Summary
Mänskligt inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) anses vara ett kraftfullt verktyg för drog- och kemisk screening och för utveckling av nya in vitro- modeller för toxicitetstestning, inklusive neurotoxicitet. Här beskrivs ett detaljerat protokoll för differentieringen av hiPSCs i neuroner och glia.
Abstract
Humana pluripotenta stamceller kan differentiera till olika celltyper som kan appliceras på humana-baserade in vitro- toxicitetsanalyser. En stor fördel är att omprogrammeringen av somatiska celler för att producera humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) undviker de etiska och lagstiftande frågorna i samband med användningen av mänskliga embryonala stamceller (hESCs). HiPSCs kan expanderas och effektivt differentieras till olika typer av neuronala och glialceller, som tjänar som testsystem för toxicitetstestning och i synnerhet för bedömning av olika vägar som är involverade i neurotoxicitet. Detta arbete beskriver ett protokoll för differentieringen av hiPSCs i blandade kulturer av neuronala och glialceller. Signalvägarna som regleras och / eller aktiveras genom neuronal differentiering definieras. Denna information är avgörande för cellmodellens tillämpning på det nya testmetoden för toxicitet, där kemikalier bedöms utifrån deras förmåga att peRturb biologiska vägar. Som ett bevis på konceptet användes rotenon, en hämmare av mitokondriell respiratorisk komplex I, för att bedöma aktiveringen av Nrf2-signaleringsvägen, en nyckelregulator för antioxidant-respons-element- (ARE) -driven cellulär försvarsmekanism mot oxidativ stress .
Introduction
USA: s forskningsrådets rapport 1 föreslog ett nytt toxicitetsprovningsparadigm där reglerings toxicitetstestning skulle flyttas från ett tillvägagångssätt baserat på fenotypiska förändringar observerade hos djur till ett tillvägagångssätt som fokuserade på mekaniska in vitro- analyser med användning av humana celler. Pluripotenta stamceller (PSC) derivat kan representera alternativ till cancercellsmodeller, eftersom de erhållna cellerna mer kan likna de fysiologiska förhållandena hos humana vävnader och tillhandahålla mer relevanta verktyg för att studera kemiskt inducerade negativa effekter. De två huvudtyperna av PSC-kulturer som är mest lovande för toxicitetstestning är humana embryonala stamceller (hESCs) och humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), som för närvarande används i stor utsträckning inom områdena grundforskning och regenerativ medicin 2 , 3 . Denna kompetens kan nu utnyttjas för utveckling av en ny klass av toxicoloGiska in vitro- tester som syftar till att identifiera de störda fysiologiska vägarna som är inblandade i utvecklingen av negativa effekter in vivo . Testmetoder för säkerhetsbedömningar på grundval av hESCs skulle dock inte troligtvis godtas av alla EU-medlemsstater och länder över hela världen på grund av möjliga etiska problem och olika nationella lagstiftningspolitiska regler som reglerar användningen av embryon-härledda celler.
HiPSCs delar egenskaper som liknar hESCs 4 , 5 och har stor potential för in vitro- metoder, både för att identifiera terapeutiska mål och för säkerhetsbedömningar. Dessutom mildrar hiPSC-tekniken begränsningarna för en begränsad givarpool och de etiska problem som är förknippade med embryo-härledda celler. En stor utmaning för hiPSCs är demonstrationen att dessa celler reproducerbart kan generera ett betydande antal toxikologiskt relevanta cellderivat,Med egenskaper och svar som är typiska för mänskliga vävnader. Fördefinierade nivåer av de markerade markörerna används allmänt för att karakterisera cellpopulationer efter differentieringsprocessen och för att ge insikt i stabiliteten i differentieringsprocessen.
Tidigare verk utvärderade lämpligheten hos hiPSCs för att generera blandade kulturer av neuronala och glialceller och för att bedöma effekterna av rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk komplex I, vid aktiveringen av Nrf2-vägen, en nyckelregulator för antioxidantförsvarsmekanismer i Många celltyper 6 , 7 .
Detta arbete beskriver ett protokoll som används för differentiering av hiPSCs i blandade neuronala och glialkulturer, vilket ger detaljer om signaleringsvägarna (gen- och proteinnivå) som aktiveras vid neuronal / glialifferentiering. Dessutom visar arbetet representativa resultat som visar hur dettaHiPSC-härledd neuron- och glialcellsmodell kan användas för att bedöma Nrf2-signaleringsaktivering inducerad genom akut (24-h) behandling med rotenon vilket möjliggör bedömning av oxidativ stressinduktion.
IMR90-fibroblaster omprogrammerades till hiPSCs vid I-Stem (Frankrike) genom viraltransduktion av 2 transkriptionsfaktorer (Oct4 och Sox2) med användning av pMIG-vektorer 6 . Analoga HiPSC-modeller kan också appliceras. Protokollen som beskrivs nedan sammanfatta alla stadier av differentiering av hiPSCs till neurala stamceller (NSC) och vidare i blandade kulturer av postmittotiska neuroner och glialceller (steg 1 och 2, se även EURL ECVAM DBALM-webbplatsen för en detaljerad beskrivning av Protokollet) 8 .
