcaklığında dengeye gelmesine izin verin. Çözümün berrak olduğundan emin olun.
    3. Çözeltiyi sürekli karıştırırken pH'ı KOH kullanarak 7.2'ye ayarlayın.
    4. Çözünene kadar 0.078 g Mg-ATP tartılır ve tamamen eritilir.
    5. Çözeltiyi buz üzerine yerleştirin ve ozmolarite ölçümü için küçük bir alikot kullanın; Genellikle, solüsyonlar ~ 290 mOsmol'u ölçer ve ayarlamaya ihtiyaç duymazlar. Ozmolarite 280-295 mOsmol'dan önemli ölçüde farklıysa, yeni bir çözüm hazırlayın.
    6. Son hacme GKD 2 O ekleyin.
    7. Çözümü 500 mcL bölmelere bölün, 0.2 um şırınga filtresi ile süzün, sıkıca sızdırmaz hale getirin ve ≤ -20 ° C'de hemen saklayın.
    8. Yama-kenetleme deneyinin yapıldığı tarihte, buz üzerinde bir kısım hücre içi çözeltiyi çözdürün ve yama-kelepçe deneyi sırasında soğutulmaya devam edin.Bozulmayı önle.
  4. Hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 5-10 M'luk dirençli mikropipet boyutları elde etmek için, cam kılcallardan yama pipetlerini çekin (aşağıdaki pipet çekmece kullanıcısının el kitabında).

4. Yama-Kelepçe Deneyi Kurma ve Hücrelerle Bütün Hücre Yapılandırması Oluşturma

  1. Yama kenetleme denemesinin ayarlanması
    1. Yama-kelepçe kurulumunu açın (bilgisayar, bilgisayar kontrollü yükseltici, sayısallaştırıcı, vb. )
    2. Yama kelepçesi yazılımını açın ( örn. AXON pCLAMP10 veya HEKA PatchMaster) ve elektrofizyolojik kayıtlar için protokolleri ayarlayın. Sinyalin filtreyi 1-3 kHz'de düşük geçirme ve sayısallaştırıcıyı 10-20 kHz'de ayarlayın.
    3. Kamerayı, mikromanipülatörü ve ışık kaynağını açın.
    4. Bilgisayar kontrollü amplifikatör açıkken, topraklanmış olan patch-clamp teçhizatına elle dokunarak deneyci gövdesini topraklayın,Elektrik çarpmalarına karşı korumak için, kulaklığa dokunmadan önce.
    5. RT'de standart PSS ~ 1 mL ile dolu kayıt odasına cam lamel kültür epitel hücreleri aktarın. Patch-clamp deneylerinden önce bir pipet kullanarak banyo PSS'sini dikkatli bir şekilde en az iki kez değiştirin.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, planlanan deneye göre perfüzyon sistemini standart PSS veya başka bir harici çözüm ile doldurun. Yama-kelepçe deneylerine başlamadan önce ~ 2 mL / dakika'lık bir hızda birkaç kez PSS ile mikroskop destekli kayıt odasını (RC-26G veya RC-26GLP) çalıştırın. Perfüzyon sistemi boyunca sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olun.
    6. Ters çevrilmiş mikroskop altında, diferansiyel parazit kontrastlı optik sistem ile donatılmış 10X ve 40X hedefleri kullanarak hücreleri görüntüleyin ve seçin. Kayıt için büyük tekli izole hücreler arayın. İzole epididimal epitel hücrelerini kaba m ile küresel şekilleri ile tanımlayınMembranların bir ucundaki icrovilli ve hücre içi içeriğin polarize dağılımı ( Şekil 1 ).
    7. 1 mL şırınga (ev yapımı bir metalik olmayan mikrosiraj iğnesi) kullanarak, iç çözeltiyle bir mikropipet doldurun (düşük EGTA K + temelli çözüm, adım 3.3'e bakın). Mikropipette, mikropipetin direncini artırabilecek hava kabarcığı olmadığından emin olun. İç çözeltinin, klorür kaplı gümüş tel elektrotu, mikropipet tutacağı içine dalması için yeterli çözelti kullanın.
    8. Mikroipeti elektrot tutucusuna takın ve düşük bir pozitif basınç uygulayın (~ 0.2 mL şırınga hacmi). Düşük pozitif basıncı sonraki adımlardaki hücre membranına dokunana kadar sürekli tutun.
  2. Kayıtlar için hücrelerle tüm hücre yapılandırması oluşturma
    1. Pipeti mikromanipülatörün en yüksek hızda banyo solüsyonuna daldırın. Pipet bulEkrana dijital kamera ile bağlantılı uç; Mikromanipülatör hızını orta-yüksek moda yavaşlatın.
    2. Bilgisayar kontrollü amplifikatörden üretilen bir voltaj kademesi ( örneğin 100 ms için 5 mV) uygulayarak veri toplama arabirimi komutunu ( örn . AXON sistemindeki "Membran Testi") kullanarak mikropipet direncini (5-10 MΩ) hızlı bir şekilde kontrol edin. Direnç bu aralığın dışına çıkarsa yeni bir mikropipet değiştirin.
    3. Mikroskop üzerine monte edilen objektifin altına inmeye başlayın; Yavaş yavaş seçilen hücreye doğru mikropipet yönlendirin. Her zaman önce hedefi indirin ve sonra, mikropipet seçili hücrenin orta yüzeyinin üzerindeyken, mikropipeti odak düzlemine indirin.
    4. Yazılımın komutan arayüzündeki "pipet ofset" komutunu kullanarak, pipet ile banyo çözeltileri arasındaki sıvı birleşim potansiyelini sıfırlayın.
    5. Bilgisayar kontrollü amplifikatör komisyonunu ayarlayınGerilim kelepçesine ve membran testine "Banyo" moduna geçin.
    6. Hücrenin daha net bir görünümü elde etmek için ince odaklanın, daha sonra düşük-orta hızda mikromanipülatörü kullanarak mikropipeti yavaş yavaş indirin.
    7. Mikroipet hücreye yakın olduğunda (membran test komutu tarafından tetiklendiğinde azaltılmış bir akım ile gösterilir), düşük pozitif basıncın derhal kaldırın ve gigaseal (> 1 GΩ) oluşturmak için zayıf negatif basınç uygulayın (0.1 mL şırınga hacmi) .
    8. Zar testi ile direnci izleyin. Direnç> 500 MΩ, ancak <1 GΩ ise, gigaseal oluşumuna yardımcı olabilecek negatif bir potansiyel (genellikle -60 mV'a ayarlanmış tutma potansiyeli) uygulayın. Mikropipetin geçici kapasitif akımı dengeleyin.
    9. Conta> 1 GΩ ve sabitse (yazılım arayüzünde gösterildiği gibi), hücre zarını kırmak için kısa ve kuvvetli bir emme uygulayın. Kendiniz için tazminat ödemeyinRies direnci ve hücre kapasitansı.
    10. Başarılı bir tam hücreli konfigürasyonu gerçekleştirdikten hemen sonra, -60 mV'lik bir tutma potansiyelinden 10 mV hiperpolarizasyon adımını (minimum zaman aralığı, 20 ms zaman süresi, sinyal örneği 20 kHz'de 5 iz) uygulayın.
    11. Voltaj modunu sıfır akım moduna geçirin ve yazılım arayüzünden okumaları işaretleyin veya hücrenin zar potansiyeli okumaları için boşluk içermeyen bir kayıt yapın (10-60 saniye).
    12. Geriye dönün ve gerilim modunda kalın ve gerilim protokollerini planlanan deneylere göre uygulayın ve mevcut tepkileri ölçün. Çıkarma, kayıtlar sırasında asıl sızıntı akımına uygulanmaz.
    13. Kayıtlardaki yanıtların kararlılığını veya hücrenin farklı parametrelerini izleyin. Örneğin, giriş direncini (R i ), seri direncini (R s ) ve hücrenin kontrolünü yapmak için "Membran Testi" komut arabirimini kullanınprotokollerin geçiş sırasında "Hücre" modunda membran test membran kapasitans (C, m).
      NOT: Giriş direncindeki ani düşmeler genellikle gevşek bir yamanın varlığına işaret eder ve seri direncinde çarpıcı bir artış, hücre içi organellerin veya zar parçalarının tıkanıklığı gösteren mikropipet ucu göstergesi olabilir. Kayıt sırasında, sürüklenmenin oluşup oluşmadığını kontrol etmek için düzenli olarak mikropipet yerini izleyin, bu da yamanın kaybolmasına neden olabilir. Sürüklenme bir problem oluşturuyorsa, mikropipeti ve yama hücresini kayıt odasının altından dikkatlice kaldırın. Bu adım bazen yamanın kaybolmasına yol açabilir, bu durumda bütün hücre yaması-kelepçe prosedürünün tekrarlanması gereklidir.

5. Hücrelerin Pasif Elektrofizyolojik Özelliklerinin Analizi

  1. Yama-kelepçe deneylerinden elde edilen verileri aldıktan sonra, Clampfit yazılımında aralıksız verileri açın ve ortalamayı ölçünHer hücre için dinlenme membranı potansiyeli. Alternatif olarak, değeri geçerli modda sıfır akım geriliminden aşağıya işaretlenmiş olarak kullanın. Sıvı bağlantı potansiyeline sahip değerleri düzeltin (bu çalışmada 12.4 mV).
  2. Bir hücreden elde edilen 10 mV hiperpolarizasyon adımından (ΔV) verileri açın, adım öncesi ve aşamadaki akım farkını ölçün (Δ I basamağı ) ve giriş direncini (R i ) aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplayın:
    Denklem 1
  3. Hücre kapasitesini hesaplayın (pF cinsinden C m ) (10 mV hiperpolarizasyon adımından gelen aynı akım verisini, voltaj basamağı tetikleyicisinde yükseltilen ilk geçici bozunma akımı boyunca membran kondansatör akımı altındaki toplam alanı birleştirerek kullanın) Hücrenin toplam birikmiş yükünün (Q, pA • ms birimi cinsinden) değerini elde etmek için. Aşağıdaki denklemi kullanın:
    Denklem 2
  4. Her bir hücre için seri direncin (R s ) değerini, 10-mV negatif adımdan gelen başlangıç ​​geçici akımını, zaman sabiti bozunma akımını ( T cinsinden, ms cinsinden) elde etmek için standart bir üstel algoritma ile uyacak şekilde hesaplayın ve Denklem aşağıdaki gibidir:
    Denklem 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sıçan kauda epididimitlerinden epitel hücrelerinin izolasyonu için tarif edilen enzimatik sindirim prosedürü önceki çalışmalarımızdan 9 , 12'deki modifiye edilmiş bir protokoldür. Bu yöntem% 90'ın üzerinde canlılığı olan ve yüzey kabarmaları veya şişmiş hücre hacmi olmayan tek hücreli bir karışım üretir. Heterojen hücre kanşımı, daha önce anlattığımız gibi esasen ana hücrelerden, berrak hücrelerden ve bazal hücrelerden oluşur 1 . Bu protokolde epididimal epitel hücrelerinin nispeten saf numuneleri, birincil ayrışmış hücreleri bir petri kabı üzerinde gece boyunca etiyal olmayan hücrelerin (fibroblastlar ve pürüzsüz hücreler gibi) çanak üzerine yapışmasına izin vermek için, Şekil 1A'da (hasattan önce) gösterilmiştir. Hücre tipleri daha önceleri, fenotipleri ile mikroskopta ayırt edilebilirVe spesifik pasif membran özelliklerine göre kategorize edilir. Ayrışmış hücre karışımı içinde yüzey membranının bir ucunda mikrovilli veya kaba bir membran ve kutuplaşmış hücresel içerikler içeren bir hücre grubu vardır; Bunlara başlıca hücreler veya berrak hücreler denir ( Şekil 1B , oklar). Bu kutuplaşmış epitel hücreleri, morfolojik özellikleri ile ayırt edilemez, ancak pasif membran özelliklerine ve tüm hücre yama klemp kayıtlarından elde edilen iletkenlik yanıtlarına göre tanımlanabilirler. Diğer hücre grubu, membranın bir ucunda stereocilia bulunmayan ve polarize hücresel içerikler barındırmayan daha küçük boyuttadır; Bunlar mikro-virüs olmayan hücreler olarak adlandırılır ve çoğunlukla bazal hücrelerden oluşur ( Şekil 1B , yıldız işareti).

Birincil epitel ana hücreler, diğer hücrelereTüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanarak uygulanan voltaj protokolüne yanıt olarak farklı pasif membran özelliklerini ( Şekil 2 ) ve mevcut modelleri ( Şekil 3 ) göstermektedir. Hücrenin pasif membran elektrofizyolojik özellikleri, tek tek hücrelerin ve hücre tipi grupların başlangıçtaki sağlık durumlarını değerlendirmede yardımcı olabilir. Her bir hücre grubunun membran kapasitesinin (C m ), giriş direncinin (R m ) ve zar potansiyelinin (V m ) tek tek nokta grafiklerinden bir özet Şekil 2A'da verilmektedir. Farklı hücre tipleri (~ 0.4 ms) arasında membran kapasitansında zaman sabitinde herhangi bir fark yoktur (veriler bu el yazmasında gösterilmemektedir). Düşük EGTA K + tabanlı çözümü kullanarak, ana hücreler için ortalama ölçülen membran kapasitesi 9.4 ± 0.5 pF (n = 32) ve net benzeri hücreler için 9.7 ± 1.9 pF (n = 12) 'dir. Zar kapasitesiMikrovilli olmayan hücreler, 5.2 0.8 pF (n = 17) olup, istatistiksel açıdan ana ve açık hücrelerdeki membran kapasitelerinden daha küçüktür.

Şekil 2A'daki (orta panel) ana hücrelerin giriş direnci 1.1 ± 0.2 GΩ (n = 32) ve şeffaf hücrelerin giriş direnci 2.2 ± 0.8 GΩ (n = 12) olup, bu değer daha düşüktür (P <0.001) Mikrovilli olmayan hücrelerin (8.9 ± 2.1 GΩ; n = 17). Şekil 2A'da (sağ panel) gösterildiği üzere, sıfır-akım membran potansiyeli ( yani istirahat membranı potansiyeli V m ) tam hücre konfigürasyonunun oluşturulmasından kısa bir süre sonra ölçülmüş ve düzeltildikten sonra grupların sıvı bağlantı potansiyeli ile karşılaştırılması için kullanılmıştır (12.4 mV). Hücreler standart PSS içinde rutin olarak yıkandı ve ATP içeren 0.1 mM EGTA K + bazlı pipet çözeltisi ile diyalize tabi tutuldu. MEan zar potansiyeli -26 ± 2 (n = 28), -51 mV ile +1 mV arasındadır ve berrak hücrelerin ortalama membran potansiyeli -30 ± 3 mV (n = 10) 47 mV ile -17 mV arasında. Mikroviri olmayan hücreler, -33 ± 5 mV (n = 17) değeri ile -63 mV ile -13 mV arasında en yüksek ortalama zar potansiyeline sahiptir.

Ana hücrelerin düşük giriş direnci, bu hücrelerde içsel iletkenliklerin bulunduğunu düşündürür, ancak pipet ile yama hücre zarları arasındaki sızdırmazlığı gösterebilir. Bu endişeyi gidermek için, kayıtlar sırasında elektriksel özelliklerin ani değişimlerle (bir sızdırmazlık sızıntısının göstergesi) bu hücrelere ait verileri ilk önce çıkarmıştık. Daha sonra, Şekil 2B'de gösterildiği gibi giriş direnciyle 1 giga-ohm eşik değerindeki sızdırmazlık direnci arasındaki korelasyonu analiz ettik. Sonuç, çok düşük bir korelasyon değeri (R2 ≈ 0.02). Bu, sızdırmazlık direncinin giriş direncinde önemsiz bir etkiye sahip olduğunu ve çeşitli hücrelerin bildirilen pasif elektriksel özelliklerinin (ana hücrelerin düşük giriş direnci gibi) bu hücrelerin özünde bulunan özelliklere sahip olduğunu gösterir.

Şekil 3A , normal fizyolojik tuz çözeltisi (PSS) içerisinde banyo yapan, düşük bir EGTA K tabanlı pipet çözeltisi ile diyaliz edilen ve -60 mV'lik bir tutma potansiyelinden uyarılarak, yarı fizyolojik koşullar altında ana hücrelerden kaydedilen tipik akım tepkisidir ( Şekil 3B'nin ekinde belirtildiği üzere -120 mV ila +60 mV arasında değişen) bir dizi 500 ms test voltajına dönüştürür. Şekil 3C'deki iki iz, sıfır akımlı kelepçe altında belirlenmiş bir ana hücrenin varlığında tipik istirahat membranı tepkilerini göstermektedir veyaPipet çözeltisinde ATP yokluğu. ATP varlığında dinlenme potansiyeli nispeten kararlıdır. Oysa hücreler ATP içermeyen bir pipet çözeltisi ile diyaliz edildiğinde ilerleyici bir hiperpolarizasyon gözlemlenir. Pipet solüsyonlarıyla hücre diyalizinin başlangıcında ölçülen başlangıç ​​dinlenme membranı potansiyeli, ATP'ye sahip veya olmayan hücrelerde önemli bir farklılık göstermemektedir ( Şekil 3D ), ölçülen değerlerin hala sağlam ve minimum düzeyde pipet solüsyonlarından etkilendiğini düşündürmektedir.

Şekil 1
Şekil 1 : İzole edilmiş sıçan kaudası epididimal epitel hücrelerinin morfolojik özellikleri. ( A, B ) Sıçanın kauda epididimidlerinden izole edilen epitel hücrelerinin ( A ) ve sonra ( B ) ove'nin hasattan sonraki örnekleriYama-klemp denemelerinden önceki çanak üstünde gece kültürü. Oklar esasen ana hücrelerden ve berrak hücrelerden oluşan mikrovilli hücreleri göstermektedir. Yıldız işaretleri no-microvilli hücreleri gösterir. Yama tutma kaydı için yalnızca tek hücreler seçildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : Tek fare cauda epididimal epitel hücrelerinin pasif membran özellikleri. ( A ) Tek fare kauda epididimal epitel hücrelerinin pasif membran özelliklerinin nokta çizimleri. Pipet çözeltisi düşük EGTA K + tabanlı ve banyo çözümü standart PSS'dir. ( B ) girdi resinin korelasyon analiziHücrelerin mühür direnci ile. NS : anlamlı fark yok, * P <0.05, ** P <0.01 *** P = 0.001 Bonferroni post-hoc testli tek yönlü ANOVA kullanan uygun kontrollere karşı anlamlı fark. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3
Şekil 3 : Tek epididimal ana hücrelerdeki tipik tüm hücreli akımlar. ( A ) Panal B'nin yerleştirilmesinde gösterildiği gibi nabız yaratma protokolü kullanılarak yarı fizyolojik koşullar altında kaydedilen tek epididimal epitel hücrelerinden kaydedilen tipik tüm hücreli akımlar. Noktalı çizgi sıfır akım seviyelerini gösterdi. ( B ) Akım vericisinin akım-gerilim ilişkisiBelirtilen zaman noktalarında A cinsinden ölçülmüştür. Veriler, en az üç hayvandan gelen sekiz ana hücrenin ortalamaları ± SEM'dir. ( C ) ATP (+ ATP) veya ATP içermeyen (-ATP) bir pipet çözeltisi ile diyaliz edilen başlıca hücrelerin dinlenme membranı potansiyelinin temsili izleri. ( D ) + ATP ve -ATP'nin başlangıç ​​istirahat membranı potansiyeli arasında anlamlı bir fark olmadığını gösteren bir çubuk grafik. Değerler, C panelinde gösterilen zamanda ölçülen araç ± SEM'dir. Çubuklardaki köşeli parantez içindeki sayılar, en az üç hayvandan test edilen hücrelerin sayısını gösterir. NS : önemli bir fark yok. ( E ) Tüm hücrelerin veya yalnızca ana hücrelerin sızdırmazlık direnci ve girdi direncinin korelasyon analizi, sıfır akımlı kıskaçta tam hücrelerin kurulmasından kısa süre ölçülen dinlenme membranları ve hiperpolarizasyondan ölçülen akım büyüklükleri P'den tutarak -100 mV'ye adım atınotential. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokolde sıçan kauda epididimidlerinin enzimatik dağılımı sürekli olarak sağlıklı epitel hücreleri vermiştir. Yama-kelepçe deneyleri için epididimal epitel hücrelerinin kalitesi protokolde birkaç kritik adıma bağlıdır. Örneğin, düşük bir santrifüj kuvveti (30 xg) ile hücre karışımının santrifüjlenmesi, spermatozoa ve epididimal luminal içeriğin giderilmesi için önemlidir; Epididimal epitel hücreleri, hücre kültüründe spermatozoa varlığında sağlıksız hale gelir. Ek olarak, birkaç saat süreyle bir Petri kabında ayrışmış hücre karışımının kültürlenmesi, fibroblastları ve düz kası hücrelerini çıkarmak için önemli bir adımdır; Epitel dışı hücreler kültür çanağında daha hızlı yapışırlar ve böylece epitel hücrelerini süspansiyona bırakarak nazik aspirasyonla yeniden hasat edilebilirler. Ayrıca, ince bir cam pipet ile kollajenaz sindirimi ve ezilmesi, salınması için iki önemli adımdırHücre ayrıştırma işlemi sırasında tekli hücreler. Nihayet, epididimal hücrelerin enzimatik sindirimi, yama-kenetleme deneyinde kritiktir; çünkü, verimsiz enzimatik aktivite ya da uzun süre inkübasyon ile aşırı sindirim altındaki sindirim, hem pipet hem de hücre zarları arasındaki giga-ohm mühür oluşumunu bozabilir.

Hücre karışımlarında, bir uçta stereocilia taşıyan sert bir membrana ve hücre içi içeriğin polarize dağılımına sahip olan daha büyük, sütun şekilli hücreler muhtemelen ana hücreler veya berrak hücrelerdir. Önemli mikrovillilere ve kutuplaşmış hücre içeriklerine sahip olmayan diğer hücreler bazal hücreleri ve bağışıklık sistemindeki bazı hücreleri içerebilir. Bu protokol, epididimal epitel hücrelerinin temel morfolojik özelliklerini tanımlamanın yanı sıra, her bir hücrenin pasif membran özelliğini ölçmek için tüm hücre yama tutma yöntemini kullanmaktadır. Bu zar özellikleri,Hücre tipleri. Bu yöntem, 20, sürekli kayıtları 19 sırasında hücresel mimarisi değişikliklerine göre pipet çözeltisi ve elektronik varyasyonları ile hücre içi içeriğinin yıkanması gibi bazı sınırlamalar vardır. Hücrelerin başlangıçta nispeten sağlam koşullarını yansıtan, tüm hücre konfigürasyonunun kurulmasını takiben hemen ölçtüğümüz parametreleri sunuyoruz. Her hücrenin pasif zar özellikleri membran kapasitansı, giriş direnci ve dinlenme membranı potansiyelini içerir.

Hücre membranlarının spesifik kapasite genellikle 1 uF / cm2 olduğu kabul edilmektedir ve bu da hücre membranları 16, 18 sınırlı katlanma ile (örneğin, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar gibi), hücreler için de geçerlidir. Bununla birlikte, özgül kapasitans sabiti, hücreler için daha büyük olma eğilimindedirFarklı bölmelerde birçok hücre zarı kıvrımı olan epitel hücreleri gibi daha karmaşık ve hücresel mimariler. Raporlar, MDCK epitel hücre çizgisi değerleri 4 uF / cm2 ve sırasıyla 17, apikal ve bazal zar özel kapasitanslar 3 uF / cm2 olduğuna işaret etmektedir. Bu çalışmada, ölçülmeyen ortalama membran kapasitansları sırasıyla, mikro-olmayan hücreler grubu, ana hücreler ve berrak hücreler grubu ( örn. Mikrovilli hücreler) için ~ 8 pF ve ~ 12 pF'dir. 1 uF hesaplamalarda / cm2 spesifik kapasite kullanılarak, ölçülen hücre yüzey alanları 13 um ve 18 çaplarına karşılık gelen, sırasıyla 500 mikron 2 ve hiç mikrovilluslar hücreleri ve mikrovilluslar hücreleri için 1,000 um 2'dir um. Bununla birlikte, bu tahminler, mikroskop altındaki hücrelerin boyutlarına dayanılarak beklenenin üzerindedir, ki bunlar ~ 8'dir1, m ve ~ 12 um bir-mikrovilluslar hücreleri ve mikrovilluslar hücreleri, sırasıyla, ve bu hücreler, sırasıyla yaklaşık 2.4 uF / cm2 ve 1.9 uF / cm2 bulunmaktadır. Bulgularımız, mikrovilli olmayan hücrelerin membran peyzajının, salgılama ve taşıma işlevleriyle tutarlı olan mikro-villus hücrelerinden daha karmaşık olduğunu göstermektedir.

Hücre membranlarının spesifik kapasite genellikle 1 uF / cm2 olduğu kabul edilmektedir ve bu da hücre membranları 16, 18 sınırlı katlanma ile (örneğin, bağışıklık sistemi hücreleri, nöronlar gibi), hücreler için de geçerlidir. Bununla birlikte, belirli kapasitans sabiti, farklı bölümlerde birçok hücre zarının katlandığı epitel hücreleri gibi daha karmaşık, hücresel mimarilere sahip hücreler için daha büyük olma eğilimindedir. Raporlar, MDCK epitel hücre çizgisi değerleri 4 uF / cm2 ve 3 uF / cm2 olduğunu göstermektedir 17 . Bu çalışmada, ölçülmeyen ortalama membran kapasitansları sırasıyla, mikro-olmayan hücreler grubu, ana hücreler ve berrak hücreler grubu ( örn. Mikrovilli hücreler) için ~ 8 pF ve ~ 12 pF'dir. 1 uF hesaplamalarda / cm2 spesifik kapasite kullanılarak, ölçülen hücre yüzey alanları 13 um ve 18 çaplarına karşılık gelen, sırasıyla 500 mikron 2 ve hiç mikrovilluslar hücreleri ve mikrovilluslar hücreleri için 1,000 um 2'dir um. Bununla birlikte, bu tahminler, mikroskop altında hücre boyutlarına dayanılarak beklenenin üzerindedir, sırasıyla, mikro-virüs olmayan hücreler ve mikro-virüs hücreleri için ~ 8 μm ve ~ 12 μm'dir ve bu hücreler, belirli bir kapasitans değeri ile daha iyi uyumludur 2 uF / cm2. Bu, epididimal epitel hücrelerinin zar görünümünün mor olduğu ileri sürülmüştürE kompleksinin salgılanması ve nakil işlevleriyle tutarlı olan diğer hücre türlerine göre daha karmaşıktır.

Tüm hücreli kayıtlarda membran boyunca ve membran ile pipet arasındaki sızdırmazlık iletkenliği ölçülen membran özelliklerine katkıda bulundu. Contanın membrandan çok daha yüksek bir direnci vardır ve bu nedenle giriş direnci ve sıfır akım membran potansiyeli gibi pasif membran özelliklerinin ölçümü üzerinde minimum etkiye sahiptir. Bu düşünceye uygun olarak, her bir hücrenin giriş direncine karşı 1 giga-ohm eşik değerindeki sızdırmazlık direncinin korelasyon analizi ~ 0.02 değerinde sonuçlandı ve bu da çok zayıf bir etkiye işaret etti. İstirahat membranı potansiyellerine karşı giriş direnci ya da sızdırmazlık direncinin ya da -100 mV'de ölçülen akım büyüklüğünün diğer korelasyon analizleri, tüm test edilen hücreler ya da yalnızca ana hücreler için düşük değerler verdi. Sonuçlarımız deEpididimal ana hücrelerin ve açık-benzeri hücrelerin giriş direncinin, mikro-olmayan hücrelere kıyasla önemli derecede düşük olduğunu ve böylece hücre tiplerini ayırt etme kararı için bir ön parametre sağladığını belirtti. Bu sonuçlar, ana hücrelerdeki düşük giriş direncinin, hücrelerin kendine özgü fizyolojik bir özelliği olduğunu göstermektedir. Tek epitel hücreleri aynı zamanda uygulanan protokollere ve deneysel koşullara yanıt olarak farklı akım modellerine sahiptir. Tanımlanan her hücre türünün aynı uygulanan voltaj protokolü altında eşsiz akım modelleri sergilediğini gözlemledik. Şekil 3'te gösterilen bir örnek, daha önce bildirdiğimiz gibi, 9 , ana fizyolojik koşullar altında ana hücrelerden kaydedilen tipik akım tepkilerini göstermektedir 9 . Her bir uzmanlaşmış hücre türünün elektrofizyolojik özellikleri kolayca ayırdedilir (veriler bu makalede gösterilmemektedir). Bu parametrelere dayanarak,Farklı hücre tipleri kabaca ana hücrelere, berrak hücrelere ve no-microvilli hücrelere kategorize edilebilir, sonuçlarda açıklandığı gibi.

Giriş direnci, uygulanan potansiyel basamağa (bu çalışmada 10 mV hiperpolarizasyon basamağı) yanıt olarak, -60 mV bir tutma potansiyelinden kaynaklanan zar direncidir. Bu, uygulanan potansiyele tepki olarak açık kanal aktivitesinin kapsamını yansıtıyor. Bu bağlamda, düşük bir direnç, hücrelerin yüksek intrinsik "kaçak" iletkenliğini, yüksek direnç ise kapalı kanalları ifade eder. Ana hücre hücrelerindeki düşük giriş direnci değeri belirgin membran iletkenliğine karşılık gelirken test membranı potansiyelinde küçük bir iletkenliğe sahip açık-benzeri hücreler, kayıt koşulları altında orta düzeyde iletkenliklerini ima etmektedir. Mikro-virüs olmayan hücrelerin önemli ölçüde yüksek giriş direnci, bu statüde açık kanallarının bulunmadığını ima eder. Sıfır cuÖlçülmemiş izole epitel hücrelerinin ortalama istirahat zar potansiyeli, üç hücre grubu için 26-33 mV aralığındadır. Bu değerler, mikroelektrod yöntemi 21 kullanılarak bildirilen zar potansiyeli (-30 mV) ile karşılaştırılabilirdir. Bununla birlikte, ölçülen istirahat potansiyeli, spontan başaklanma potansiyelleri bulunmamasına rağmen, bireysel hücrelerde (+3 mV ila -63 mV arasında) büyük farklılıklar göstermektedir. Yakın zamanda, 9 rapor ettiği gibi bu varyasyon, örneğin ana hücrelerde TRPV6 ve TMEM16A kanalları bağlanmış etkileşimi gibi çeşitli hücre tiplerinde, farklı iyon kanal faaliyetleri etkileşimini yansıtmaktadır. Hücreler ATP pipeti ile diyaliz edildiğinde, ana hücrelerde spontan elektrik potansiyeli gözlemlemedik; Bu, epitel hücrelerinin uyarılmayan 4 olarak sınıflandırılmasına katılır. İlerleyen hiperpolarizasyon, hücreler pi ile diyaliz edildiğindeATP içermeyen pette çözeltisi ATP'ye duyarlı potasyum akımının kademeli görünümünü yansıtmış olabilir. ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının, sıçan epididimisinin ana hücrelerinin Golgi aygıtında eksprese edildiği ve hücre içi ATP'nin tükenmesinin, K ATP kanallarının 14 , 22 etkinleşmesine yol açtığı bildirilmiştir. Bu gözlem, ATP'nin pipet çözeltisine dahil edilmesinin epididimal ana hücrelerin sabit fizyolojik koşullarını desteklediğini önermektedir.

Tam hücre yama tutma tekniği, nöronlar gibi uyarılabilir hücrelerin elektrofizyolojisini incelemek için yaygın olarak kullanılan iyi kurulmuş bir yöntemdir. Bu yazıda, epitel hücreleri gibi uyarılmayan hücrelerin biyoelektrik özelliklerinin karakterizasyonu için de yararlı bir araç olduğunu gösterdik. Ek olarak, bu protokol primer izole epididimin işlevsel incelemelerini mümkün kılarEpididimideki fizyolojik rollerini daha da açıklığa kavuşturmak için kullanılmıştır. Bu çalışma, bu hücrelerin fizyolojik davranışlarının gelecekteki araştırmalarına ve epididimideki biyolojik önemin altına inmesine yardımcı olması için, sıçan kaidesi epididimisinden izole edilen epitel hücrelerinin bazı ön elektriksel özelliklerini sağlamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Metin hakkında faydalı yorumlar için Dr. Christopher Antos'a teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, ŞangayTech Üniversitesi'nden Winnie Shum'a verilen start-up finansmanı ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NNSFC 31471370) finansman ile desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrument of AXON system
Computer controlled amplifier Molecular Devices - Axon Multiclamp 700B patch-clamp amplifier
Digital Acquisition system Molecular Devices - Axon Digidata 1550 converter
Microscope Olympus BX-61WI
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Instrument of HEKA system
Patch Clamp amplifier Harvard Bioscience - HEKA EPC-10 USB double
Microscope Olympus IX73
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Recording chamber and in-line Heater Warner Instruments TC-324C
Other Instrument
Micropipette Puller Sutter Instrument  P-1000
Recording Chamber Warner Instruments RC-26G or homemade chamber
Borosilicate capillary glass with filament Sutter Instrument / Harvard Apparatus BF150-86-10
Vibration isolation table TMC  63544
Digital Camare HAMAMASTU ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
Reagents for isolation
RPMI 1640 medium Gibco 22400089
Penicillin/Streptomycin Gibca 15140112
IMDM ATCC  30-2005 
IMDM Gibco C12440500BT
Collagenase I Sigma C0130
Collagenase II Sigma C6885
5-α-dihydrotestosterone Medchemexpress HY-A0120
Fetal bovine serum capricorn FBS-12A
Micropipette internal solutions (K+-based solution) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35mM Sigma/various V900068
MgCl2 · 6H2O, 2mM Sigma/various M2393
EGTA, 0.1mM Sigma/various E4378
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
K-gluconate, 100mM Sigma/various P-1847
Mg-ATP, 3mM Sigma/Various A9187
The standard external recording physiological salt solution (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140mM Sigma/various V900058
KCl, 4.7mM Sigma/various V900068
CaCl2, 2.5mM Sigma/various V900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mM Sigma/various M2393
NaH2PO4, 1.2mM Sigma/various V900060
HEPES, 10mM Sigma/various V900477
Glucose, 10mM Sigma/various V900392
For pH adjustment
NaOH Sigma/various V900797 Purity >=97%
KOH Sigma/various 60371 Purity >=99.99%

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32, (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141, (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80, (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2, (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4, (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135, (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148, (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52, (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125, (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275, (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102, (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74, (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83, (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263, (2), 280 (1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79, (2), 253-261 (2008).
Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).More

Zhang, B. L., Gao, D. Y., Zhang, X. X., Shi, S., Shum, W. Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis. J. Vis. Exp. (126), e55700, doi:10.3791/55700 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter