Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

Summary

Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sont considérées comme un outil puissant pour le dépistage médicamenteux et chimique et pour le développement de nouveaux modèles in vitro pour les tests de toxicité, y compris la neurotoxicité. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation des hiPSC dans les neurones et la glie est décrit.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent se différencier en divers types cellulaires qui peuvent être appliqués à des essais de toxicité in vitro à base humaine. Un avantage majeur est que la reprogrammation des cellules somatiques pour produire des cellules souches pluripotentes induites par l'homme (HPSP) évite les problèmes éthiques et législatifs liés à l'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (HESC). Les HiPSC peuvent être étendus et efficacement différenciés en différents types de cellules neuronales et gliales, servant de systèmes d'essai pour les tests de toxicité et, en particulier, pour l'évaluation des différentes voies impliquées dans la neurotoxicité. Ce travail décrit un protocole pour la différenciation des hiPSC en cultures mixtes de cellules neuronales et gliales. Les voies de signalisation qui sont régulées et / ou activées par la différenciation neuronale sont définies. Cette information est essentielle à l'application du modèle cellulaire au nouveau paradigme de test de toxicité, dans lequel les produits chimiques sont évalués en fonction de leur capacité à utiliserRturb des voies biologiques. En tant que preuve de concept, le rotenone, un inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial I, a été utilisé pour évaluer l'activation de la voie de signalisation Nrf2, un régulateur clé du mécanisme anti-oxydant-réponse-élément- (ARE) de défense cellulaire contre le stress oxydatif .

Introduction

Le rapport du Conseil national de recherches des États-Unis ¹ prévoyait un nouveau paradigme de test de toxicité dans lequel les tests de toxicité réglementaire seraient déplacés d'une approche s'appuyant sur les changements phénotypiques observés chez les animaux à une approche axée sur des essais mécanistes in vitro utilisant des cellules humaines. Les dérivés de cellules souches pluripotentes (PSC) peuvent représenter des alternatives aux modèles de cellules cancéreuses, car les cellules obtenues peuvent ressembler davantage aux conditions physiologiques des tissus humains et fournir des outils plus pertinents pour étudier les effets indésirables induits par les produits chimiques. Les deux principaux types de cultures de PSC qui sont les plus prometteurs pour les tests de toxicité sont les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (HiPSC), actuellement largement utilisées dans les domaines de la recherche fondamentale et de la médecine régénératrice ^{2 , 3} . Cette expertise peut maintenant être exploitée pour le développement d'une nouvelle classe de toxinoTests in vitro in vitro visant à identifier les voies physiologiques perturbées impliquées dans le développement d'effets indésirables in vivo . Cependant, tous les États membres de l'UE et les pays du monde pourraient accepter les méthodes d'essai pour les évaluations de sécurité réglementaires basées sur des problèmes d'éthique et diverses politiques législatives nationales régissant l'utilisation de cellules dérivées d'embryons.

Les hiPSCs partagent des caractéristiques similaires aux HESC ^{4 , 5} et possèdent un grand potentiel pour les méthodes in vitro , à la fois pour identifier les cibles thérapeutiques, ainsi que pour les évaluations de sécurité. En outre, la technologie HiPSC atténue les contraintes d'un pool de donneurs limité et les préoccupations éthiques associées aux cellules dérivées d'embryons. Un défi majeur pour les hiPSCs est la démonstration que ces cellules peuvent générer de manière reproductible une gamme significative de dérivations cellulaires toxicologiquement pertinentes,Avec des caractéristiques et des réponses typiques des tissus humains. Les niveaux prédéfinis des marqueurs sélectionnés sont généralement utilisés pour caractériser les populations cellulaires après le processus de différenciation et pour donner une idée de la stabilité du processus de différenciation.

Des travaux antérieurs ont évalué la pertinence des hiPSC pour générer des cultures mixtes de cellules neuronales et gliales et pour évaluer les effets de la roténone, un inhibiteur du complexe respiratoire mitochondrial I, sur l'activation de la voie Nrf2, un régulateur clé des mécanismes de défense anti-oxydants dans Plusieurs types de cellules ^{6 , 7} .

Ce travail décrit un protocole utilisé pour la différenciation des hiPSC dans les cultures neuronales et gliales mixtes, fournissant des détails sur les voies de signalisation (niveau des gènes et des protéines) qui sont activés lors de la différenciation neuronale / gliale. En outre, le travail montre des résultats représentatifs démontrant comment celaLe modèle de cellules neuronales et gliaques dérivé de HiPSC peut être utilisé pour évaluer l'activation de la signalisation Nrf2 induite par un traitement aigu (24 h) avec de la rotenone, permettant l'évaluation de l'induction du stress oxydatif.

Les fibroblastes IMR90 ont été reprogrammés dans les hiPSC à I-Stem (France) par la transduction virale de 2 facteurs de transcription (Oct4 et Sox2) en utilisant des vecteurs pMIG ⁶ . Des modèles hiPSC analogues peuvent également être appliqués. Les protocoles décrits ci-dessous résument tous les stades de la différenciation des hiPSC dans les cellules souches neurales (NSC) et encore dans les cultures mixtes des neurones post-mitotiques et des cellules gliales (étapes 1 et 2, voir également le site EURL ECVAM DBALM pour une description détaillée de Le protocole) ⁸ .

Un protocole supplémentaire pour l'isolement, l'expansion, la cryoconservation et la différenciation supplémentaire des NSC dans les neurones mixtes et les cellules gliales est détaillé aux étapes 3 et 4 (référence également à l'EURL ECVAM DBALM nousBsite pour une description détaillée de ce protocole) ⁹ . L'étape 5 décrit les analyses qui peuvent être faites pour évaluer l'identité phénotypique des cellules au cours des différentes étapes de l'engagement et de la différenciation.

Protocol

1. Expansion de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC)

NOTE: Les hiPSC peuvent être cultivés sur un substrat de mélange de protéines approprié en présence de mTeSR1 contenant des suppléments mTeSR1 5x (préparés selon les instructions du fabricant, plaque ~ 100 fragments de colonie / boîte de Petri de 60 mm). Lorsque les colonies hiPSC atteignent une taille appropriée (voir un exemple de colonie dans la Figure 2A ), passez les cellules comme décrit ci-dessous (une fois par semaine).

1. Revêtir des vaisselles avec une matrice de membrane basée sur hESC (ci-après dénommée «matrice qualifiée») ou tout autre substrat protéique approprié.
   1. Conservez la matrice qualifiée (voir la Table des matériaux ) à -80 ° C dans des aliquotes de 200 μL dans des tubes froids de 1,5 mL et des pipettes froides de 5 ou 10 ml.
   2. Avant de passer, décongéler 200 μL de matrice qualifiée sur glace.
   3. Diluer 200 μL de matrice qualifiée en 20 mL de milieu DMEM / F12 (dilution 1: 100).
   4. Enduire des boîtes de Petri de 60 mm avec cette solution (5 mL / plat).
   5. Incuber les plats enduits à 37 ° C pendant au moins 1 h.
2. Brillance et décongélation du fragment de colonie HiPSC
   1. Après avoir coupé les colonies hiPSC (voir l'étape 1.3 pour la procédure de coupe de la colonie hiPSC), restreignez doucement et lentement les fragments de colonies hiPSC dans le milieu de congélation des cellules souches, ~ 100 fragments / 250 μL (voir la Table des matériaux).
   2. Aliquotez les fragments de colonies dans des flacons appropriés pour la cryoconservation (250 μL / flacon).
   3. Placez les flacons dans un récipient rempli de 2-propanol et placez le récipient à -80 ° C pendant au moins 2 h et jusqu'à 2 semaines.
   4. Transférer les flacons dans la phase vapeur d'un réservoir d'azote liquide.
   5. Pour redémarrer la culture, décongeler 1 flacon congelé dans un bain d'eau à 37 ° C.
   6. Recueillir doucement les fragments de colonie hiPSC dans 7 mL de hiPSC complet préchaufféMoyen (voir la table des matières ) dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   7. Centrifuger les fragments de colonies hiPSC à 130 xg pendant 3 min.
   8. Retirez le surnageant et resustez doucement les fragments de colonie hiPSC dans 1 mL de milieu hiPSC complet en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   9. En outre, diluer la suspension cellulaire dans 3 ou 4 mL de milieu hiPSC complet.
   10. Placer les fragments de colonie hiPSC dans une plaque de Petri 60 mm (matricielle matricielle qualifiée) (~ 100 fragments / plat, enduire la vaisselle comme décrit à l'étape 1.1).
   11. Incuber les hiPSC à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   12. Effectuer un changement moyen total tous les jours.
3. Passage des colonies HiPSC
   REMARQUE: les HiPSC non indifférenciés devraient avoir une forme ronde, avec de gros nucléoles et sans cytoplasme abondant. Les colonies indifférenciées devraient être caractérisées par une morphologie plate et très serrée. Seules les colonies indifférenciées (environ 1 mm iN diamètre) doivent être coupés pour un passage ultérieur.
   1. Couper les colonies de cellules souches dans des carrés d'environ 200 μm x 200 μm en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G ou tout autre outil disponible dans le commerce (voir la Table des matières). Utilisez un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4x dans une armoire à flux laminaire à température ambiante.
   2. Détachez les fragments de colonies de la surface du plat à l'aide d'une pipette de 200 μL en pipetteant doucement le milieu en dessous pour soulever les pièces.
   3. Transférer les fragments de colonies (~ 100 pièces) à une plaque matricielle qualifiée-DMEM / F12 remplie de 4 mL de milieu hiPSC complet (voir la Table des matériaux, enduire la vaisselle comme décrit à l'étape 1.1).
   4. Incuber la (les) nouvelle (s) plaque (s) à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   5. Effectuer un changement moyen total tous les jours et inspecter la morphologie des colonies en utilisant un microscope à contraste de phase à des grossissements de 4X et 10X.

2. HiPSC DiffereNtiation dans les neurones mixtes et Glia

REMARQUE: la procédure dure approximativement 28 jours, avec les étapes principales décrites dans la figure 1 (partie supérieure).

Figure 1: Représentation schématique du protocole de différenciation neuronale. (Partie supérieure) Les colonies IMR90-hiPSC peuvent être coupées en fragments pour former des corps embryoïdes (EB). Après 2 jours in vitro (DIV), les EB peuvent être plaqués sur des plaques enduites de matrice laminées ou standard et cultivées en présence d'un milieu d'induction neuroépithéliale (NRI) pour générer des dérivés neuroectodermiques (rosettes, ici colorées pour nestin (vert) et β -III-tubuline (rouge)). Les rosettes peuvent être dissociées, collectées, reconstituées sur des plats revêtus de matrice laminés ou standard, et différenciées en neurones matures (NF200, rouge) et gliales(GFAP, vert) en présence d'un milieu de différenciation neuronale (ND). (Partie inférieure) Les NSC dérivés de la rosette (nestin, rouge) peuvent être développés en présence d'un milieu d'induction neurale (NI), cryoconservé ou encore différenciés en présence de milieu ND pour former des neurones mixtes (NF200, vert) et gliaux ( GFAP, rouge) cultures. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Production de corps embryoïdes (EB) (Jours 0 → 1)
   REMARQUE: cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision. Les fragments de colonies HiPSC devraient être de même taille pour obtenir des corps embryoïdes homogènes (EB) dans les prochaines étapes. Les colonies morphologiquement différenciées (avec de grandes fractions cytoplasmiques et petits nucléoles) doivent être éliminées.
   1. Rafraîchir le milieu HiPSC (plaque de Petri de 3 mL / 60 mm) avant de couper les colonies hiPSC indifférenciées (environ 1 mm de diamètreEter, voir la figure 2A ) dans des conditions stériles (comme décrit à l'étape 1).
   2. Couper les colonies indifférenciées (comme le montrent les figures 2A et 2B ) en fragments d'environ 200 μm x 200 μm en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G. Utiliser un microscope stéréoscopique à un grossissement de 4X dans une armoire à flux laminaire à température ambiante.
   3. Détachez les fragments de colonies de la surface du plat à l'aide d'une pipette de 200 μl en faisant pipeter doucement le milieu en dessous pour soulever les pièces.
   4. Transférer tous les fragments détachés et le tube moyen à 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   5. Rincer le plat avec 2 ml de milieu HiPSC complet pour récupérer tous les fragments.
   6. Centrifuger à 112 xg pendant 1 min.
   7. Aspirer le surnageant et ressusciter doucement les fragments dans 5 ml de milieu hiPSC EB complet (voir la Table des matériaux ).
   8. Plaquer le coDes fragments de lony dans une boîte de Petri ultra-basse de 60 mm (plaque de Petri de 5 mL / 60 mm).
   9. Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   10. Le jour suivant (Jour 1), collecter les EB et leur milieu dans un tube de 15 mL en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   11. Centrifuger les EB à 112 xg pendant 1 min.
   12. Aspirer soigneusement le surnageant et ressusciter doucement les EB dans 5 ml de milieu hiPSC EB complet en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL.
   13. Replacer les EB sur une nouvelle boîte de Petri à fixation ultra-basse de 60 mm (5 pi / 60 mm de boîte à pétri).
   14. Incuber la boîte de Petri pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
2. Le jour 1, revêtir la vaisselle avec la matrice de la membrane du sous-sol ( p. Ex. Matrigel, ci-après dénommée «matrice standard») ou tout autre substrat de protéine approprié ( p . Ex ., Laminine).
   1. Conservez la matrice standard (voir la Table des matériaux ) à -80 ° C enDes aliquotes de 200 μL utilisant des tubes froids de 1,5 ml et des pipettes froides de 5 ou 10 ml.
   2. Décongeler 200 μL de matrice standard sur glace.
   3. Diluer 200 μL de matrice standard dans 20 mL de milieu DMEM / F12 (dilution 1: 100).
   4. Enduire des boîtes de Petri de 60 mm avec cette solution (5 mL / plat).
   5. Incuber les plats enduits à 37 ° C pendant la nuit.
      REMARQUE: Ces plats seront utilisés pour plaquer les EB (environ 50 EB / plat) et générer des agrégats neuroépithéliaux (rosettes); Voir l'étape 2.3.
3. Génération d'agrégats neuroépithéliaux (rosettes) (jours 2 → 7)
   1. Le jour 2, retirer la solution de revêtement de matrice standard des boîtes de Petri de 60 mm (pas besoin de rincer les plaques) et les remplir avec 5 mL / plat de milieu d'induction neuroépithélial complet (NRI); Voir la table des matières .
   2. Transférer les EB flottants (de l'étape 2.1.14) aux plats enrobés (~ 50 EB / plat) à l'aide d'une pipette de 200 μL sous une stéréoscopieCroscope à un grossissement de 4x et placé dans une armoire à flux laminaire.
      REMARQUE: Il est essentiel de sélectionner des EBs homogènes et de taille moyenne (~ 200 à 300 μm de diamètre). Des EB trop petites peuvent ne pas survivre bien pendant la différenciation neuroectodermique, alors que les EB trop larges ont tendance à subir une nécrose de noyau.
   3. Incuber la vaisselle à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   4. Le lendemain (Jour 3), vérifiez la vaisselle au microscope à un grossissement de 10x pour s'assurer que les EB sont tous attachés.
   5. Effectuez doucement un changement de milieu total avec un NRI complet.
   6. Changez le milieu NRI tous les deux jours jusqu'au jour 7, lorsque les agrégats neuroépithéliaux (rosettes) devraient être visibles.
   7. Le jour 7, revérifier la matrice standard (ou la laminine), comme décrit à l'étape 2.2, sur n'importe quel format de plaque ou plat: plaques à 96 puits (100 μL / puits), plaques à 24 puits (250 μL / puits), 12- Des plaques de puits (500 μL / puits), des puces MEA (pour l'activité électrique, 1 mL / puce de puits unique), ou 60 mm de disrime de PetriS (4 mL / plat).
   8. Incuber les plaques / vaisselle revêtues pendant au moins 2 h à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
4. La dissociation de la rosette et la différenciation neuronale (jours 8 → 28)
   REMARQUE: cette procédure nécessite de bonnes compétences manuelles et de précision. Pour éviter de collecter des cellules mésodermiques et endodermiques, seules les structures de type rosette ectodermiques doivent être dissociées et collectées.
   1. Le jour 8, couper les structures en forme de rosette en fragments sous un microscope stéréoscopique à un grossissement 10X dans des conditions stériles. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille 30G. Notez que les rosettes ont tendance à se détacher facilement du plat lorsqu'il est touché avec l'aiguille.
   2. Compléter le détachement des fragments de rosette en utilisant une pipette de 200 μL.
   3. Transférer le plat sous le capot de flux laminaire et collecter les fragments de rosette et leur milieu dans un tube conique de 15 ml en utilisant une pipette de 1, 2 ou 5 mL. Rincer le plat avec 2 ml de milieu NRI pour récupérerTous les fragments.
   4. Tournez les fragments de rosette à 112 xg pendant 2 min.
   5. Aspirer le surnageant.
   6. Remplacer doucement la pastille dans 1 mL de 1x DPBS (sans calcium et magnésium) et pipeter doucement les fragments de rosette vers le haut et vers le bas en utilisant une pipette de 1000 μL pour les dissocier partiellement.
   7. Ajouter 4 ml de milieu NRI complet et compter les cellules en utilisant du bleu trypan et un compteur automatique de cellules (voir la Table des matières )
      REMARQUE: Diluer 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu trypan. Cette étape peut être omise si les cellules ne peuvent pas être introduites dans une suspension à une seule cellule. Si les fragments de rosette ne semblent pas complètement dissociés, des fragments de rosettes dérivés d'environ 50 EB / plat de 60 mm peuvent être remis en suspension dans 50 ml de milieu NRI complet et plaqué, comme indiqué dans le tableau 1 .
   8. Aspirer la solution de revêtement de matrice standard (ou laminine) des plaques de Petri, des plaques et / ou des chips MEA (de l'étape 2.3.7). Ne les laissez pas sécher.
   9. Placer les cellules dans un milieu NRI complet selon le plan d'étude (environ 15 000 cellules / cm ² , voir Tableau 1 pour les indications de volume du placage).
   10. Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   11. Le jour 10, effectuez un changement de milieu total en utilisant un milieu de différenciation neuronal complet (ND); Voir la table des matières.
   12. Rafraîchir le support ND complet deux fois par semaine jusqu'au jour 28.
   13. Caractériser les dérivés des cellules neuronales / gliaires, comme décrit à l'étape 5 (voir le tableau 2 pour les critères d'acceptation générale).

