Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokol for differensiering av humane inducerte pluripotente stamceller i blandede kulturer av neuroner og glia for test av neurotoxicitet

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55702
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Directorate F - Health, Consumers and Reference Materials, Joint Research Centre

Summary

Menneskeinducerte pluripotente stamceller (hiPSCs) anses som et kraftig verktøy for stoff- og kjemisk screening og for utvikling av nye in vitro- modeller for toksisitetstesting, inkludert nevrotoksisitet. Her beskrives en detaljert protokoll for differensiering av hiPSCs i nevroner og glia.

Abstract

Humane pluripotente stamceller kan differensiere til forskjellige celletyper som kan brukes på humane-baserte in vitro toksisitetsanalyser. En stor fordel er at omprogrammeringen av somatiske celler for å produsere humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) unngår de etiske og lovgivningsmessige problemene knyttet til bruken av humane embryonale stamceller (hESCs). HiPSCs kan utvides og effektivt differensieres til forskjellige typer nevrale og glialceller, som tjener som testsystemer for toksisitetstesting, og spesielt for vurdering av forskjellige veier involvert i nevrotoksisitet. Dette arbeidet beskriver en protokoll for differensiering av hiPSCs i blandede kulturer av nevron- og glialceller. Signalveiene som er regulert og / eller aktivert ved neuronal differensiering er definert. Denne informasjonen er kritisk for anvendelsen av cellemodellen til det nye toksisitetsprøveparadigmet, der kjemikalier vurderes ut fra deres evne til å peRturb biologiske veier. Som et bevis på konseptet ble rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, brukt til å vurdere aktiveringen av Nrf2 signalveien, en nøkkelregulator av antioksidant-respons-elementet (ARE) -driven cellulær forsvarsmekanisme mot oksidativ stress .

Introduction

Den amerikanske forskningsrådets rapport 1 forestilte et nytt toksisitetsprøveparadigm hvor reguleringstoksisitetstesting skulle forskyves fra en tilnærming som baserer seg på fenotypiske endringer observert hos dyr til en tilnærming som fokuserer på mekanistiske in vitro- analyser ved bruk av humane celler. Pluripotente stamceller (PSC) derivater kan representere alternativer til kreftcellemodeller, da de oppnådde celler kan ligner de fysiologiske tilstandene av humane vev og gi mer relevante verktøy for å studere kjemisk fremkalte bivirkninger. De to hovedtyper av PSC-kulturer som er mest lovende for toksisitetstesting er humane embryonale stamceller (hESCs) og humant induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), som for tiden er mye brukt innen grunnforskning og regenerativ medisin 2 , 3 . Denne kompetansen kan nå utnyttes for utvikling av en ny klasse toxicoloGiske in vitro tester med sikte på å identifisere de forstyrrede fysiologiske banene som er involvert i utviklingen av bivirkninger in vivo . Testmetoder for reguleringssikkerhetsvurderinger basert på hESCs vil imidlertid ikke sannsynligvis bli akseptert av alle EU-landene og landene over hele verden på grunn av mulige etiske bekymringer og ulike nasjonale lovgivningspolitikker som regulerer bruken av embryoavledede celler.

HiPSCs deler egenskaper som ligner hESCs 4 , 5 og har stort potensial for in vitro- metoder, både for å identifisere terapeutiske mål, samt for sikkerhetsvurderinger. I tillegg reduserer hiPSC-teknologien begrensningene i et begrenset donorbasseng og de etiske problemene knyttet til embryo-avledede celler. En stor utfordring for hiPSC er demonstrasjonen om at disse cellene reproduserbart kan danne et betydelig utvalg av toksikologisk relevante cellederivater,Med egenskaper og responser som er typiske for humane vev. Forhåndsdefinerte nivåer av de valgte markørene brukes vanligvis til å karakterisere cellepopulasjoner etter differensieringsprosessen og å gi innsikt i stabiliteten av differensieringsprosessen.

Tidligere arbeider evaluerte egnethet av hiPSCs for å generere blandede kulturer av nevron- og glialceller og for å vurdere effekten av rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, ved aktivering av Nrf2-banen, en nøkkelregulator for antioksidant-forsvarsmekanismer i Mange celletyper 6 , 7 .

Dette arbeidet beskriver en protokoll som brukes for differensiering av hiPSCs i blandede nevron- og glialkulturer, og gir detaljer om signalveiene (gen- og proteinnivå) som aktiveres ved neuronal / glialdifferensiering. I tillegg viser arbeidet representative resultater som viser hvordan detteHiPSC-avledet nevron- og glialcellemodell kan brukes til å vurdere Nrf2-signalaktivisering indusert ved akutt (24-h) behandling med rotenon, som muliggjør vurdering av oksidativ stressinduksjon.

IMR90 fibroblaster ble omprogrammert til hiPSCs ved I-Stem (Frankrike) ved viral transduksjon av 2 transkripsjonsfaktorer (okt4 og sox2) ved anvendelse av pMIG vektorer 6 . Analoge HiPSC-modeller kan også brukes. Protokollene beskrevet nedenfor oppsummerer alle stadier av differensiering av hiPSCs i neurale stamceller (NSC) og videre inn i blandede kulturer av postmittotiske nevroner og glialceller (trinn 1 og 2, se også EURL ECVAM DBALM-nettsiden for en detaljert beskrivelse av Protokollen) 8 .

En tilleggsprotokoll for isolering, utvidelse, kryopreservering og videre differensiering av NSC i blandede nevroner og glialceller er beskrevet i trinn 3 og 4 (se også EURL ECVAM DBALM viBsite for en detaljert beskrivelse av denne protokollen) 9 . Trinn 5 beskriver analysene som kan gjøres for å vurdere cellens fenotypiske identitet under de flere stadier av engasjement og differensiering.

Protocol

1. Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Expansion

MERK: HiPSCs kan dyrkes på et egnet proteinblandesubstrat i nærvær av mTeSR1 medium som inneholder mTeSR1 5x kosttilskudd (utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner, plate ~ 100 kolonifragmenter / 60 mm petriskål). Når hiPSC-koloniene når en passende størrelse (se et eksempel på en koloni i figur 2A ), passerer cellene som beskrevet nedenfor (en gang i uken).

  1. Coatfat med hESC-kvalifisert kjellermembranmatrise (heretter kalt "kvalifisert matrise") eller et hvilket som helst annet egnet proteinsubstrat.
    1. Oppbevar den kvalifiserte matrisen (se Materialetabell ) ved -80 ° C i 200 μl alikvoter i kalde 1,5 ml rør og kalde 5 eller 10 ml pipetter.
    2. Tør opp 200 μL kvalifisert matrise på is før passasje.
    3. Fortynn 200 μl kvalifisert matrise i 20 mL DMEM / F12 medium (1: 100 fortynning).
    4. Coat 60 mm petriskål med denne løsningen (5 ml / tallerken).
    5. Inkubér belagte retter ved 37 ° C i minst 1 time.
  2. HiPSC-koloni-fragmentet kryopreservering og opptining
    1. Etter kutting av hiPSC-koloniene (se trinn 1.3 for hiPSC-kolonisnitprosedyren) resuspenderes hiSHC-kolonifragmentene forsiktig og langsomt i stamcellefrysemedium, ~ 100 fragmenter / 250 μl (se Materialetabellen).
    2. Aliquot kolonifragmentene i passende hetteglass for kryopreservering (250 μl / hetteglass).
    3. Plasser hetteglassene i en beholder fylt med 2-propanol og plasser beholderen ved -80 ° C i minst 2 timer og opptil 2 uker.
    4. Overfør hetteglassene i dampfasen av en flytende nitrogentank.
    5. For å starte kulturen på nytt, tine 1 frosset hetteglass i vannbad ved 37 ° C.
    6. Hent forsiktig hiPSC-kolonifragmentene i 7 ml forvarmet komplett hiPSCMedium (se Materialetabell ) i et 15 ml rør ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    7. Sentrifug hiPSC-kolonifragmentene ved 130 xg i 3 min.
    8. Fjern supernatanten og forsiktig resuspenge hiPSC koloni fragmentene i 1 ml komplett hiPSC medium ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    9. Videre fortynn cellesuspensjonen i 3 eller 4 ml komplett hiPSC medium.
    10. Plasser hiPSC-kolonifragmentene i en kvalifisert matrisen-belagt 60 mm petriskål (~ 100 fragmenter / tallerken; beleg oppvasken som beskrevet i trinn 1.1).
    11. Inkubér hiPSCene ved 37 ° C og 5% CO2.
    12. Utfør totalt gjennomsnittlig forandring hver dag.
  3. Passering av hiPSC koloniene
    MERK: Uendifferentierte hiPSCs skal være runde i form, med store nukleoler og uten rikelig cytoplasma. Utifferentierte kolonier bør karakteriseres av en flat og tett pakket morfologi. Kun utifferentierte kolonier (ca. 1 mm iN diameter) skal kuttes for videre passering.
    1. Klipp stamcellekolonier i firkanter på ca. 200 μm x 200 μm ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 30 G nål eller andre kommersielt tilgjengelige verktøy (se Materialebordet). Bruk et stereoskopisk mikroskop ved 4x forstørrelse i et laminarflytskap ved romtemperatur.
    2. Løs kolonifragmentene fra oppvaskflaten ved hjelp av en pipette på 200 μl ved å pipette mediet forsiktig under for å løfte brikkene.
    3. Overfør kolonifragmentene (~ 100 stykker) til en kvalifisert matriks-DMEM / F12-belagt plate fylt med 4 ml komplett hiPSC-medium (se Materialetabellen; beleg oppvasken som beskrevet i trinn 1.1).
    4. Inkubér den nye platen / platene ved 37 ° C og 5% CO 2 .
    5. Utfør en total medium forandring hver dag og inspiser koloniernes morfologi ved hjelp av et fasekontrastmikroskop ved 4X og 10X forstørrelser.

2. HiPSC DiffereNtiation i blandede neuroner og glia

MERK: Prosedyren tar omtrent 28 dager å fullføre, med hovedtrinnene som er skissert i Figur 1 (øverste del).

Figur 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av den neuronale differensieringsprotokollen. (Øvre del) IMR90-hiPSC kolonier kan kuttes i fragmenter for å danne embryoidlegemer (EBs). Etter 2 døgn in vitro (DIV) kan EB-plater bli plettet på laminin- eller standardmatriks-belagte retter og dyrket i nærvær av nevro-cytitelial induksjon (NRI) medium for å generere neuroektodermale derivater (rosettes, her farget for nestin (grønn) og p -III-tubulin (rødt)). Rosetter kan dissosieres, samles, repliseres på laminin- eller standardmatrise-belagte retter, og videre differensieres til modne nevron (NF200, rød) og glial(GFAP, grønn) celler i nærvær av neuronal differensiering (ND) medium. (Nesten) rosett-avledede NSC (nestin, rød) kan ekspanderes i nærvær av neural induksjon (NI) medium, kryopreservert eller videre differensiert i nærvær av ND-medium for å danne blandet nevronalt (NF200, grønt) og glial GFAP, rød) kulturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Generering av embryoidlegemer (EBs) (Dager 0 → 1)
    MERK: Denne prosedyren krever god manuell ferdighet og presisjon. HiPSC-kolonifragmenter bør være like store for å oppnå homogene embryoidlegemer (EBs) i de neste trinnene. Morfologisk differensierte kolonier (med store cytoplasmatiske fraksjoner og små nukleoler) bør kastes.
    1. Oppdater hiPSC-mediumet (3 ml / 60 mm petriskål) før kutte de utifferentierte hiPSC-koloniene (ca. 1 mm i diameterEter, se figur 2A ) under sterile betingelser (som beskrevet i trinn 1).
    2. Klipp de utifferentierte koloniene (som vist på figur 2A og figur 2B ) i fragmenter på omtrent 200 μm x 200 μm ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 30 G nål. Bruk et stereoskopisk mikroskop ved 4X forstørrelse i et laminar strømkabinett ved romtemperatur.
    3. Løs kolonifragmentene fra oppvaskflaten ved hjelp av en pipette på 200 μl ved forsiktig pipetteringsmedium under for å løfte brikkene.
    4. Overfør alle frittliggende fragmenter og mediet til et 15 ml rør ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    5. Skyll parabolen med 2 ml komplett hiPSC medium for å gjenvinne alle fragmenter.
    6. Sentrifuge ved 112 xg i 1 min.
    7. Aspirer supernatanten og forsiktig resuspender fragmentene i 5 ml komplett hiPSC EB medium (se Materialebordet ).
    8. Plate coLonyfragmenter i en 60 mm ultrafylt feste Petriskål (5 ml / 60 mm petriskål).
    9. Inkubér petriskålen over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
    10. På neste dag (Dag 1) samler du EBs og deres medium i et 15 ml rør ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    11. Sentrifuger EBs ved 112 xg i 1 min.
    12. Sug forsiktig supernatanten og resuspender EBs forsiktig i 5 ml komplett hiPSC EB medium ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    13. Bytt EBs på en ny 60 mm ultra-lav vedlegg petriskål (5 ml / 60 mm petriskål).
    14. Inkubér petriskålen over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. På dag 1, beleg oppvasken med kjellermembranmatrise ( f.eks . Matrigel, referert til som "standardmatrise") eller et hvilket som helst annet egnet protein substrat ( f.eks . Laminin).
    1. Oppbevar standardmatrisen (se Materialetabellen ) ved -80 ° C200 μl alikvoter ved bruk av kolde 1,5 ml rør og kalde 5 eller 10 ml pipetter.
    2. Tine 200 μL standardmatrise på is.
    3. Fortynn 200 μl standardmatrise i 20 ml DMEM / F12 medium (1: 100 fortynning).
    4. Coat 60 mm petriskål med denne løsningen (5 ml / tallerken).
    5. Inkubér de belagte oppvaskene ved 37 ° C over natten.
      MERK: Disse rettene vil bli brukt til å plate EBs (ca. 50 EBs / tallerken) og generere neuroepithelial aggregater (rosettes); Se trinn 2.3.
  3. Generering av neuroepithelialaggregater (rosettes) (Dager 2 → 7)
    1. På dag 2, fjern standardmatrixbeleggløsningen fra 60 mm petriskålene (ikke skylle platen) og fyll dem med 5 ml / tallerken med komplett nevrolytialial induksjonsmedium (NRI); Se Materialebordet .
    2. Overfør de flytende EB-ene (fra trinn 2.1.14) til belagte retter (~ 50 EBs / tallerken) ved hjelp av en 200 μL pipett under en stereoskopisk miCroscope ved 4x forstørrelse og plassert i et laminar strømkabinett.
      MERK: Det er avgjørende å velge homogene, mellomstore EB'er (~ 200-300 μm i diameter). For små EB-er kan ikke overleve godt under neuroektodermal differensiering, mens for store EB'er pleier å gjennomgå kjerne nekrose.
    3. Inkubér oppvaskene ved 37 ° C og 5% CO2.
    4. Dagen etter (Dag 3), kontroller oppvaskene under mikroskopet ved 10x forstørrelse for å sikre at EBs er alle festet.
    5. Forsiktig utfør en total medium endring med komplett NRI medium.
    6. Endre NRI-mediet annenhver dag frem til dag 7, da nevrolytiske aggregater (rosettes) skal være synlige.
    7. På dag 7, blekkmatrise (eller laminin), som beskrevet i trinn 2.2, på et hvilket som helst ønsket plate eller tallerkenformat: 96-brønnsplater (100 μl / brønn), brønner med 24 brønner (250 μl / brønn), 12- Brønnplater (500 μl / brønn), MEA-sjetonger (for elektrisk aktivitet, 1 ml / brønn med en brønn) eller 60 mm petri disheS (4 ml / tallerken).
    8. Inkubér de belagte platene / tallerkene i minst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Rosette dissosiasjon og neuronal differensiering (Dager 8 → 28)
    MERK: Denne prosedyren krever god manuell ferdighet og presisjon. For å unngå å samle mesodermale og endodermale celler, bør bare ektoderm-rosettlignende strukturer dissosieres og samles.
    1. På dag 8 kuttes de rosettlignende strukturer i fragmenter under et stereoskopisk mikroskop ved 10X forstørrelse i sterile forhold. Bruk en 1 ml sprøyte med en 30 G nål. Legg merke til at rosetter tendens til å løsne lett fra fatet når det berøres med nålen.
    2. Fullfør løsningen av rosettfragmentene ved hjelp av en pipette på 200 μl.
    3. Overfør parabolen under laminarstrømshetten og samle rosettfragmentene og deres medium i et 15 ml konisk rør ved hjelp av en 1, 2 eller 5 ml pipette. Skyll parabolen med 2 ml NRI-medium for å gjenvinneAlle fragmenter.
    4. Spinn ned rosettfragmentene ved 112 xg i 2 minutter.
    5. Aspirer supernatanten.
    6. Resuspender pelleten forsiktig i 1 ml 1x DPBS (uten kalsium og magnesium) og pipett rosettfragmentene forsiktig opp og ned ved hjelp av en 1000-l pipett for å delvis dissociere dem.
    7. Tilsett 4 ml komplett NRI-medium og teller cellene ved hjelp av trypanblått og en automatisert celleteller (se Materialetabellen )
      MERK: Fortynn 20 μl cellesuspensjon i 20 μl Trypanblå. Dette trinnet kan utelates hvis cellene ikke kan bringes inn i en enkeltcellesuspensjon. Hvis rosettfragmentene ikke ser helt dissocierte, kan rosettefragmenter avledet fra ca. 50 EBs / 60 mm fat resuspenderes i 50 ml komplett NRI-medium og belagt som angitt i tabell 1 .
    8. Aspirer standardmatrisen (eller laminin) beleggoppløsningen fra petriskålene, platene og / eller MEA-sjetongene (fra trinn 2.3.7). Ikke la dem tørke.
    9. Plate cellene i komplett NRI medium i henhold til studieplanen (ca. 15.000 celler / cm2, se tabell 1 for plating volum indikasjoner).
    10. Inkubér platene over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
    11. På dag 10 utfører du en total medium endring ved hjelp av komplett neuronal differensieringsmedium (ND); Se Materialebordet.
    12. Oppdater det komplette ND-mediet to ganger i uken til dag 28.
    13. Karakteriser neuronal / glialcellederivatene, som beskrevet i trinn 5 (se tabell 2 for generelle akseptkriterier).

3. HiPSC-avledet neural stamcelle (NSC) utvidelse og differensiering i blandede neuroner og glia

MERK: NSCer avledet fra rosettfragmenter kan utvides og opprettholdes ved å følge fremgangsmåten beskrevet nedenfor ( Figur 1 , nedre del). Dette gjør det mulig å øke thE antall celler for differensiering og kjemisk testing.

  1. Påfør en 60 mm petriskål (eller en T-25-kolbe) med 5 ml standardmatrix DMEM / F12 beleggløsning og inkuber den i minst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2 (som beskrevet i trinn 2.2).
  2. Spinn ned rosettfragmentene fra trinn 1-2 (se trinn 2.4.) I et konisk 15 ml rør ved 112 xg i 2 minutter.
  3. Resuspender pelleten forsiktig i 5 ml nevralt induksjonsmedium (NI); Se Materialebordet.
  4. Overfør cellene på en standardmatrisk belagt 60 mm petriskål (eller T-25 kolbe).
  5. Kultur-roset-avledede NSC'er i nærvær av NI-medium, forfriskende mediet annenhver dag til cellene når sammenflytelse.
  6. Når konfluent, passerer NSC som beskrevet i de følgende trinnene.
    MERK: Passere NSCs om en gang i uken; Vurdere å bruke ferskt belagte retter, kolber eller plater, avhengig av studieplanen.
  7. Fjern komplett NI medium og gentlSkyll NSC med DPBS (uten kalsium og magnesium).
  8. Tilsett 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA forvarmet til 37 ° C til 60 mm petriskålen (eller T-25-kolben) som inneholder cellene og plasser den i inkubatoren i 1 min.
  9. Trykk forsiktig på fatet (eller kolben) for å løsne cellene.
  10. Tilsett 1,5 ml trypsininhibitor forvarmet til 37 ° C og overfør cellene til et 15 ml rør.
  11. Skyll Petriskålen (eller T-25-kolben) med et lik volum NI-medium (1,5 ml) og samle volumet i samme 15 ml rør.
  12. Sentrifuger cellene ved 130 xg i 3 min.
  13. Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 1 ml komplett NI-medium ved bruk av en 1000 μl pipette.
  14. Videre fortynn cellesuspensjonen i 3 eller 4 ml komplett NI-medium og teller cellene ved hjelp av trypanblått og en automatisert celleteller.
  15. Plasser NSCene på 60 mm petriskålen (eller T-25-kolben) fra trinn 3.1 ved en tetthet på ca. 50 000 celler / cm 2 .
  16. Karakteriser cellene for nærvær av nevron / glialcellederivater, som beskrevet i trinn 5.
    MERK: NSCer kan differensieres til blandede kulturer av nevroner og glia i komplett ND-medium (som beskrevet i trinn 2.4.11-2.4.13), forfriskende det komplette ND-medium to ganger i uken i 21 dager.

4. HiPSC-avledet NSC-kryopreservering og opptining

MERK: Ved passering kan NSCs fryses og gjenopptas etter denne prosedyren.

  1. Sentrifuge passasjert NSC (fra trinn 3.12) ved 130 xg i 3 min.
    MERK: Cellene skal telles i trinn 3.14.
  2. Forsiktig og langsomt resuspendere NSCene ved 3 x 10 6 / ml frysemiddel (se Materialebordet ).
  3. Aliquot cellene i passende hetteglass for kryopreservering (ca. 0,5 ml = 1,5 x 10 6 / hetteglass).
  4. Sett hetteglassene i en beholder fiLled med 2-propanol og plasser beholderen ved -80 ° C i minst 2 timer og opptil 2 uker.
  5. Overfør hetteglassene til dampfasen i en flytende nitrogentank.
  6. For å starte cellekulturen på nytt, tine 1 frosset hetteglass i et vannbad ved 37 ° C.
  7. Samle forsiktig cellene i 7 ml forvarmet komplett NI-medium i et 15 ml rør ved bruk av en 1000-l pipett.
  8. Sentrifuger cellene ved 130 xg i 3 min.
  9. Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 1 ml komplett NI-medium ved bruk av en 1000 μl pipette.
  10. Videre fortynnet cellesuspensjonen i 3 eller 4 ml komplett NI-medium og teller cellene ved hjelp av trypanblått og en automatisert celleteller (merk: fortynne 20 μl cellepensjon i 20 μL trypanblått, levedyktigheten etter tining skal være ≥ 80 %).
  11. Plasser NSCene i en bestrøket 60 mm petriskål (eller T25-kolbe) med en tetthet på ca. 50 000 celler / cm 2 .

5. CharaCterisering av hiPSC-avledede nevron- og glialceller

MERK: Ved differensiering kan nevrale og glialderivater karakteriseres ved bruk av forskjellige teknikker, som de som er beskrevet i de følgende avsnitt.

  1. Kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) analyser 10
    1. Spinn ned hiPSC koloni fragmenter, EBs og / eller NSCs ved 130 xg i 3 min.
    2. Resuspender cellepelletet i 100 μL kald RNA lysisbuffer gitt i et egnet sett for RNA-ekstraksjon.
    3. Alternativt kan du samle nevron / glialderivater direkte fra platene ved å aspirere mediet og tilsette kald RNA lysisbuffer til brønnene for å samle inn cellene.
    4. Isoler RNA etter produsentens instruksjon.
    5. Omvendt transkriber 500 ng av det totale RNA ved bruk av et egnet sett for RNA til cDNA retrotransskrift.
    6. Kjør qPCR reaksjoner i duplikat ved å bruke passende master mix og primerSett (se Materialebordet ).
    7. Ta opp fluorescerende utslipp i sanntid: 45 sykluser med primere annealing ved 60 ° C.
    8. Normaliser de relative RNA-mengdene til GAPDH og β-actin som referansegener og bruk utifferentierte hiPSC eller ubehandlede celler for kalibreringsbetingelsene (ΔΔCt-metode). Alternativt, bruk en annen egnet metode.
  2. Immunocytokjemi og høykvalitetsbilder (HCI) 6 , 11
    1. Fest hiPSC koloniene, NSC og / eller neuronale / glialderivater med kald 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
    2. Vask forsiktig cellene i 1X PBS og oppbevar platene ved 4 ° C i opptil 1 måned.
    3. Når det er klart for farging, permeabiliserer cellene i permeabiliseringsbufferen (1 x DPBS som inneholder 0,1% triton-X-100 og 3% BSA) i 15 minutter ved romtemperatur.
    4. Fjern permeabiliseringsbuenFfer og inkuber cellene i blokkeringsbuffer (3% BSA / 1X DPBS) i 15 minutter ved romtemperatur for å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffer.
    5. Fjern blokkeringsbufferen og inkuber cellene over natten ved 4 ° C i blokkeringsbuffer som inneholder egnede primære antistoffer (se Materialetabell ).
    6. Vask cellene 3 ganger med 1x PBS.
    7. Inkubér cellene i 45 minutter ved romtemperatur i blokkeringsbuffer som inneholder fluorokrom-konjugerte sekundære antistoffer (se Materialetabell ), motstrykning av kjernene med DAPI-fargestoff.
    8. Kvantifiser gjennomsnittlig fluorescensintensitet og relativ prosentandel av celletyper ved å bruke en egnet høyoppløselig bildeplattform, hvis tilgjengelig (se Materialetabellen ).
      NB: For å bestemme intensitetsnivået på den fluorescerende bakgrunnen inkuberer noen celler / brønner med sekundære antistoffer alene. Den flytende cytometriske analysen av levende (ikke fast), undIfferentiated hiPSCs kan utføres for å vurdere uttrykket av PSC-spesifikke markører, for eksempel SSEA4 (se Materialetabellen ). Uifferensierte hiPSC kolonier kan analyseres for alkalisk fosfataseaktivitet ved å bruke kommersielt tilgjengelige BCIP / NBT-sett, i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialebordet ). I tillegg kan analyser og analyser av reversfaseproteiner (RPPA) utføres, som beskrevet i Referanse 12 (for en liste over testede antistoffer, se Materialetabellen ).
  3. Elektrofysiologiske målinger 13
    1. Plater de dissocierte rosettefragmentene (etter 7 DIV) eller NSC-er avledet fra rosettes på belagte multielektrode-arrays (MEAs, se tabell over materialer ) i komplett ND-medium (~ 1 x 10 5 celler / enkeltbrønn MEA-brikke).
    2. Differensier cellene i 3 uker i komplett ND medium, forfriskende thE medium to ganger i uken.
    3. På slutten av differensiering, forsegl MEA-sjetongene med en semi-permeabel membran under en laminær hette for å holde kulturen steril for gjentatte målinger.
    4. Bytt ut en av elektrodene med en jordreferanse, slik at du kan ta opp fra de gjenværende elektrodene.
    5. Ta opp den gjennomsnittlige avfyringshastigheten (MFR, antall pigger / min) ved hjelp av en MEA-forsterker med den integrerte temperaturprosesskontrollen justert til 37 ° C og 5% CO 2 .
    6. Oppdag topper fra MEA-rådataene med terskelgrense på -4,7σ (σ representerer standardavviket til basalstøyen).
    7. Behandle postopptaksdataene med en passende programvare.

Representative Results

Karakterisering av utifferentierte hiPSCs

For å vurdere fenotypen av hiPSCene, bør analysen av koloni / celle morfologi, bestemmelsen av PSC-spesifikke markører og undersøkelsen av genuttrykk og alkalisk fosfataktivitet utføres. Uifferensierte hiPSCs bør være runde, med store nukleoler og uten rikelig cytoplasma. Flertallet av koloniene skal karakteriseres av en flat og tett pakket morfologi, som indikerer en utifferentiert fenotype ( Figur 2A og Figur 2B ). I tillegg bør mer enn 80% av koloniene være positive for alkalisk fosfataseaktivitetsfarging ( figur 2C ).

Ca. 80% av cellene skal være positive for klassiske pluripotensrelaterte markører, for eksempel okt4, sSEA3, SSEA4 og Tra1-60 ( Figur 2D-H ), som vist ved immuncytokjemi og strømningscytometri, mens prosentandeler av nestin + og p-lll-tubulin + celler burde være signifikant lave (ca. 8% og 3% Som vist i figur 2H ). Disse resultatene skal kunne reproduseres over passasjer.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering av ikke-differentierte IMR90-hiPSCs. (A og B) Representative fasekontrastbilder (10X og 20X forstørrelser) av utifferentierte IMR90-hiPSC kolonier. (C) representative bilder av alkaliske fosfatase-farget kolonier (4X forstørrelse). (DF) Representative immuncytokjemiske bilder av (D) Okt4 (rød), (E) SSEA3 (grønn) og (F) TrA1-60 (grønn). (G) Representativ punktplot av SSEA1 (CD15) og SSEA4-farging, analysert ved hjelp av flytcytometri. (H) Bardiagrammet viser prosentene av Oct4 + (~ 75-80%), Tra1-60 + (~ 75-80%), SSEA3 + (~ 75-80%), nestin + (~ 10-15% ) Og β-III-tubulin + (~ 3 - 7%) celler, motsatt med DAPI og kvantifisert ved HCl, med et middel på 3 til 5 biologiske replikater ± SEM (graf modifisert fra referanse 6). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Vurdering av pluripoten via EB-dannelse

HiPSC er pluripotente, noe som betyr at de uttrykker tre kimlagrelaterte gener under passende forhold. For å vurdere hiPSC pluripotency, er det mulig å bruke en fellesTilnærming basert på spontan EB-dannelse, som induserer dannelsen av de tre kimlagene 14 . Analyser av kimlagsspesifikke gener må indikere en tidsavhengig økning av endoderm (α-fetoprotein (AFP) og Cytokeratin 18 (KRT18)), ectoderm (Nestin, SRY-boks 1 (Sox1) og parret boks 6 (Pax6) ) Og mesoderm (natriuretisk peptid A (NPPA) og Brachyury-T) -relatert genuttrykk ( Figur 3A og Figur 3B ); Se Materialebordet.

Figur 3
Figur 3. Vurdering av pluripotency ved EB-dannelse. (A) Representativt fasekontrastbilde av EB på dag 1. (B) Stanggrafen viser qPCR-analyser av mesodermalt (NPPA og brachyury), ektodermalt (Pax6, Sox1 og nestin) og endodermalt (AFP og KRT18 ) Gener, normalisert til referansegenene, p-aktin og GAPDH, og kalibrert til utifferentierte celler (dag 0). Dette er ΔΔCt-metoden, med et gjennomsnitt på 5 uavhengige analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf endret fra referanse 6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Induksjon av neuronal og glial differensiering

IMR90-iPSCs kan differensieres til blandede kulturer av postmittotiske nevroner og glialceller etter trinnene som er oppsummert i figur 1 og i protokolldelene. 5-8 dager etter plating av EBs på standardmatrise- eller lamininbelagte retter i nærvær av komplett NRI-medium, bør rosettlignende strukturer begynne å bli synlige (= "Xfig"> Figur 4A). Rosetter er preget av tilstedeværelse av nestin + celler (nerveprekursorer, ~ 90%), med få β-III-tubulin + celler (engasjert neuronalceller, ~ 5 - 10%), sistnevnte lokalisert hovedsakelig i periferien av Rosettes ( figur 4B , rosettes på dag 12).

Ved rosette-dissosiasjon og replisering på laminin- eller standardmatrise-belagte retter eller plater i nærvær av komplett ND-medium, begynner cellene å bli differensiert i blandede kulturer av nevroner og glia, som progressivt danner klaser av nevroncellelegemer som er forbundet med bunter av nevreter ( figur 4C og figur 4D ). Lignende resultater bør oppnås ved analyse av nevronpopulasjoner oppnådd ved å utvide rosett-avledede NSC og differensiere dem til nevroner og glia. NSCs utvidet fra rosetter bør være nEstin + ( figur 4E , innsett som viser nestin + celler).

Etter 21 dagers differensiering bør cellene være positive for p-III-tubulin; NF200; Tau; Og MAP2, den sentrale markøren for dendriter ( Figur 4D , 4F og Figur 4H), med minst 10-15% av cellene positive for glialfibrillære sure proteinet (GFAP), en astroglial markør ( Figur 4G og Figur 4H) . Videre bør ~ 20-30% av cellene beholde ekspresjonen av nestin etter differensiering ( Figur 4H ). Det er viktig å vurdere at prosentandelen av hver celletype ( dvs. neuron, astrocyt, nestin + celler) kan variere over passasjer, og brukeravhengig variasjon kan observeres.

Ved å analysere spesifikke neuronale subpopulasjoner, representerer GABAergic nevronerSendte ~ 15-20% av de totale cellene, dopaminerge neuroner ~ 13-20% og glutamatergiske nevroner ~ 35-42%, som vist ved immunfarging for gamma-aminosmørsyre (GABA), tyrosinhydroksylase (TH) og vesikulært glutamat Transportør 1 (VGlut1), henholdsvis (se representativ kvantifisering i figur 4H ). Induksjon av differensiering kan også vurderes ved analyse av pluripotensrelaterte markører ( f.eks. Okt4, Tra1-60 og SSEA3), som bør være signifikant nedregulert i differensierte celler versus utifferentierte hiPSCs (ikke vist, se referanse 6). Dette kan også bekreftes ved analyse av genuttrykk av qPCR, som skulle indikere en reduksjon av okt4 og nanog og oppregulering av nevrongener, slik som nevracellens adhesjonsmolekyl 1 (NCAM1) og mikrotubulærassosiert protein 2 (MAP2); Det presynaptiske genet, synaptofysin (SYP); Og det postsynaptiske genet, mikrotubulær assosiert protein tau (MAPT), som vist i < Sterk klasse = "xfig"> Figur 4I. Videre er dopaminerge (TH og NR4A1), noradrenerge (PHOX2A og PHOX2B), glutamatergiske (NARG2, GRIA1 og GAP43), GABAergic (GABRA1 og GABRA3), motorneuroner (ISL1 og LHX3) og kolinergiske (SLC5A7 og SLC18A13) -relaterte gener Resulterer i oppregulerte nevronceller sammenlignet med utifferentierte celler ( figur 4J ).

Analysen av spontan elektrisk aktivitet, ved hjelp av MEA, er en verdifull lesing for å vurdere funksjonaliteten til nevronnettverket i differensierte hiPSCs. På slutten av differensieringsperioden karakteriseres nevronderivater generelt ved en gjennomsnittlig brennhastighet (MFR) på minst 60 pigger / min (se representativ rasterplott i figur 4K ). Imidlertid observeres ikke brister.

55702fig4.jpg "/>
Figur 4. Differensiering av IMR90-hiPSCs i blandede kulturer av neuroner og glia. (A og B) Representative bilder av rosetter etter 7 DIV (A) og etter 12 DIV (B) , farget for nestin (grønn) og β-III-tubulin (rød)). (C og D) Representative bilder av differensierte celler etter 22 DIV (C) og 28 DIV (D) , farget for β-III-tubulin (rødt) og NF200 (grønt)). (E) Representativt bilde av NSC som er avledet fra rosette dissosiasjon og ekspansjon (innsett viser nestin + celler, rød). (F og G) Representative bilder av nevronceller ( F , farget for NF200 (rødt) og Tau (grønt)) og glialceller ( G , farget for GFAP (rødt)) differensiert fra NSCs (etter 21 DIV). (H) Kvantifisering av nestin, MAP2, GFAP, gamma-aminosmørsyre (GABA), vesikulær glutamattransportør 1 (VGlut1) og tyrosinhydroksylase (TH) -positive celler ved hjelp av HCI, sammenligne IMR90-hiPSC-derivater og celler differensiert fra IMR90-hiPSC-avledede NSC'er (graf modifisert fra referanse 7). (I og J) Bargrafer som viser qPCR-analyser av pluripotensgener (okt4 og nanog) og neuronale gener (NCAM1, MAP2, SYP og MAPT) (I) og av dopaminerge (TH og NR4A1), noradrenerge (PHOX2A og PHOX2B), Glutamatergisk (NARG2, GRIA1 og GAP43), GABAergic (GABRA1 og GABRA3), motorneuron (ISL1 og LHX3) og kolinerg (SLC5A7 og SLC18A13) -relaterte gener (J) . Alle analyser ble normalisert til referansegenene, β-aktin og GAPDH, og kalibrert til utifferentierte celler (grønne stenger). Dette er ΔΔCt-metoden, med et gjennomsnitt på 5 uavhengige analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Grafer i I og J ble modifisert fra Referanse 6. (K) Representativ rasterplott av IMR90-NSC-avledet neurOns (opptaket ble utført i minst 600 s, de vertikale stolpene representerer enkle pigger). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En spesifikk signatur av neuronmarkører er oppregulert i differensierte IMR90-hiPSCs

I det nye toksisitetsprøveparadigmet er det viktig å definere molekylære og cellulære hendelser som forekommer i en celle etter eksponering for et gitt giftmiddel. Derfor er det aktuelt å karakterisere hvilke signalveier som aktiveres og / eller oppreguleres innenfor den mobile modellen som undersøkes.

Kommercielt tilgjengelige arrays for analysene av proteinkinase-genuttrykk kan brukes til å sammenligne utifferentierte hiPSCs versus differensierte celler. differenTierte IMR90-hiPSCs gjennomgår oppregulering av gener som er involvert i kontrollen av neurotropinreceptorer, aksonveiledningsregulering, neurit utvoksningsmodulasjon, glial-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF) reseptorer, benmorfogenetisk protein (BMP) / TGF-beta-bane og blodplate- Avledede vekstfaktor (PDGF) reseptorer ( Figur 5A og Figur 5B ).

Analysen av RPPA viser oppreguleringen av en spesifikk neuronal signatur i differensierte IMR90-hiPSCs. Spesielt er Erk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR og Notch1 signalveier aktivert ved differensiering ( Figur 5C ).

