Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

Published: June 6, 2017 doi: 10.3791/55701
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3
1Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 2Bredesen Center for Interdisciplinary Research and Graduate Education, University of Tennessee, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory

Summary

הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים, כולל אדריכלות סביבתית, שפע חבר, תכונות, ואינטראקציות. פרוטוקול זה מתאר סביבה סינתטי, microfabricated למעקב בו זמנית של אלפי קהילות הכלול בארות femtoliter, שבו גורמים מרכזיים כגון גודל נישה כליאה ניתן בקירוב.

Abstract

הפיתוח של קהילות חיידקים תלוי בשילוב של גורמים דטרמיניסטיים וסטוכסטיים מורכבים שיכולים לשנות באופן דרמטי את ההתפלגות המרחבית ואת פעילותם של חברי הקהילה. פיתחנו פלטפורמת מערך microell שניתן להשתמש בה במהירות להרכיב ולעקוב אחר אלפי קהילות חיידקים במקביל. פרוטוקול זה מדגיש את השירות של הפלטפורמה ומתאר את השימוש שלה עבור ניטור אופטי של פיתוח של קהילות פשוטות, שתי חברות בתוך אנסמבל של מערכים בתוך הפלטפורמה. הדגמה זו משתמשת בשני מוטציות של Pseudomonas aeruginosa , חלק מסדרה של מוטציות שפותחו כדי לחקור פתוגניות של סוג VI. הוספת כרומוזומלית של גנים mCherry או GFP או להקל על הביטוי המכונן של חלבונים ניאון עם אורכי גל פליטה שונים שניתן להשתמש בהם כדי לפקח על שפע הקהילה ואת המיקום בתוך microwell. פרוטוקול זה מתאר מת 'מפורטד להרכבת תערובות של חיידקים לתוך הבארות של המערך ושימוש זמן לשגות הדמיה פלואורסציה ניתוח כמותי התמונה כדי למדוד את הצמיחה היחסית של כל אוכלוסייה חבר לאורך זמן. זריעה והרכבה של פלטפורמת microwell, ההליכים הדמיה הכרחי לניתוח כמותי של קהילות חיידקים בתוך המערך, ואת השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לחשוף אינטראקציות בין מינים באזור מינים כל דנו.

Introduction

קהילות מיקרוביאליות מעוצבות על ידי גורמים דטרמיניסטיים, כגון מבנה הסביבה ותהליכים סטוכסטיים, הקשורים למוות תאים, חלוקה, ריכוז חלבון, מספר האברונים, ומוטציה 1 . בתוך הסביבה הטבעית, זה כמעט בלתי אפשרי לנתח את ההשפעה הפרטנית של השפעות אלה על הרכב הקהילה ופעילותה. המסתתרים על ידי מבנים טבעיים ונקברים בתוך סביבה כימית וביולוגית, זיהוי חברי הקהילה והמשך פתרון הפיצול הספטיוטמפוראלי שלהם בתוך הסביבה הטבעית הם מאתגרים ביותר. עם זאת, המאמצים האחרונים הדגישו את חשיבותו של הארגון המרחבי על תפקוד הקהילה והצביעו על הצורך לתת דין וחשבון על שפע הארגון וארגונו במחקרים מתמשכים 2 , 3 , 4 .

זהברור כי הסביבה הכימית המקומית ( כלומר , הזמינות של חומרים מזינים וחילוף חומרים משני), המבנה הפיזי ( למשל, ארכיטקטורה של אדמה, שורשי צמחים, חלקיקי האוקיינוס ​​או מיקרוביילי המעי), נוכחות או היעדר חמצן והכנסת מינים פתוגניים משפיעים על הרכב, ארכיטקטורה ותפקוד של קהילות מיקרוביאליות 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, טכניקות מסורתיות עבור תרבויות הזנחה ללכוד גורמים אלה ממשיכים לגבור. הרכב הקהילה ( למשל, נוכחות של מינים תלויי תלות), התקשרות פיזית, ריכוז מולקולה איתות, קשר ישיר תא סלולרי הם כל הגורמים החשובים לעיצוב קהילה חיידקים והוא יכול ללכת לאיבוד גתנאי התרבות האונבנציונלית. מאפיינים אלה קשה לשכפל בתרבות נוזלי בתפזורת או על צלחת אגר. הזמינות של טכניקות microfluidic, micropatterning ו- nanofabrication המאפשרות שכפול של תכונות פיסיקליות וכימיות עיקריות של סביבות טבעיות אפשרה לחוקרים רבים לבנות קהילות חיידקים כדי לחקור את האינטראקציות שלהם 12 , 13 , 14 ולפתח סביבות מלאכותיות לחקות את התנאים הטבעיים 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .

פרוטוקול זה מתאר שיטה לפברק מכשיר מערך microell ומספק נהלים ניסיוניים מפורט שניתן להשתמש בהם כדי פונקציונליE wells במערך לגדל חיידקים, הן כמושבות יחיד מינים בקהילות מרובות חברים. עבודה זו גם ממחישה כיצד חיידקים שונה כדי לייצר חלבונים הכתב ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על צמיחה חיידקים בתוך בארות לאורך זמן. מערך דומה הוצג בעבר הראה כי ניתן לעקוב אחר הצמיחה של מינים בודדים מינים של Pseudomonas aeruginosa ( פ aeruginosa) ב microwells. על ידי שינוי גודל וצפיפות זריעה היטב, התנאים ההתחלתיים של אלפי ניסויים הצמיחה יכול להיות מגוונות במקביל כדי לקבוע כיצד תנאי חיסון ראשוני להשפיע על היכולת של חיידקים לגדול 21 . העבודה הנוכחית משתמשת בגירסה שונה מעט של מערך microwell אשר בונה על העבודה הקודמת בכך שהוא מאפשר השוואה בו זמנית של מערכים מרובים באמצעות פרוטוקול ניסיוני חזק יותר. המערך שבו נעשה שימוש בעבודה זו מכיל מספר תת-מערכות משנה, או מערך אנסםBles, המכיל בארות בגדלים שונים, הנעים בין 15-100 מיקרומטר בקוטר, אשר מסודרים על שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, ו 4x קוטר). מערכים הם חרוט לתוך סיליקון, ואת הצמיחה של חיידקים seeded במערכי הסיליקון מאופשר על ידי איטום מערכים עם coverslip כי כבר מצופה עם ג'ל agarose בינונית חדורים. P. aeruginosa מוטנטים שנועדו ללמוד את מערכת הפרשת סוג VI משמשים בהפגנה זו.

התוצאות המוצגות כאן לבנות לקראת המטרה האולטימטיבית של ניתוח קהילות multimember בתוך מערכים microwell, המאפשר לחוקרים לפקח על שפע וארגון של חיידקים באתרם תוך שליטה וחוקר הסביבה הכימית. זה צריך בסופו של דבר לספק תובנות את "הכללים" אשר קובעים פיתוח הקהילה ואת הירושה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Silicon Microwell- מערך ייצור

  1. ציפוי פרילין
    1. הפקדה בין 1-1.5 מיקרומטר של parylene N על ופלים סיליקון באמצעות מערכת ציפוי parylene זמין מסחרית על פי מפרטים של היצרן והוראות (הגדרות: מאדה להגדיר נקודה = 160 ° C; תנור להגדיר נקודת = 650 ° C).
      הערה: כ 6 גרם של parylene N נטען לתוך ציפויים תשומות קאמרית 1-1.5 מיקרומטר עבה.
  2. פוטוליטוגרפיה
    1. ספין מעיל ופרילין N- מצופה ופלים עם האמרגן הידבקות, 20% hexamethyldisilazane (HMDS), ו 80% פרופילן גליקול monomethyl אתר אצטט (PGMEA) (ראה טבלה של חומרים ) ב 3000 סל"ד במשך 45 שניות. ממלאים פיפטה העברת 2 מ"ל עם האמרגן הידבקות ומפזרים אותו על פרוסות כולו. אפשר פרוסות לשבת על כ 10 s לפני ספינינג אותו יבש.
    2. מילוי פיפטה העברת 2 מ"ל עם חיובי לNe photoresist (ראה טבלה של חומרים ) ו לוותר על photoresist במרכז רקיק. ספין בסל"ד 3,000 עבור 45 ים להניב ציפוי להתנגד כי הוא כ 1.5 מיקרומטר עבה.
    3. רך לאפות את דגימות על hotplate ב 115 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות.
    4. השתמש aligner קשר photomask עם דפוס היטב הרצוי לחשוף את המדגם לאור אולטרה סגול. לחשוף את רקיק מצופה ספין דרך photomask בדוגמת במשך 6 שניות, נותן מינון משוער של 60-80 mJ / cm 2 נמדד ב 365 ננומטר.
    5. פיתוח דפוס על ידי שקוע המדגם מפתח (<3% tetramethyl amroium hydroxide במים, לראות את לוח החומרים ) במשך 2 דקות. לשטוף עם מים DI יבש עם חנקן נקי, יבש.
      הערה: שטחי photoresist חשופים UV יש לנקות במהלך הפיתוח.
  3. ריאקציה יונית תגובתי
    1. השתמש לחרוט פלזמה חמצן כדי להסיר את parylene חשוףכל הדרך למצע הסיליקון.
      הערה: המתכון יכול להיות מאופנן כדי לשנות את שיעור חרוט של parylene. עבור עובי parylene בין 1 ל 5 מיקרומטר, השתמש מתכון עם 60 mTorr, 20 ° C, 100 Sccm O 2 , 10 W RF, ו 2000 W ICP על תגובתי יון תחריט (RIE) כלי. לאחר חריטה והסרה של שכבת parylene חשופים, אזור בדוגמת ( כלומר, הסיליקון חשוף) צריך להיראות מבריק וכסף.
    2. השתמש עמוק RIE (DRIE, למשל, Bosch DRIE) תהליך לחרוט כדי לחרוט לתוך הסיליקון.
      הערה: קצב חריץ ומשך יקבע את עומק היטב. מחזור אחד שלם של תהליך בוש (שלב 3 בתצהיר: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF, ו 1,750 W ICP ואחריו תהליך 10 etch: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF, ו 1,750 W ICP) מתאים כ 1 מיקרומטר של עומק חרוט. הבארות המשמשים בהפגנה זו נע בין 3 - 3.5 מיקרומטר עמוק.
    3. אשרלהקים את עומק חרוט באמצעות profilometry פיזית.
      1. טען את המדגם לתוך profilometer פיזית (ראה טבלה של חומרים ).
      2. הפעל את ואקום המדגם ולחץ על לחצן העומס הידני.
      3. פוקוס על המערכת על ידי לחיצה על כפתור "פוקוס". מקם תכונה מתאימה למדידה במסך התצוגה.
      4. סרוק את המדגם. שלב את הפרופיל ולמדוד את עומק התכונה.
      5. הקלט את קצב חריץ ו לווסת פעמים etch הבאים כדי להשיג את העומק הרצוי.
        הערה: המדידות יכללו את עומק הסיליקון היטב, את עובי parylene שהופקדו, ואת עובי photoresist. אימות עובי של כל שכבה לאורך ההליך הוא הכרחי כדי להשיג עומק מדויק מדויק.

2. תרבות חיידקים זריעת ( איור 1 א )

  1. מושבות התחל על Luria Broth (LB) אגר צלחות מניות גליצרול ולהשתמש בתוך שבועיים. בחר מושבות של הזנים הרצוי של צלחות אגר LB ולהתחיל תרבויות לילה של פ aeruginosa. דגירה תרבויות לילה במשך כ 18 שעות ב 37 ° C תוך רעד ב 220 סל"ד בינוני R2A.
    הערה: המושבות צריך להיבחר בתוך שבועיים של ציפוי על מנת להבטיח את המוטציות ואת גנים כתב ניאון נשמרים. כל עבודה P. aeruginosa צריך להיעשות בתנאים BSL-2.
  2. השתמש בסופר היהלום כדי לפרק את פרוסות הסיליקון לתוך שבבים בודדים המכילים את ההרכבים בגדלים שונים מערכים המגרש היטב. ודא כי כל שבב מכיל את מלוא השלמה של גדלים היטב ואת המגרש עבור המחקר.

איור 1
איור 1: ייצור ו Cell זרע נוהל. ( א ) מערכי Microell אנחרט מחדש לתוך פרוסות סיליקון מצופה בשכבה דקה של parylene (i). כדי להרטיב את הבארות ו / או פונקציונלי את פני השטח, פתרון חלבון מתווסף טיפה על גבי מערכים (ii). הפתרון חלבון מוסר, ופלים מיובשים, וכן פתרון חדש המכיל את החיידקים הרצוי נוסף (iii). הפתרון החיידקי מוסר לאחר תקופת הדגירה, ופלים מותר להתייבש, משאיר מאחוריו חיידקים בבארות ועל פני השטח (iv). החיידקים הקשורים משטח מוסרים עם parylene להרים- off, משאירים מאחור חיידקים seeded נקי microells ועדיין קיימא בשל בינוני גליצרול 2%, אשר מסייע לשמור על בארות hydrated (V). שבבי סיליקון ממוקמים מכן בצד מערך למטה על agarose ג'ל מצופה coverslip זכוכית, אשר מזין צמיחה חיידקים microwells (vi). ( ב ) פריסת תת מערכים על מכשיר סיליקון יחיד. כל מערך משנה מכיל קבוצה של בארות זהות. הקוטר של microwells בכל תת-אRrays טווח בקוטר של 5-100 מיקרומטר מאורגנים ב 2x, 3x, או 4x את הקוטר היטב המגרש, אשר מסומן על ידי לבן כדי אפור כהה צבעים על לוחית הסכימה התחתונה. כאשר מעמקי הבאר הם רדודים (<10 מיקרומטר), 5 ו 10 מיקרומטר היטב בקטרים ​​מועילים לעתים נדירות, בדרך כלל בגלל חוסר תאים ליישב אלה בארות קטנות מאוד. בעבודה זו, רק את הנתונים מבארות עם 15-100 קוטר מיקרומטר נותחו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הערה: כפי שמוצג בתרשים 1b , שבב מלא מכיל מערכי משנה של בארות, בקוטר שבין 5 ל 100 מיקרומטר, עם שלוש זפות שונות ( כלומר 2x, 3x, 4x קוטר) חוזר 4 פעמים.

  1. מניחים 150 droplet μL של 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור (BSA) ב PBS פתרוןעל גבי המערך כדי להרטיב את microwells. דגירה הפתרון BSA עבור 1 שעה על השבב ב RT בחדר לח.
    1. יצירת החדר על ידי מילוי החלק התחתון של תיבת פיפטה קצה ריק עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
      הערה: חומרים אחרים, כגון lectins ספציפיים, ניתן להשתמש במקום BSA כדי לתפקד את פני השטח של microwells.
  2. בעוד דגירה שבבי סיליקון עם פתרון BSA, צנטריפוגה התרבויות בסל"ד 2,500 (המקביל לממוצע של 950 XG) במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend אותם μL 500 של מדיום R2A טרי עם גליצרול 2%.
    1. לקבוע את OD של התרבות באמצעות ספקטרומטר UV-vis ב 600 ננומטר. התאם אותו OD של 0.02 באמצעות בינוני 2% גליצרול R2A.
      הערה: גליצרול מסייע למנוע את הבארות מתייבש במהלך parylene להרים- off.
  3. לאחר הדגירה, להסיר את הפתרון BSA ולשטוף 3x עם PBS על ידי הסרת והחלפת נוזל נוזללא מכסה את מערך סיליקון microwell. יבש בחנקן.
  4. הוסף 150 μL של 0.02 תרבויות OD לכל אחד מערכים יבש להציב תא לח. לדגור על 1 שעות ב 4 ° C כדי לאפשר את החיידקים לדבוק קירות היטב.
    הערה: קירור אינו נדרש עבור הדגירה. 4 ° C דגירה זמן ניתן להשתמש כדי למנוע את הצמיחה של חיידקים לפני הדמיה מתחילה, כך שניתן לדמיין את הארגון המרחבי של הקהילות לפני הצמיחה. ניתן להשתמש בדגירת טמפרטורת החדר. שני הפרוטוקולים לגרום עקומות הצמיחה דומה.

3. מיקרוסקופ הגדרת

  1. לפני תחילת הדגירה חיידקים על שבבי סיליקון, להדליק את הבמה העליונה בקרת הסביבה קאמרית (עיין בטבלה של חומרים) ולהתאים את ההגדרות על תיבת הבקרה כך הלחות (~ 100%) והטמפרטורה (30-32 ° C, ראה שלב 3.2) יכול לאזן לפני הוספת דוגמאות.
  2. רמה את בעל המדגם ואת קו פנימה Terior סביב המדגם עם מגבונים PBS ספוג מעבדה (ראה טבלה של חומרים ) כדי להגדיל את הלחות בחדר לנקודת טל. הגדר את הטמפרטורה של החדר ל 30 מעלות צלזיוס וכי מכסה תא ל 32 מעלות צלזיוס כדי להפחית את עיבוי על המטוס הדמיה.
    הערה: מחזיק שקופיות נכנס לחדר תא חי עם אטם כי הוא כ 1 ס"מ עובי. מחזיק המדגם הוא מפולס בסיוע ברמה בועה כי הוא הניח על גבי המדגם. בעל המדגם יכול להיות מוטה מעט ולהישאר אטום אטם לרמה.
  3. בעוד תרבויות הן incubating על שבבי סיליקון, ידני להפעיל את מתג ההפעלה עבור מנורת כספית לפחות 30 דקות לפני הדמיה. הפעל ידנית את המצלמה ואת הבמה המיקרוסקופ האוטומטית. פתח את התוכנה המשמשת לשלוט במיקרוסקופ וציוד היקפי ולוודא כי הציוד מוכר על ידי התוכנה.
    הערה: ההגדלה היא 10X עם 0.3 = NA.

Class = "jove_title"> 4. הכנת Agarose מצופה זכוכית Coverslips

  1. מיקרוגל שהוכנו בעבר agarose פתרונות ( כלומר 2% agarose במדיום R2A) עד למצב נוזלי הוא הגיע, כ 60 s.
  2. רטוב בחלק האחורי של 75 מ"מ x 22 מ"מ, # 1.5 זכוכית coverslip עם אתנול ומניחים אותו לאורכו, במרכז, על פני שקופית זכוכית 2 x 3 "(50 x 75 מ"מ) .מיקום שני מרווחי PDMS (עובי של 1 מ"מ) לאורך הקצוות הארוכים של coverslip ולהעביר את coverslip זכוכית כך בערך 1 מ"מ של coverslip הוא overhanging את קצה השקופית.
  3. יוצקים 5 מ"ל של תמיסת agarose נוזלית על גבי coverslip זכוכית, רק מספיק כדי לכסות אותו לחלוטין, במקום השני 2 x 3 "שקופיות זכוכית על גבי הרכבה כדי" כריך "אגר נוזלי בין coverslip ו השקופית.
    הערה: זה שולט בעומק agarose, מה שהופך את עובי הכולל של coverslip ו agarose מוקשה שווה עובי למרווחים PDMS.
  4. אפשר זכוכית שקופית-coverslip-agarose ג'ל זכוכית שקופית כריך להגדיר עד הפתרון agarose מתחיל לחזק; ואז, להעביר אותו למקרר. לאחר 15 דקות, להסיר את agarose מוצק עודף לחתוך סביב coverslip זכוכית. מעבירים אותו לתבנית נקייה ומניחים אותו במקרר עד לשימוש.

5. איטום וולס עם Coverslip ו- Agarose מצופה הדמיה

  1. לאחר תקופת הדגירה חיידקים מוחלטת, להסיר את coverslip מצופה agarose מהמקרר ולהכין את שבבי סיליקון, כדלקמן.
    1. לטבול את שבבי הסיליקון במים ultrapure, אחד בכל פעם, במשך 10 שניות כל אחד. הגדר אותם על הקצוות שלהם על מעבדה לנגב או רקמות עד שרוב הנוזלים העודפים יש מרוקן מקצוות של הצ 'יפס.
    2. חותכים חתיכת קלטת כדי להתאים את קצה קצה של כל שבב סיליקון. מניחים את הקלטת על parylene כי הוא מכסה את הסיליקון ולהשתמש בו כדי לקלף במהירות את ציפוי parylene.
    3. Immedלהפוך את כל שבב מקולף ומקום כל שבב כזה בצד microwell מערך פונה (ועושה קשר עם) בצד agarose מצופה של coverslip מצופה agarose. הקפד לא לזוז או להזיז את השבב לאחר שהוא נוגע agarose כדי למנוע את הצמיחה של חיידקים מחוץ הבארות.
  2. מניחים את מערך microwell התאספו / coverslip agarose מחזיק השקופית של הבמה העליונה בקרת הסביבה קאמרית על miscroscope.
    1. השתמש באורות הסביבה או באור מכוון ( למשל, פנס) כדי לאתר מערכי עניין. השתמש בתוכנה המסחרית השולטת על הבמה האוטומטית כדי לשמור על מיקומים אלה (ראה טבלת החומרים). כבה את האור הסביבתי או המכוון לאחר שהמיקומים מאוחסנים.
    2. בתוכנה המסחרית, פתח את החלונית "ND רכישה".
      הערה: לוח זה כולל תפריט לשמירה אוטומטית לספרייה מסוימת, כמו גם לרכישת תמונה לתכנות. עבור ניסויים אלה, התפריטים "זמן", "XY" ו- "λ" משמשים.
    3. כדי לשמור את המיקומים בתוכנה, לחץ על "תפריט XY" ולאחר מכן סמן תיבה ריקה בצד שמאל עבור כל מיקום שיש לשמור. כמו כן, לחץ על הלחצן "כלול Z".
  3. לרכוש תמונות לאורך זמן באורכי גל הרצוי 10 הגדלה באמצעות קוביות מסנן הקרינה המתאים (ראה טבלה של חומרים).
    1. השתמש בתוכנות הבקרה ושמור את מיקומי המעברים כדי לעבור לכל מיקום שנשמר ולהתמקד בבארות. לחץ על כל מיקום XY ברשימה השמורה ולהתאים את המיקוד באמצעות מסנן חלבון הירוק (GFP) מסנן. שמור את מיקום z החדש על ידי לחיצה על החץ המצביע על מיקום z.
      הערה: תהליך זה עשוי לגזול זמן רב. שקול לנקוט באמצעי זהירות של הגדלת הרווח באמצעות מסנן צפיפות נייטרלית כדי להפחית את עוצמת האור כדי למנוע photobleaching.
    2. לקבוע את המרחק בין ציר הציר בין מטוסים מוקד לכל אורך גל על ​​ידי ציון ההבדל במצב z- ציר כאשר התמקדו על פני השטח של המערך. בחר 2-3 מיקומים מהמערך עם האוכלוסייה מעורבת אדום / ירוק חיידקים ולהתמקד באמצעות פילטר הקרינה האדום (RFP) מסנן.
      1. הפחת את המרחק בין המטוסים מוקד באמצעות GFP ו RFP הקרינה מסננים ולהוסיף כי התאמה המטוס מוקד תחת תפריט "λ".
        הערה: לדוגמה, אם המערך נראה ממוקד בערוץ ה- GFP במיקום z של 50 מיקרומטר, ואת המערך אותו נראה ממוקד בערוץ RFP ב 55 מיקרומטר, הוסף +5 ליד תצורה אופטי RFP ב "λ בתפריט.
    3. להתחיל זמן לשגות רכישת התמונה.
      הערה: עבור הניסויים המוצגים כאן, RFP ותמונות GFP נרכשו עבור כל מיקום מערך במרווחים 30 דקות באמצעות רכישת תמונה מרובת מאפיינים באמצעות תוכנה מסחרית השולטתאת המצלמה, תריס, גלגל המסנן, ואת הבמה ממונע.
      1. הגדר את "מרווח" ל 30 דקות ואת "משך הניסוי" ל 24 שעות תחת תפריט "זמן". לחץ על "הפעל כעת".
        הערה: עם הזמן "תיבה", "XY" ו "λ" תיבות מסומנת, הפעלת התוכנית תעביר את הבמה לתמונה כל מיקום ( כלומר את מיקומי XYZ שנשמרו), לקחת תמונה באורך גל אחד, להזיז את המיקום z כדי להסביר את ההבדלים בין המטוס הפוקוס ( כלומר, lambda או אורך הגל שליטה), לקחת את התמונה השנייה, לעבור אל מיקום המערך הבא (multipoint), ואת לולאה זה ב 30 דקות אינטרוולים (זמן לשגות).
  4. לרכוש תמונות בקרת תאורה.
    הערה: השתמש בתפריטים "ND רכישה", "זמן" ו- "XY" כדי לצלם תמונות של 4 מיקומים, 25x כל אחת.
    1. קח סדרה של 100 "darkfield" תמונות על ידי כיבוי כל מקורות האור לוקח"תמונה" של שקופית רגילה. תמונות אלה יצלמו את רעש המצלמה. השתמש זמן חשיפה הארוך ביותר בשימוש במהלך timelapse (שלב 5.3.3).
    2. קח סדרה של 100 "שדה תאורה" תמונות על ידי הדמיה שקופית סטנדרטית ( כלומר RFP אחיד או עוצמת ה- GFP) בכמה מיקומים שונים כדי ללכוד את תאורה אחידה בתנאים הניסוי נתון. בחר זמן חשיפה שממקסם את האות מבלי להגיע לרוויה.

6. ניתוח

  1. לעבד את התמונה ערימות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ( למשל, ImageJ).
    1. להמיר את התמונות שנרכשו לפורמט קובץ tiff באמצעות תוכנה מסחרית. העלה תמונות לתוכנת ניתוח התמונות על ידי לחיצה על "קובץ"> "ייבוא"> "רצף תמונות".
    2. יצירת "תיקון תמונה" על ידי ממוצעים של כל "darkfield" ו "שדה תאורה" תמונות. תת-סמךT התמונה הממוצעת "darkfield" תמונה ממוצעת "שדה תאורה" על ידי בחירת "תהליך"> "מחשבון תמונה". בחר את שתי התמונות, "Image1" ו- "Image2" ולאחר מכן "Subtract" בשדה "מבצע". לחץ על "אישור".
      1. עבור ממוצע, טען את תמונות התיקון (או darkfield), לחץ על "תמונה"> "ערימות"> "פרוייקט Z"> "תחזית ממוצעת".
    3. בצע רישום תמונה במידת הצורך. לאחר מכן, בצע חיסור רקע על-ידי לחיצה על 'עיבוד'> 'הפחתת רקע'. הזן רדיוס ( למשל, 125) בשדה "רדיוס" ובחר "פרבולואיד הזזה".
    4. בצע תיקון תאורה באמצעות "תהליך"> "מחשבון פלוס". בחר את הפרמטרים הבאים: פעולה, מחלק; I1, גם תמונה; I2, תמונת תיקון; K1, תיקון תמונה מתכוון; ו k2, 0. לחץ על "Creאכלו חלון חדש ".
      הערה: סט נתונים זה לא דורש רישום, אבל בעבודה אחרת, ImageJ Plugin StackReg שימש עם טרנספורמציה "תרגום". עבור חיסור רקע, להשתמש באותו רדיוס paraboloid הזזה עבור כל תמונה מוגדר. לדוגמה, אם בארות הגדול ביותר צילמו יש רדיוס פיקסל של 100, להשתמש ברדיוס גדול מ -100 ( למשל, 125) עבור כל תמונה להגדיר.
  2. לקבוע את הצמיחה של כל זן microwells.
    1. בחר אזורים של עניין (ROIs) סביב microwell בכל המערכים הרצוי באמצעות ImageJ "MicroArray" תוסף.
      1. בתפריט "מפה", לחץ על "אפס רשת". ציין שורות, עמודות וקוטר (בהתאם לגודל ולמספר במערך, ראה איור 1 ב ). בחר "מעגל" מהתפריט "צורה ROI".
      2. החזק את מקש "Alt" בעת בחירת ROI השמאלי העליון עם העכבר כדי לעבור tהוא ROI מערך. החזק את המקש "Shift" בעת בחירת החזר ה- ROI השמאלי התחתון כדי לשנות את גודל המערך. החזק את המקש "Shift" בעת בחירת החזר ROI מהצד הימני של המערך, אך לא בפינות, כדי לשנות את המרווחים של החזר ההשקעה (ROI).
      3. השתמש בפקודות לעיל כדי להתאים את מערך ההחזר על ההשקעה על הבארות בתמונה. לחץ על "מדידת RT".
        הערה: הפלאגין ייצא את המדידות הרצויות מכל החזר ROI. השתמש שלושה גדלים ROI, יצירת טבעות קונצנטריות סביב הבארות כדי לאסוף המקומי את האות הרקע ( כלומר, האות מן הטבעת באמצע מופחת מן הטבעת החיצונית) ואת מדידות הקרינה ( כלומר, האות מן הטבעת הפנימית).
    2. לאסוף את הנתונים בתוכנה גיליון אלקטרוני ולחשב את האות הרקע. לייבא אותו תוכנת scripting מותאמת אישית לניתוח נוסף.
  3. ארגון נתונים וניתוח
    1. ייבא את הנתונים וארגן את הנתוניםשנאספו ב- ImageJ למטריצה ​​בסדר הבא לכל הזמנים: עמודה 1, מספר מערך משנה; טור 2, שורה טובה; עמודה 3, עמודה טובה; טור 4, עוצמת מתכוון; עמודה 5, עוצמת הרקע; ואת עמודה 6, עוצמת אינטנסיביות - עוצמת הרקע.
      1. להפריד את התוצאות של הרכישה mCherry ו GFP לתוך מטריצות שונות. אחסן את התוצאות מכל מערך משנה וכל צבע בתא אחר במערך תאים.
        הערה: ארגון זה מקל על מעבר הלוך ושוב בין נתוני תמונות ותוצאות מדידה, ניקוי הנתונים ולוודא שהמדידות מייצגות במדויק את הנתונים.
    2. התאם עבור autofluorescence של פ aeruginosa .
      הערה: בניסויים מעורבים שיתוף תרבות של GFP ו mCherry זנים, שבב mCherry בלבד צריך להיות מנותח כדי לוודא את הקשר בין mCherry ו autofluorescence ירוק.
      1. מגרש את האות mCherry לעומת GFP מכל mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 בארות בכל עת נקודות כדי לקבוע את הקשר בין האות mCherry ו autofluorescence בערוץ ה- GFP. הפחת את האות autofluorescence מן שיתוף תרבויות.
    3. מגרש את המסלולים ולהתאים משוואה לוגיסטית שונה לכל מסלול כדי לחלץ פרמטרים באמצעות ריבועים לפחות התאמת או תוכנת גיליון אלקטרוני או תוכנה מותאמת אישית scripting.
    4. חפש קורלציות בין לבין הפרמטרים מסלול GFP ו mCherry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפלטפורמה הניסויית המוצגת כאן מיועדת לתפוקה גבוהה ולחקר תוכן גבוה של קהילות חיידקים. התכנון מאפשר לנתח בו זמנית אלפי קהילות, הגדלות בארות בגדלים שונים. עם עיצוב מערך microwell זה, את התלות של הרכב הקהילה הסופי על צפיפות זריעת הראשונית, גם גודל, סביבה כימית ניתן לקבוע. עבודה זו מדגימה את הצמיחה של הקהילה שני חברים במערך microwell ומכניס שיטות לנתח את הרכב הקהילה וארגון.

מערכת המודל המשמשת כאן תוכננה במעבדה מוגוס כדי לחקור את הפרשת סוג VI ב P aeruginosa . המערכת מורכבת של זנים מוטציה מספר, המכיל גם GFP או mCherry עיתונאים פלואורסצנטי. בעבודה זו השתמשו 2 זנים שונים. הראשון הוא GFP שכותרתו ΔretS מוטציה כי constutivelY מבטא את חלבונים משפיע רעילים הקשורים הפרשת סוג VI, וכתוצאה מכך רמות גבוהות יותר של מוות של תאים בתאים רגישים. השני הוא RFP שכותרתו ΔretSΔtse / i1-6 זן כי הוא מוטציה המחיקה חסר כל שישה חלבונים משפיע ידוע וזה הוכח להיות רגישים יותר סוג 6 פתוגנזה 22 , 23 , 24 . מסלולי הצמיחה של כל מין היו במעקב בנפרד ובתוך שתי קהילות חבר ( כלומר שיתוף תרבות בתוך פלטפורמת מערך).

Δrets ו ΔretSΔtse / i1-6 מוטציות היו seeded על שלושה מערכים, כל אחד בנפרד מעורבב יחד יחס 1: 2, ולאחר מכן צילמו כל 30 דקות במשך 20 שעות. גידול בקטריאלי בארות נפסקה בין 6 & 12 שעות postseeding. דוגמאות לנתוני תמונת הניאון מוצגים באיורים 2 ו -3. איור 2 מראה צמיחה לאורך זמן של Δrets ו ΔretSΔtse / i1-6 זנים בקוטר 45 מיקרומטר בקוטר, ואיור 3 מציג את מצבם של אלה שתי קהילות חברים על 6 שעות postseeding (hps) בארות בגדלים שונים.

איור 2
איור 2: תמונות לדוגמה מתוך זמן תרבות שיתוף תרבות ניסוי הצמיחה. שני מוטנטים של פ aeruginosa , להביע או mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (אדום) או GFP (ΔretS) (ירוק), הם seeded יחד ב mCherry 2: 1: יחס GFP במערכים microwell. בתמונה כאן הם תמונות מרוכבות שצולמו ב 3 פעמים שונות postseeding בקוטר 45 מיקרומטר בקוטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותרשל נתון זה.

איור 3
איור 3: טווח של בקטרים ​​היטב כלול מערך Microell מערך. תמונות נציג של שתי קהילות חברות שנתפסו 8 שעות של צמיחה. באופן כללי, mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (אדום) או GFP (ΔretS) (ירוק) מושבות להראות colocalization מינימלית, שנותרו בתוך אזורים שונים microwells. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

לפני רכישת המדידות בוצע חיסור רקע פרלבלי. צעד תיקון תאורה נעשה שימוש, כך שניתן יהיה להשוות את האות מכל microwell שצולם בניסוי נתון באופן כמותי. שיטות אלה היו pתיאר היטב 25 . באמצעות תוסף microarray ב ImageJ, העוצמה הממוצעת של חיידקים אדומים וירוקים נמדד בתמונות מתוקנות, יחד עם אות רקע מקומי. אות הרקע המקומי היה מופחת מן האות היטב, ואת האות GFP הותאם לתקן את autofluorescence של P. aeruginosa שיתוף תרבויות (autofluorescence נקבע מתוך mCherry ΔretSΔtse / i1-6 רק מערכים) . לאחר שכל התיקונים בוצעו, מסלולי הגידול הכמותיים של חיידקי mCherry ו- GFP המבטאים יכולים להיות מזויפים. דוגמה מסלולים הצמיחה מ 20 ו 50 מיקרומטר בקוטר בארות מוצגים באיור 4 .

איור 4
איור 4: עקומות הצמיחה של מונו ו-תרבויות של P. aeruginosa סוג VI מוטציות הפרשת.( A ו- D ) GFP-ΔretS צמיחה עקומות הצמיחה ב -20 מיקרומטר ו -50 מיקרומטר בארות, בהתאמה. ( B ו e ) mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 monoculture צמיחה עקומות 20 ו 50 מיקרומטר בארות, בהתאמה. (C ו) שיתוף תרבות של תערובת יחס של 1: 2 של GFP (ירוק) ו mCherry (אדום) P. aeruginosa זנים. עקומות הצמיחה הם זממו מ כאשר רכישת התמונה החלה, כ 2 שעות postseeding (hps). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

מסלולי הצמיחה של מונו ו שיתוף תרבות של זני aeruginosa פ מצביעים על כך שיש כמה השתנות הצמיחה מ טוב היטב כי השתנות זו היא גדלה בארות של ממדים קטנים יותר. עם זאת, עוצמת מתכוון לא מושפע באופן משמעותי על ידי טוב siז. לא נראה שיש השפעה שלילית דרמטית או ברורה על הצמיחה של זן רגישים (ΔretSΔtse / i1-6) כאשר זן ΔretS קיים. העוצמה הכוללת עבור כל זן ירד, אבל זה היה בשל ריכוז מתחיל נמוך יותר של כל זן בבארות, כמו OD הכולל נשמר עקביות על פני ניסויים, לא OD בודדים של כל זן. עם זאת, קשה לקבוע מהם הגורמים החשובים ביותר להבנת הצמיחה של חיידקים אלה בארות פשוט על ידי הסתכלות על מסלולי הצמיחה לבד. לכן, כל מסלול היה מתאים עם פונקציה לוגיסטית שונה 26 ( איור 5 א ), כך פרמטרים רלוונטיים ניתן לחלץ ומשמשים לנתח נתונים הצמיחה חיידקי. כל מסלול השתנה על ידי לקיחת יומן טבעי של האות מחולק האות הראשוני. פונקציה לוגיסטית שונה, עם שלושה פרמטרים המקביל האות המרבי (A), מקסימום(Μ), וזמן השהיה (τ), שימש כדי להתאים לכל מסלול.

בהתחשב אינטראקציה ידועה בין GFP-Δrets ו mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 זנים, אפשר לשער כי הצמיחה של זן mCherry יהיה עכבות שיתוף תרבויות עם זן GFP-ΔretS 22 , 24 . באמצעות הפרמטרים שחולצו, ניתן לחפש מתאמים חיוביים או שליליים בין הפרמטרים המופקים מ GFP ו מסלולים mCherry. מהניתוח הראשוני של הפרמטרים עולה כי לתרבות המשותפת של מינים אלה השפעה זניחה על צמיחתם הכוללת. השתנות שנראית בעקומות הצמיחה צפויה בשל גורמים סביבתיים, כגון צפיפות זריעה ראשונית, אשר הופך משתנה יותר בקטרים ​​טוב יותר ( איור 5 ב ). השפעות שליליות משמעותיות על המתח mCherry בשל נוכחות של GFP-ΔretS לא נצפו. לדוגמה, כאשר מתכננים את האות mCherry מקסימלית לעומת היחס של האות GFP-to-RFP הראשוני, לא ירידה בביטוי mCherry נמצא כאשר היה יחס גבוה יותר של GFP-ΔretS בבארות.

איור 5
איור 5: מסלולי צמיחה פלורסנט להתאים עם משוואה לוגיסטית שונה. ( א ) עקומת הדגימה מנורמל ולאחר מכן מתאים עם משוואה לוגיסטית שונה על ידי התאמת שלושה פרמטרים, אינטנסיביות מקסימלית (A), שיעור מקסימלי (μ) וזמן השהיה (τ). ( ב ) האות mCherry הראשונית לעומת האות GFP הראשונית בארות בודדים של קטרים ​​שונים. ( ג ) האות המקסימלי mCherry כתב זממו לעומת היחס בין עוצמת הראשונית של החיידק GFP- להביע את החיידק להביע RFP.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

עבודה קודמת במעבדה מוגוס ציינה כי ההשפעות של הפרשת סוג VI דורשות קשר ישיר בין תא לתא בין תאים מפרישים ותאים רגישים, וכי תוצאות תקופת מגע ארוכות יותר בתאי תא נוספים 23 . לכן, אנו מאמינים כי במערכים אלה, הצמיחה המהירה של שני המוטנטים היא פשוט צוללת את ההשפעות הפתוגניות המגע באמצעות מערכת מודל זו. עם זאת, בארות בכל הגדלים, את ה- GFP ו- mCherry- להביע חיידקים לגדול טלאים שונים ( תרשימים 2 ו -3 ). לכן, במקום להתמקד בשיעורי צמיחה, קהילות חיידקיות המכילות שחקנים מתווכת קשר מתווכים ניתן ללמוד טוב יותר באמצעות ניתוח מרחבי. לדוגמה, במקום להתמקדNg על אינטגרציה אינטנסיבית, אשר מייצג את המספר הכולל של תאים אדומים או ירוקים היטב, זה בפורמט microwell מאפשר למספר ומיקום של אדום ו / או ירוק פיקסלים לספור. ניתן לנתח את הצמיחה של מושבות בודדות או טלאים בתוך בארות אלה, תוך התמקדות בגבולות שבהם האותות האדומים והירוקים חופפים ( איור 6 א ). לכמת אירועים שיתוף לוקליזציה ואת השכן הקרוב ניתוחים אז ניתן לבצע כדי להסתכל מקרוב על תכונות כמו גודל תיקון, תיקון קצב הצמיחה, ואת החפיפה תיקון בתוך בארות בודדים. ניתוח מרחבי יהיה בסיוע הדמיה הגדלה גבוהה מיקרוסקופיה confocal ( איור 6 ב ).

איור 6
איור 6: הארגון המרחבי של מינים שונים ניתן לנתח באמצעות מיקרוסקופיה Epifluorescent ו Confocal. ( B ו c ) תמונות confocal (הגדלה 20X, NA = 0.8) של 15 מיקרומטר קוטר, ~ 7.5 מיקרומטר בארות עמוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה הציג מכשיר מערך microell ופרוטוקולים ניסיוניים שנועדו לאפשר תפוקה גבוהה תוכן גבוהה לחיות תא הדמיה מבוסס ניתוח של פיתוח הקהילה חיידקים. בעוד שמיקוד ההפגנה כאן היה לבחון את ההשפעות של הפרשת סוג 6 על פיתוח הקהילה, המערכים נועדו להיות גמישים ולהתאים את המחקר למגוון רחב של קהילות חיידקים ואינטראקציות חיידקים מיקרוביאליים. העבודה כאן מתמקדת אך ורק בשימוש בחיידקים המבטאים באופן קונקרטי סמנים פלואורסצנטיים על מנת לאפשר מעקב פייסני של שפע החברות ומיקומן. עם זאת, הזדמנויות למדגם חומר ביולוגי מבארות בודדות בעקבות צמיחה או הפרעה על ידי שינוי הסביבה הכימית יכול, בראש ובראשונה, לשמש כדי לזהות הרכב הקהילה ביטוי גנים.

כל מכשיר סיליקון מורכב עשרות מערכים המכילים microwells עם שונים היטבבקוטר, מאורגן על 2x, 3x, או 4x קוטר גובה, חרוט לעומק בין 3 & 3.5 מיקרומטר. בגלל חומרים מזינים מטבוליטים משניים יכול לפזר באופן חופשי דרך ומכסה את המכסה agarose, שונים תת המגרש מערכים נכללו כדי לאפשר בדיקה של איך איתות בין microwells או דלדול התזונה המקומי השפעה הקהילה פיתוח. בהפגנה זו, הצמיחה ופיתוח הקהילה לא נראה להיות מושפע על ידי ריווח microell או מיקום בתוך מערכים. עומק הרדוד נבחר כדי לפשט את ניתוח התמונה, הגבלת כל הצמיחה חיידקים ופיתוח למישור תמונה אחת. עם זאת, בארות עמוקות (20 מיקרומטר עמוק) שימשו בעבר והוא יכול להיות מאופנן בקלות לעומק על ידי שינוי משך תהליך סיליקון תחריט. הגדלת יחס הממדים של בארות בעצם משנה את מידת הכליאה שחווים את התאים בפנים של הבארות, ביעילות לשנות את היחס בין נפח הכולללאזור שבו חומרי הזנה לפזר לתוך החלק העליון של הבאר. מגוון זה של תצורות מערך יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של טוב היטב או היטב תוך איתות.

מגבלה אחת של שימוש בסיליקון כדי לפברק את microwells היא כי הוא אטום לאור הנראה. כתוצאה מכך, ניתוחים שגרתיים המסתמכים על העברת אור ( למשל, brightfield, שלב, או הפרעה הדדית בניגוד הדמיה) לא ניתן להשתמש כדי לפקח על הצמיחה. מחקר ופיתוח מתמשך בקבוצה שלנו התמקדה התאמת תצורה זו michelell סיליקון פרוטוקול ניסיוני לעבודה עם מערכים שקופים כדי לאפשר הקרינה ברזולוציה גבוהה יותר הדמיה brightfield לניטור וכימות 27 . באמצעות חומרים שקופים עבור ייצור, כגון SU-8 אפוקסי על coverslip זכוכית, אפשר לרכוש גם brightfield ו תמונות פלואורסצנציה עם מטרות הפועלות במרחקים עבודה קצר יותר.זה מאפשר רזולוציה אופטימלית יותר להתקבל עם טבילה במים או מטרות שמן שיש הגדלה 40X, ללא הקושי של הדמיה דרך שכבת אגר, כמו במקרה של מערכי סיליקון.

כפי שתואר בעבודה הקודמת שלנו, זריעת התנאים היטב הגיאומטריה להשפיע על זריעת תאים בתוך מערכים היטב. בצפיפות זריעה נמוכה או בארות קטנות, רמות גבוהות של וריאציה במספר וסוגים של תאים העומסים לתוך בארות בודדות מאפשר בדיקה רחבה ומהירה של שטח פרמטר ניסיוני. צפיפות זריעה גבוהה יותר ו / או הדמיה בארות גדולות מניבות יחסי עקביות יותר של סוגי תאים ורמות inoculum הכולל, המאפשר ניתוח של מספר גדול של משכפל ניסיוני. מבט מהיר על התמונות במהלך השלבים המוקדמים של הצמיחה עולה כי תאים לצרף ולגדול בעיקר לאורך הקצוות של בארות ( איור 5 א ). לא ברור אם זהו חפץ הקשור לסOme evaporative ייבוש במהלך תהליך זריעה או מציע העדפה של התא המצורף למספר קצוות. באופן מכוון לשנות את הטופוגרפיה או כימיה פני השטח של הבארות באופן דטרמיניסטי יכול לחשוף אילו גורמים יש את ההשפעה הגדולה ביותר על התקשרות תא biofilm היווצרות.

הצמיחה של החיידקים בארות אלה נתמך על ידי שימוש agarose ג'ל מצופה coverslip זכוכית חדורים בינוני R2A. השיטות המתוארות כדי ליצור את זה coverslip agarose מצופה להבטיח עובי אפילו שדרכו התמונה די קבוע z- מיקום, המאפשר את האפשרות סימולטנית תמונה מרובים שבבי סיליקון. השימוש agarose אולטרה טהור כמו סוכן gelling בינוני מינימלי ולא בינוני להשלים תוצאות מנקה, פחות רקע autofluorescent, הגדלת יחס האות לרעש הכולל. כאשר להסתמך על הקרינה למעקב כמותי של קהילות חיידקים, חיוני לשמור imagiNg התנאים עקבית להיות מודעים בחריפות תרומות מ autofluorescence, photobleaching, תאורה לא אחידה. בנוסף, עבור ניסויים הדורשים זמן רב לשגות רכישת התמונה, שכבה עבה של agarose, כמו בשימוש כאן, הוא הרצוי. שכבות מדלל (~ 100 מיקרומטר עבה) ניתן לבצע הדמיה הגדלה גבוה. עם זאת, קשה לשמור על ההרכבה לח מספיק כדי למנוע את השכבה דקה מייבש החוצה.

למרות הניתוח הראשוני של פרמטרים הצמיחה ורמות inoculum הראשונית עדיין לא גילה שום מתאם משמעותי עבור המערכת הפשוטה המתוארת כאן, הפרוטוקולים והנתונים המוצגים להדגיש את עומק המידע שניתן לחלץ תמונות של פיתוח הקהילה לאורך זמן. הארגון המרחבי בתוך הבארות מתפתח כמו מושבות מינים בודדים להרחיב מן הראשונים "נוקלאציה" אתרים. לפיכך, גורמים הקשורים בצפיפות ההתקשרות הראשונית ( כלומר, הפקת פרהPS מתוך העדפה גדולה יותר של מין אחד עבור פני השטח היטב לעומת אחרת) או שיעור הצמיחה של תיקונים בודדים יכול להשפיע באופן דרמטי על פיתוח הקהילה. אינטראקציות Subtler, כגון אלה מתווכת על ידי מגע בין מינים (תיקונים) הוקמה מאוחר מאוד בתהליך הצמיחה עשוי לדרוש ניתוח מעמיק יותר של נתוני התמונה.

פלטפורמת מערך microell ופרוטוקול המוצגים כאן להקל על הרכבה מהירה תוכן גבוהה ניתוח של פיתוח הקהילה מיקרוביאלית חיידקים חיידקים חיידקים. עבודה עתידית המאפשרת את השליטה בסביבה הכימית המקומית, על ידי שינוי הרכב בינוני בתוך המכסה אגר או על ידי ישירות modulation ו דגימה באמצעות microfluidics משולבת, צריך לאפשר פרוטוקולים ניסיוניים כי מעבר מעבר לחיקוי טבעי נישה וגודל נישה ולהתחיל לחקור את ההשפעה של סביבות המשתנות באופן דינמי, בדומה לאלו הנמצאות בטבע. העבודה העתידית תוגברעיצוב מערך עם microfluidics משולבת שניתן להשתמש בהם כדי דינמי לווסת את הסביבה הכימית המקומית לדגום נוזל מבארות בודדים. עבודה נוספת על פיתוח של מערכים microell ברור אופטית שניתן להשתמש בהם עבור ברזולוציה גבוהה יותר מעקב brightfield של צמיחה קהילתית תוארה במקום אחר 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מערכים Microwell היו מפוברקות מאופיין במרכז חומרים Nanophase מדעי משתמש מתקני החטיבה, משרד בסיסי מדעי האנרגיה, מחלקת האנרגיה של ארה"ב. תמיכה כספית לעבודה זו נמסרה באמצעות Oak Ridge National Laboratory מנהל מחקר ופיתוח הקרן. המחברים גם רוצים להודות למעבדה ג 'יי מוגז (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, WA) על אספקת זנים פ aeruginosa המשמשים מחקרים אלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Parylene N Specialty Coating Systems CAS NO.:1633-22-3
Parylene coater Specialty Coating Systems Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010
Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>,
adhesion promoter Shin-Etsu Microsci MicroPrime P20 adhesion promoter
postive tone photoresist Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357)
Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool Oxford Instruments Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher
R2A Broth TEKnova R0005
Bovine Serum Albumin Sigma A9647
Multimode Plate Reader Perkin Elmer Enspire, 2300-0000
Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
Automated Stage Prior ProScan III
CCD camera Nikon DS-QiMc
Stage-top environmental control chamber In Vivo Scientific STEV ECU-HOC
Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190144
UltraPure Agarose ThermoFisher Scientific 16500500
25 x 75 mm No. 1.5 coverslip Nexterion High performance #1.5H coverslips
Fluorescence Reference Slides Ted Pella 2273
Physical Stylus Profilometer KLA Tencor P-6
lab wipes Kimberly Clark Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
commercial software Nikon NIS Elements
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss
filter cubes Nikon Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, J., Deng, Y., et al. Stochasticity, succession, and environmental perturbations in a fluidic ecosystem. Proc Natl Acad Sci. 111, E836-E845 (2014).
  2. Valm, A. M., Welch, J. L. M., et al. Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (10), 4152-4157 (2011).
  3. Satoh, H., Miura, Y., Tsushima, I., Okabe, S. Layered structure of bacterial and archaeal communities and their in situ activities in anaerobic granules. Appl Environ Microbiol. 73 (22), 7300-7307 (2007).
  4. Kim, H. J., Boedicker, J. Q., Choi, J. W., Ismagilov, R. F. Defined spatial structure stabilizes a synthetic multispecies bacterial community. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18188-18193 (2008).
  5. Nunan, N., Wu, K., Young, I. M., Crawford, J. W., Ritz, K. Spatial distribution of bacterial communities and their relationships with the micro-architecture of soil. FEMS Microbiol Ecol. 44, 203-215 (2003).
  6. Grundmann, G. L. Spatial scales of soil bacterial diversity - The size of a clone. FEMS Microbiol Ecol. 48, 119-127 (2004).
  7. Langenheder, S., Lindstrom, E. S., Tranvik, L. J. Structure and Function of Bacterial Communities Emerging from Different Sources under Identical Conditions. Appl Environ Microbiol. 72 (1), 212-220 (2006).
  8. Camp, J. G., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Patterns and Scales in Gastrointestinal Microbial Ecology. Gastroenterology. 136 (6), 1989-2002 (2009).
  9. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  10. Wessel, A. K., Hmelo, L., Parsek, M. R., Whiteley, M. Going local: technologies for exploring bacterial microenvironments. Nat Rev Microbiol. 11 (5), 337-348 (2013).
  11. Stacy, A., McNally, L., Darch, S. E., Brown, S. P., Whiteley, M. The biogeography of polymicrobial infection. Nat Rev Microbiol. 14 (2), 93-105 (2015).
  12. Hansen, R. R., Shubert, K. R., Morrell-Falvey, J. L., Lokitz, B. S., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Microstructured block copolymer surfaces for control of microbe adhesion and aggregation. Biosensors. 4 (1), 63-75 (2014).
  13. Hansen, R. R., Hinestrosa, J. P., et al. Lectin-functionalized poly(glycidyl methacrylate)- block -poly(vinyldimethyl azlactone) surface scaffolds for high avidity microbial capture. Biomacromolecules. 14 (10), 3742-3748 (2013).
  14. Timm, C. M., Hansen, R. R., Doktycz, M. J., Retterer, S. T., Pelletier, D. A. Microstencils to generate defined, multi-species patterns of bacteria. Biomicrofluidics. 9 (6), (2015).
  15. Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (46), 17290-17295 (2006).
  16. Zhang, Q., Lambert, G., et al. Acceleration of Emergence of Bacterial Antibiotic Resistance in Connected Microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  17. Friedlander, R. S., Vlamakis, H., Kim, P., Khan, M., Kolter, R., Aizenberg, J. Bacterial flagella explore microscale hummocks and hollows to increase adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (14), 5624-5629 (2013).
  18. Zhou, J., Liu, W., et al. Stochastic Assembly Leads to Alternative Communities with Distinct Functions in a Bioreactor Microbial Community. MBio. 4 (2), 1-8 (2013).
  19. van Vliet, S., Hol, F. J., Weenink, T., Galajda, P., Keymer, J. E. The effects of chemical interactions and culture history on the colonization of structured habitats by competing bacterial populations. BMC Microbiol. 14 (1), 116 (2014).
  20. Niepa, T. H. R., Hou, L., et al. Microbial Nanoculture as an Artificial Microniche. Sci Rep. 6, 30578 (2016).
  21. Hansen, R. H., Timm, A. C., et al. Stochastic Assembly of Bacteria in Microwell Arrays Reveals the Importance of Confinement in Community Development. PLoS ONE. 11 (5), e0155080 (2016).
  22. Hood, R. D., Singh, P., et al. A Type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  23. LeRoux, M., Ja De Leon,, et al. Quantitative single-cell characterization of bacterial interactions reveals type VI secretion is a double-edged sword. Proc Natl Acad Sci. 109 (48), 19804-19809 (2012).
  24. Whitney, J. C., Beck, C. M., et al. Genetically distinct pathways guide effector export through the type VI secretion system. Mol Microbiol. 92 (3), 529-542 (2014).
  25. Warrick, J. W., Timm, A., Swick, A., Yin, J. Tools for Single-Cell Kinetic Analysis of Virus-Host Interactions. PLoS ONE. 11 (1), e0145081 (2016).
  26. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., Van't Riet, K. Modeling of the Bacterial Growth Curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  27. Halsted, M., Wilmoth, J. L., et al. Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities. J Vac Sci Technol B Nanotechnol Microelectron. 34 (6), 06KI03 (2016).

Tags

Bioengineering גיליון 124 microwell הקהילה microbial הירושה microfluidics microfabrication nanofabrication להרים- off מערך התא נישה כליאה
העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Timm, A. C., Halsted, M. C.,… More

Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform. J. Vis. Exp. (124), e55701, doi:10.3791/55701 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter