Summary
Utvecklingen av mikrobiella samhällen beror på en kombination av faktorer, bland annat miljöarkitektur, medlemmens överflöd, egenskaper och interaktioner. Detta protokoll beskriver en syntetisk, mikrofabrikad miljö för samtidig spårning av tusentals samhällen som finns i femtoliter brunnar, där viktiga faktorer som nischstorlek och inneslutning kan approximeras.
Abstract
Utvecklingen av mikrobiella samhällen beror på en kombination av komplexa deterministiska och stokastiska faktorer som dramatiskt kan förändra rumsfördelningen och aktiviteterna hos medlemmar i samhället. Vi har utvecklat en mikrowell array plattform som kan användas för att snabbt montera och spåra tusentals bakteriella samhällen parallellt. Detta protokoll belyser plattformens användbarhet och beskriver dess användning för att optiskt övervaka utvecklingen av enkla, två medlemmarsamhällen inom ett ensemble av arrays inom plattformen. Denna demonstration använder två mutanter av Pseudomonas aeruginosa , en del av en serie mutanter utvecklade för att studera typ VI-sekretionspatogenitet. Kromosomala insatser av antingen mCherry eller GFP-gener underlättar det konstitutiva uttrycket av fluorescerande proteiner med distinkta emissionsvåglängder som kan användas för att övervaka samhällsmedlemsöverskott och plats inom varje mikrowell. Detta protokoll beskriver en detaljerad metodD för att montera blandningar av bakterier i brunnarna i matrisen och använda tidsförlängningsfluorescensavbildning och kvantitativ bildanalys för att mäta den relativa tillväxten av varje medlemspopulation över tiden. Mikrowellplattens sådd och sammansättning, de bildbehandlingar som krävs för den kvantitativa analysen av mikrobiella samhällen inom matrisen och de metoder som kan användas för att avslöja interaktioner mellan mikrobiella arter som diskuteras.
Introduction
Mikrobiella samhällen formas av både deterministiska faktorer, såsom miljöens struktur och stokastiska processer, som är associerade med celldöd, uppdelning, proteinkoncentration, antal organeller och mutation 1 . Inom den naturliga miljön kan det vara nästan omöjligt att analysera de individuella effekterna av dessa påverkningar på gemenskapens sammansättning och aktivitet. Obscured av naturliga strukturer och begraven inom en kemisk och biologisk miljö, är det extremt utmanande att identifiera medlemmar i samhället och vidare lösa sin spatiotemporal fördelning inom den naturliga miljön. De senaste ansträngningarna har dock underströk betydelsen av den regionala organisationen för samhällsfunktionen och pekar på behovet av att redogöra för både medlemmens överflöd och organisation i pågående studier 2 , 3 , 4 .
DetDet är tydligt att den lokala kemiska miljön ( dvs. tillgången på näringsämnen och sekundära metaboliter), den fysiska strukturen ( t.ex. jordarkitektur, växtrotsor, havspartiklar eller intestinala mikrovilli), närvaro eller frånvaro av syre och införandet av Patogena arter påverkar sammansättningen, arkitekturen och funktionen hos mikrobiella samhällen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Ändå fortsätter traditionella tekniker för kulturer som försummar att fånga dessa faktorer att råda. Gemenskapens sammansättning (till exempel närvaron av medberoende arter), fysisk bindning, signalmolekylkoncentration och direktcellcellskontakt är alla viktiga faktorer för att forma ett mikrobiellt samhälle och kan gå vilse i cOvannämnda kulturbetingelser. Dessa egenskaper är svåra att replikera i en bulkvätskekultur eller på en agarplatta. Tillgången till mikrofluidiska, mikropatterning och nanofabrikationstekniker som möjliggör replikering av centrala fysikaliska och kemiska egenskaper hos naturmiljöer har dock gjort det möjligt för många forskare att bygga bakteriegemenskaper för att studera deras interaktioner 12 , 13 , 14 och att utveckla syntetiska miljöer som Efterlikna naturliga tillstånd 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Detta protokoll beskriver en metod för att tillverka en microwell array-enhet och ger detaljerade experimentella förfaranden som kan användas för att funktionalisera thE brunnar i matrisen och växa bakterier, både som enskilda kolonier och i flera medlemmarsamhällen. Detta arbete visar också hur bakterier modifierade för att producera fluorescerande reporterproteiner kan användas för övervakning av bakteriell tillväxt i brunnar över tiden. En liknande matris presenterades tidigare och visade att det är möjligt att spåra tillväxten av enskilda arter kolonier av Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) i mikrovågor. Genom att modulera brunnstorlek och sådddensitet kan startförhållandena för tusentals tillväxtexperiment varieras parallellt för att bestämma hur de initiala inokulationsförhållandena påverkar bakteriens förmåga att växa 21 . Det aktuella arbetet använder en lite modifierad version av mikrowell-arrayen som bygger på det föregående arbetet genom att möjliggöra samtidig jämförelse av flera arrayer och genom att använda ett mer robust experimentprotokoll. Arrayen som används i det här arbetet innehåller flera undergrupper, eller array ensemBles, som innehåller brunnar i olika storlekar, som sträcker sig från 15 till 100 μm i diameter, som är anordnade på tre olika ställen ( dvs 2x, 3x och 4x brunnsdiametern). Arrayerna är etsade i kisel och tillväxten av bakterierna som utsöndras i kiseluppsättningarna möjliggörs genom att försegla arraysna med en täckglas som har belagts med en medium-infuserad agarosgel. P. aeruginosa- mutanter avsedda att studera typ VI-sekretionssystemet används i denna demonstration.
Resultaten som presenteras här bygger upp mot det ultimata målet att analysera multimembergemenskaper inom mikrovågsskivor, vilket gör det möjligt för forskare att övervaka bakteriens överflöd och organisation på plats samtidigt som man kontrollerar och undersöker den kemiska miljön. Detta borde slutligen ge insikter i "reglerna" som styr samhällsutveckling och arv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Silicon Microwell-array Fabrication
- Parylenbeläggning
- Deponera mellan 1-1,5 μm parylene N på kiselplattor med användning av ett kommersiellt tillgängligt parylenebeläggningssystem enligt tillverkarens specifikationer och instruktioner (inställningar: förångare börvärde = 160 ° C, ugnsuppsättning = 650 ° C).
OBS: Ca 6 g parylene N laddad i en kammare ger beläggningar 1-1,5 μm tjocka.
- Deponera mellan 1-1,5 μm parylene N på kiselplattor med användning av ett kommersiellt tillgängligt parylenebeläggningssystem enligt tillverkarens specifikationer och instruktioner (inställningar: förångare börvärde = 160 ° C, ugnsuppsättning = 650 ° C).
- fotolitografi
- Spin-coat de parylene N-belagda skivorna med vidhäftningspromotorn, 20% hexametyldisilazan (HMDS) och 80% propylenglykolmonometyleteracetat (PGMEA) (se Materialetabell ) vid 3000 rpm under 45 s. Fyll en 2 ml överföringspipett med vidhäftningspromot och strö över hela skivan. Låt skivan sitta i ca 10 s innan den torkas.
- Fyll en 2 ml överföringspipett med positiv-tillNe fotoresist (se Materialetabellen ) och ge bort fotoresist i mitten av skivan. Spinn vid 3000 rpm i 45 s för att ge en resistbeläggning som är ca 1,5 μm tjock.
- Mjukbagna proverna på en kokplatta vid 115 ° C under 1 min.
- Använd en kontaktjusterare och fotomask med önskat brunnmönster för att exponera provet till ultraviolett ljus. Exponera den spinnbelagda skivan genom den mönstrade fotomasken under 6 s, vilket ger en ungefärlig dos av 60-80 mJ / cm2 mätt vid 365 nm.
- Utveckla mönstret genom att nedsänka provet i utvecklaren (<3% tetrametylammoniumhydroxid i vatten, se materialet ) under 2 minuter. Skölj med DI vatten och torka med rent, torrt kväve.
OBS! De områden som fotoresist utsätts för UV bör rensas under utveckling.
- Reaktiv jonetsning
- Använd ett syreplast ets för att avlägsna exponerade parylenHela vägen till kiselsubstratet.
OBS: Receptet kan moduleras för att ändra etylhalten hos parylenen. För parylen tjocklekar mellan 1 och 5 μm, använd ett recept med 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O 2 , 10 W RF och 2000 W ICP på ett Reactive Ion Etching (RIE) verktyg. Efter etsning och avlägsnande av det exponerade parylenskiktet ska det mönstrade området ( dvs. det exponerade kislet) se blankt och silver. - Använd en djup RIE (DRIE, t.ex. Bosch DRIE) etsningsprocess för att etsas i kisel.
OBS: Etchhastigheten och varaktigheten bestämmer brunnsdjupet. En fullständig cykel av Bosch-processen (ett 3 s deponeringssteg: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF och 1,750 W ICP följt av en 10 s etchprocess: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF och 1,750 W ICP) motsvarar ungefär 1 μm etchdjup. Brunnarna som används i detta demonstrationsintervall är 3 - 3,5 μm djupa. - VErifiera etchdjupet med hjälp av fysisk profilometri.
- Ladda provet i en fysisk profilometer (se materialet ).
- Slå på provvakuumet och tryck på den manuella lastknappen.
- Fokusera systemet på provet genom att trycka på "Focus" -knappen. Placera en lämplig funktion för mätning på visningsskärmen.
- Skanna provet. Nivån på profilen och mäta funktionsdjupet.
- Anteckna etsningshastigheten och modulera efterföljande etsningstider för att uppnå önskat djup.
OBS: Mätningarna kommer att omfatta djupet av kiselbrunnen, tjockleken på deponerad parylen och fotoresistens tjocklek. Verifiering av tjockleken hos varje skikt under hela förfarandet är nödvändigt för att uppnå exakt väldjup.
- Använd ett syreplast ets för att avlägsna exponerade parylenHela vägen till kiselsubstratet.
2. Bakteriell kultur och sådd ( Figur 1a )
- Börja kolonier på Luria buljong (LB) agarplattor från glycerollager och använd inom två veckor. Välj kolonier av önskade stammar från LB agarplattor och starta över nattkulturer av P. aeruginosa. Inkubera odlingarna över natten i ca 18 h vid 37 ° C under skakning vid 220 rpm i R2A-medium.
OBS: Kolonier ska plockas inom två veckor efter plätering för att säkerställa att mutationerna och fluorescerande reportergenen behålls. Alla P. aeruginosa- arbeten bör ske under BSL-2-förhållanden. - Använd en diamantskribent för att snitta kiselplattan i individuella marker som innehåller ensembler av olika storlekar och brunnsbrunnskivor. Se till att varje chip innehåller hela komplementet av brunnstorlekar och platser för studien.
Figur 1: Tillverkning och cellsåtning. ( A ) Microwell-arrays aEtsas i kiselplattor belagda med ett tunt skikt av parylen (i). För att blöta brunnarna och / eller funktionalisera ytan, tillsätts en proteinlösning i en droppe ovanpå arraysna (ii). Proteinlösningen avlägsnas, skivorna torkas och en ny lösning innehållande de önskade bakterierna tillsättes (iii). Bakterielösningen avlägsnas efter en inkubationsperiod, och skivorna får torka, lämnar bakterier i brunnarna och på ytan (iv). De ytassocierade bakterierna avlägsnas med parylene-häftning, vilket efterlämnar bakterier som utsöndras rent i mikrovågorna och är fortfarande livskraftiga på grund av 2% glycerolmediet vilket hjälper till att hålla brunnarna hydratiserade (v). Kiselchipsen placeras sedan på array-sidan ned på en agarosgel-belagd glasöverdrag, som matar bakterietillväxt i mikrovågorna (vi). ( B ) Layout av delrader på en enda kiselanordning. Varje delmatris innehåller en uppsättning identiska brunnar. Diametern på microwells över alla sub-aRrays intervall i diameter från 5-100 μm och är organiserad vid 2x, 3x eller 4x brunnsdiameterhöjden, som betecknas av de vita till mörkgråa färgerna på den nedre panelen schematisk. När brunnsdjupet är grunt (<10 μm) är brunndiametrarna 5 och 10 μm sällan användbara, allmänt på grund av brist på celler som koloniserar dessa mycket små brunnar. I detta arbete analyserades endast data från brunnar med 15-100 μm diametrar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
ANMÄRKNING: Såsom visas i Figur 1b innehåller ett komplett chip delbrunnar med brunnar, med diametrar som sträcker sig från 5 till 100 μm, med tre olika toner ( dvs 2x, 3x och 4x diameteren) som upprepas 4 gånger.
- Placera en 150 μl droppe av 500 μg / ml bovint serumalbumin (BSA) i PBS-lösningOvanpå matrisen för att blötlägga mikrovågorna. Inkubera BSA-lösningen i 1 h på chipet vid RT i en fuktig kammare.
- Skapa kammaren genom att fylla botten av en tom pipettspetslåda med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS! Andra ämnen, som specifika lektiner, kan användas istället för BSA för att funktionalisera mikrovågens yta.
- Skapa kammaren genom att fylla botten av en tom pipettspetslåda med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Medan inkubering av kiselchips med BSA-lösning centrifugeras kulturerna vid 2500 rpm (motsvarande i genomsnitt 950 xg) i 5 min och resuspenderas sedan dem i 500 pl av färskt R2A-medium med 2% glycerol.
- Bestäm odlingen av odlingen med användning av en UV-visk spektrometer vid 600 nm. Justera den till en OD av 0,02 med 2% glycerol R2A-medium.
OBSERVERA: Glycerolen hjälper till att förhindra brunnarna att torka ut under parylene.
- Bestäm odlingen av odlingen med användning av en UV-visk spektrometer vid 600 nm. Justera den till en OD av 0,02 med 2% glycerol R2A-medium.
- Efter inkubation, ta bort BSA-lösningen och skölj 3x med PBS genom att ta bort och byta vätskedroppT som täcker kiselmikrocellsuppsättningen. Torka under kväve.
- Tillsätt 150 μl av 0,02 OD-odlingar till var och en av de torra uppsättningar som placeras i en fuktig kammare. Inkubera i 1 h vid 4 ° C för att tillåta bakterierna att vidhäfta vid brunnsväggarna.
OBS: Kylning krävs inte för inkubation. Inkubationstiden på 4 ° C kan användas för att förhindra tillväxten av bakterier innan bildbildningen börjar så att man kan visualisera samhällets geografiska organisation före tillväxten. Rumstemperaturinkubation kan också användas. Båda protokollen resulterar i liknande tillväxtkurvor.
3. Mikroskop Inställning
- Innan du börjar bakteriell inkubation på kiselchipsen, sätt på miljöskyddet (se materialets tabell) och ställ in inställningarna på kontrollboxen så att luftfuktigheten (~ 100%) och temperaturen (30-32) ° C, se steg 3.2) kan jämviktas före tillsats av prov.
- Nivån provhållaren och linje in denTerior runt provet med PBS- blötläggda laboratorietorkar (se materialtabellen ) för att öka fuktigheten i kammaren till daggpunkten . Ställ in kammarens temperatur till 30 ° C och den hos kammarlocket till 32 ° C för att minska kondensationen på bildplanet.
OBS: Glidhållaren passar in i levande cellkammaren med en packning som är ca 1 cm tjock. Provhållaren nivelleras med hjälp av en bubbelnivå som placeras ovanpå provhållaren. Provhållaren kan lutas något och förblir förseglad i packningen till nivå. - Medan kulturer inkuberar på kiselchipsen, slår du strömbrytaren på kvicksilverlampan manuellt minst 30 minuter före bildbehandling. Slå på kameran och det automatiska mikroskopet manuellt. Öppna programvaran som används för att styra mikroskop och kringutrustning och se till att utrustningen är känd av programvaran.
OBS! Förstoringen är 10X med NA = 0,3.
- Mikrovågsugn tidigare framställda agaroslösningar ( dvs 2% agaros i R2A-medium) tills ett vätsketillstånd uppnås, cirka 60 s.
- Vattna på baksidan av en 75 mm x 22 mm, # 1.5 glasskyddsplatta med etanol och placera den i längdriktningen, centrerad, över en glidglas på 2 x 3 "(50 x 75 mm). Placera två PDMS distanshållare (tjocklek på ~ 1 mm) Längs täckglasets långa kanter och byt glasskyddet så att ungefär 1 mm av täckglaset överhänger glidkanten.
- Häll 5 ml flytande agaroslösning på toppen av glasskyddet, bara tillräckligt för att helt täcka det och placera en andra 2 x 3 "glasskiva ovanpå aggregatet för att" smörja "den flytande agaren mellan täckglaset och glidbanan.
OBS: Detta styr agarosdjupet, vilket gör att tjockleken på täckglaset och härdad agaros är lika med tjockleken till PDMS-distanserna. - Låt glasskyddsglasögon-agaros-gelglasögonsmörgassängen sättas tills agaroslösningen börjar stelna; Överför det sedan till ett kylskåp. Efter 15 minuter avlägsnar du överskottet av fast agaros och skär runt glasskyddet. Flytta detta till en ren maträtt och lägg den i ett kylskåp tills det används.
5. Tätning av brunnarna med en agarosbelagd täckglas och bildbehandling
- Efter att inkubationstiden för bakterier är klar, ta bort den agarosbelagda täckglaset från kylskåpet och förbered kiselflisarna enligt följande.
- Doppa kiselchips i ultratat vatten, en i taget, i 10 s vardera. Ställ dem på kanterna på ett labbtork eller vävnad tills det mesta av överskottsvätskan har tappat ur kanterna på flisorna.
- Skär ett stycke tejp för att matcha kantlängden på varje kiselchip. Placera bandet på parylenen som täcker kiseln och använd den för att snabbt avlägsna parylenbeläggningen.
- OmgSväng inåt varje skuret chip och placera varje chip så att microwell-arraysidan vetter mot (och gör kontakt med) den agarosbelagda sidan av en agarosbelagd täckglas. Var försiktig så att du inte flyttar eller byter ut chipet när det rör agarosen för att förhindra tillväxt av bakterier utanför brunnarna.
- Placera den sammansatta microwell array / agaros täckglaset i glidhållaren på scen-topp miljökontrollkammaren på miscroscope.
- Använd omgivande ljus eller riktade ljus ( t.ex. en ficklampa) för att lokalisera intressanta arrays. Använd den kommersiella programvaran som styr det automatiska steget för att spara de positionerna (se materialtabellen). Stäng av omgivande eller riktade ljus efter att positionerna är lagrade.
- Öppna den kommersiella programvaran genom att öppna panelen "ND Acquisition".
OBS! Den här panelen innehåller en meny för automatisk sparning till en specifik katalog, liksom programmerbar bildupptagning. För dessa experiment, Menyerna "Tid", "XY" och "X" används. - För att spara platserna i programvaran, klicka på "XY-menyn" och kolla sedan en tom låda till vänster för varje position som måste sparas. Klicka också på knappen "Inkludera Z".
- Skaffa bilder över tiden vid önskade våglängder och 10 förstoring med hjälp av lämpliga fluorescensfilterbitar (se Materialetabellen).
- Använd kontrollprogramvaran och sparade arraypositioner för att flytta till varje sparade plats och fokusera på brunnarna. Klicka på varje XY-plats i den sparade listan och justera fokuset med hjälp av filtret Green Flourescence Protein (GFP). Spara den nya z-positionen genom att klicka på pilen som pekar på z-platsen.
OBS: Denna process kan vara tidskrävande. Överväg att vidta försiktighetsåtgärder för att öka förstärkningen och använda det neutrala täthetsfiltret för att minska ljusintensiteten för att förhindra photobleaching. - Bestäm z-axelavståndet mellan fokalplan för varje våglängd genom att notera skillnaden i z-axelpositionen när den fokuseras på ytan av matrisen. Välj 2-3 platser från matrisen med den blandade röda / gröna bakteriepopulationen och fokusera med hjälp av filtret Röda Fluorescensprotein (RFP).
- Subtrahera avståndet mellan fokalplanen med hjälp av GFP- och RFP-fluorescensfiltret och lägg till den fokalplanjusteringen under "λ" -menyn.
OBS! Om arrayen exempelvis visas inriktad i GFP-kanalen vid en z-plats på 50 μm, och samma array visas fokuserad i RFP-kanalen vid 55 μm, lägg till +5 bredvid RFP optisk konfiguration i "λ "Menyn.
- Subtrahera avståndet mellan fokalplanen med hjälp av GFP- och RFP-fluorescensfiltret och lägg till den fokalplanjusteringen under "λ" -menyn.
- Börja bildförvärv med tidsfördröjning.
OBS! För de experiment som visas här, blev RFP- och GFP-bilder förvärvade för varje gruppposition med intervaller på 30 min med hjälp av bilddisposition med flera dimensioner genom en kommersiell programvara som styrKameran, slutaren, filterhjulet och motoriseringssteget.- Ställ in "intervallet" till 30 minuter och "experimentets varaktighet" till 24 timmar under "Tid" -menyn. Klicka på "Kör nu".
OBS: När rutorna "Tid", "XY" och "X" är markerade, kommer programmet att flytta scenen till bild varje plats ( dvs. de sparade XYZ-platserna), ta en bild i en våglängd, flytta z-positionen För att redogöra för brännviddsskillnader ( dvs. lambda- eller våglängdskontroll), ta den andra bilden, fortsätt till nästa matrisplats (multipunkt) och loop detta med 30 min intervaller (tidsförlängning).
- Ställ in "intervallet" till 30 minuter och "experimentets varaktighet" till 24 timmar under "Tid" -menyn. Klicka på "Kör nu".
- Använd kontrollprogramvaran och sparade arraypositioner för att flytta till varje sparade plats och fokusera på brunnarna. Klicka på varje XY-plats i den sparade listan och justera fokuset med hjälp av filtret Green Flourescence Protein (GFP). Spara den nya z-positionen genom att klicka på pilen som pekar på z-platsen.
- Skaffa belysningskontrollbilder.
OBS! Använd menyerna "ND Acquisition", "Time" och "XY" för att ta bilder på 4 platser, 25x vardera.- Ta en serie av 100 "darkfield" -bilder genom att stänga av alla ljuskällor och taEn "bild" av en standard bild. Dessa bilder kommer att fånga kamerans ljud. Använd den längsta exponeringstid som användes under timelapsen (steg 5.3.3).
- Ta en serie av 100 "belysningsfält" -bilder genom att avbilda en standardglas ( dvs. enhetlig RFP eller GFP-intensitet) på några olika ställen för att fånga ojämn belysning vid de givna experimentella förhållandena. Välj en exponeringstid som maximerar signalen utan att uppnå mättnad.
6. Analys
- Bearbeta bildstaplarna med hjälp av en bildanalysprogramvara ( t.ex. ImageJ).
- Konvertera de förvärvade bilderna till tiff-filformat med hjälp av den kommersiella programvaran. Ladda upp bilder i bildanalysprogrammet genom att klicka på "File"> "Import"> "Image Sequence."
- Skapa en "Correction Image" genom att medelvärda alla "darkfield" och "illumination field" bilder. SubtracT den genomsnittliga "darkfield" -bilden från det genomsnittliga "belysningsfältet" -bilden genom att välja "Process"> "Image Calculator". Välj de två bilderna, "Image1" och "Image2" och sedan "Subtract" i "Operation" fältet. Klicka på "OK".
- För medelvärde, ladda korrigering (eller mörkfält) bilder, klicka på "Bild"> "Stackar"> "Z Project"> "Genomsnittlig projicering."
- Utför bildregistrering om det behövs. Utför sedan bakgrundsuttrag genom att klicka på "Process"> "Subtrahera bakgrund." Ange en radie ( t.ex. 125) i "radie" fältet och välj "glidande paraboloid".
- Utför belysningskorrigering med hjälp av "Process"> "Calculator Plus". Välj följande parametrar: operation, dela upp; I1, välbild I2, korrigeringsbild K1, korrigeringsbild betyder; Och k2, 0. Klicka på "CreÅt nytt fönster. "
OBS! Den här datasatsen krävde inte registrering, men i annat arbete användes ImageJ Plugin StackReg med "Translation" -transformationen. För bakgrundsuttrag, använd samma glidande paraboloidradie för varje bildsats. Om exempelvis de största brunnarna som bildas har en pixeldiameter av 100, använd en radie större än 100 ( t.ex. 125) för varje bildsats.
- Bestäm tillväxten av varje stam i mikrovågorna.
- Välj regioner av intresse (ROI) runt varje mikrovågsugn i de önskade uppsättningarna med hjälp av pluginet ImageJ "MicroArray".
- Klicka på "Reset Grid" i menyn "MAP". Ange rader, kolumner och diameter (baserat på brunnstorlek och antal på matrisen, se figur 1b ). Välj "cirkel" från menyn "ROI-form".
- Håll "Alt" -tangenten medan du väljer den övre vänstra avkastningen med musen för att flytta tHan ROI array. Håll "shift" -knappen medan du väljer den vänstra ROI för att ändra storleken på arrayen. Håll "shift" -knappen medan du väljer en avkastning från höger sida av matrisen, men inte i hörnen, för att ändra avståndet för avkastningen.
- Använd ovanstående kommandon för att passa ROI-matrisen över brunnarna i en bild. Klicka på "Mät RT".
OBS! Plugin exporterar de önskade mätningarna från varje avkastning. Använd tre ROI-storlekar, skapa koncentriska ringar runt brunnarna för att samla lokal bakgrundssignal ( dvs signalen från mittenringen subtraherad från ytterringen) och fluorescensmätningar ( dvs. signalen från den inre ringen).
- Samla in data i ett kalkylprogram och beräkna bakgrundssignalen. Importera det till en anpassad skriptprogramvara för vidare analys.
- Välj regioner av intresse (ROI) runt varje mikrovågsugn i de önskade uppsättningarna med hjälp av pluginet ImageJ "MicroArray".
- Dataanalys och analys
- Importera data och organisera dataSamlas i ImageJ i en matris i följande ordning för alla tider: kolumn 1, sub-array nummer; Kolumn 2, brunnrad; Kolumn 3, brunn kolonn; Kolumn 4, medelintensitet Kolumn 5, bakgrundsintensitet; Och kolumn 6, medelintensitet - bakgrundsintensitet.
- Separera resultaten från mCherry och GFP förvärvet i olika matriser. Spara resultaten från varje undergrupp och varje färg i en annan cell i en cellmatris.
OBS! Den här organisationen gör det enklare att flytta fram och tillbaka mellan bilddata och mätresultat, rengöra data och se till att mätningarna exakt representerar data.
- Separera resultaten från mCherry och GFP förvärvet i olika matriser. Spara resultaten från varje undergrupp och varje färg i en annan cell i en cellmatris.
- Justera för autofluorescensen av P. aeruginosa .
OBS: I experiment som involverar samkultur av GFP- och mCherry-stammar, bör en mCherry-only-chip analyseras för att fastställa sambandet mellan mCherry och grön autofluorescens.- Markera mCherry-versus-GFP-signalen från alla mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 brunnar vid alla tidpunkter för att bestämma förhållandet mellan mCherry-signalen och autofluorescensen i GFP-kanalen. Subtrahera autofluorescenssignalen från samkulturerna.
- Rita upp banorna och anpassa en modifierad logistisk ekvation till varje bana för att extrahera parametrar med minsta kvadrater som passar i antingen en kalkylprogram eller en anpassad skriptprogramvara.
- Leta efter korrelationer mellan och bland GFP- och mCherry-banorparametrar.
- Importera data och organisera dataSamlas i ImageJ i en matris i följande ordning för alla tider: kolumn 1, sub-array nummer; Kolumn 2, brunnrad; Kolumn 3, brunn kolonn; Kolumn 4, medelintensitet Kolumn 5, bakgrundsintensitet; Och kolumn 6, medelintensitet - bakgrundsintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den experimentella plattformen som presenteras här är utformad för högkvalitativa och höghaltiga studier av bakteriegemenskaper. Designen gör att tusentals samhällen, som växer i brunnar i olika storlekar, kan analyseras samtidigt. Med denna microwell array design kan beroendet av den slutliga samhällssammansättningen vid initiala sådddensiteter, brunnstorlek och kemisk miljö bestämmas. Detta arbete demonstrerar tillväxten av en tvåmedlems community i microwell-arrayen och framlägger metoder för att analysera samhällsammansättning och organisation.
Modelsystemet som användes här designades i Mougous-labbet för att studera typ VI-sekretion i P. aeruginosa . Systemet består av flera mutantstammar, innehållande antingen GFP eller mCherry fluorescerande reportrar. I detta arbete användes 2 olika stammar. Den första är en GFP-märkt ΔretS-mutant som är konstitutivelY uttrycker de toxiska effektorproteinerna associerade med typ VI-sekretion, vilket resulterar i högre nivåer av celldöd i mottagliga celler. Den andra är en RFP-märkt ΔretSΔtse / i1-6-stam som är en deletionsmutant som saknar alla sex kända effektorproteiner och som har visat sig vara mer mottaglig för typ VI-patogenes 22 , 23 , 24 . Växthistorierna för varje art spåras individuellt och inom två medlemmarsamhällen ( dvs. samkultur inom matrisplattformen).
ΔretS- och ΔretSΔtse / i1-6-mutanterna såddes på tre arrays, var och en separat och blandades också ihop i ett förhållande 1: 2 och avbildades därefter var 30: e minut i 20 timmar. Bakteriell tillväxt i brunnarna upphörde mellan 6 och 12 timmar efter sådd. Exempel på fluorescerande bilddata visas i figurerna 2 och 3. Figur 2 visar tillväxt över tiden av ΔretS- och ΔretSΔtse / i1-6-stammarna i 45 μm diameterbrunnar, och Figur 3 visar tillståndet för dessa samma tvåmedlemsgrupper om 6 h efterfröning (hps) i brunnar i olika storlekar.
Figur 2: Pröva bilder från en tidskurs medkultur tillväxtförsök. Två mutanter av P. aeruginosa , som uttrycker antingen mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (röd) eller GFP (retretS) (grön), såddas tillsammans i ett 2: 1 mCherry: GFP-förhållande i mikrowell-arrays. Avbildad här är kompositbilder som tas vid 3 olika tider efter sådd i 45 μm diameterbrunnar. Vänligen klicka här för att se en större versionAv denna siffra.
Figur 3: Räckvidden för brunnsdiametrar som ingår i Microwell Array Device. Representativa bilder av två medlemmarsamhällen fångade vid 8 timmars tillväxt. Generellt visar mCherry (ΔretSΔtse / I1-6) (röd) eller GFP (retret) (gröna) kolonier minimal kolokalisering, som återstår inom olika områden i mikrovågorna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Före förvärv av mätningarna utfördes en glidande parabaloidbakgrunds-subtraktion. Ett belysningskorrektionssteg användes så att signalen från varje mikrovåg som avbildades i ett givet experiment kunde jämföras kvantitativt. Dessa metoder har varit pOmtvistat 25 . Med hjälp av microarray-plugin i ImageJ mättes den genomsnittliga intensiteten hos de röda och gröna bakterierna i de korrigerade bilderna, tillsammans med en lokal bakgrundssignal. Den lokala bakgrundssignalen subtraherades från brunnsignalen och GFP-signalen justerades för att korrigera för autofluorescensen av P. aeruginosa -samkulturer (autofluorescens bestämd från mCherry ΔretSΔtse / i1-6-enda arrays) . När alla dessa korrigeringar utfördes kunde de kvantitativa tillväxtbanorna för mCherry- och GFP-uttryckande bakterier ritas. Exempelväxlingsbanor från 20 och 50 pm diameterbrunnar visas i figur 4 .
Figur 4: Tillväxtkurvor av mono- och samkulturer av P. aeruginosa typ VI-sekretionsmutanter.( A och d ) GFP-AretS monokultur tillväxtkurvor i respektive 20-im och 50-im brunnar. ( B och e ) mCherry-AretSΔtse / i1-6 monokultur tillväxtkurvor i respektive 20 respektive 50 / im brunnar. (C och f) Samkultur av en 1: 2- förhållande bland GFP (grön) och mCherry (röd) P. aeruginosa stammar. Tillväxtkurvor är uppskattade när bildförvärv började, cirka 2 h efterföljande (hps). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Tillväxtvägarna från mono- och samkulturen av P. aeruginosa- stammar indikerar att det finns viss variation i tillväxten från väl till väl och att denna variabilitet ökas i brunnar med mindre dimensioner. Emellertid påverkas medelintensiteten inte signifikant av väl size. Det verkar inte vara en dramatisk eller tydlig negativ effekt på tillväxten av den mottagliga stammen (ΔretSΔtse / i1-6) när ΔretS-stammen är närvarande. Den totala intensiteten för varje stam minskade, men detta berodde på en lägre startkoncentration av varje stam i brunnarna, eftersom den totala ODn hölls konsekvent över experiment, inte den individuella OD-värdet hos varje stam. Det är emellertid svårt att bestämma vilka faktorer som är viktigast för att förstå bakteriens tillväxt i dessa brunnar helt enkelt genom att titta på tillväxtbanor ensam. Därför var varje bana passande med en modifierad logistisk funktion 26 ( Figur 5a ) så att relevanta parametrar kunde extraheras och användas för att analysera bakterieutvecklingsdata. Varje bana transformerades genom att signalets naturliga logg delades av den ursprungliga signalen. En modifierad logistikfunktion, med tre parametrar som motsvarar en maximal signal (A), maximaltHastighet (μ) och en fördröjningstid (τ) användes för att passa varje bana.
Med tanke på den kända växelverkan mellan GFP-AretS och mCherry-AretSΔtse / i1-6-stammarna kan man förutse att tillväxten av mCherry-stammen skulle hämmas i samkulturer med GFP-AretS-stammen 22 , 24 . Med hjälp av de extraherade parametrarna är det möjligt att leta efter positiva eller negativa korrelationer mellan parametrarna extraherade från GFP och mCherry-banor. Den inledande parametraranalysen föreslog att samkulturen av dessa arter hade en försumbar effekt på deras totala tillväxt. Variabiliteten i tillväxtkurvorna beror sannolikt på miljöfaktorer, såsom initial sådddensitet, som blir mer variabel vid mindre brunndiametrar ( Figur 5b ). Betydande negativa effekter på mCherry-stammen på grund av närvaron av GFP-ΔretS observerades ej. När man till exempel plottar den maximala mCherry-signalen jämfört med förhållandet mellan den ursprungliga GFP-till-RFP-signalen sågs ingen minskning av mCherry-uttryck när det var ett högre förhållande av GFP-ΔretS i brunnarna.
Figur 5: Fluorescerande tillväxtbanor passar med en modifierad logistisk ekvation. ( A ) Exempelkurvan normaliseras och passar sedan med en modifierad logistisk ekvation genom att justera tre parametrar, en maximal intensitet (A), en maximal hastighet (μ) och en fördröjningstid (τ). ( B ) Initial mCherry-signal kontra initial GFP-signal i enskilda brunnar med olika diametrar. ( C ) Den maximala mCherry-reportersignalen ritad mot förhållandet mellan initialintensiteten hos de GFP-uttryckande bakterierna till de RFP-uttryckande bakterierna.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Tidigare arbete i Mougous lab visade att effekterna av typ VI-sekretion kräver direkt cell-till-cellkontakt mellan utsöndrande och mottagliga celler och att en längre kontaktperiod resulterar i mer celllys 23 . Därför tror vi att de exponentiala tillväxten hos de två mutanterna i dessa arrays helt enkelt eliminerar de kontaktmedierade patogena effekterna i detta modellsystem. I brunnar i alla storlekar växer de GFP- och mCherry-uttryckande bakterierna i olika patchar (figurerna 2 och 3 ). Därför, snarare än att fokusera på tillväxten, kan bakterier som innehåller kontaktmedierade patogena aktörer studeras bättre med hjälp av rumsliga analyser. Till exempel, snarare än focusiNg på den integrerade intensiteten, som är representativ för det totala antalet röda eller gröna celler i en brunn, tillåter detta microwell-format antalet och platsen för röda och / eller gröna pixlar att räknas. Det är möjligt att analysera tillväxten av enskilda kolonier eller fläckar i dessa brunnar, med fokus på gränserna där de röda och gröna signalerna överlappar varandra ( figur 6a ). Kvantifiera samlokaliseringshändelser och närmaste granneanalyser kan sedan utföras för att titta närmare på egenskaper som patchstorlek, patchtillväxt och patchöverlapp inom enskilda brunnar. Spatialanalyser skulle kunna stödjas av högre förstoringsbildnings- och konfokalmikroskopi ( Figur 6b ).
Figur 6: Den geografiska organisationen av olika arter kan analyseras med hjälp av epifluorescerande och konfokal mikroskopi. (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln presenterade en mikrowell array-enhet och experimentella protokoll som är utformade för att möjliggöra högkvalitativ och hög innehållsinriktad analys av levande celler av bakteriell samhällsutveckling. Medan demonstrationens fokus här var att studera effekterna av kontaktmedierad typ VI-sekretion på samhällsutveckling, var arraysna utformade för att vara flexibla och rymma studien av ett brett spektrum av mikrobiella samhällen och mikro-mikrobi-interaktioner. Arbetet här fokuserar enbart på användningen av bakterier som konstitutivt uttrycker fluorescerande markörer för att möjliggöra enkel spårning av medlemmens överflöd och plats. Möjligheter att prova biologiskt material från enskilda brunnar efter tillväxt eller störning genom att ändra den kemiska miljön kan i princip användas för att identifiera samhällssammansättning och genuttryck.
Varje kiselanordning består av dussintals arrays som innehåller mikrovågor med olika brunnarDiametrar, anordnade på antingen en 2x, 3x eller 4x diameter höjd och etsades till ett djup mellan 3 och 3,5 μm. Eftersom näringsämnen och sekundära metaboliter kan diffundera fritt genom och över agaroslocket, inkluderades olika tonhöjdsarrayer för att möjliggöra undersökning av hur signaleringen mellan mikrovågor eller lokal näringsämnesutarmning påverkar samhällsutvecklingen. I denna demonstration verkar tillväxt och samhällsutveckling inte påverkas av mikrovågsavstånd eller plats inom arraysna. Det grunda djupet valdes för att förenkla bildanalys, vilket begränsar all mikrobiell tillväxt och utveckling till ett enda bildplan. Emellertid har djupare brunnar (20 μm djup) tidigare använts och kan enkelt moduleras i djup genom att variera kiseletsningsprocessen. Att öka aspektförhållandet hos brunnarna förändrar väsentligen graden av infångning som upplevs av cellerna i det inre av brunnarna, vilket effektivt förändrar förhållandet mellan det totala brunnsvolymenTill det område genom vilket näringsämnen diffunderar i brunnens övre del. Denna mängd array konfigurationer kan användas för att studera effekterna av väl till brunn eller brunnsignalering.
En begränsning att använda kisel för att tillverka microwells är att den är ogenomskinlig för synligt ljus. Följaktligen kan rutinanalyser som bygger på ljusöverföring ( t.ex. ljusfält-, fas- eller differentialinterferenskontrastbilder) inte användas för att övervaka tillväxten. Löpande forskning och utveckling i vår grupp har fokuserat på att anpassa denna kiselmikrocells konfiguration och experimentell protokoll för arbete med transparenta arrays för att möjliggöra högre upplösning av fluorescens och ljusfältbildning för övervakning och kvantifiering 27 . Genom att använda transparenta material för tillverkning, såsom SU-8 epoxi på en glasskyddslip, är det möjligt att förvärva både ljusfält och fluorescensbilder med mål som arbetar på kortare arbetsavstånd.Detta möjliggör en mer optimal upplösning som erhålls med nedsänkning av vatten eller oljemål som har ≥40X förstoring, utan svårigheten att avbilda genom ett agarskikt, vilket är fallet för kiselskivor.
Såsom beskrivits i vårt tidigare arbete påverkar såddförhållandena och brunngeometrin sådden av celler i brunnsarrayerna. Vid låga sådddensiteter eller i små brunnar möjliggör stor variation av antalet och typerna av celler som laddas i enskilda brunnar en bred och snabb undersökning av experimentell parameterutrymme. Högre sådddensiteter och / eller avbildning större brunnar ger mer konsekventa förhållanden av celltyper och totala inokulationsnivåer, vilket möjliggör analys av ett stort antal experimentella replikat. En snabb titt på bilder under de tidigaste stadierna av tillväxt tyder på att cellerna bifogar och växer huvudsakligen längs brunnarnas kanter ( Figur 5a ). Det är inte klart om detta är en artefakt relaterad till sOme avdunstningstorkning under såddprocessen eller föreslår en preferens för cellfästning vid flera kanter. Att avsiktligt ändra topografi eller ytkemi hos brunnarna på ett deterministisk sätt skulle kunna avslöja vilka faktorer som har störst inverkan på cellbindning och biofilmbildning.
Tillväxten av bakterierna i dessa brunnar stöds av användningen av en agarosgelbelagd glasöverdragslip infunderad med R2A-medium. Metoderna som beskrivs för att skapa denna agarosbelagda täckglas säkerställer en jämn tjocklek genom vilken bild och en relativt konstant z-position, vilket möjliggör simultan bildning av flera kiselskivor. Användningen av ultra-ren agaros som gelningsmedlet och ett minimalt medium istället för ett komplett medium resulterar i en renare, mindre autofluorescerande bakgrund, vilket ökar det totala signal-brusförhållandet. När man bygger på fluorescens för kvantitativ spårning av mikrobiella samhällen är det viktigt att hålla imagiNg förhållanden konsekventa och att vara akut medvetna om bidrag från autofluorescens, fotobildning och ojämn belysning. Dessutom är det önskvärt med ett tjockt agaroslag, såsom det används här, för experiment som kräver lång tidsförlust av bildförvärv. Tunna skikt (~ 100 μm tjocka) kan göras för att möjliggöra högre förstoringsbilder. Det är dock svårt att hålla aggregatet fuktigt nog för att förhindra att det tunna lagret torkar ut.
Även om den inledande analysen av tillväxtparametrar och initiala inokulationsnivåer ännu inte har avslöjat några signifikanta korrelationer för det enkla systemet som beskrivs här, betonar de protokoll och data som visas i informationsdjupet som kan extraheras från bilder av samhällsutveckling över tiden. Den rumsliga organisationen inom brunnarna utvecklas som enskilda arter kolonier expandera från första "kärnbildning" platser. Således är faktorer som är associerade med den initiala fästdensiteten ( dvs stämning perhaPs från den större preferensen av en art för brunnsytan jämfört med en annan) eller tillväxthastigheten för enskilda plåster kan dramatiskt påverka samhällsutvecklingen. Subtila interaktioner, som de som medieras av kontakt mellan arter (patchar) som etablerats väldigt sent i tillväxtprocessen, kan kräva en djupare analys av bilddata.
Microwell-arrayplattformen och protokollet som presenteras här underlättar den snabba sammansättningen och höghaltighetsanalysen av mikrobiell samhällsutveckling och mikrobe-mikrobe-interaktioner. Framtida arbete som möjliggör kontrollen av den lokala kemiska miljön, genom att förändra sammansättningen av medium i agarlocket eller genom direkt modulering och provtagning via integrerade mikrofluidika, bör möjliggöra experimentella protokoll som rör sig bortom att efterlikna naturlig infiltration och nischstorlek och börja Utforska effekterna av dynamiskt föränderliga miljöer, liknande dem som finns i naturen. Framtida arbete kommer att ökaMatrisdesignen med integrerade mikrofluidika som kan användas för att dynamiskt modulera den lokala kemiska miljön och att prova vätska från enskilda brunnar. Ytterligare arbete med utvecklingen av optiskt tydliga mikrovågsskivor som kan användas för upplösen och uppspelning av samhällsutveckling på högre upplösningar har beskrivits på annat håll 27 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Microwell-arrays tillverkades och karaktäriserades vid Center for Nanophase Materials Sciences User Facilities Division, Office of Basic Energy Sciences, US Department of Energy. Ekonomiskt stöd till detta arbete har skett genom Oak Ridge National Laboratory Director Research and Development Fund. Författarna skulle också vilja tacka J. Mougous Laboratory (University of Washington, Seattle, WA) för tillförsel av P. aeruginosa- stammar som användes i dessa studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 | |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 | |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, | |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter | |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher | |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| Automated Stage | Prior | ProScan III | |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc | |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC | |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips | |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 | |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 | |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| commercial software | Nikon | NIS Elements | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
References
- Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
- Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
- Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
- Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
- Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
- Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
- Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
- Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
- Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
- Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
- Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
- Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
- Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
- Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
- Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
- Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
- Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
- van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
- Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
- Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
- Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
- LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
- Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
- Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).