Figur 5
Figur 5. Differensierte neuronale og glialceller viser aktiveringen av Neuron-relaterte veier. (ENOg B) Bargrafer rapporterer qPCR-analysene av nevronrelaterte kinaser (A) og andre kinase-relaterte gener (B) . Gene ekspresjonsdata ble normalisert til referansegenene 18S og GAPDH (angitt i gruppen) og kalibrert til utifferentierte celler. For disse analysene ble et gen ansett å være betydelig oppregulert når ekspresjonen var minst 2x høyere enn i utifferentierte celler (2 -ΔΔCt ≥ 2); Gjennomsnitt av 3 uavhengige analyser ± SEM). (C) Stanggrafen viser de absolutte proteinkvantifikasjonene ved hjelp av RPPA-analyse, sammenligne differensierte (røde stenger) og utifferentierte celler (grønne stenger). Proteinene som tilhører de samme signaleringsbanekaskader er gruppert sammen som følger: CREB / Erk / Akt, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh og Wnt, SAPK / JNK og BMP / SMAD. Mean ± SEM av 4 uavhengige analyser. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf modifisert fRom Referanse 6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

IMR90-hiPSC-avledede nevron / glialkulturer kan brukes til å vurdere effekten av rotenon

Rotenon, en inhibitor av kompleks I i mitokondriell respiratorisk kjede, er kjent for å forårsake oksidativt stress ved å utløse aktiveringen av Nrf2-banen. Under hvilende forhold er Nrf2 forankret i cytoplasmaet av Keap1 (Kelch-lignende ECH-assosiert protein 1), en Nrf2-repressor, som letter nrf2 ubiquitinering og proteolyse 15 . Ved induksjon av oksidativt stress translaterer Nrf2 inn i kjernen og aktiverer ekspresjonen av Nrf2-ARE målgener 16 .

IMR90-hiPSC-avledede nevroner ogD glialceller kan brukes til å vurdere effekten av rotenon på Nrf2-aktivering ved å utsette cellene for forskjellige konsentrasjoner av rotenon ( f.eks. 1, 10 og 100 nM) i 24 timer. Disse konsentrasjonene ble etablert i henhold til tidligere studier 17 , 18 .

Ved disse konsentrasjoner og eksponeringstidene resulterte ikke rotenon i cytotoksisitet, som vist ved kvantifisering av levende DAPI + -cellekjerner ( figur 6A ). Rotenon indusert Nrf2-nukleær translokasjon, spesielt etter å ha eksponert cellene til 100 nM rotenon ( figur 6B og figur 6E ). Ved samme konsentrasjon ble det observert en signifikant reduksjon i cytoplasmatisk Keap1 ( figur 6C ), sammen med en økning i både NAD (P) H kinonoksydoreduktase 1 (NQO1) og Sulfiredoxin 1 (SRXN1), to Nrf2-mål enZymes 19 , 20 ( figur 6D ).

Figur 6
Figur 6. Effekt av Rotenone på Nrf2 Nuclear Translocation, Keap1, SRXN1 og NQO1 protein nivåer. (A) Kvantifisering av levende DAPI + -celler ( dvs. ikke-pyknotiske kjerner) ved 24 timer behandling med 1, 10, 100 nM rotenon og normalisert til ubehandlede celler (Control, Ctr). (B) NF2-proteinkjernetranslokasjon ( dvs. kjernefysiske / cytoplasmiske forhold) etter 24 timers eksponering for rotenon, vurdert ved målinger av fluorescensintensitet ved bruk av HCI-analyse. (C) Kvantifisering av cytoplasmatiske Keap1-proteinnivåer ved rotenonbehandling, vurdert ved HCl-analyse. (D) Kvantifisering av NAD (P) H kinon oksidoreduktase 1 (NQO1) og SulfiRedoxin 1 (SRXN1) ved hjelp av immunofluorescens og HCI etter 24 timers behandling med rotenon. (E) Representative bilder av Nrf2 protein lokalisering (grønn). Alle verdier er vist som gjennomsnittlig ± SEM av 3 biologiske replikater. * P <0,05, ** p <0,01; Figur endret fra referanse 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved disse konsentrasjoner og behandlingstidene fremkalte rotenon også en konsentrasjonsavhengig økning av den aggrosentale (GFAP + ) celleprosenten ( Figur 7A og Figur 7B ) uten å påvirke proporsjonene av NSC (nestin + ) og nevroner (MAP2 + ) 7B ). Ved å se på proporsjoner av spesifikke neuronale subtyper, behandles rotenonbehandling (10 nM og 100 nM)Signifikant redusert antall dopaminerge neuroner (TH + ) ( Figur 7C og D ), mens prosentandelen GABAergic (GABA + ) og glutamatergic (VGlut1 + ) -neuroner ikke endret seg ( Figur 7D ). Analogt har tidligere in vivo og in vitro- studier beskrevet en rotenon-avhengig og selektiv dopaminerg neuronal celledød 21 , 22 , 23 .

Figur 7
Figur 7. Effekter av Rotenone på glialceller og dopaminerge neuroner. (A) Representative bilder av GFAP + -celler (rød), med 40X forstørrelse i innleggene, ubehandlet eller behandlet med 100 nM rotenon i 24 timer. (B) Kvantifisering Av nestin + , MAP2 + og GFAP + celler, normalisert til ubehandlede celler (kontroll, Ctr). (C) Representative bilder av dopaminerge TH + nevroner (grønn), med 40X forstørrelse i innsatsene, ubehandlet eller behandlet med 100 nM rotenon i 24 timer. (D) Kvantifisering av GABA + , VGlut1 + og TH + nevonceller, normalisert til ubehandlede celler (Ctr). Alle verdier er vist som gjennomsnittlig ± SEM av 3 biologiske replikater. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figur endret fra referanse 7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Statistisk signifikans ble vurdert ved enveis ANOVA med Dunnetts Multiple Comparison Test som en posttest (sammenligner alle kolonnene mot kontroll kolonnen)Xref "> 24 eller med to-tailed unpaired eller paired t-test i henhold til type analyse. Alle data representerer gjennomsnittet av minst tre biologiske replikater ± standardfeilen til gjennomsnittet (SEM). En stjerne over en bar indikerer En signifikant forskjell med kontrollgruppen. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Tabell 1.
Merknad om dissosiert rosettplettertetthet: Hvis rosettefragmenter ikke ser helt dissocierte, for å nå en celleplettertetthet på ca. 15.000 celler / cm2, kan dissosierte rosettesfragmenter som kommer fra ca. 50 EBs / 1 x 60 mm parabolen resuspenderes i 50 ml komplett NRI-medium og belagt som følger (avhengig av plateformatet):

Multiwell plater / MEA Vekstområde (cm 2 Volum av cellesuspensjon til plate per brønn (eller MEA-chip) Maksimalt antall plater som kan pletteres (med 50 ml cellesuspensjon)
96 brønner 0.3 100 ul 5
48 brønner 0.7 220 ul 4
24 brønner 2 625 ul 3
12 brønner 4 1,25 ml 3
6 brønner 10 3.125 ml 2
Enkeltbrønn MEA-brikke 3,5 1,1 ml 45

Tabell 2: Godkjenningskriterier

Marker /antistoff Prosentandel (på DAPI + (levende) celler) etter 28 DIV
B-III-tubulin (Tuj1) 35-45%
MAP2 50-60%
NF200 45-55%
GFAP 10-25%
Nestinmarkøren 15-25%

Discussion

Dette arbeidet beskriver en robust og relativt rask protokoll for differensiering av IMR90-hiPSCs i postmittotiske nevroner og glialceller. Tidligere publiserte neuronal differensieringsprotokoller basert på hESCs og hiPSCs gir vanligvis høye prosentvis av nevrale forløpere 25 , 26 og et signifikant antall neuronale målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt er differensieringsprotokollen beskrevet her egnet for å generere heterogene kulturer av GABAergic, glutamatergiske og dopaminerge neuronale celler, sammen med glia og en diskret andel av nestin + -celler. Tilstedeværelsen av glutamatergiske (~ 35-42%) og GABAergic (~ 15-20%) nevrale celler antyder atDenne kulturen har forløp, kortikale egenskaper, og tilstedeværelsen av et diskret antall dopaminerge nevroner (~ 13-20%) kan også indikere midbrainspesifikitet. Videre kan permanentheten til en beskjeden andel av nestin + -celler være egnet for undersøkelsen av nevrogenese og de mulige effektene av kjemikalier på NSC, som hovedsakelig er begrenset til både hippocampus og subventrikulær sone (SVZ) av forebrain 34 . Ytterligere immuncytokjemiske og genuttrykksanalyser vil bidra til å bedre definere den regionale spesifisiteten av de differensierte cellederivatene.

De to mest kritiske trinnene i differensieringsprotokollen beskrevet i dette dokumentet er: (i) kutting av hiPSC-kolonier i homogene fragmenter (som er kritisk for generering av EB med homogene størrelser) og (ii) kutting av neuroektodermale strukturer (rosetter ) For NSC-differensiering, som krever betydelig manuell ferdighetOg presisjon for å unngå å samle mesodermale og endodermale celler som kan redusere proporsjonene av nevroner og glialceller oppnådd ved differensiering.

Det er avgjørende å karakterisere fenotypene til cellene under ekspansjon (som utifferentierte kolonier eller NSC) og under alle differensieringstrinn. Spesielt bør gen- og proteinuttrykksprofiler av nevron / glialcelle-derivatene vise oppregulering og aktivering av nevronrelaterte signalveier, mens uttrykket av pluripotensmarkører bør reduseres.

Genereringen av EB og neuroektodermale derivater (rosettes) kan være manuelt utfordrende og utsatt for variabilitet. Av denne grunn utviklet vi en protokoll for utvidelse av rosett-avledede NSC og deres videre differensiering i nevron / glialceller.

Mulige begrensninger av denne differensieringsprotokollen er hovedsakelig (i) den relativt lave prosentandelen av dIfferentiated glialderivater og (ii) mangelen på modne neuronale nettverksfunksjoner (som vist ved mangel på sprekker). Videre kan spesifikke subpopulasjoner av astrocytter fungere som primære progenitorer eller NSCs 35 . Mens nestin / GFAP dobbelt positive celler ikke ble observert i denne differensierte cellekulturen (data ikke vist), er det hypoteset at GFAP + -cellene i disse blandede kulturer er astrocytiske stamceller og astrocytter. Det er plausibelt at ved å forlenge tiden for differensiering, kan antallet astrocytter øke, og deres morfologi kan bli mer moden, som allerede angitt av tidligere verk fra Zhangs gruppe 36 , 37 .

I det nye toksisitetsprøveparadigmet er kunnskap om kjemisk induserte forstyrrelser av biologiske veier av største betydning når man vurderer kjemisk motgang. Derfor bør in vitro testsystemer kunneRelaterer bivirkninger til forstyrrelser av signalveier, i henhold til begrepet bivirkningsvei (AOP). Som et bevis på konseptet kan rotenon brukes til å vurdere aktiveringen av Nrf2-banen, som er involvert i det cellulære forsvaret mot oksidativ eller elektrofil stress 38 , og oksidativt stress er en viktig og vanlig nøkkelhendelse i ulike AOPer som er relevante for Utviklings- og voksen nevrotoksisitet 39 .

Rotenon bør fremkalle aktiveringen av Nrf2-banen, som kan demonstreres ved Nrf2-proteinkjernetranslokasjon og økt ekspression av Nrf2-mål-enzymer, inkludert NQO1 og SRXN1. Det har blitt funnet at rotenon induserer en doseavhengig økning av GFAP-proteinnivåer, som indikerer astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon reduserer også antall dopaminerge (TH + ) celler, som er i samsvar med previOus in vitro og in vivo studier som viser rotenonavhengig dopaminerge celledød, siden denne typen neuron er spesielt følsom for oksidativt stress 21 , 22 , 23 .

Som konklusjon er denne hiPSC-avledede nevron- og glialcellekulturmodellen et verdifullt verktøy for å vurdere de nevrotoksiske virkninger av kjemikalier som fremkaller oksidativt stress som resulterer i Nrf2-pathway-aktivering. Siden denne differensieringsprotokollen tillater generering av blandede kulturer av nevronceller (GABAergic, dopaminergic og glutamatergic neurons) og astrocytter, kan det vise seg egnet til å studere kronestrekningen mellom nevroner og glia i fysiologiske og patologiske forhold, som for eksempel i neurodegenerative sykdommer ( F.eks. Parkinsons sykdom). Videre kan tilstedeværelsen av en betydelig andel NSCs bidra til å vurdere de mulige effektene av kjemikalier på neurale progEnitors, som er kjent for å være hovedmål for kjemisk induserte mutasjoner eller virusinfeksjoner 42 .

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrike), for å gi IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari og Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italia); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr. Tiziana Santini (italiensk institutt for teknologi, Roma), for å gi råd om immunfluorescensfarging evaluering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo, og Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italia), for deres bidrag til RPPA-analysen og antistoffvalidering. Finansiering: dette arbeidet ble støttet av EU-finansiert prosjekt "SCR & Tox" (Grant Agreement nr. 266753).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium Stem Cell Technologies 05851 (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8 °C for up to 2 weeks. 5x Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20 °C. Use frozen aliquots within 3 months.
mTeSR1 5x Supplements Stem Cell Technologies 05852
Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium Stemgent 01-0013-50 Freeze ~ 100 fragments/250 μL/vial (Step 1.2.1)
Name Company Catalog Number Comments
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM Thermo-Fisher 10829-018 (Step 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR) Thermo-Fisher 10828-028 20% final concentration (Step 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 2.1.7)
β-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 31350-010 50 µM final concentration (Step 2.1.7)
Name Company Catalog Number Comments
Complete neuroepithelial induction medium (NRI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.3.1)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 2.3.1)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 20 ng/mL final concentration added before use (Step 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of cold DMEM/F12 medium.
Laminin Sigma-Aldrich L2020 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1x.
Name Company Catalog Number Comments
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium Thermo-Fisher 21103049 (Step 2.4.11)
B-27 Supplements (50x) Thermo-Fisher 17504044 (Step 2.4.11)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11)
GDNF Thermo-Fisher PHC7045 1 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
Name Company Catalog Number Comments
Neural induction medium (NI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 3.3)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 3.3)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 3.3)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 3.3)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 3.3)
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Thermo-Fisher 12587010 (Step 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 3.3)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
EGF Thermo-Fisher PHG6045 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Thermo-Fisher R007-100 Pre-warm at 37 °C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10)
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo-Fisher 15400054 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37 °C (Step 3.8)
CryoStor cell cryopreservation medium Sigma-Aldrich C2874-100ML (Step 4.2)
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
Name Company Catalog Number Comments
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis:
RNAqueous-Micro kit Thermo-Fisher AM1931 (Step 5.1.6)
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Thermo-Fisher 4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo-Fisher 4369016
GFAP Thermo-Fisher Hs00909233_m1
MAP2 Thermo-Fisher Hs00258900_m1
NQO1 Thermo-Fisher Hs02512143_s1
SRXN1 Thermo-Fisher Hs00607800_m1
HMOX1 Thermo-Fisher Hs01110250_m1
GSR Thermo-Fisher Hs00167317_m1
PAX6 Thermo-Fisher Hs01088112_m1
NES Thermo-Fisher Hs00707120_s1
GRIA1 Thermo-Fisher Hs00181348_m1
GAP43 Thermo-Fisher Hs00967138_m1
GABRA3 Thermo-Fisher Hs00968132_m1
GABRA1 Thermo-Fisher Hs00168058_m1
NR4A2 Thermo-Fisher Hs00428691_m1
TH Thermo-Fisher Hs00165941_m1
GAPDH Thermo-Fisher Hs02758991_g1
ACTB Thermo-Fisher Hs99999903_m1
MAPT Thermo-Fisher Hs00902194_m1
SYP Thermo-Fisher Hs00300531_m1
NANOG Thermo-Fisher Hs04260366_g1
POU5F1 (OCT4) Thermo-Fisher Hs04195369_s1
SOX1 Thermo-Fisher Hs01057642_s1
AFP Thermo-Fisher Hs00173490_m1
KRT18 Thermo-Fisher Hs01941416_g1
NPPA Thermo-Fisher Hs00383230_g1
T Thermo-Fisher Hs00610080_m1
NCAM1 Thermo-Fisher Hs00941821_m1
NR4A1 Thermo-Fisher Hs00374226_m1
PHOX2A Thermo-Fisher Hs00605931_mH
PHOX2B Thermo-Fisher Hs00243679_m1
NARG2 Thermo-Fisher Hs00973298_g1
SLC18A3 Thermo-Fisher Hs00268179_s1
SLC5A7 Thermo-Fisher Hs00222367_m1
ISL1 Thermo-Fisher Hs00158126_m1
LHX3 Thermo-Fisher Hs01033412_m1
TaqMan Human Protein Kinase Array Thermo-Fisher 4418721
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and reagents for immunostaining:
B-III-tubulin (Tuj1) Covance MMS-435P 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used.
MAP2 Sigma Aldrich M4403 1:500
NF200 Sigma Aldrich N4142 1:1000
GFAP Acris Antibodies GmbH AP02002SU-N 1:500
Nestin Sigma-Aldrich N5413 1:200
synaptophysin (SYN) Abcam AB14692 1:200
Tau Thermo-Fisher MA5-12808 1:100
Nrf2 Abcam AB62352 1:200
Keap1 Abcam AB66620 1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1) Abcam AB92298 1:200
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) Abcam AB2346 1:200
OCT4 Millipore MAB4401 1:100
SSEA3 Millipore MAB4303 1:100
Tra1-60 Millipore MAB4360 1:250
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 1:200
Gamma-aminobutyric acid (GABA) Sigma-Aldrich A0310 1:100
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) Abcam AB72311 1:500
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G 4% (4% formaldehyde can also be used)
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo-Fisher 14190144
Triton-X-100 Solution Sigma-Aldrich 93443-100ML 0.1%
BSA 35% Sigma-Aldrich A7979-50ML 3.5%
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate Thermo-Fisher SA5-10040 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser.
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10166 1:500
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10086 1:500
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo-Fisher 62248 1:1000 (Step 5.2.7)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA):
4E-BP1 (S65) Abcam AB81297 1:250 (Note after step 5.2.8)
Akt (T308) Cell Signaling 9275 1:100
Akt (S473) Cell Signaling 9271 1:100
AMPKalpha (T172) Cell Signaling 2531 1:100
AMPKbeta1 (S108) Cell Signaling 4181 1:100
ATF-2 (T71) Cell Signaling 9221 1:100
c-Jun (S63) Cell Signaling 9261 1:200
c-Jun (S73) Cell Signaling 9164 1:200
c-Kit (Y719) Cell Signaling 3391 1:250
CREB (S133) Cell Signaling 9191 1:100
EGFR (Y1068) Cell Signaling 2234 1:50
ErbB2/HER2 (Y1248) Cell Signaling 2247 1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) Cell Signaling 9101 1:2000
GSK-3alpha (S21) Cell Signaling 9337 1:50
Jak1 (Y1022/1023) Cell Signaling 3331 1:100
Lck (Y505) Cell Signaling 2751 1:500
LKB1 (S428) Cell Signaling 3051 1:100
mTOR (S2448) Cell Signaling 5536 1:100
NFkB p65 (S536) Cell Signaling 3031 1:50
p70 S6 Kinase (T389) Cell Signaling 9205 1:200
PDK1 (S241) Cell Signaling 3061 1:100
PKA C (T197) Cell Signaling 4781 1:250
PRAS40 (T246) BioSource 44-1100 1:2000
PTEN (S380) Cell Signaling 9551 1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) Cell Signaling 9511 1:500
Src (Y527) Cell Signaling 2105 1:500
Src Family (Y416) Cell Signaling 2101 1:200
Stat1 (Y701) Cell Signaling 9171 1:200
Stat3 (S727) Cell Signaling 9134 1:200
Zap-70 (Y319) Enogene E011159 1:100
βCatenin (S33/37/T41) Cell Signaling 9561 1:250
CREB Upstate Biotechnologies 06-863 1:100
Fos B Cell Signaling 2251 1:200
GRB2 Cell Signaling 3972 1:2000
HSP70 Stressgen SPA-810 1:100
c-Jun Cell Signaling 9165 1:100
Kip1/p27 BD 610241 1:100
Lck Cell Signaling 2984 1:250
Mcl-1 Cell Signaling 4572 1:80
Musashi Cell Signaling 2154 1:100
NOTCH1 Cell Signaling 3439 1:100
PTEN Cell Signaling 9552 1:500
SGK1 Abnova PAB4590 1:250
Zap-70 Cell Signaling 2705 1:250
β-Catenin Abcam AB32572 1:1000
Dll4 Abcam AB7280 1:500
Shh Abcam AB53281 1:250
HIF-1α BD 610958 1:50
NUMB PAN-ISO Upstate Biotechnologies 07-207 1:400
NUMB-L Chemicon AB15145 1:750
Cyclin B BD 610220 1:75
c-Myc Calbiochem OP-10 1:100
BCIP/NBT Kit Thermo-Fisher 002209 (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Flow Cytometry:
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate Thermo-Fisher MHCD1528 1:100 (Note after step 5.2.8)
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher SSEA421 1:100
Name Company Catalog number Comments
Specific instruments, tools and softwares:
Countess Automated Cell Counter Thermo-Fisher C10227 Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used.
MEA1060-Inv-BC Multichannel Systems MEA1060-Inv-BC (Step 5.3)
MEA1060-BC control software Multichannel Systems MEA1060-BC (Step 5.3)
NeuroExplorer Multichannel Systems NeuroExplorer (NE) (Step 5.3) For post-processing of MEA data
Multielectrode arrays (MEA) Multichannel Systems 60MEA100/10iR-Ti-gr (Step 5.3) Single-well MEA chip
ArrayScan XTI High Content Platform Thermo-Fisher ASN00002P (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo-Fisher 4351405 (Step 5.1.6)
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) BD 328280 (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1)
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool ThermoFisher 23181010 This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1)
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) Corning 10010582 (Step 2.1.8) Also other brands can be used.
Mr. Frosty Freezing container Sigma-Aldrich C1562-1EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. NRC. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).
  2. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  3. Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges. Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).
  4. Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. Natural and artificial routes to pluripotency. Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).
  5. Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
  6. Pistollato, F., et al. Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition. Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).
  7. Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells. Neurochem Int. , (2016).
  8. Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570 (2016).
  9. Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571 (2016).
  10. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  11. Brien, P. J., et al. High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening. Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).
  12. Accordi, B., et al. Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL. PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).
  13. Vassallo, A., et al. A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing. Neurotoxicology. , (2016).
  14. Shamblott, M. J., et al. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).
  15. Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation. Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).
  16. Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease. Parkinsons Dis. , 314082 (2011).
  17. Kovac, S., et al. Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase. Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).
  18. Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons. J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).
  19. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).
  20. Li, L., et al. Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling. Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).
  21. Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).
  22. Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation. Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).
  23. Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures. Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).
  24. Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm (2017).
  25. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).
  26. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J Vis Exp. (96), e52495 (2015).
  27. Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells. Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).
  28. Parsons, X. H., et al. Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction. J Vis Exp. (56), e3273 (2011).
  29. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  30. Zeng, H., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).
  31. Zeng, X., et al. An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).
  32. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  33. Almeida, S., et al. Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons. Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).
  34. Urbán, N., Guillemot, F. Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles. Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).
  35. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  36. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).
  37. Krencik, R., Zhang, S. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  38. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  39. Bal-Price, A., et al. Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).
  40. Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone. Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).
  41. Swarnkar, S., et al. Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage. Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).
  42. Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 124 humant indusert pluripotente stamceller differensiering nevroner glia nevrotoksisitet Nrf2-pathway aktivering
Protokol for differensiering av humane inducerte pluripotente stamceller i blandede kulturer av neuroner og glia for test av neurotoxicitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pistollato, F., Canovas-Jorda, D.,… More

Pistollato, F., Canovas-Jorda, D., Zagoura, D., Price, A. Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing. J. Vis. Exp. (124), e55702, doi:10.3791/55702 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter