Summary
O desenvolvimento de comunidades microbianas depende de uma combinação de fatores, incluindo arquitetura ambiental, abundância de membros, traços e interações. Este protocolo descreve um ambiente sintético e microfabricado para o rastreamento simultâneo de milhares de comunidades contidas em poços de femtoliter, onde fatores-chave como tamanho de nicho e confinamento podem ser aproximados.
Abstract
O desenvolvimento de comunidades microbianas depende de uma combinação de fatores deterministas e estocásticos complexos que podem alterar drasticamente a distribuição espacial e as atividades dos membros da comunidade. Nós desenvolvemos uma plataforma de matriz de microwell que pode ser usada para montar e rastrear rapidamente milhares de comunidades bacterianas em paralelo. Este protocolo destaca a utilidade da plataforma e descreve seu uso para monitorar opticamente o desenvolvimento de comunidades simples de dois membros dentro de um conjunto de arrays dentro da plataforma. Esta demonstração usa dois mutantes de Pseudomonas aeruginosa , parte de uma série de mutantes desenvolvidos para estudar a patogenicidade da secreção do Tipo VI. As inserções cromossômicas de genes mCherry ou GFP facilitam a expressão constitutiva de proteínas fluorescentes com comprimentos de onda de emissão distintos que podem ser usados para monitorar a abundância e localização de membros da comunidade dentro de cada micropoeira. Este protocolo descreve um metho detalhadoD para montagem de misturas de bactérias nos poços da matriz e uso de imagens de fluorescência por lapso de tempo e análise de imagem quantitativa para medir o crescimento relativo de cada população membro ao longo do tempo. A semeadura e montagem da plataforma de micropoços, os procedimentos de imagem necessários para a análise quantitativa das comunidades microbianas dentro da matriz e os métodos que podem ser usados para revelar as interações entre a área de espécies microbianas discutidas.
Introduction
As comunidades microbianas são moldadas por fatores deterministas, como a estrutura do meio ambiente e os processos estocásticos, associados à morte celular, divisão, concentração de proteína, número de organelas e mutação 1 . Dentro do ambiente natural, pode ser quase impossível analisar o impacto individual dessas influências na composição e atividade da comunidade. Obscurecido por estruturas naturais e enterrado dentro de um meio químico e biológico, identificar membros da comunidade e resolver ainda mais sua distribuição espaciotemporal dentro do ambiente natural é extremamente desafiador. No entanto, os esforços recentes sublinharam a importância da organização espacial na função comunitária e apontam para a necessidade de explicar a abundância e a organização dos membros nos estudos em andamento 2 , 3 , 4 .
istoÉ claro que o ambiente químico local ( ou seja, a disponibilidade de nutrientes e metabolitos secundários), a estrutura física ( por exemplo, arquitetura do solo, raízes da planta, partículas do oceano ou microvília intestinal), a presença ou ausência de oxigênio e a introdução de As espécies patogênicas afetam a composição, a arquitetura e a função das comunidades microbianas 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . No entanto, as técnicas tradicionais para culturas que negligenciam a captura desses fatores continuam a prevalecer. A composição da comunidade ( por exemplo, a presença de espécies co-dependentes), a ligação física, a concentração da molécula de sinalização e o contato direto com células-células são fatores importantes para a formação de uma comunidade microbiana e podem ser perdidos em cCondições culturais convencionais. Essas propriedades são difíceis de replicar em uma cultura líquida em massa ou em uma placa de ágar. A disponibilidade de técnicas microfluídicas, micropatternadoras e de nanofabricação que permitem a replicação de características físicas e químicas fundamentais de ambientes naturais, no entanto, permitiu que muitos pesquisadores construíssem comunidades bacterianas para estudar suas interações 12 , 13 , 14 e desenvolver ambientes sintéticos que Imita as condições naturais 4 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Este protocolo descreve um método para fabricar um dispositivo de matriz de micropoços e fornece procedimentos experimentais detalhados que podem ser usados para funcionar.E poços na matriz e para cultivar bactérias, tanto como colônias de uma única espécie como em comunidades multi-membros. Este trabalho também demonstra como as bactérias modificadas para produzir proteínas repórter fluorescentes podem ser usadas para monitorar o crescimento bacteriano dentro dos poços ao longo do tempo. Uma matriz semelhante foi apresentada anteriormente e mostrou que é possível rastrear o crescimento de colônias de uma única espécie de Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) em micropoços. Ao modular o tamanho do poço e densidade de semeadura, as condições iniciais de milhares de experiências de crescimento podem ser variadas em paralelo para determinar como as condições iniciais de inoculação afetam a capacidade das bactérias de crescer 21 . O trabalho atual usa uma versão ligeiramente modificada da matriz de micropoços que se baseia no trabalho anterior, permitindo a comparação simultânea de matrizes múltiplas e usando um protocolo experimental mais robusto. A matriz usada neste trabalho contém múltiplas subarquias, ou matriz ensemCom poços de diferentes tamanhos, que variam de 15 a 100 μm de diâmetro, que estão dispostos em três campos diferentes ( ou seja , 2x, 3x e 4x o diâmetro do poço). As matrizes são gravadas em silício e o crescimento das bactérias semeadas nas matrizes de silício é habilitado selando as matrizes com uma lamínula que foi revestida com um gel de agarose com infusão média. Os mutantes de P. aeruginosa projetados para estudar o sistema de secreção de Tipo VI são utilizados nesta demonstração.
Os resultados apresentados aqui se baseiam no objetivo final de analisar as comunidades de multimídia dentro dos arrays de micropoços, permitindo aos pesquisadores monitorar a abundância ea organização das bactérias in situ enquanto controlam e examinam o ambiente químico. Isso deve, em última análise, fornecer informações sobre as "regras" que regem o desenvolvimento e a sucessão da comunidade.
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Protocol
1. Silicon Microrowell-array Fabrication
- Revestimento de parileno
- Depósito entre 1-1,5 μm de parileno N em bolachas de silício usando um sistema de revestimento de parileno comercialmente disponível de acordo com as especificações e instruções do fabricante (configurações: ponto de ajuste do vaporizador = 160 ° C, ponto de ajuste do forno = 650 ° C).
NOTA: Aproximadamente 6 g de parileno N carregado em uma câmara produz reveses de 1-1,5 μm de espessura.
- Depósito entre 1-1,5 μm de parileno N em bolachas de silício usando um sistema de revestimento de parileno comercialmente disponível de acordo com as especificações e instruções do fabricante (configurações: ponto de ajuste do vaporizador = 160 ° C, ponto de ajuste do forno = 650 ° C).
- Fotolitografia
- Revestir as bolachas revestidas com parileno N com promotor de adesão, 20% de hexametildisilazano (HMDS) e 80% de acetato de éter monometílico de propileno glicol (PGMEA) (ver Tabela de Materiais ) a 3.000 rpm durante 45 s. Encha uma pipeta de transferência de 2 mL com o promotor de adesão e polvilhe-a sobre toda a bolacha. Permita que a bolacha se sente durante aproximadamente 10 s antes de girar para secar.
- Preencha uma pipeta de transferência de 2 mL comNe fotorresistência (veja a Tabela de Materiais ) e dispensar a fotorresistência no centro da bolacha. Girar a 3.000 rpm por 45 s para produzir um revestimento de resistência com aproximadamente 1,5 um de espessura.
- Cozinhe as amostras em uma placa quente a 115 ° C durante 1 min.
- Use um alinhador de contato e uma fotomáquica com o padrão de poço desejado para expor a amostra à luz ultravioleta. Exponha a bolacha revestida por centrifugação através da fotomáscara padronizada por 6 s, dando uma dose aproximada de 60-80 mJ / cm2 medida a 365 nm.
- Desenvolva o padrão submergindo a amostra no desenvolvedor (<3% de hidróxido de tetrametil amônio na água, veja a Tabela de Materiais ) durante 2 min. Enxaguar com água DI e secar com nitrogênio limpo e seco.
NOTA: As áreas de fotorresistentes expostas aos UV devem ser limpas durante o desenvolvimento.
- Gravação de iões reativa
- Use uma gravação de plasma de oxigênio para remover o parileno expostoTodo o caminho para o substrato de silício.
NOTA: A receita pode ser modulada para alterar a taxa de etch do parileno. Para espessuras de parileno entre 1 e 5 μm, use uma receita com 60 mTorr, 20 ° C, 100 sccm O 2 , 10 W RF e 2,000 W ICP em uma ferramenta Reactive Ion Etching (RIE). Após a gravação e remoção da camada de parileno exposta, a área padronizada ( ou seja, o silício exposto) deve parecer brilhante e prata. - Use um processo de gravação profunda RIE (DRIE, por exemplo, Bosch DRIE) para gravar no silício.
NOTA: A taxa e a duração do etch determinam a profundidade do poço. Um ciclo completo do processo Bosch (um passo de deposição de 3 s: 20 mTorr, 15 ° C, 140 sccm C 4 F 8 , 10 W RF e 1.750 W ICP seguido de um processo de gravação de 10 s: 20 mTorr, 15 ° C , 120 sccm SF 6 , 8 W RF e 1.750 W ICP) corresponde a aproximadamente 1 μm de profundidade de gravação. Os poços utilizados nesta demonstração variam de 3 a 3,5 μm de profundidade. - VErite a profundidade do ataque usando a profilometria física.
- Coloque a amostra em um perfilômetro físico (veja a Tabela de Materiais ).
- Ligue o vácuo de amostra e pressione o botão de carga manual.
- Focalize o sistema na amostra pressionando o botão "Foco". Posicione uma característica apropriada para a medição na tela de exibição.
- Digitalize a amostra. Nivele o perfil e mire a profundidade do recurso.
- Registre a taxa de gravura e module os tempos de gravação subsequentes para atingir a profundidade desejada.
NOTA: As medidas incluirão a profundidade do poço de silício, a espessura do parileno depositado e a espessura da fotorresistência. Verificando a espessura de cada camada ao longo do procedimento é necessário para obter uma profundidade de poço precisa.
- Use uma gravação de plasma de oxigênio para remover o parileno expostoTodo o caminho para o substrato de silício.
2. Cultura bacteriana e sementeira ( Figura 1a )
- Comece colônias em Luria Broth (LB) placas de ágar a partir de estoques de glicerol e use dentro de duas semanas. Escolha as colônias das estirpes desejadas das placas de agar LB e comece as culturas durante a noite de P. aeruginosa. Incubar as culturas durante a noite durante aproximadamente 18 h a 37 ° C enquanto se agita a 220 rpm em meio R2A.
NOTA: As colônias devem ser colhidas dentro de duas semanas de revestimento para garantir que as mutações e os genes repórteres fluorescentes sejam mantidos. Todo o trabalho de P. aeruginosa deve ser feito nas condições de BSL-2. - Use um escriba de diamante para separar a bolacha de silício em pastilhas individuais que contenham conjuntos de diferentes tamanhos e arrays de pitch-well. Certifique-se de que cada chip contém o conjunto completo de tamanhos de poços e lançamentos para o estudo.
Figura 1: Procedimento de fabricação e semente celular. (A) Microwell arrays aSão gravados em bolachas de silício revestidas com uma fina camada de parileno (i). Para molhar os poços e / ou funcionalizar a superfície, uma solução de proteína é adicionada em uma gota sobre as matrizes (ii). A solução de proteína é removida, as bolachas são secas, e uma nova solução contendo as bactérias desejadas é adicionada (iii). A solução bacteriana é removida após um período de incubação, e as bolachas são deixadas a secar, deixando para trás bactérias nos poços e na superfície (iv). As bactérias associadas à superfície são removidas com destilação de parileno, deixando para trás bactérias semeadas limpas nos micropoços e ainda viáveis devido ao meio de glicerol a 2%, o que ajuda a manter os poços hidratados (v). As microplaquetas de silício são então colocadas em um lado de matriz em uma camada de vidro revestida com gel de agarose, que alimenta o crescimento bacteriano nos micropoços (vi). ( B ) Layout de sub-arrays em um único dispositivo de silício. Cada sub-matriz contém um conjunto de poços idênticos. O diâmetro dos micropoços em todos os sub-aAs bandejas variam em diâmetro de 5-100 μm e são organizadas em 2x, 3x ou 4x, o passo do diâmetro do poço, que é denotado pelas cores de branco a cinza escuro no esquema do painel inferior. Quando as profundidades dos poços são superficiais (<10 μm), os diâmetros de 5 e 10 μm são raramente úteis, geralmente devido à falta de células que colonizam esses poços muito pequenos. Neste trabalho, apenas os dados de poços com diâmetros de 15 a 100 μm foram analisados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
NOTA: Como mostrado na Figura 1b , um chip completo contém sub-arrays de poços, com diâmetros que variam de 5 a 100 μm, com três passos diferentes ( ou seja , 2x, 3x e 4x o diâmetro) repetindo 4 vezes.
- Coloque uma gota de 150 μL de albumina de soro bovino (BSA) de 500 μg / mL em solução de PBSEm cima da matriz para molhar os micropoços. Incubar a solução de BSA por 1 h no chip na RT em uma câmara úmida.
- Crie a câmara preenchendo o fundo de uma caixa de ponta de pipeta vazia com salina tamponada com fosfato (PBS).
NOTA: Outras substâncias, tais como lectinas específicas, podem ser utilizadas em lugar de BSA para funcionarizar a superfície dos micropoços.
- Crie a câmara preenchendo o fundo de uma caixa de ponta de pipeta vazia com salina tamponada com fosfato (PBS).
- Ao incubar chips de silício com solução de BSA, centrifugar as culturas a 2.500 rpm (correspondente a uma média de 950 xg) durante 5 min e depois ressuspendê-las em 500 μL de meio R2A fresco com 2% de glicerol.
- Determine a OD da cultura usando um espectrômetro UV-vis a 600 nm. Ajuste-o para uma DO de 0,02 usando 2% de meio de glicerol R2A.
NOTA: O glicerol ajuda a evitar que os poços se sectem durante a retirada de parileno.
- Determine a OD da cultura usando um espectrômetro UV-vis a 600 nm. Ajuste-o para uma DO de 0,02 usando 2% de meio de glicerol R2A.
- Após a incubação, remover a solução de BSA e enxaguar 3x com PBS removendo e substituindo a gota de líquidoT cobrindo a matriz de micropoços de silício. Secar sob nitrogênio.
- Adicione 150 μL de culturas de 0,02 OD a cada um dos arrays secos colocados em uma câmara úmida. Incube durante 1 h a 4 ° C para permitir que as bactérias adiram às paredes do poço.
NOTA: A refrigeração não é necessária para a incubação. O tempo de incubação de 4 ° C pode ser usado para prevenir o crescimento de bactérias antes do início da imagem, para que se possa visualizar a organização espacial das comunidades antes do crescimento. A incubação à temperatura ambiente também pode ser utilizada. Ambos os protocolos resultam em curvas de crescimento semelhantes.
3. Configuração do microscópio
- Antes de iniciar a incubação bacteriana nas pastilhas de silício, ligue a câmara de controle ambiental do estágio (veja a tabela de materiais) e ajuste as configurações na caixa de controle para que a umidade (~ 100%) e a temperatura (30-32 ° C, ver passo 3.2) podem equilibrar-se antes da adição de amostras.
- Nivele o suporte da amostra e alinhe oTerior em torno da amostra com toalhetes de laboratório embebidos em PBS (veja a Tabela de Materiais ) para aumentar a umidade na câmara para o ponto de condensação . Ajuste a temperatura da câmara para 30 ° C e a da tampa da câmara para 32 ° C para reduzir a condensação no plano de imagem.
NOTA: O suporte de deslizamento se encaixa na câmara de células vivas com uma junta de aproximadamente 1 cm de espessura. O suporte da amostra é nivelado com a ajuda de um nível de bolha que é colocado no topo do suporte da amostra. O suporte da amostra pode ser inclinado ligeiramente e permanecer selado na junta até o nível. - Enquanto as culturas estão incubando nos chips de silício, ligue manualmente o interruptor de energia para a lâmpada de mercúrio pelo menos 30 minutos antes da imagem. Ligue manualmente a câmera e o estágio do microscópio automatizado. Abra o software usado para controlar o microscópio e equipamentos periféricos e garantir que o equipamento seja reconhecido pelo software.
NOTA: A ampliação é 10X com NA = 0.3.
- Soluções de agarose previamente preparadas com microondas ( isto é, 2% de agarose no meio R2A) até atingir um estado líquido, aproximadamente 60 s.
- Molhe a parte de trás de uma lamínula de vidro de 75 mm x 22 mm, nº 1.5 com etanol e colocá-la longitudinalmente, centrada, através de uma corrediça de vidro de 2 x 3 "(50 x 75 mm). Coloque dois espaçadores PDMS (espessura de ~ 1 mm) Ao longo das bordas longas da lamínula e deslize a lamela de vidro de modo que aproximadamente 1 mm da lamínula sobreponha a borda do slide.
- Despeje 5 mL de solução líquida de agarose no topo da lamínula de vidro, apenas o suficiente para cobri-la completamente, e coloque uma segunda corrediça de vidro de 2 x 3 "em cima da montagem para" encaixar "o agar líquido entre a lamínula e a corrediça.
NOTA: Isso controla a profundidade da agarose, fazendo com que a espessura total da lamínula e agarose endurecida seja igual em espessura aos espaçadores PDMS. - Permitir que o sanduíche de deslizamento de vidro e gel de vidro de agarose de vidro para definir até a solução de agarose começar a solidificar; Então, transfira para uma geladeira. Após 15 min, retire o excesso de agarose sólida e corte ao redor da lamínula de vidro. Mova isto para um prato limpo e coloque-o na geladeira até o uso.
5. Selar os poços com uma capa de cobertura revestida de agarose e imagem
- Após o período de incubação das bactérias estar completo, remova a lamínula revestida com agarose da geladeira e prepare as pastilhas de silício, como se segue.
- Mergulhe as pastilhas de silício em água ultrapura, uma por vez, por 10 s cada. Coloque-os em suas bordas em um limpa ou tecido de laboratório até que a maior parte do excesso de líquido tenha escorrido das bordas dos chips.
- Corte um pedaço de fita para combinar o comprimento da borda de cada chip de silício. Coloque a fita no parileno que cobre o silício e use-o para remover rapidamente o revestimento de parileno.
- ImmedInvente imediatamente cada pastilha descascada e coloque cada chip de tal modo que o lado da matriz de micropoços se enfrente (e faça contato) com o lado revestido com agarose de um lamíngulo revestido com agarose. Tenha cuidado para não mover ou deslocar o chip depois que ele toca a agarose para evitar o crescimento de bactérias fora dos poços.
- Coloque o conjunto de micropoços montado / lâmina de agarose no suporte deslizante da câmara de controle ambiental do palco no miscroscópio.
- Use luz ambiente ou luz dirigida ( por exemplo, uma lanterna) para localizar matrizes de interesse. Use o software comercial que controla o estágio automatizado para salvar essas posições (veja a tabela de materiais). Desligue a luz ambiente ou dirigida depois de as posições serem armazenadas.
- No software comercial, abra o painel "ND Acquisition".
NOTA: Este painel inclui um menu para gravação automática em um diretório específico, bem como aquisição de imagem programável. Para esses experimentosOs menus "Time", "XY," e "λ" são usados. - Para salvar as localizações no software, clique no "menu XY" e, em seguida, marque uma caixa vazia no lado esquerdo para cada posição que precisa ser salva. Além disso, clique no botão "Incluir Z".
- Adquira imagens ao longo do tempo aos comprimentos de onda desejados e 10 ampliação usando os cubos de filtro de fluorescência apropriados (veja a Tabela de Materiais).
- Use o software de controle e as posições de matriz salvas para mover para cada local salvo e concentrar-se nos poços. Clique em cada local XY na lista salva e ajuste o foco usando o filtro Green Flourescence Protein (GFP). Salve a nova posição z clicando na seta apontando para o local z.
NOTA: Este processo pode demorar muito tempo. Considere tomar a precaução de aumentar o ganho e usar o filtro de densidade neutra para reduzir a intensidade da luz para evitar a fotovelagem. - Determine a distância do eixo z entre os planos focais para cada comprimento de onda, observando a diferença na posição do eixo z quando focada na superfície da matriz. Escolha 2-3 locais da matriz com a população de bactérias vermelhas / verdes misturadas e foco usando o filtro Red Fluorescence Protein (RFP).
- Subtrair a distância entre os planos focais usando os filtros de fluorescência GFP e RFP e adicionar o ajuste do plano focal no menu "λ".
NOTA: Por exemplo, se a matriz aparecer focada no canal GFP em uma localização z de 50 μm, e a mesma matriz aparece focada no canal RFP a 55 μm, adicione +5 ao lado da configuração ótica RFP na seção "λ " cardápio.
- Subtrair a distância entre os planos focais usando os filtros de fluorescência GFP e RFP e adicionar o ajuste do plano focal no menu "λ".
- Comece a aquisição de imagens em lapso de tempo.
NOTA: Para os experimentos mostrados aqui, as imagens de RFP e GFP foram adquiridas para cada posição de matriz em intervalos de 30 min usando aquisição de imagem multidimensional através de um software comercial que controlaA câmera, o obturador, a roda do filtro e o estágio motorizado.- Defina o "intervalo" para 30 min e a "duração da experiência" para 24 h no menu "Hora". Clique em "Executar agora".
NOTA: Com as caixas "Tempo", "XY" e "λ" marcadas, o programa executará o palco para a imagem de cada local ( ou seja, as localizações XYZ salvas), tirar uma imagem em um comprimento de onda, mover a posição z Para explicar as diferenças do plano focal ( ou seja, o controle de lambda ou o comprimento de onda), pegue a segunda imagem, avance para a próxima localização da matriz (multiponto) e faça um loop a intervalos de 30 minutos (lapso de tempo).
- Defina o "intervalo" para 30 min e a "duração da experiência" para 24 h no menu "Hora". Clique em "Executar agora".
- Use o software de controle e as posições de matriz salvas para mover para cada local salvo e concentrar-se nos poços. Clique em cada local XY na lista salva e ajuste o foco usando o filtro Green Flourescence Protein (GFP). Salve a nova posição z clicando na seta apontando para o local z.
- Adquira imagens de controle de iluminação.
NOTA: use os menus "ND Acquisition", "Time" e "XY" para tirar imagens de 4 locais, 25x cada.- Pegue uma série de 100 imagens de "darkfield" desligando todas as fontes de luz eUma "imagem" de um slide padrão. Essas imagens captarão o ruído da câmera. Use o tempo de exposição mais longo usado durante o timelapse (etapa 5.3.3).
- Pegue uma série de 100 imagens de "campo de iluminação" ao imaginar um slide padrão ( ou seja, uma intensidade RFP ou GFP uniforme) em alguns locais diferentes para capturar a iluminação irregular nas condições experimentais fornecidas. Escolha um tempo de exposição que maximize o sinal sem atingir a saturação.
6. Análise
- Processe as pilhas de imagens usando um software de análise de imagem ( por exemplo, ImageJ).
- Converta as imagens adquiridas em formato de arquivo tiff usando o software comercial. Carregue imagens no software de análise de imagem clicando em "Arquivo"> "Importar"> "Sequência de imagens".
- Crie uma "imagem de correção" com a média de todas as imagens de "campo escuro" e "campo de iluminação". SubtracT a imagem média "darkfield" da imagem média de "campo de iluminação" escolhendo "Processo"> "Calculadora de imagem". Selecione as duas imagens, "Image1" e "Image2", e depois "Subtrair" no campo "Operação". Clique em "OK".
- Para calcular a média, carregue as imagens de correção (ou campo escuro), clique em "Imagem"> "Pilhas"> "Projeto Z"> "Projeção média".
- Execute o registro de imagem, se necessário. Em seguida, execute a subtração de fundo clicando em "Processar"> "Subtrair fundo". Digite um raio ( por exemplo, 125) no campo "raio" e selecione "paraboloide deslizante".
- Execute a correção de iluminação usando "Processo"> "Calculadora Plus". Escolha os seguintes parâmetros: operação, divisão; I1, bem imagem; I2, imagem de correção; K1, imagem de correção significa; E k2, 0. Clique em "CreComeu Nova Janela ".
NOTA: Este conjunto de dados não exigiu registro, mas em outros trabalhos, o ImageJ Plugin StackReg foi usado com a transformação "Tradução". Para a subtração de fundo, use o mesmo raio de paraboloide deslizante para cada conjunto de imagens. Por exemplo, se os maiores poços criados tiverem um raio de pixel de 100, use um raio maior que 100 ( por exemplo, 125) para cada conjunto de imagens.
- Determine o crescimento de cada estirpe nos micropoços.
- Selecione regiões de interesse (ROIs) em torno de cada micropoente nas matrizes desejadas usando o plugin ImageJ "MicroArray".
- No menu "MAP", clique em "Redefinir grade". Especifique linhas, colunas e diâmetro (com base no tamanho e número do poço na matriz, veja a Figura 1b ). Selecione "círculo" no menu "ROI shape".
- Segure a tecla "Alt" enquanto seleciona o ROI superior esquerdo com o mouse para mover tEle ROI array. Segure a tecla "shift" enquanto seleciona o ROI inferior esquerdo para alterar o tamanho da matriz. Mantenha a tecla "shift" enquanto seleciona um ROI do lado direito da matriz, mas não nos cantos, para alterar o espaçamento dos ROIs.
- Use os comandos acima para caber a matriz ROI sobre os poços em uma imagem. Clique em "Medir RT".
NOTA: O plugin irá exportar as medidas desejadas de cada ROI. Use três tamanhos ROI, criando anéis concêntricos ao redor dos poços para coletar local o sinal de fundo ( ou seja, o sinal do anel médio subtraído do anel externo) e medidas de fluorescência ( ou seja, o sinal do anel interno).
- Colecione os dados em um software de planilha eletrônica e calcule o sinal de fundo. Importá-lo para um software de script personalizado para análise posterior.
- Selecione regiões de interesse (ROIs) em torno de cada micropoente nas matrizes desejadas usando o plugin ImageJ "MicroArray".
- Organização e análise de dados
- Importe os dados e organize os dadosColetados em ImageJ em uma matriz na seguinte ordem para todos os tempos: coluna 1, número de sub-matriz; Coluna 2, fileira de poços; Coluna 3, coluna do poço; Coluna 4, intensidade média; Coluna 5, intensidade de fundo; E coluna 6, intensidade média - intensidade de fundo.
- Separe os resultados da aquisição mCherry e GFP em diferentes matrizes. Armazene os resultados de cada sub-matriz e cada cor em uma célula diferente em uma matriz de células.
NOTA: Esta organização facilita a movimentação entre dados de imagem e resultados de medição, limpar os dados e garantir que as medições representem com precisão os dados.
- Separe os resultados da aquisição mCherry e GFP em diferentes matrizes. Armazene os resultados de cada sub-matriz e cada cor em uma célula diferente em uma matriz de células.
- Ajuste para a autofluorescência de P. aeruginosa .
NOTA: Em experimentos envolvendo a co-cultura das cepas GFP e mCherry, um chip apenas de mCherry deve ser analisado para determinar a relação entre mCherry e autofluorescência verde.- Trace o sinal mCherry versus GFP de todos os mCherry ΔretS &# 916; tse / i1-6 wells em todos os pontos de tempo para determinar a relação entre o sinal mCherry e a autofluorescência no canal GFP. Subtrair o sinal de autofluorescência das co-culturas.
- Trace as trajetórias e ajuste uma equação logística modificada para cada trajetória para extrair parâmetros usando o ajuste de mínimos quadrados em um software de planilha ou um software de script personalizado.
- Procure as correlações entre e entre os parâmetros da trajetória GFP e mCherry.
- Importe os dados e organize os dadosColetados em ImageJ em uma matriz na seguinte ordem para todos os tempos: coluna 1, número de sub-matriz; Coluna 2, fileira de poços; Coluna 3, coluna do poço; Coluna 4, intensidade média; Coluna 5, intensidade de fundo; E coluna 6, intensidade média - intensidade de fundo.
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Representative Results
A plataforma experimental apresentada aqui é projetada para estudos de alto teor de alto teor de conteúdo de comunidades bacterianas. O design permite que milhares de comunidades, crescendo em poços de vários tamanhos, sejam analisados simultaneamente. Com este projeto de matriz de micropoços, pode-se determinar a dependência da composição final da comunidade nas densidades iniciais de semeadura, tamanho do poço e ambiente químico. Este trabalho demonstra o crescimento de uma comunidade de dois membros na matriz de micropoços e apresenta métodos para analisar a composição e a organização da comunidade.
O sistema modelo usado aqui foi projetado no laboratório Mougous para estudar a secreção do Tipo VI em P. aeruginosa . O sistema é composto por várias cepas mutantes, que contêm repórteres fluorescentes GFP ou mCherry. Neste trabalho, utilizamos 2 estirpes diferentes. O primeiro é um mutante ΔretS marcado com GFP que constituíveE expressa as proteínas efectoras tóxicas associadas à secreção de Tipo VI, resultando em maiores níveis de morte celular em células susceptíveis. A segunda é uma estirpe ΔretSΔtse / i1-6 marcada com RFP que é um mutante de deleção que falta todas as seis proteínas efectoras conhecidas e que demonstrou ser mais suscetível à patogênese do Tipo VI 22 , 23 , 24 . As trajetórias de crescimento de cada espécie foram rastreadas individualmente e dentro de duas comunidades membros ( isto é, co-cultura dentro da plataforma de matriz).
Os mutantes ΔretS e ΔretSΔtse / i1-6 foram semeados em três arrays, cada um separadamente e também misturados em uma proporção de 1: 2, e depois foram formados a cada 30 min por 20 h. O crescimento bacteriano nos poços cessou entre 6 e 12 h após a entrada. Exemplos de dados de imagens fluorescentes são mostrados nas Figuras 2 e 3. A Figura 2 mostra o crescimento ao longo do tempo das estirpes ΔretS e ΔretSΔtse / i1-6 em poços de 45 μm de diâmetro, e a Figura 3 mostra o estado dessas mesmas comunidades de dois membros cerca de 6 h pós-adesão (hps) em poços de vários tamanhos.
Figura 2: Imagens de amostra de uma experiência de crescimento de co-cultura do curso do tempo. Dois mutantes de P. aeruginosa , que expressam o mCherry ( ΔretSΔtse / i1-6) (vermelho) ou o GFP (ΔretS) (verde), são semeados juntos em uma proporção de 2: 1 mCherry: GFP nas matrizes de micropoços. Aqui são imagens compostas tiradas em 3 tempos diferentes de postagem nos poços de 45 μm de diâmetro. Clique aqui para ver uma versão maiorDesta figura.
Figura 3: Faixa de diâmetros de poço incluída no dispositivo de matriz de microwell. Imagens representativas de comunidades de dois membros conquistadas às 8 h de crescimento. Geralmente, as colônias mCherry (ΔretSΔtse / i1-6) (vermelho) ou GFP (ΔretS) (verde) mostram colocação mínima, permanecendo dentro de áreas distintas nos micropoços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Antes da aquisição das medidas, uma subtração de fundo parabaloide deslizante foi realizada. Um passo de correção de iluminação foi empregado de modo que o sinal de cada micropoente fotografado em uma determinada experiência poderia ser comparado quantitativamente. Esses métodos foram pDescrito anteriormente 25 . Usando o plugin de microarrays em ImageJ, a intensidade média das bactérias vermelha e verde foi medida nas imagens corrigidas, juntamente com um sinal de fundo local. O sinal de fundo local foi subtraído do sinal do poço e o sinal GFP foi ajustado para corrigir a autofluorescência das co-culturas de P. aeruginosa (autofluorescência determinada a partir de matrizes de mCherry ΔretSΔtse / i1-6) . Uma vez que todas essas correções foram realizadas, as trajetórias de crescimento quantitativas das bactérias que expressam mCherry e GFP podem ser plotadas. As trajetórias de crescimento de exemplo de poços de 20 e 50 μm de diâmetro são mostradas na Figura 4 .
Figura 4: Curvas de crescimento de Mono- e Co-culturas de mutantes de secreção de tipo VI de P. aeruginosa .(A e d ) curvas de crescimento de monocultura GFP-ΔretS em poços de 20 μm e 50 μm, respectivamente. ( B e e ) curvas de crescimento de monoculturas mCherry-ΔretSΔtse / i1-6 em poços de 20 e 50 μm, respectivamente. (C e f) Co-cultura de uma mistura de proporção 1: 2 das estirpes GFP (verde) e mCherry (vermelho) P. aeruginosa . As curvas de crescimento são plotadas a partir de quando a aquisição da imagem começou, aproximadamente 2 h postando (hps). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As trajetórias de crescimento da monocultura e co-cultura das cepas de P. aeruginosa indicam que existe uma certa variabilidade no crescimento do bem para o bem e que esta variabilidade é aumentada em poços de dimensões menores. No entanto, a intensidade média não é significativamente afetada pelo bem siZ e. Não parece haver um efeito negativo dramático ou claro sobre o crescimento da estirpe suscetível (ΔretSΔtse / i1-6) quando a estirpe ΔretS está presente. A intensidade geral para cada estirpe diminuiu, mas isso se deveu a uma menor concentração de partida de cada estirpe nos poços, uma vez que a DO total foi mantida consistente em experimentos, não a DE individual de cada estirpe. No entanto, é difícil determinar quais os fatores mais importantes para a compreensão do crescimento de bactérias nesses poços, simplesmente considerando as trajetórias de crescimento sozinhas. Portanto, cada trajetória estava em conformidade com uma função logística modificada 26 ( Figura 5a ) para que os parâmetros relevantes pudessem ser extraídos e utilizados para analisar dados de crescimento bacteriano. Cada trajetória foi transformada tomando o log natural do sinal dividido pelo sinal inicial. Uma função logística modificada, com três parâmetros correspondentes a um sinal máximo (A), um máximoTaxa (μ), e um tempo de latência (τ), foi usado para caber cada trajetória.
Dada a interação conhecida entre as estirpes GFP-ΔretS e mCherry-ΔretSΔtse / i1-6, pode-se hipotetizar que o crescimento da estirpe mCherry seria inibido em co-culturas com a estirpe 22 , 24 de GFP-ΔretS. Usando os parâmetros extraídos, é possível buscar correlações positivas ou negativas entre os parâmetros extraídos das trajetórias de GFP e mCherry. A análise dos parâmetros iniciais sugeriu que a co-cultura dessas espécies teve um efeito insignificante em seu crescimento geral. A variabilidade observada nas curvas de crescimento é provavelmente devido a fatores ambientais, como a densidade de semeadura inicial, que se torna mais variável em diâmetros de poços menores ( Figura 5b ). Efeitos negativos significativos na estirpe mCherry devido à presença de GFP-ΔretS não foram observados. Por exemplo, ao traçar o sinal mCherry máximo em relação à razão do sinal GFP inicial para RFP, nenhuma diminuição na expressão de mCherry foi encontrada quando houve uma proporção maior de GFP-ΔretS nos poços.
Figura 5: Trajetórias de crescimento fluorescente ajustadas com uma equação logística modificada. (A) A curva de exemplo é normalizada e, em seguida, se encaixa com uma equação logística modificada ajustando três parâmetros, uma intensidade máxima (A), uma taxa máxima (μ) e um tempo de latência (τ). ( B ) sinal mCherry inicial versus sinal GFP inicial em poços individuais de vários diâmetros. ( C ) O sinal de repórter mCherry máximo plotado em relação à razão da intensidade inicial das bactérias que expressam GFP para as bactérias que expressam RFP.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55701/55701fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O trabalho anterior no laboratório Mougous indicou que os efeitos da secreção de Tipo VI requerem contato direto célula a célula entre células secretoras e susceptíveis e que um período de contato mais longo resulta em mais lise celular 23 . Portanto, acreditamos que, nessas matrizes, o crescimento exponencial dos dois mutantes é simplesmente superar os efeitos patogênicos mediados pelo contato nesse sistema modelo. No entanto, em poços de todos os tamanhos, as bactérias que expressam GFP e mCherry crescem em manchas distintas ( Figuras 2 e 3 ). Portanto, ao invés de se concentrar nas taxas de crescimento, as comunidades bacterianas que contêm atores patogênicos mediados por contato podem ser melhor estudadas usando análises espaciais. Por exemplo, em vez de focoNg na intensidade integrada, que é representativa do número total de células vermelhas ou verdes em um poço, este formato de microwell permite que o número e a localização dos pixels vermelhos e / ou verdes sejam contados. É possível analisar o crescimento de colônias ou manchas individuais dentro desses poços, com foco nas fronteiras onde os sinais vermelho e verde se sobrepõem ( Figura 6a ). A quantificação de eventos de co-localização e as análises de vizinhança mais próxima podem ser executadas para analisar de perto as propriedades como tamanho do patch, taxa de crescimento do patch e sobreposição de patch em poços individuais. As análises espaciais seriam auxiliadas por imagens de aumento de ampliação e microscopia confocal ( Figura 6b ).
Figura 6: A Organização Espacial de Diferentes Espécies pode ser Analisada com Microscopia Epifluorescente e Confocal. (
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Discussion
Este artigo apresentou um dispositivo de matriz de micropoços e protocolos experimentais projetados para permitir a análise baseada em imagens de células vivas de alto conteúdo e alto conteúdo de desenvolvimento de comunidades bacterianas. Enquanto o foco da demonstração aqui era estudar os efeitos da secreção de tipo VI mediada pelo contato no desenvolvimento da comunidade, os arrays foram projetados para ser flexíveis e acomodar o estudo de uma ampla gama de comunidades microbianas e interações de micróbios-micróbios. O trabalho aqui se concentra unicamente no uso de bactérias que expressam constitutivamente marcadores fluorescentes para facilitar o rastreamento da abundância e localização dos membros. No entanto, as oportunidades de amostrar material biológico a partir de poços individuais após o crescimento ou a perturbação, alterando o ambiente químico, podem, em princípio, ser usadas para identificar a composição da comunidade e a expressão gênica.
Cada dispositivo de silício é composto por dezenas de arrays contendo micropoços com vários poçosDiâmetros, organizados em um passo de 2x, 3x ou 4x de diâmetro, e gravados até uma profundidade entre 3 e 3,5 μm. Como os nutrientes e os metabolitos secundários podem se difundir livremente através e através da tampa de agarose, foram incluídos diferentes sub-arrays de passo para permitir o exame de como a sinalização entre micropoços ou depleção de nutrientes locais afeta o desenvolvimento da comunidade. Nesta demonstração, o crescimento e o desenvolvimento da comunidade não pareciam ser impactados pelo espaçamento ou localização do microwell dentro dos arrays. A profundidade superficial foi escolhida para simplificar a análise de imagem, limitando todo o crescimento e desenvolvimento microbiano a um único plano de imagem. No entanto, os poços mais profundos (20 μm de profundidade) foram utilizados anteriormente e podem ser facilmente modulados em profundidade, variando a duração do processo de corrosão por silício. Aumentar a relação de aspecto dos poços altera essencialmente o grau de confinamento experimentado pelas células no interior dos poços, alterando efetivamente a proporção do volume de poço totalPara a área através da qual os nutrientes se difundem para o topo do poço. Esta variedade de configurações de matriz poderia ser usada para estudar os efeitos da sinalização de bom-bem-estar ou intra-bem.
Uma limitação do uso de silício para fabricar os micropoços é que ele é opaco para a luz visível. Consequentemente, as análises de rotina que dependem da transmissão de luz ( por ex., Imagem de contraste, fase ou interferência diferencial) não podem ser usadas para monitorar o crescimento. A pesquisa e o desenvolvimento em curso em nosso grupo se concentraram na adaptação dessa configuração de microfilmes de silício e protocolo experimental para trabalho com arrays transparentes para permitir a fluorescência de maior resolução e a imagem em campo brilhante para monitoramento e quantificação 27 . Ao usar materiais transparentes para fabricação, como o epóxi SU-8 em uma lamínula de vidro, é possível adquirir imagens de campo brilhante e fluorescente com objetivos operando em distâncias de trabalho mais curtas.Isso permite obter uma resolução mais ótima para a imersão em água ou objetivos de óleo com uma ampliação ≥40X, sem a dificuldade de imagem através de uma camada de ágar, como é o caso das matrizes de silício.
Conforme descrito em nosso trabalho anterior, as condições de semeadura e a geometria do poço afetam a semeadura de células dentro dos arrays de poços. Em baixas densidades de semeadura ou em poços pequenos, altos níveis de variação no número e tipos de células que carregam em poços individuais permite uma exploração ampla e rápida do espaço de parâmetros experimentais. Maiores densidades de semeadura e / ou imagens de poços maiores produz taxas mais consistentes de tipos de células e níveis de inoculação total, permitindo a análise de um grande número de repetições experimentais. Um olhar rápido sobre as imagens durante os primeiros estágios de crescimento sugere que as células se liguem e crescem principalmente ao longo das bordas dos poços ( Figura 5a ). Não está claro se este é um artefato relacionado a sA secagem evaporativa durante o processo de semeadura ou sugere uma preferência pela fixação de células a várias arestas. Alterar intencionalmente a topografia ou química superficial dos poços de forma determinista pode revelar quais fatores têm o maior impacto na ligação celular e na formação de biofilmes.
O crescimento das bactérias nestes poços é suportado pelo uso de uma capa de vidro revestida com gel de agarose infundida com meio R2A. Os métodos descritos para criar esta capa revestida de agarose garantem uma espessura uniforme através da qual a imagem e uma posição z bastante constante, permitindo a possibilidade de simultaneamente reproduzir múltiplos chips de silício. O uso de agarose ultra-pura como agente gelificante e um meio mínimo em vez de um meio completo resulta em um fundo mais limpo, menos autofluorescente, aumentando a relação sinal-ruído geral. Ao confiar na fluorescência para o rastreamento quantitativo de comunidades microbianas, é essencial manter a imaginaçãoNg condições consistentes e estar plenamente conscientes das contribuições de autofluorescência, fotoblanquecimento e iluminação não uniforme. Além disso, para experiências que requerem uma aquisição de imagens de lapso de tempo longo, é desejada uma camada grossa de agarose, como é usado aqui. Camadas mais finas (~ 100 um de espessura) podem ser feitas para permitir uma maior ampliação de imagem. No entanto, é difícil manter a montagem úmida o suficiente para evitar que a camada fina seque.
Embora a análise inicial dos parâmetros de crescimento e dos níveis iniciais do inóculo ainda não tenha revelado correlações significativas para o sistema simples descrito aqui, os protocolos e os dados mostrados enfatizam a profundidade da informação que pode ser extraída das imagens do desenvolvimento comunitário ao longo do tempo. A organização espacial dentro dos poços evolui à medida que as colônias de uma única espécie se expandem a partir dos locais iniciais de "nucleação". Assim, fatores associados à densidade inicial de inserção ( ou seja, perdas de peraPs da maior preferência de uma espécie para a superfície do poço em comparação com outra) ou a taxa de crescimento de manchas individuais poderia influenciar dramaticamente o desenvolvimento da comunidade. As interações mais subterrâneas, como as mediadas pelo contato entre espécies (patches) estabelecidas muito tarde no processo de crescimento, podem requerer uma análise mais aprofundada dos dados da imagem.
A plataforma de matriz de micropoços e o protocolo apresentado aqui facilitam a montagem rápida e a análise de alto conteúdo do desenvolvimento da comunidade microbiana e interações de micróbios-micróbios. O trabalho futuro que permite o controle do ambiente químico local, alterando a composição do meio dentro da tampa de ágar ou modulando diretamente e amostragem por meio de microfluídica integrada, deve permitir protocolos experimentais que se movam além de imitar o confinamento natural e o tamanho do nicho e começar a Explore o impacto de ambientes em mudança dinâmica, semelhantes aos encontrados na natureza. O trabalho futuro aumentaráO design da matriz com microfluídica integrada que pode ser usada para modular dinamicamente o ambiente químico local e provar o fluido de poços individuais. Trabalhos adicionais sobre o desenvolvimento de arrays de micropoços opticamente claros que podem ser usados para o rastreamento de crescimento da comunidade e de alta resolução do crescimento da comunidade foram descritos em outro lugar 27 .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
As matrizes de microwell foram fabricadas e caracterizadas no Centro de Divisão de Instalações do Usuário das Ciências dos Materiais de Nanophase, Escritório de Ciências Básicas da Energia, Departamento de Energia dos EUA. O apoio financeiro para este trabalho foi fornecido através do Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento do Diretor de Laboratório Nacional Oak Ridge. Os autores também agradecem ao Laboratório J. Mougous (Universidade de Washington, Seattle, WA) para o fornecimento de cepas de P. aeruginosa usadas nesses estudos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parylene N | Specialty Coating Systems | CAS NO.:1633-22-3 | |
| Parylene coater | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 Parylene Deposition Unit PDS2010 | |
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550μm thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>, | |
| adhesion promoter | Shin-Etsu Microsci | MicroPrime P20 adhesion promoter | |
| postive tone photoresist | Rohm and Haas Electronics Materials LLC (Owned by Dow) | Microposit S1818 Positive Photoresist (code 10018357) | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Reactive Ion Etching Tool | Oxford Instruments | Plasmalab System 100 Reactive Ion Etcher | |
| R2A Broth | TEKnova | R0005 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | Enspire, 2300-0000 | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| Automated Stage | Prior | ProScan III | |
| CCD camera | Nikon | DS-QiMc | |
| Stage-top environmental control chamber | In Vivo Scientific | STEV ECU-HOC | |
| Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| 25 x 75 mm No. 1.5 coverslip | Nexterion | High performance #1.5H coverslips | |
| Fluorescence Reference Slides | Ted Pella | 2273 | |
| Physical Stylus Profilometer | KLA Tencor | P-6 | |
| lab wipes | Kimberly Clark | Kimipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| commercial software | Nikon | NIS Elements | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | ||
| filter cubes | Nikon | Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313) |
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