3. Expansion et différenciation des cellules souches neuronales (NSC) dérivées par HiPSC dans les neurones mixtes et Glia

REMARQUE: Les NSC dérivés de fragments de rosette peuvent être développés et maintenus selon la procédure décrite ci-dessous ( Figure 1 , partie inférieure). Cela permet d'augmenterNombre de cellules pour la différenciation et les tests chimiques.

1. Enduire une boîte de Petri de 60 mm (ou un ballon T-25) avec 5 ml de solution de revêtement DMEM / F12 de matrice standard et l'incuber pendant au moins 2 h à 37 ° C et 5% de CO ₂ (comme décrit à l'étape 2.2).
2. Faire tourner les fragments de rosette dérivés des étapes 1-2 (voir étape 2.4) dans un tube conique de 15 ml à 112 xg pendant 2 min.
3. Remplacer doucement la pastille dans 5 ml de milieu d'induction neurale (NI); Voir la table des matières.
4. Transférer les cellules sur une plaque de Petri 60 mm (ou une fiole T-25) standard.
5. Culture des NSC dérivés de rosette en présence de NI medium, rafraîchissant le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules atteignent la confluence.
6. Lorsqu'il est confluent, passez les NSC comme décrit dans les étapes suivantes.
   REMARQUE: Passer les NSC environ une fois par semaine; Envisager d'utiliser des plats, des flacons ou des assiettes fraîchement revêtus, selon le plan d'étude.
7. Supprimer l'intégralité NI medium et gentlRincez les NSC avec du DPBS (sans calcium et magnésium).
8. Ajouter 1,5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA préchauffée à 37 ° C à la boîte de Petri 60 mm (ou flacon T-25) contenant les cellules et la placer dans l'incubateur pendant 1 min.
9. Tapez doucement le plat (ou le flacon) pour détacher les cellules.
10. Ajouter 1,5 ml d'inhibiteur de trypsine préchauffé à 37 ° C et transférer les cellules dans un tube de 15 ml.
11. Rincer la boîte de Petri (ou le ballon T-25) avec un volume égal de milieu NI (1,5 mL) et collecter le volume dans le même tube de 15 ml.
12. Centrifuger les cellules à 130 xg pendant 3 min.
13. Supprimez le surnageant et resuspendez doucement les cellules dans 1 ml de milieu NI complet en utilisant une pipette de 1000 ul.
14. En outre, diluer la suspension cellulaire dans 3 ou 4 ml de milieu NI complet et compter les cellules en utilisant du bleu de trypan et un compteur de cellules automatisé.
15. Placer les NSC sur la boîte de Petri de 60 mm (ou flacon T-25) à partir de l'étape 3.1 à une densité d'environ 50 000 cellules / cm ² .
16. Caractériser les cellules pour la présence de dérivés de cellules neuronales / gliales, comme décrit à l'étape 5.
    NOTE: Les NSC peuvent être différenciés en cultures mixtes de neurones et de glie dans un milieu ND complet (comme décrit aux étapes 2.4.11-2.4.13), rafraîchissant le milieu ND complet deux fois par semaine pendant 21 jours.

4. Cryopreservation et décongélation NSC dérivées HiPSC

REMARQUE: lors du passage, les NSC peuvent être gelés et redémarré suivant cette procédure.

1. Centrifugement NSC passaged (à partir de l'étape 3.12) à 130 xg pendant 3 min.
   REMARQUE: les cellules doivent être comptées à l'étape 3.14.
2. Ressuscissez doucement et lentement les NSC à 3 x 10 ⁶ / mL de milieu de congélation (voir la Table des matières ).
3. Aliquoter les cellules dans des flacons appropriés pour la cryoconservation (environ 0,5 mL = 1,5 x 10 ⁶ / flacon).
4. Placer les flacons dans un récipientLiner avec du 2-propanol et placer le récipient à -80 ° C pendant un minimum de 2 h et jusqu'à 2 semaines.
5. Transférer les flacons à la phase vapeur d'un réservoir d'azote liquide.
6. Pour redémarrer la culture cellulaire, décongeler 1 flacon congelé dans un bain d'eau à 37 ° C.
7. Recueillir doucement les cellules dans 7 ml de milieu NI préchauffé dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette de 1000 ul.
8. Centrifuger les cellules à 130 xg pendant 3 min.
9. Retirez le surnageant et resuspendez doucement les cellules dans 1 mL de milieu NI complet en utilisant une pipette de 1000 μl.
10. Diminuer davantage la suspension cellulaire dans 3 ou 4 mL de milieu NI complet et compter les cellules en utilisant du bleu de trypan et un compteur de cellules automatisé (note: diluer 20 μL de suspension cellulaire dans 20 μL de bleu trypan; la viabilité après décongélation doit être ≥ 80 %).
11. Placer les NSC dans une boîte de Petri 60 mm revêtue (ou une fiole T25) à une densité d'environ 50 000 cellules / cm ² .

5. CharaCterisation de cellules neuronales et gliaques dérivées de HiPSC

NOTE: Lors de la différenciation, les dérivés neuronaux et gliaux peuvent être caractérisés en utilisant différentes techniques, telles que celles décrites dans les sections suivantes.

1. Analyses quantitatives en temps réel de la PCR (qPCR) ¹⁰
   1. Faites tourner les fragments de colonies HiPSC, EBs et / ou NSC à 130 xg pendant 3 min.
   2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 μl de tampon de lyse à ARN froid fourni dans un kit approprié pour l'extraction de l'ARN.
   3. Alternativement, collecter des dérivés neuronaux / gliaux directement à partir des plaques en aspirant le milieu et en ajoutant un tampon de lyse à ARN froid dans les puits pour collecter les cellules.
   4. Isoler l'ARN en suivant les instructions du fabricant.
   5. Inverser-transcrire 500 ng de l'ARN total en utilisant un kit approprié pour l'ARN à la rétrotranscription d'ADNc.
   6. Exécutez les réactions qPCR en double en utilisant un mélange maître approprié et une amorce(Voir la table des matières ).
   7. Enregistrez l'émission fluorescente en temps réel: 45 cycles avec un amorçage d'amorces à 60 ° C.
   8. Normaliser les quantités d'ARN relatives à GAPDH et β-actine en tant que gènes de référence et utiliser des hiPSC indifférenciés ou des cellules non traitées pour les conditions d'étalonnage (méthode ΔΔCt). Alternativement, utilisez une autre méthode appropriée.
2. Immunocytochimie et imagerie à haute teneur (HCI) ^{6 , 11}
   1. Fixer les colonies hiPSC, les NSC et / ou les dérivés neuronaux / gliaux avec du paraformaldéhyde froid à 4% pendant 15 minutes à température ambiante.
   2. Laver doucement les cellules dans 1X PBS et stocker les plaques à 4 ° C pendant 1 mois maximum.
   3. Lorsqu'ils sont prêts à colorer, perméabiliser les cellules dans un tampon de perméabilisation (1x DPBS contenant 0,1% de triton-X-100 et 3% de BSA) pendant 15 minutes à température ambiante.
   4. Supprimer la perméabilisation buFermer et incuber les cellules dans le tampon de blocage (3% BSA / 1X DPBS) pendant 15 min à température ambiante pour éviter la liaison non spécifique des anticorps.
   5. Enlever le tampon de blocage et incuber les cellules pendant une nuit à 4 ° C dans un tampon de blocage contenant des anticorps primaires appropriés (voir la Table des matières ).
   6. Laver les cellules 3 fois avec 1x PBS.
   7. Incuber les cellules pendant 45 minutes à température ambiante dans un tampon de blocage contenant des anticorps secondaires conjugués au fluorochrome (voir le tableau des matériaux ), contre-colorant les noyaux avec du colorant DAPI.
   8. Quantifier l'intensité de fluorescence moyenne et les pourcentages relatifs de types de cellules en utilisant une plate-forme d'imagerie à contenu élevé appropriée, si disponible (voir la Table des matériaux ).
      NOTES: Pour déterminer le niveau d'intensité du fond fluorescent, incuber certaines cellules / puits avec des anticorps secondaires seuls. L'analyse cytométrique en flux de Live (non fixe), undDes hiPSC peuvent être effectués pour évaluer l'expression des marqueurs spécifiques de PSC, tels que SSEA4 (voir le tableau des matériaux ). Les colonies hiPSC indifférenciées peuvent être analysées pour l'activité de la phosphatase alcaline en utilisant des kits BCIP / NBT disponibles dans le commerce, en suivant les instructions du fabricant (voir la Table des matériaux ). En outre, des analyses et analyses de matrice de protéines en phase inverse (RPPA) peuvent être effectuées, comme décrit dans la référence 12 (pour une liste d'anticorps testés, voir la Table des matières ).
3. Mesures électrophysiologiques ¹³
   1. Placer les fragments de rosette dissociés (après 7 DIV) ou les NSC dérivés de rosettes sur des tableaux multi-électrodes revêtus (MEA, voir la Table des matériaux ) en milieu ND complet (~ 1 x 10 ⁵ cellules / puce MEA à un seul puits).
   2. Différencier les cellules pendant 3 semaines en milieu ND complet, rafraîchissantE moyenne deux fois par semaine.
   3. À la fin de la différenciation, sceller les puces MEA avec une membrane semi-perméable sous une hotte à flux laminaire afin de maintenir les cultures stériles pour des mesures répétées.
   4. Remplacez l'une des électrodes par une seule référence au sol, ce qui permet d'enregistrer les enregistrements des électrodes restantes.
   5. Enregistrez le taux de tir moyen (MFR, nombre de pointes / min) en utilisant un amplificateur MEA avec la régulation intégrée de la température réglée à 37 ° C et 5% de CO ₂ .
   6. Détecter des pics à partir des données brutes MEA en utilisant une limite de seuil de -4,7σ (σ représente l'écart type du bruit de base).
   7. Traiter les données post-enregistrement avec un logiciel approprié.

Representative Results

Caractérisation des hiPSC indifférenciés

Pour évaluer le phénotype des hiPSC, il faut effectuer l'analyse de la morphologie des colonies / cellules, la détermination des marqueurs spécifiques de PSC et l'examen de l'expression des gènes et de l'activité des phosphates alcalins. Les hiPSC indifférenciés devraient être ronds, avec de gros nucléoles et sans cytoplasme abondant. La majorité des colonies devraient être caractérisées par une morphologie plate et très serrée, indiquant un phénotype indifférencié ( figure 2A et figure 2B ). En outre, plus de 80% des colonies devraient être positives pour la coloration de l'activité de la phosphatase alcaline ( figure 2C ).

Environ 80% des cellules devraient être positives pour les marqueurs classiques liés à la pluripotence, tels que Oct4, SSEA3, SSEA4 et Tra1-60 ( Figure 2D-H ), comme le montrent l'immunocytochimie et la cytométrie en flux, tandis que les pourcentages de cellules Nestin ⁺ et β-III-Tubulin ⁺ devraient être significativement faibles (environ 8% et 3%, respectivement, Comme le montre la figure 2H ). Ces résultats doivent être reproductibles sur des passages.

Figure 2. Caractérisation des IMP90-hiPSC indifférenciés. (A et B) Des images représentatives de contraste de phase (grossissements 10X et 20X) de colonies IMR90-hiPSC indifférenciées. (C) des images représentatives de colonies colorées à la phosphatase alcaline (grossissement 4X). (DF) Des images immunocytochimiques représentatives de (D) Oct4 (rouge), (E) SSEA3 (vert) et (F) TrA1-60 (vert). (G) Tableau représentatif des points de SSEA1 (CD15) et coloration SSEA4, analysés par cytométrie en flux. (H) Le graphique à barres montre les pourcentages de Oct4 ⁺ (~ 75 - 80%), Tra1-60 ⁺ (~ 75 - 80%), SSEA3 ⁺ (~ 75 - 80%), nestin ⁺ (~ 10-15% ) Et des cellules β-III-tubuline ⁺ (~ 3 - 7%), contrastées avec DAPI et quantifiées par HCI, avec une moyenne de 3 à 5 répétitions biologiques ± le SEM (graphique modifié de la référence 6). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Évaluation de la pluripotence via la formation d'EB

Les HiPSC sont pluripotents, ce qui signifie qu'ils expriment trois gènes liés aux couches germinales dans des conditions appropriées. Pour évaluer la pluripotence hiPSC, il est possible d'appliquer une méthode communeApproche basée sur la formation d'EB spontanée, ce qui induit la formation des trois couches germinales ¹⁴ . Les analyses des gènes spécifiques de la couche de germe doivent indiquer une augmentation de l'endoderme (α-foetoprotéine (AFP) et Cytokératine 18 (KRT18)), l'ectoderme (Nestin, SRY-box 1 (Sox1) et la boîte appariée 6 (Pax6) ) Et le mésoderme (expression du gène apparenté au peptide A natriurétique (NPPA) et Brachyury-T) ( Figure 3A et Figure 3B ); Voir la table des matières.

Figure 3. Évaluation de la pluripotence par la formation d'EB. (A) Image représentative de contraste de phase des EB au jour 1. (B) Le graphique à barres montre les analyses qPCR du mésodermique (NPPA et brachyury), ectodermique (Pax6, Sox1 et nestin) et endodermiques (AFP et KRT18 ), Normalisés aux gènes de référence, β-actine et GAPDH, et calibrés aux cellules indifférenciées (Jour 0). Il s'agit de la méthode ΔΔCt, avec une moyenne de 5 analyses indépendantes ± la SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graphique modifié de la référence 6. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Induction de la différenciation neuronale et gliale

Les IMR90-iPSC peuvent être différenciés en cultures mixtes de neurones post-mitotiques et de cellules gliales selon les étapes résumées dans la Figure 1 et dans les sections du protocole. 5-8 jours après avoir plaqué les EB sur des plaques standard ou matricées en laminine en présence d'un NRI complet, les structures en forme de rosette devraient commencer à devenir visibles (= "Xfig"> Figure 4A). Les rosettes sont caractérisées par la présence de cellules nestin ⁺ (précurseurs neuronaux, ~ 90%), avec quelques cellules β-III-tubuline ⁺ (cellules neuronales engagées, ~ 5 à 10%), la dernière étant généralement localisée principalement à la périphérie de la Rosettes ( figure 4B , rosettes le jour 12).

Lors de la dissociation de la rosette et de la répétition sur des plaques ou des plaques revêtues de matrices de laminine ou standard en présence d'un milieu ND complet, les cellules commencent à se différencier en cultures mixtes de neurones et de glie, formant progressivement des grappes de corps de cellules neuronales reliés par des faisceaux de neurites ( Figure 4C et Figure 4D ). Des résultats similaires devraient être obtenus lors de l'analyse des populations neuronales obtenues en développant les NSC dérivés de la rosette et en les différenciant en neurones et glia. Les NSC développés à partir de rosettes devraient être nEstin ⁺ ( figure 4E , insertion montrant les cellules nestin ⁺ ).

Après 21 jours de différenciation, les cellules devraient être positives pour la β-III-tubuline; NF200; Tau; Et MAP2, le marqueur tardif des dendrites ( Figure 4D , 4F et Figure 4H), avec au moins 10 à 15% des cellules positives pour la protéine acide fibrillaire glial (GFAP), un marqueur astroglial ( Figure 4G et Figure 4H) . Par ailleurs, 20 à 30% des cellules devraient conserver l'expression du nestin après différenciation ( figure 4H ). Il est important de considérer que le pourcentage de chaque type de cellule ( c.-à-d. Cellules neuronales, astrocytes, nestin ⁺ ) peut varier par rapport aux passages et une variabilité dépendante de l'utilisateur peut être observée.

En analysant des sous-populations neuronales spécifiques, les neurones GABAergiques représententOnt envoyé ~ 15 - 20% des cellules totales, les neurones dopaminergiques ~ 13-20% et les neurones glutamatérgiques ~ 35 - 42%, comme en témoigne l'immunocoloration pour l'acide gamma-aminobutyrique (GABA), la tyrosine hydroxylase (TH) et le glutamate vésiculaire Transporteur 1 (VGlut1), respectivement (voir la quantification représentative de la figure 4H ). L'induction de la différenciation peut également être évaluée par l'analyse des marqueurs liés à la pluripotence ( par exemple, Oct4, Tra1-60 et SSEA3), qui devrait être significativement réduit dans les cellules différenciées par rapport aux hiPSC indifférenciés (non indiqué, voir référence 6). Cela peut également être confirmé par l'analyse de l'expression des gènes par qPCR, ce qui devrait indiquer une diminution de Oct4 et Nanog et la régulation positive des gènes neuronaux, tels que la molécule d'adhésion des cellules neuronales 1 (NCAM1) et la protéine 2 associée aux microtubules (MAP2); Le gène présynaptique, la synaptophysine (SYP); Et le gène post-synaptique, protéine tau associée aux microtubules (MAPT), comme indiqué dans < Strong class = "xfig"> Figure 4I. En outre, des gènes glutamatérgiques (NARG2, GRIA1 et GAP43) GABAergiques (GABRA1 et GABRA3), des neurones moteurs (ISL1 et LHX3) et des gènes liés au cholinergique (SLC5A7 et SLC18A13) Entraînent des cellules neuronales à régulations élevées par rapport aux cellules indifférenciées ( figure 4J ).

L'analyse de l'activité électrique spontanée, au moyen de MEA, est une lecture précieuse pour évaluer la fonctionnalité du réseau neuronal dans les hiPSC différenciés. À la fin de la période de différenciation, les dérivées neuronales sont généralement caractérisées par un taux moyen de tir (MFR) d'au moins 60 pointes / min (voir la trame raster représentative de la figure 4K ). Cependant, les éclats ne sont pas observés.

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Figure 4. Différenciation des IMR90-hiPSC dans les cultures mixtes de neurones et de Glia. (A et B) Images représentatives des rosettes après 7 DIV (A) et après 12 DIV (B) , colorées pour nestin (vert) et β-III-tubulin (rouge)). (C et D) Images représentatives de cellules différenciées après 22 DIV (C) et 28 DIV (D) , colorées pour β-III-tubulin (rouge) et NF200 (vert)). (E) Image représentative des NSC dérivés de la dissociation et de l'expansion de la rosette (l'insertion montre les cellules nestin ⁺ , rouge). (F et G) Des images représentatives de cellules neuronales ( F , colorées pour NF200 (rouge) et Tau (vert)) et des cellules gliales ( G , colorées pour GFAP (rouge)) différenciées des NSC (après 21 DIV). (H) Quantification de nestin, MAP2, GFAP, acide gamma-aminobutyrique (GABA), transporteur vésiculaire de glutamate 1 (VGlut1) et des cellules positives à la tyrosine hydroxylase (TH) par HCI, en comparant les dérivés IMR90-hiPSC et les cellules différenciées des NSC dérivés IMR90-hiPSC (graphique modifié de la référence 7). (I et J) Graphiques à barres montrant les analyses qPCR des gènes de pluripotence (Oct4 et Nanog) et des gènes neuronaux (NCAM1, MAP2, SYP et MAPT) (I) et dopaminergiques (TH et NR4A1), noradrénergiques (PHOX2A et PHOX2B) Glutamatérgique (GABRA1 et GABRA3) GABAergic (GABRA1 et GABRA3), neurones moteurs (ISL1 et LHX3) et gènes liés au cholinergique (SLC5A7 et SLC18A13) (J) . Toutes les analyses ont été normalisées aux gènes de référence, à la β-actine et à la GAPDH, et calibrées à des cellules indifférenciées (barres vertes). Il s'agit de la méthode ΔΔCt, avec une moyenne de 5 analyses indépendantes ± la SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Les graphiques dans I et J ont été modifiés à partir de la Référence 6. (K) Trame raster représentatif du neur de dérivé IMR90-NSCOns (l'enregistrement a été effectué pour un minimum de 600 s, les barres verticales représentent des pointes simples). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Une signature spécifique des marqueurs neuronaux est régulée à la hausse dans les IMR90-hiPSC différenciés

Dans le nouveau paradigme de test de toxicité, il est essentiel de définir les événements moléculaires et cellulaires se produisant dans une cellule suite à une exposition à un toxique donné. Par conséquent, il est pertinent de caractériser quelles voies de signalisation sont activées et / ou réglementées dans le modèle cellulaire sous enquête.

Les tableaux commercialement disponibles pour l'analyse de l'expression des gènes de la protéine kinase peuvent être utilisés pour comparer les hiPSC indifférenciés par rapport aux cellules différenciées. DifferenLes IMF90-hiPSC ont subi une régulation positive des gènes impliqués dans le contrôle des récepteurs de la neurotrophine, la régulation de l'orientation des axones, la modulation de la croissance des neurites, les récepteurs du facteur neurotrophique dérivé de la glie (GDNF), la protéine morphogénétique osseuse (TGP) et la voie des TGF-bêta, Les récepteurs du facteur de croissance dérivés (PDGF) ( Figure 5A et Figure 5B ).

L'analyse du RPPA montre la régulation à la hausse d'une signature neuronale spécifique dans des IMR90-hiPSC différenciés. En particulier, les voies de signalisation Erk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR et Notch1 sont activées lors de la différenciation ( Figure 5C ).

Figure 5. Les cellules neuronales et ganglionnaires différenciées présentent l'activation des voies liées aux neurones. (UNEEt B) Les graphiques à barres rapportent les analyses qPCR des kinases liées aux neurones (A) et d'autres gènes liés à la kinase (B) . Les données d'expression génétique ont été normalisées aux gènes de référence 18S et GAPDH (fournis dans le tableau) et calibrés à des cellules indifférenciées. Pour ces analyses, un gène a été jugé significativement régulé à la hausse lorsque son expression était au moins 2 fois plus élevée que dans les cellules indifférenciées (2 ^-ΔΔCt ≥ 2); Moyenne de 3 analyses indépendantes ± la SEM). (C) Le graphique à barres montre les quantifications absolues des protéines au moyen d'une analyse RPPA, en comparant les barres différenciées (barres rouges) et les cellules indifférenciées (barres vertes). Les protéines appartenant aux mêmes cascades de la voie de signalisation sont regroupées comme suit: CREB / Erk / Akt, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh et Wnt, SAPK / JNK et BMP / SMAD. Moyenne ± la SEM de 4 analyses indépendantes. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graphique modifié fRom Reference 6. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les cultures neuronales / gliales dérivées par IMR90-hiPSC peuvent être utilisées pour évaluer les effets de la rotenone

La Roténone, un inhibiteur du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, est connue pour provoquer un stress oxydatif en déclenchant l'activation de la voie Nrf2. Dans des conditions de repos, Nrf2 est ancré dans le cytoplasme par Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), un répresseur Nrf2, ce qui facilite l'ubiquitination Nrf2 et la protéolyse ¹⁵ . Lors de l'induction du stress oxydatif, Nrf2 se translate dans le noyau et active l'expression des gènes cibles Nrf2-ARE ¹⁶ .

Les neurones dérivés d'IMR90-hiPSC etD cellules gliales peuvent être utilisées pour évaluer les effets de la roténone sur l'activation du Nrf2 en exposant les cellules à différentes concentrations de roténone ( p. Ex., 1, 10 et 100 nM) pendant 24 h. Ces concentrations ont été établies selon les études précédentes ^{17 , 18} .

À ces concentrations et à ces moments d'exposition, la roténone n'a pas entraîné de cytotoxicité, comme en témoigne la quantification des noyaux cellulaires DAPI ⁺ ( figure 6A ). La Roténone induit la translocation nucléaire Nrf2, en particulier après avoir exposé les cellules à la roténone 100 nM ( Figure 6B et Figure 6E ). À la même concentration, une diminution significative du Keap1 cytoplasmique a été observée ( figure 6C ), avec une augmentation de NAD (P) H quinone oxydoréductase 1 (NQO1) et de Sulfiredoxine 1 (SRXN1), deux Nrf2-cible enZymes ^{19 , 20} ( figure 6D ).

Figure 6. Effets de la Roténone sur les concentrations de protéines nucléaires Nrf2, Keap1, SRXN1 et NQO1. (A) Quantification des cellules DAPI ⁺ en direct ( c.-à-d., Noyaux non pyknotiques) par traitement de 24 h avec 1, 10, 100 nM de roténone et cellules normalisées à non traitées (Control, Ctr). (B) La translocation nucléaire de la protéine Nrf2 ( c'est-à-dire les rapports nucléaires / cytoplasmiques) après 24 heures d'exposition à la roténone, évaluée par des mesures de l'intensité de fluorescence en utilisant une analyse HCI. (C) Quantification des niveaux cytoplasmiques de protéines Keap1 sur le traitement par roténone, évalué par analyse HCI. (D) Quantification de NAD (P) H quinone oxydoréductase 1 (NQO1) et SulfiRedoxine 1 (SRXN1) au moyen d'immunofluorescence et de HCl après 24 heures de traitement par rotenone. (E) Images représentatives de la localisation de la protéine Nrf2 (vert). Toutes les valeurs sont indiquées comme moyenne ± SEM de 3 répétitions biologiques. * P <0,05, ** p <0,01; Figure modifiée à partir de la référence 7. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

À ces concentrations et à ces moments de traitement, la roténone a également provoqué une augmentation de la concentration du pourcentage de cellules astrogliales (GFAP ⁺ ) en fonction de la concentration ( Figure 7A et Figure 7B ), sans affecter les proportions des NSC (nestin ⁺ ) et des neurones (MAP2 ⁺ ) ( Figure 7B ). En examinant les proportions de sous-types neuronaux spécifiques, le traitement par rotenone (10 nM et 100 nM)A considérablement diminué le nombre de neurones dopaminergiques (TH ⁺ ) ( Figure 7C et D ), tandis que les pourcentages des neurones GABAergic (GABA ⁺ ) et glutamatérgiques (VGlut1 ⁺ ) n'ont pas changé ( figure 7D ). Par analogie, des études antérieures in vitro et in vitro ont décrit une mort de cellules neuronales dopaminergiques dépendantes de la roténone et sélective ^{21 , 22 , 23} .

Figure 7. Effets de la Roténone sur les cellules Glial et les Neurones Dopaminergiques. (A) Images représentatives des cellules GFAP ⁺ (rouge), avec un grossissement 40X dans les insertions, non traitées ou traitées avec 100 nM de rotenone pendant 24 h. (B) Quantification Des cellules nestin ⁺ , MAP2 ⁺ et GFAP ⁺ , normalisées aux cellules non traitées (contrôle, Ctr). (C) Images représentatives des neurones dopaminergiques TH ⁺ (vert), avec un grossissement 40X dans les inserts, non traitées ou traitées avec 100 nM de rotenone pendant 24 h. (D) Quantification des cellules neuronales GABA ⁺ , VGlut1 ⁺ et TH ⁺ , normalisées aux cellules non traitées (Ctr). Toutes les valeurs sont indiquées comme moyenne ± SEM de 3 répétitions biologiques. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figure modifiée à partir de la référence 7. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

La signification statistique a été évaluée par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Dunnett comme post-test (en comparant toutes les colonnes par rapport à la colonne de contrôle)Xref "> 24 ou par t-test à deux têtes ou non appariés selon le type d'analyse. Toutes les données représentent la moyenne d'au moins trois répliques biologiques ± l'erreur type de la moyenne (SEM). Un astérisque sur une barre indique Une différence significative avec le groupe témoin. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Tableau 1.
Note sur la densité de placage de la rosette dissociée: si les fragments de rosette ne semblent pas complètement dissociés, afin d'atteindre une densité de plaquage cellulaire d'environ 15 000 cellules / cm ² , des fragments de rosettes dissociées dérivant d'environ 50 EB / 1 x 60 mm de plat peuvent être remis en suspension dans 50 ml de milieu NRI complet et plaqué comme suit (selon le format de la plaque):

Plaques Multiwell / MEA	Zone de croissance (cm 2	Volume de suspension de cellules à la plaque par puits (ou puce MEA)	Nombre maximal de plaques pouvant être plaquées (avec 50 ml de suspension cellulaire)
96 puits	0,3	100 ul	5
48 puits	0,7	220 ul	4
24 puits	2	625 ul	3
12 puits	4	1,25 ml	3
6 puits	dix	3,15 ml	2
Puce MEE MEE single	3.5	1,1 ml	45

Tableau 2: Critères d'acceptation

Marker /Anticorps	Pourcentage (sur les cellules DAPI + (en direct) après 28 DIV
B-III-tubuline (Tuj1)	35-45%
MAP2	50-60%
NF200	45-55%
GFAP	10-25%
Nestin	15-25%

Discussion

Ce travail décrit un protocole robuste et relativement rapide pour la différenciation des IMR90-hiPSC en neurones post-mitotiques et cellules gliales. Les protocoles de différenciation neuronale précédemment publiés basés sur les hESC et les hiPSCs donnent généralement des pourcentages élevés de précurseurs neuronaux ^{25 , 26} et un nombre significatif de cellules cibles neuronales ^{27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33} . Par analogie, le protocole de différenciation décrit ici est approprié pour générer des cultures hétérogènes de cellules neuronales GABAergiques, glutamatérgiques et dopaminergiques, ainsi que la glie et une proportion discrète de cellules Nestin ⁺ . La présence de cellules neuronales glutamatérgiques (~ 35-42%) et GABAergiques (~ 15-20%) suggère queCette culture possède le cerveau antérieur, les caractéristiques corticales et la présence d'un nombre discret de neurones dopaminergiques (~ 13-20%) peut également indiquer une spécificité du cerveau moyen. En outre, la permanence d'une modeste proportion de cellules nestin ⁺ peut s'avérer appropriée pour l'étude de la neurogénèse et les effets possibles des produits chimiques sur les NSC, qui se limitent principalement à l'hippocampe et à la zone subventriculaire (SVZ) du cerveau antérieur ³⁴ . D'autres analyses immunocytochimiques et d'expression des gènes aideraient à mieux définir la spécificité régionale des dérivés cellulaires différenciés.

Les deux étapes les plus critiques du protocole de différenciation décrites dans ce document sont: (i) la coupe des colonies hiPSC en fragments homogènes (qui est critique pour la génération d'EB avec des tailles homogènes) et (ii) la coupe des structures neuroectodermiques (rosettes ) Pour la différenciation NSC, qui nécessite une compétence manuelle significativeEt une précision pour éviter de collecter des cellules mésodermiques et endodermiques qui peuvent réduire les proportions de neurones et de cellules gliales obtenues lors de la différenciation.

Il est crucial de caractériser les phénotypes des cellules pendant l'expansion (en tant que colonies indifférenciées ou NSC) et pendant toutes les étapes de différenciation. En particulier, les profils d'expression de gènes et de protéines des dérivés des cellules neuronales et gliales devraient présenter une régulation et une activation des voies de signalisation liées aux neurones, alors que l'expression des marqueurs de pluripotence devrait être diminuée.

La génération d'EB et de dérivés neuroectodermiques (rosettes) peut être difficile à l'emploi et susceptible d'être modifiée. Pour cette raison, nous avons développé un protocole pour l'expansion des NSC dérivés de la rosette et leur différenciation supplémentaire en cellules neuronales / gliales.

Les limites possibles de ce protocole de différenciation sont principalement (i) le pourcentage relativement faible de dDérivés de glie inférentielle et (ii) le manque de fonctions de réseau neuronal matures (comme le montre le manque de rafales). En outre, des sous-populations spécifiques d'astrocytes peuvent fonctionner comme progéniteurs primaires ou NSC ³⁵ . Bien que les cellules double-positives de nestin / GFAP n'aient pas été observées dans cette culture cellulaire différenciée (données non présentées), on suppose que les cellules GFAP ⁺ dans ces cultures mixtes sont des progéniteurs astrocytaires et des astrocytes. Il est plausible que, en prolongeant le temps de différenciation, le nombre d'astrocytes augmente, et leur morphologie peut devenir plus mature, comme l'ont déjà indiqué les travaux antérieurs du groupe ^{36 , 37} de Zhang.

Dans le nouveau paradigme de test de toxicité, les connaissances sur les perturbations chimiques des voies biologiques sont de la plus haute importance lors de l'évaluation de l'adversité chimique. Par conséquent, les systèmes de test in vitro devraient pouvoirAssocient des effets indésirables aux perturbations des voies de signalisation, selon la notion de voie de résultat défavorable (AOP). En tant que preuve de concept, la rotenone peut être utilisée pour évaluer l'activation de la voie Nrf2, qui est impliquée dans la défense cellulaire contre le stress oxydatif ou électrophile ³⁸ , et le stress oxydatif est un événement clé important et commun dans différents AOPs pertinents pour Neurotoxicité développementale et adulte ³⁹ .

La Roténone devrait susciter l'activation de la voie Nrf2, qui peut être démontrée par la translocation nucléaire de la protéine Nrf2 et l'expression accrue des enzymes Nrf2-cible, y compris NQO1 et SRXN1. Il a été constaté que la roténone induit une augmentation dose-dépendante des taux de protéines de GFAP, indicatif de l'activation des astrocytes ^{40 , 41} . La Roténone diminue également le nombre de cellules dopaminergiques (TH ⁺ ), en accord avec les préviLes études in vitro et in vivo montrant la mort de la cellule dopaminergique dépendante de rotenone, puisque ce type de neurone est particulièrement sensible au stress oxydatif ^{21 , 22 , 23} .

En conclusion, ce modèle de culture cellulaire et neurale dérivée de HiPSC est un outil précieux pour évaluer les effets neurotoxiques des produits chimiques qui provoquent un stress oxydatif entraînant une activation de la voie Nrf2. Comme ce protocole de différenciation permet la génération de cultures mixtes de cellules neuronales (neurones GABAergiques, dopaminergiques et glutamatérgiques) et astrocytes, il peut s'avérer approprié d'étudier la diaphonie entre les neurones et la glie dans des conditions physiologiques et pathologiques telles que dans les maladies neurodégénératives ( Par exemple, la maladie de Parkinson). En outre, la présence d'une proportion significative de NSC peut aider à évaluer les effets possibles des produits chimiques sur le programme neuralQui sont connus pour être la cible principale de mutations chimiquement induites ou d'infections virales ⁴² .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium	Stem Cell Technologies	05851	(Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8 °C for up to 2 weeks. 5x Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20 °C. Use frozen aliquots within 3 months.
mTeSR1 5x Supplements	Stem Cell Technologies	05852
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium	Stemgent	01-0013-50	Freeze ~ 100 fragments/250 μL/vial (Step 1.2.1)
Name	Company	Catalog Number	Comments
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	(Step 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR)	Thermo-Fisher	10828-028	20% final concentration (Step 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM final concentration (Step 2.1.7)
β-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher	31350-010	50 µM final concentration (Step 2.1.7)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete neuroepithelial induction medium (NRI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Step 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 2.3.1)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.3.1)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/mL final concentration (Step 2.3.1)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	20 ng/mL final concentration added before use (Step 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of cold DMEM/F12 medium.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1x.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium	Thermo-Fisher	21103049	(Step 2.4.11)
B-27 Supplements (50x)	Thermo-Fisher	17504044	(Step 2.4.11)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.4.11)
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	1 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	2.5 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural induction medium (NI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Step 3.3)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 3.3)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 3.3)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 3.3)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/mL final concentration (Step 3.3)
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A	Thermo-Fisher	12587010	(Step 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM final concentration (Step 3.3)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
EGF	Thermo-Fisher	PHG6045	10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	2.5 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
Defined Trypsin Inhibitor (DTI)	Thermo-Fisher	R007-100	Pre-warm at 37 °C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10)
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo-Fisher	15400054	1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37 °C (Step 3.8)
CryoStor cell cryopreservation medium	Sigma-Aldrich	C2874-100ML	(Step 4.2)
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
Name	Company	Catalog Number	Comments
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis:
RNAqueous-Micro kit	Thermo-Fisher	AM1931	(Step 5.1.6)
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits	Thermo-Fisher	4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo-Fisher	4369016
GFAP	Thermo-Fisher	Hs00909233_m1
MAP2	Thermo-Fisher	Hs00258900_m1
NQO1	Thermo-Fisher	Hs02512143_s1
SRXN1	Thermo-Fisher	Hs00607800_m1
HMOX1	Thermo-Fisher	Hs01110250_m1
GSR	Thermo-Fisher	Hs00167317_m1
PAX6	Thermo-Fisher	Hs01088112_m1
NES	Thermo-Fisher	Hs00707120_s1
GRIA1	Thermo-Fisher	Hs00181348_m1
GAP43	Thermo-Fisher	Hs00967138_m1
GABRA3	Thermo-Fisher	Hs00968132_m1
GABRA1	Thermo-Fisher	Hs00168058_m1
NR4A2	Thermo-Fisher	Hs00428691_m1
TH	Thermo-Fisher	Hs00165941_m1
GAPDH	Thermo-Fisher	Hs02758991_g1
ACTB	Thermo-Fisher	Hs99999903_m1
MAPT	Thermo-Fisher	Hs00902194_m1
SYP	Thermo-Fisher	Hs00300531_m1
NANOG	Thermo-Fisher	Hs04260366_g1
POU5F1 (OCT4)	Thermo-Fisher	Hs04195369_s1
SOX1	Thermo-Fisher	Hs01057642_s1
AFP	Thermo-Fisher	Hs00173490_m1
KRT18	Thermo-Fisher	Hs01941416_g1
NPPA	Thermo-Fisher	Hs00383230_g1
T	Thermo-Fisher	Hs00610080_m1
NCAM1	Thermo-Fisher	Hs00941821_m1
NR4A1	Thermo-Fisher	Hs00374226_m1
PHOX2A	Thermo-Fisher	Hs00605931_mH
PHOX2B	Thermo-Fisher	Hs00243679_m1
NARG2	Thermo-Fisher	Hs00973298_g1
SLC18A3	Thermo-Fisher	Hs00268179_s1
SLC5A7	Thermo-Fisher	Hs00222367_m1
ISL1	Thermo-Fisher	Hs00158126_m1
LHX3	Thermo-Fisher	Hs01033412_m1
TaqMan Human Protein Kinase Array	Thermo-Fisher	4418721
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and reagents for immunostaining:
B-III-tubulin (Tuj1)	Covance	MMS-435P	1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used.
MAP2	Sigma Aldrich	M4403	1:500
NF200	Sigma Aldrich	N4142	1:1000
GFAP	Acris Antibodies GmbH	AP02002SU-N	1:500
Nestin	Sigma-Aldrich	N5413	1:200
synaptophysin (SYN)	Abcam	AB14692	1:200
Tau	Thermo-Fisher	MA5-12808	1:100
Nrf2	Abcam	AB62352	1:200
Keap1	Abcam	AB66620	1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1)	Abcam	AB92298	1:200
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1)	Abcam	AB2346	1:200
OCT4	Millipore	MAB4401	1:100
SSEA3	Millipore	MAB4303	1:100
Tra1-60	Millipore	MAB4360	1:250
Tyrosine hydroxylase (TH)	Millipore	AB152	1:200
Gamma-aminobutyric acid (GABA)	Sigma-Aldrich	A0310	1:100
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1)	Abcam	AB72311	1:500
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	4% (4% formaldehyde can also be used)
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fisher	14190144
Triton-X-100 Solution	Sigma-Aldrich	93443-100ML	0.1%
BSA 35%	Sigma-Aldrich	A7979-50ML	3.5%
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10040	1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser.
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10166	1:500
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10086	1:500
DAPI Solution (1 mg/mL)	Thermo-Fisher	62248	1:1000 (Step 5.2.7)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA):
4E-BP1 (S65)	Abcam	AB81297	1:250 (Note after step 5.2.8)
Akt (T308)	Cell Signaling	9275	1:100
Akt (S473)	Cell Signaling	9271	1:100
AMPKalpha (T172)	Cell Signaling	2531	1:100
AMPKbeta1 (S108)	Cell Signaling	4181	1:100
ATF-2 (T71)	Cell Signaling	9221	1:100
c-Jun (S63)	Cell Signaling	9261	1:200
c-Jun (S73)	Cell Signaling	9164	1:200
c-Kit (Y719)	Cell Signaling	3391	1:250
CREB (S133)	Cell Signaling	9191	1:100
EGFR (Y1068)	Cell Signaling	2234	1:50
ErbB2/HER2 (Y1248)	Cell Signaling	2247	1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204)	Cell Signaling	9101	1:2000
GSK-3alpha (S21)	Cell Signaling	9337	1:50
Jak1 (Y1022/1023)	Cell Signaling	3331	1:100
Lck (Y505)	Cell Signaling	2751	1:500
LKB1 (S428)	Cell Signaling	3051	1:100
mTOR (S2448)	Cell Signaling	5536	1:100
NFkB p65 (S536)	Cell Signaling	3031	1:50
p70 S6 Kinase (T389)	Cell Signaling	9205	1:200
PDK1 (S241)	Cell Signaling	3061	1:100
PKA C (T197)	Cell Signaling	4781	1:250
PRAS40 (T246)	BioSource	44-1100	1:2000
PTEN (S380)	Cell Signaling	9551	1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428)	Cell Signaling	9511	1:500
Src (Y527)	Cell Signaling	2105	1:500
Src Family (Y416)	Cell Signaling	2101	1:200
Stat1 (Y701)	Cell Signaling	9171	1:200
Stat3 (S727)	Cell Signaling	9134	1:200
Zap-70 (Y319)	Enogene	E011159	1:100
βCatenin (S33/37/T41)	Cell Signaling	9561	1:250
CREB	Upstate Biotechnologies	06-863	1:100
Fos B	Cell Signaling	2251	1:200
GRB2	Cell Signaling	3972	1:2000
HSP70	Stressgen	SPA-810	1:100
c-Jun	Cell Signaling	9165	1:100
Kip1/p27	BD	610241	1:100
Lck	Cell Signaling	2984	1:250
Mcl-1	Cell Signaling	4572	1:80
Musashi	Cell Signaling	2154	1:100
NOTCH1	Cell Signaling	3439	1:100
PTEN	Cell Signaling	9552	1:500
SGK1	Abnova	PAB4590	1:250
Zap-70	Cell Signaling	2705	1:250
β-Catenin	Abcam	AB32572	1:1000
Dll4	Abcam	AB7280	1:500
Shh	Abcam	AB53281	1:250
HIF-1α	BD	610958	1:50
NUMB PAN-ISO	Upstate Biotechnologies	07-207	1:400
NUMB-L	Chemicon	AB15145	1:750
Cyclin B	BD	610220	1:75
c-Myc	Calbiochem	OP-10	1:100
BCIP/NBT Kit	Thermo-Fisher	002209	(Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for Flow Cytometry:
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate	Thermo-Fisher	MHCD1528	1:100 (Note after step 5.2.8)
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	SSEA421	1:100
Name	Company	Catalog number	Comments
Specific instruments, tools and softwares:
Countess Automated Cell Counter	Thermo-Fisher	C10227	Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used.
MEA1060-Inv-BC	Multichannel Systems	MEA1060-Inv-BC	(Step 5.3)
MEA1060-BC control software	Multichannel Systems	MEA1060-BC	(Step 5.3)
NeuroExplorer	Multichannel Systems	NeuroExplorer (NE)	(Step 5.3) For post-processing of MEA data
Multielectrode arrays (MEA)	Multichannel Systems	60MEA100/10iR-Ti-gr	(Step 5.3) Single-well MEA chip
ArrayScan XTI High Content Platform	Thermo-Fisher	ASN00002P	(Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition
7900HT Fast Real-Time PCR System	Thermo-Fisher	4351405	(Step 5.1.6)
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle)	BD	328280	(Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1)
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool	ThermoFisher	23181010	This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1)
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm)	Corning	10010582	(Step 2.1.8) Also other brands can be used.
Mr. Frosty Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562-1EA