Ett tilläggsprotokoll för isolering, expansion, kryopreservering och ytterligare differentiering av NSC i blandade neuroner och glialceller beskrivs i steg 3 och 4 (se även EURL ECVAM DBALM viBsite för en detaljerad beskrivning av detta protokoll) 9 . Steg 5 beskriver de analyser som kan göras för att bedöma cellens fenotypiska identitet under de flera stadierna av engagemang och differentiering.
Protocol
1. Human inducerad pluripotent stamceller (hiPSC) Expansion
ANMÄRKNING: hiPSCs kan odlas på ett lämpligt proteinblandningssubstrat i närvaro av mTeSR1-medium innehållande mTeSR1 5x-tillskott (beredda enligt tillverkarens instruktioner; platta ~ 100 kolonifragment / 60 mm petriskål). När hiPSC-kolonierna når en lämplig storlek (se ett exempel på en koloni i Figur 2A ), passera cellerna som beskrivs nedan (en gång i veckan).
- Coatdiskar med hESC-kvalificerad basmembranmatris (nedan kallad "kvalificerad matris") eller något annat lämpligt proteinsubstrat.
- Förvara den kvalificerade matrisen (se materialet ) vid -80 ° C i 200 μl alikvoter i kalla 1,5 ml rör och kalla 5 eller 10 ml pipetter.
- Tina 200 μL kvalificerad matris på isen före passering.
- Späd 200 μL kvalificerad matris på 20 mL av DMEM / F12-medium (1: 100 utspädning).
- Coat 60 mm petriskålar med denna lösning (5 ml / fat).
- Inkubera belagda rätter vid 37 ° C under minst 1 h.
- HiPSC-kolonifragmentet kryopreservering och upptining
- Efter att ha klippt hiPSC-kolonierna (se steg 1.3 för hiPSC-kolonnskärningsproceduren) resuspenderar hiPSC-kolonifragmenten i stamcellsfrysmedium, ~ 100 fragment / 250 μl, försiktigt och långsamt (se Materialetabell).
- Aliquot kolonifragmenten i lämpliga ampuller för kryopreservering (250 μl / ampull).
- Placera flaskorna i en behållare fylld med 2-propanol och placera behållaren vid -80 ° C i minst 2 timmar och upp till 2 veckor.
- Överför injektionsflaskorna i ångfasen i en flytande kvävebehållare.
- För att starta om kulturen, tina 1 frusen flaska i vattenbad vid 37 ° C.
- Uppsamla försiktigt hiPSC-kolonifragmenten i 7 ml föruppvärmd fullständig hiPSCMedium (se materialet ) i ett 15 ml rör med användning av en 1, 2 eller 5 ml pipett.
- Centrifugera hiPSC-kolonifragmenten vid 130 xg under 3 min.
- Ta bort supernatanten och försiktigt resuspendera hiPSC-kolonifragmenten i 1 ml fullständigt hiPSC-medium med en 1, 2 eller 5 ml pipett.
- Vidare späd cellsuspensionen i 3 eller 4 ml komplett hiPSC-medium.
- Placera hiPSC-kolonifragmenten i en kvalificerad matrisbelagd 60 mm petriskål (~ 100 fragment / skål, bestryka disken enligt beskrivningen i steg 1.1).
- Inkubera hiPSCs vid 37 ° C och 5% CO2.
- Utför en total medeländring varje dag.
- Passering av hiPSC-kolonierna
OBSERVERA: Ockifferentierade hiPSCs ska vara rundformade, med stora nukleoler och utan riklig cytoplasma. Otifferentierade kolonier ska präglas av en platt och tätt packad morfologi. Endast odifferentierade kolonier (ca 1 mm iN diameter) ska skäras för vidare passage.- Klipp stamcellkolonierna i kvadrater på ca 200 μm x 200 μm med en 1 ml spruta med en 30G nål eller något annat kommersiellt tillgängligt verktyg (se Materialetabellen). Använd ett stereoskopiskt mikroskop vid 4x förstoring i ett laminärt flödesskåp vid rumstemperatur.
- Lossa kolonifragmenten från skålytan med hjälp av en pipette av 200 μl genom att pipettera mediet försiktigt under för att lyfta bitarna.
- Överför kolonifragmenten (~ 100 stycken) till en kvalificerad matris-DMEM / F12-belagd platta fylld med 4 ml komplett hiPSC-medium (se Materialetabellen, täcka disken enligt beskrivningen i steg 1.1).
- Inkubera den nya plattan / plattorna vid 37 ° C och 5% CO2.
- Utför en total medeländring varje dag och inspektera koloniernas morfologi med hjälp av ett faskontrastmikroskop vid 4X och 10X förstoringar.
2. HiPSC DiffereNtiation i Mixed Neurons och Glia
OBS! Proceduren tar ungefär 28 dagar att slutföra, med de huvudsakliga stegen som beskrivs i Figur 1 (övre delen).
Figur 1: Schematisk representation av Neuronal Differentiation Protocol. (Övre delen) IMR90-hiPSC kolonier kan skäras i fragment för att bilda embryoidkroppar (EBs). Efter 2 dygn in vitro (DIV) kan EB-pläteras på laminin- eller standardmatrisbelagda rätter och odlas i närvaro av neuroepitelial induktions (NRI) medium för att generera neuroektodermala derivat (rosetter, här färgade för nestin (grön) och p -III-tubulin (röd)). Rosetter kan dissocieras, uppsamlas, replikeras på laminin- eller standardmatrisbelagda rätter och vidare differentieras till mogen neuronal (NF200, röd) och glial(GFAP, grön) celler i närvaro av neuronal differentierings (ND) medium. (Nederdel, rost) rosett-härledda NSC (nestin, röd) kan expanderas i närvaro av neuralt induktions (NI) medium, kryopreserveras eller differentieras ytterligare i närvaro av ND-medium för att bilda blandad neuronal (NF200, grön) och glial GFAP, röd) kulturer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Generering av embryoidkroppar (EBs) (Dag 0 → 1)
OBS! Denna procedur kräver god manuell färdighet och precision. HiPSC-kolonifragment bör vara lika stora för att erhålla homogena embryoidkroppar (EBs) i de följande stegen. Morfologiskt differentierade kolonier (med stora cytoplasmiska fraktioner och små nukleoler) bör kasseras.- Uppdatera hiPSC-mediet (3 ml / 60 mm petriskål) innan du skär de odifferentierade hiPSC-kolonierna (ca 1 mm i diameterEter, se figur 2A ) under sterila betingelser (såsom beskrivits i steg 1).
- Klipp ut de odifferentierade kolonierna (som visas i Figur 2A och Figur 2B ) i fragment på cirka 200 μm x 200 μm med en 1 ml spruta med en 30G nål. Använd ett stereoskopiskt mikroskop vid 4X förstoring i ett laminärt flödesskåp vid rumstemperatur.
- Lossa kolonifragmenten från skålytan med en pipette av 200 μl genom försiktigt pipetteringsmedium under för att lyfta bitarna.
- Överför alla frilagda fragment och mediet till ett 15 ml rör genom att använda en 1, 2 eller 5 ml pipett.
- Skölj skålen med 2 ml komplett hiPSC-medium för att återvinna alla fragment.
- Centrifugera vid 112 xg i 1 min.
- Aspirera supernatanten och försiktigt resuspendera fragmenten i 5 ml fullständigt hiPSC EB-medium (se Materialetabell ).
- Placera coLionfragment i en 60 mm ultrafasad petriskål (5 ml / 60 mm petriskål).
- Inkubera petriskålen över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- På nästa dag (dag 1) samlar du EBs och deras medium i ett 15 ml rör med en 1, 2 eller 5 ml pipett.
- Centrifugera EB: erna vid 112 xg under 1 min.
- Aspirera försiktigt supernatanten och försiktigt resuspendera EB: erna i 5 ml fullständigt hiPSC EB-medium med en 1, 2 eller 5 ml pipett.
- Byt EB: erna på en ny 60 mm lång petrifat (5 ml / 60 mm petriskål).
- Inkubera petriskålen över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- På dag 1, täcka upp disken med basmembranmatris ( t.ex. matrigel, nedan kallad "standardmatris") eller något annat lämpligt proteinsubstrat ( t.ex. laminin).
- Förvara standardmatrisen (se Materialetabell ) vid -80 ° C200 μl alikvoter med användning av kalla 1,5 ml rör och kalla 5 eller 10 ml pipetter.
- Tina 200 μl standardmatris på is.
- Späd 200 μL standardmatris i 20 ml DMEM / F12-medium (1: 100 spädning).
- Coat 60 mm petriskålar med denna lösning (5 ml / fat).
- Inkubera de belagda rätterna vid 37 ° C över natten.
OBS: Dessa rätter kommer att användas för att plana EBs (ca 50 EBs / maträtt) och generera neuroepithelialaggregat (rosetter); Se steg 2.3.
- Generering av neuroepithelialaggregat (rosetter) (Dagar 2 → 7)
- På dag 2, avlägsna standardmatrisbeläggningslösningen från 60 mm petriskålarna (behöver inte skölja plattorna) och fyll dem med 5 ml / maträtt med fullständigt neuroepitelialt induktionsmedium (NRI); Se materialet .
- Överför de flytande EB: erna (från steg 2.1.14) till belagda rätter (~ 50 EB / parabol) med en 200 μL pipett under en stereoskopisk miCroscope vid 4x förstoring och placerad i ett laminärt flödesskåp.
OBS! Det är viktigt att välja homogena, medelstora EB-enheter (~ 200-300 μm i diameter). För små EB kan inte överleva bra under neuroektodermal differentiering, medan alltför stora EBs tenderar att genomgå kärnnekros. - Inkubera disken vid 37 ° C och 5% CO2.
- Dagen efter (Dag 3), kontrollera disken under mikroskopet med 10x förstoring för att säkerställa att alla EB-enheter är fästade.
- Gör försiktigt en total mediumförändring med fullständigt NRI-medium.
- Byt NRI-medium varannan dag upp till dag 7, när neuropiteliala aggregat (rosetter) ska vara synliga.
- På dag 7, beläggning standardmatris (eller laminin), som beskrivs i steg 2.2, på vilket som helst önskat platta eller skålformat: 96-brunnsplattor (100 pl / brunn), brunnar med 24 brunnar (250 pl / brunn) Brunnplattor (500 μl / brunn), MEA-brickor (för elektrisk aktivitet, 1 ml / brunn med enkelbrunn) eller 60 mm petri disheS (4 ml / skål).
- Inkubera de belagda plattorna / diskarna i minst 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Rosettdissociation och neuronal differentiering (Dagar 8 → 28)
OBS! Denna procedur kräver god manuell färdighet och precision. För att undvika att samla mesodermala och endodermala celler, bör endast ektoderm-rosettliknande strukturer dissocieras och samlas in.- På dag 8 skär de rosettliknande strukturerna i fragment under ett stereoskopiskt mikroskop vid 10X förstoring i sterila förhållanden. Använd en 1 ml spruta med en 30G nål. Observera att rosetten tenderar att lätt lossa från skålen när den berörs med nålen.
- Komplettera avlägsnandet av rosettfragmenten med hjälp av en 200 μl pipett.
- Överför disken under laminärflödeskåpan och samla rosettfragmenten och deras medium i ett 15 ml koniskt rör med användning av en 1, 2 eller 5 ml pipett. Skölj skålen med 2 ml NRI-medium för att återvinnaAlla fragment.
- Snurra ner rosettfragmenten vid 112 xg under 2 min.
- Aspirera supernatanten.
- Resuspendera pelleten försiktigt i 1 ml 1x DPBS (utan kalcium och magnesium) och pipett rosettfragmenten försiktigt upp och ner med en 1000-l pipett för att delvis dissociera dem.
- Tillsätt 4 ml komplett NRI-medium och räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en automatiserad cellräknare (se Materialetabellen )
ANMÄRKNING: Späd 20 μl cell suspension i 20 pl Trypan Blue. Detta steg kan utelämnas om cellerna inte kan bringas i en enkelcellsuspension. Om rosettfragmenten inte ser helt dissocierade, kan rosettesfragment härledda från ca 50 EBs / 60 mm skål resuspenderas i 50 ml fullständigt NRI-medium och pläteras, såsom anges i Tabell 1 . - Aspirera standardmatrisen (eller laminin) beläggningslösningen från petriskålarna, plattorna och / eller MEA-chipsen (från steg 2.3.7). Låt dem inte torka.
- Placera cellerna i komplett NRI-medium enligt studieplanen (ca 15 000 celler / cm2, se tabell 1 för plätering av volymindikationer).
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- På dag 10 utför du en total medianändring med fullständigt neuronal differentieringsmedium (ND); Se materialet.
- Uppdatera det kompletta ND-mediet två gånger i veckan fram till dag 28.
- Karakterisera neuronala / glialcellderivaten, som beskrivs i steg 5 (se tabell 2 för allmänna acceptkriterier).
3. HiPSC-härledd neural stamceller (NSC) Expansion och differentiering i blandade neuroner och Glia
OBS: NSC som härstammar från rosettfragment kan expanderas och upprätthållas enligt proceduren som beskrivs nedan ( Figur 1 , nedre delen). Detta gör det möjligt att öka thE antal celler för differentiering och kemisk testning.
- Belägga en 60 mm petriskål (eller en T-25 kolv) med 5 ml standardmatris DMEM / F12 beläggningslösning och inkubera den i minst 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 (som beskrivs i steg 2.2).
- Snurra ner rosettfragmenten härledda från steg 1-2 (se steg 2.4.) I ett koniskt 15 ml rör vid 112 xg under 2 min.
- Resuspendera pelleten försiktigt i 5 ml neuralt induktionsmedium (NI); Se materialet.
- Överför cellerna till en standardmatrisbelagd 60 mm petriskål (eller T-25 kolv).
- Kultur-rosett-härledda NSC i närvaro av NI-medium, uppfriskande mediet varannan dag tills cellerna når sammanflöde.
- När sammanflödet passerar NSC: erna som beskrivs i följande steg.
OBS: Passera NSC: erna en gång i veckan. Överväga att använda färskt belagda rätter, kolvar eller tallrikar, beroende på studieplanen. - Ta bort hela NI-mediet och gentlSkölj NSC med DPBS (utan kalcium och magnesium).
- Tillsätt 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA förvärmd till 37 ° C till 60 mm petriskålen (eller T-25 kolven) innehållande cellerna och placera den i inkubatorn i 1 min.
- Tryck försiktigt på skålen (eller kolven) för att lossa cellerna.
- Tillsätt 1,5 ml trypsininhibitor förvärmd till 37 ° C och överför cellerna till ett 15 ml rör.
- Skölj petriskålen (eller T-25-kolven) med en lika stor mängd NI-medium (1,5 ml) och samla volymen i samma 15 ml rör.
- Centrifugera cellerna vid 130 xg under 3 minuter.
- Ta bort supernatanten och försiktigt resuspendera cellerna i 1 ml fullständigt NI-medium med en 1000-ul pipett.
- Vidare späd cellsuspensionen i 3 eller 4 ml fullständigt NI-medium och räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en automatiserad cellräknare.
- Placera NSC: erna på 60 mm petriskålen (eller T-25 kolven) från steg 3.1 vid en densitet av ca 50 000 celler / cm 2 .
- Karakterisera cellerna för närvaron av neuronala / glialcellderivat, såsom beskrivs i steg 5.
OBS: NSC kan differentieras till blandade kulturer av neuroner och glia i komplett ND-medium (som beskrivs i steg 2.4.11-2.4.13), uppfriskande det kompletta ND-mediumet två gånger i veckan i 21 dagar.
4. HiPSC-härledd NSC-kryopreservering och upptining
ANMÄRKNING: Vid passage kan NSC-enheter frysas och återtinas efter denna procedur.
- Centrifugera passagerad NSC (från steg 3.12) vid 130 xg under 3 min.
OBS: Cellerna ska räknas i steg 3.14. - Återanvänd NSCs försiktigt och långsamt vid 3 x 10 6 / ml frysmedium (se Materialetabell ).
- Aliquot cellerna i lämpliga ampuller för kryopreservering (ca 0,5 ml = 1,5 x 10 6 / ampull).
- Placera flaskorna i en behållare fiLeds med 2-propanol och placera behållaren vid -80 ° C i minst 2 timmar och upp till 2 veckor.
- Överför injektionsflaskorna till ångfasen i en flytande kvävebehållare.
- För att starta om cellkulturen, tina 1 frusen flaska i ett vattenbad vid 37 ° C.
- Uppsamla försiktigt cellerna i 7 ml föruppvärmt komplett NI-medium i ett 15 ml rör med användning av en 1000-il pipett.
- Centrifugera cellerna vid 130 xg under 3 minuter.
- Ta bort supernatanten och försiktigt resuspendera cellerna i 1 ml fullständigt NI-medium med en 1000-il pipett.
- Vidare späd cellsuspensionen i 3 eller 4 ml fullständigt NI-medium och räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en automatiserad cellräknare (notera: späd 20 μl cellsuspension i 20 pl trypanblått, livskraften efter upptining bör vara ≥ 80 %).
- Placera NSC i en belagd 60 mm petriskål (eller T25 kolv) med en densitet av ca 50 000 celler / cm 2 .
5. CharaCterisering av hiPSC-härledda neuronala och glialceller
OBS: Vid differentiering kan neuronala och glialderivat karakteriseras med användning av olika tekniker, såsom de som beskrivs i följande avsnitt.
- Kvantitativa realtid PCR (qPCR) analyser 10
- Snurra ner hiPSC-kolonifragment, EBs och / eller NSC vid 130 xg i 3 min.
- Resuspendera cellpelleten i 100 | il av kall RNA-lysbuffert tillhandahållen i ett lämpligt kit för RNA-extraktion.
- Alternativt, samla neuronala / glialderivat direkt från plattorna genom att suga mediumet och tillsätta kall RNA lysisbuffert till brunnarna för att samla cellerna.
- Isolera RNA enligt tillverkarens instruktioner.
- Omvänd transkribera 500 ng av det totala RNA med användning av ett lämpligt kit för RNA till cDNA retrotransskription.
- Kör qPCR-reaktioner i duplikat med lämplig masterblandning och primerUppsättningar (se materialet ).
- Notera fluorescerande utsläpp i realtid: 45 cykler med primers glödgning vid 60 ° C.
- Normalisera de relativa RNA-kvantiteterna till GAPDH och p-aktin som referensgener och använd odifferentierade hiPSC eller obehandlade celler för kalibreringsförhållandena (AΔCt-metod). Alternativt använd en annan lämplig metod.
- Immunocytokemi och högupplösta bilder (HCI) 6 , 11
- Fix hiPSC-kolonierna, NSC och / eller neuronala / glialderivat med kall 4% paraformaldehyd i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Torka försiktigt cellerna i 1X PBS och förvara plattorna vid 4 ° C i upp till 1 månad.
- När det är klart för färgning permeabiliserar cellerna i permeabiliseringsbufferten (1x DPBS innehållande 0,1% triton-X-100 och 3% BSA) under 15 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort permeabiliseringen buFfer och inkubera cellerna i blockerande buffert (3% BSA / 1X DPBS) under 15 min vid rumstemperatur för att förhindra icke-specifik bindning av antikroppar.
- Ta bort blockeringsbufferten och inkubera cellerna över natten vid 4 ° C i blockerande buffert som innehåller lämpliga primära antikroppar (se Materialetabell ).
- Tvätta cellerna 3 gånger med 1x PBS.
- Inkubera cellerna i 45 minuter vid rumstemperatur i blockerande buffert som innehåller fluorokromkonjugerade sekundära antikroppar (se Materialetabell ), motverkande av kärnorna med DAPI-färgämne.
- Kvantifiera medelfluorescensintensiteten och de relativa procentsatserna av celltyper med hjälp av en lämplig bildhanteringsplattform med hög innehåll, om det finns tillgängligt (se Materialetabellen ).
ANMÄRKNINGAR: För att bestämma intensitetsnivån för den fluorescerande bakgrunden inkuberar vissa celler / brunnar med sekundära antikroppar enbart. Flödescytometrisk analys av levande (ej fixerad), undIfferentiated hiPSCs kan utföras för att bedöma uttrycket av PSC-specifika markörer, såsom SSEA4 (se Materialetabellen ). Ockifferentierade hiPSC-kolonier kan analyseras för alkalisk fosfatasaktivitet med användning av kommersiellt tillgängliga BCIP / NBT-kit, enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabellen ). Vidare kan analyser och analyser av omvändfasproteiner (RPPA) utföras, såsom beskrivs i Referens 12 (för en lista över testade antikroppar, se Materialetabell ).
- Elektrofysiologiska mätningar 13
- Placera de dissocierade rosettefragmenten (efter 7 DIV) eller NSC: er som härrör från rosetter på belagda multielektrode-arrays (MEAs, se Materialetabell ) i komplett ND-medium (~ 1 x 10 5 celler / MEA-chip med enkelbrunn ).
- Differentiera cellerna i 3 veckor i komplett ND-medium, uppfriskande thE medium två gånger i veckan.
- Vid slutet av differentiering försegla MEA-chipsen med ett semi-permeabelt membran under en laminär flödeshuv för att hålla kulturerna sterila för upprepade mätningar.
- Byt ut en av elektroderna med en jordreferens, vilket möjliggör inspelningar från de återstående elektroderna.
- Anteckna den genomsnittliga avfyrningshastigheten (MFR, antal spikes / min) med en MEA-förstärkare med den integrerade temperaturprocesskontrollen justerad till 37 ° C och 5% CO2.
- Upptäck toppar från MEA-rådata med tröskelgränsen på -4,7σ (σ representerar standardavvikelsen för det grundläggande bruset).
- Bearbeta efterinspelningsdata med lämplig programvara.
Representative Results
Karakterisering av odifferentierade hiPSCs
För att bedöma fenotypen av hiPSC: erna bör analysen av koloni / cellmorfologi, bestämning av PSC-specifika markörer och undersökning av genuttryck och alkalisk fosfataktivitet utföras. Ockifferentierade hiPSC bör vara runda, med stora nukleoler och utan riklig cytoplasma. Majoriteten av kolonierna bör karakteriseras av en platt och tätt packad morfologi, som indikerar en odifferentierad fenotyp ( figur 2A och figur 2B ). Dessutom bör mer än 80% av kolonierna vara positiva för alkalisk fosfatasaktivitetsfärgning ( Figur 2C ).
Cirka 80% av cellerna bör vara positiva för klassiska pluripotensrelaterade markörer, till exempel Oct4, SSEA3, SSEA4 och Tra1-60 ( Figur 2D-H ), såsom visas av immuncytokemi och flödescytometri, medan procentandelarna av nestin + och β-III-Tubulin + celler borde vara signifikant låga (ca 8% respektive 3% Som visas i figur 2H ). Dessa resultat bör reproduceras över passager.
Figur 2. Karakterisering av icke-differentierade IMR90-hiPSCs. (A och B) Representativa faskontrastbilder (10X och 20X förstoringar) av odifferentierade IMR90-hiPSC-kolonier. (C) representativa bilder av alkaliska fosfatasfärgade kolonier (4X förstoring). (DF) Representativa immuncytokemiska bilder av (D) Oct4 (röd), (E) SSEA3 (grön) och (F) TrA1-60 (grön). (G) Representativ punktplot av SSEAl (CD15) och SSEA4-färgning, analyserad genom flödescytometri. (H) Stångdiagrammet visar procentsatserna av Oct4 + (~ 75-80%), Tra1-60 + (~ 75-80%), SSEA3 + (~ 75-80%), nestin + (~ 10-15% ) Och β-III-tubulin + (~ 3-7%) celler motströms med DAPI och kvantifieras med HCl, med ett medelvärde av 3 till 5 biologiska replikat ± SEM (graf modifierad från referens 6). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Bedömning av pluripoten via EB-bildning
HiPSCs är pluripotenta, vilket innebär att de uttrycker tre kiemskiktrelaterade gener under lämpliga betingelser. För att bedöma hiPSC pluripoten är det möjligt att tillämpa en gemensamTillvägagångssätt baserad på spontan EB-bildning, vilket inducerar bildningen av de tre bakterielagren 14 . Analyser av kimskiktsspecifika gener måste ange en tidsberoende ökning av endoderm (a-fetoprotein (AFP) och cytoktatin 18 (KRT18)), ectoderm (Nestin, SRY-box 1 (Sox1) och parad låda 6 (Pax6) ) Och mesoderm (natriuretisk peptid A (NPPA) och Brachyury-T) -relaterat genuttryck ( Figur 3A och Figur 3B ); Se materialet.
Figur 3. Bedömning av pluripotens genom EB-bildning. (A) Representativ faskontrastbild av EBs vid dag 1. (B) Stångdiagrammet visar qPCR-analyser av mesodermalt (NPPA och brachyury), ectodermal (Pax6, Sox1 och nestin) och endodermalt (AFP och KRT18 ) Gener, normaliserade till referensgenerna, p-aktin och GAPDH, och kalibrerades till odifferentierade celler (dag 0). Detta är ΔΔCt-metoden, med ett medelvärde av 5 oberoende analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf modifierad från referens 6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Induktion av neuronal och glial differentiering
IMR90-iPSCs kan differentieras till blandade kulturer av postmittotiska neuroner och glialceller enligt de steg som sammanfattas i Figur 1 och i protokollsektionerna. 5-8 dagar efter plätering av EB: erna på standardmatris- eller lamininbelagda rätter i närvaro av fullständigt NRI-medium bör rosettliknande strukturer börja bli synliga (= "Xfig"> Figur 4A). Rosetter kännetecknas av närvaron av nestin + celler (neuronprekursorer, ~ 90%), med få β-III-tubulin + celler (engagerade neuronala celler, ~ 5 - 10%), sistnämnda lokaliseras huvudsakligen i periferin av Rosettes ( Figur 4B , rosettes på dag 12).
Vid rosettissociation och replikering på laminin- eller standardmatrisbelagda rätter eller plattor i närvaro av fullständigt ND-medium, börjar cellerna genomgå differentiering i blandade kulturer av neuroner och glia, som progressivt bildar kluster av neuronala cellkroppar kopplade av buntar av neuriter ( Figur 4C och figur 4D ). Liknande resultat bör erhållas när man analyserar neuronpopulationer erhållna genom att expandera rosett-härledda NSC och differentiera dem till neuroner och glia. NSC: s utvidgade från rosetter bör vara nEstin + ( Figur 4E , inset som visar nestin + celler).
Efter 21 dagars differentiering bör cellerna vara positiva för P-III-tubulin; NF200; tau; Och MAP2, den sena markören för dendriter ( Figur 4D , 4F och Figur 4H), med minst 10-15% av cellerna positiva för glialfibrillärt surt protein (GFAP), en astroglialmarkör ( Figur 4G och Figur 4H) . Dessutom bör ~ 20-30% av cellerna bibehålla uttrycket av nestin efter differentiering ( Figur 4H ). Det är viktigt att anse att andelen av varje celltyp ( dvs. neuron, astrocyt, nestin + celler) kan variera över passager och användarberoende variabilitet kan observeras.
Genom att analysera specifika neuronala subpopuleringar representerar GABAergic neuronerSkickade ~ 15-20% av de totala cellerna, dopaminerga neuroner ~ 13-20% och glutamatergiska neuroner ~ 35-42%, vilket visas genom immunförstärkning för gamma-aminosmörsyra (GABA), tyrosinhydroxylas (TH) och vesikulärt glutamat Transportör 1 (VGlut1) (se representativ kvantifiering i figur 4H ). Induktionen av differentiering kan också bedömas genom analys av pluripotensrelaterade markörer ( t.ex. okt4, tra1-60 och SSEA3), som bör signifikant nedregleras i differentierade celler jämfört med odifferentierade hiPSCs (ej visat, se referens 6). Detta kan också bekräftas genom analys av genuttryck av qPCR, vilket bör indikera en minskning av okt4 och nanog och uppreglering av neuronala gener, såsom neuralcelladhesionsmolekyl 1 (NCAM1) och mikrotubulärt associerat protein 2 (MAP2); Den presynaptiska genen, synaptofysin (SYP); Och den postsynaptiska genen, mikrotubuleassocierad protein tau (MAPT), såsom visas i < Stark klass = "xfig"> Figur 4I. Vidare är dopaminerga (TH och NR4A1), noradrenerga (PHOX2A och PHOX2B), glutamatergiska (NARG2, GRIA1 och GAP43), GABAergic (GABRA1 och GABRA3), motorneuroner (ISL1 och LHX3) och kolinerga (SLC5A7 och SLC18A13) -relaterade gener Resulterar i uppreglerade neuronala celler jämfört med odifferentierade celler ( Figur 4J ).
Analysen av spontan elektrisk aktivitet, med hjälp av MEA, är en värdefull avläsning för att bedöma funktionaliteten hos det neuronala nätverket i differentierade hiPSCs. Vid slutet av differentieringsperioden karakteriseras neuronderivat generellt av en genomsnittlig avfyringshastighet (MFR) på minst 60 spikar / min (se representativt rasterplot i figur 4K ). Brister observeras emellertid inte.
55702fig4.jpg "/>
Figur 4. Differentiering av IMR90-hiPSCs i blandade kulturer av neuroner och Glia. (A och B) Representativa bilder av rosetter efter 7 DIV (A) och efter 12 DIV (B) , färgade för nestin (grön) och β-III-tubulin (röd)). (C och D) Representativa bilder av differentierade celler efter 22 DIV (C) och 28 DIV (D) färgade för P-III-tubulin (röd) och NF200 (grön)). (E) Representativ bild av NSC som härrör från rosette-dissociation och expansion (inset visar nestin + celler, röd). (F och G) Representativa bilder av neuronala celler ( F , färgad för NF200 (röd) och Tau (grön)) och glialceller ( G , färgad för GFAP (röd)) differentierad från NSC (efter 21 DIV). (H) Kvantifiering av nestin, MAP2, GFAP, gamma-aminobutyrsyra (GABA), vesikulär glutamattransportör 1 (VGlut1) och tyrosinhydroxylas (TH) -positiva celler genom HCI, jämförande IMR90-hiPSC-derivat och celler differentierade från IMR90-hiPSC-härledda NSCs (graf modifierad från referens 7). (I och J) stapeldiagram som visar qPCR-analyser av pluripotensgener (okt4 och nanog) och neuronala gener (NCAM1, MAP2, SYP och MAPT) (I) och dopaminerg (TH och NR4A1), noradrenerga (PHOX2A och PHOX2B), Glutamatergisk (NARG2, GRIA1 och GAP43), GABAergic (GABRA1 och GABRA3), motor neuron (ISL1 och LHX3) och kolinerga (SLC5A7 och SLC18A13) -relaterade gener (J) . Alla analyser normaliserades till referensgenerna, p-aktin och GAPDH, och kalibrerades till odifferentierade celler (gröna staplar). Detta är ΔΔCt-metoden, med ett medelvärde av 5 oberoende analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Graferna i I och J modifierades från Referens 6. (K) Representativ rasterplot av IMR90-NSC-härledd neurOns (inspelningen utfördes i minst 600 s, de vertikala stavarna representerar enstaka spikar). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
En specifik signatur av neuronmarkörer uppreguleras i differentierade IMR90-hiPSCs
I det nya testmetoden för toxicitet är det viktigt att definiera molekylära och cellulära händelser som uppträder inom en cell efter exponering för en given toxicant. Därför är det relevant att karakterisera vilka signalvägar som aktiveras och / eller uppregleras inom den cellmodell som undersöks.
Kommersiellt tillgängliga arrays för analyserna av proteinkinasgenuttryck kan användas för att jämföra odifferentierade hiPSCs mot differentierade celler. differenTierade IMR90-hiPSC: er genomgår uppreglering av gener som är involverade i kontrollen av neurotrofinreceptorer, axonstyrningsreglering, neurit utväxtmodulation, glial-härledda neurotrofa faktor (GDNF) receptorer, benmorfogenetisk protein (BMP) / TGF-beta-väg och blodplätt- Härledda tillväxtfaktor (PDGF) receptorer ( Figur 5A och Figur 5B ).
Analysen av RPPA visar uppregleringen av en specifik neuronal signatur i differentierade IMR90-hiPSCs. I synnerhet aktiveras Erk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR och Notch1-signalvägar vid differentiering ( Figur 5C ).
Figur 5. Differentierade neuronala och glialceller visar aktiveringen av Neuron-relaterade vägar. (ENOch B) stapeldiagram rapporterar qPCR-analyserna av neuronrelaterade kinaser (A) och andra kinasrelaterade gener (B) . Genuttrycksdata normaliserades till referensgenerna 18S och GAPDH (som tillhandahålls i matrisen) och kalibrerades till odifferentierade celler. För dessa analyser betraktades en gen väsentligt uppreglerad när dess uttryck var minst 2x högre än i odifferentierade celler (2 -ΔΔCt ≥ 2); Medelvärde av 3 oberoende analyser ± SEM). (C) Stångdiagrammet visar de absoluta proteinkvantifieringarna med hjälp av RPPA-analys, jämförande differentierade (röda staplar) och odifferentierade celler (gröna staplar). Proteinerna som hör till samma signaleringsvägskaskader grupperas ihop enligt följande: CREB / Erk / Akt, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh och Wnt, SAPK / JNK och BMP / SMAD. Medel ± SEM av 4 oberoende analyser. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf modifierad fRom Referens 6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
IMR90-hiPSC-härledda neuronala / glialkulturer kan användas för att utvärdera effekterna av rotenon
Rotenon, en hämmare av komplexet I i mitokondriell andningskedja, är känt för att orsaka oxidativ stress genom att utlösa aktiveringen av Nrf2-vägen. Under lugna förhållanden förankras Nrf2 i cytoplasman av Keap1 (Kelch-liknande ECH-associerat protein 1), en Nrf2-repressor, vilket underlättar Nrf2-ubiquitinering och proteolys 15 . Vid induktion av oxidativ stress translaterar Nrf2 i kärnan och aktiverar uttrycket av Nrf2-ARE målgener 16 .
IMR90-hiPSC-härledda neuroner anD glialceller kan användas för att bedöma effekterna av rotenon på Nrf2-aktivering genom att exponera cellerna för olika koncentrationer av rotenon ( t ex 1, 10 och 100 nM) i 24 timmar. Dessa koncentrationer fastställdes enligt tidigare studier 17 , 18 .
Vid dessa koncentrationer och exponeringstider resulterade rotenon inte i cytotoxicitet, vilket framgår av kvantifieringen av levande DAPI + cellkärnor ( Figur 6A ). Rotenon inducerade nrf2-kärntransplacering, speciellt efter att cellerna exponerats till 100 nM rotenon ( Figur 6B och Figur 6E ). Vid samma koncentration observerades en signifikant minskning av cytoplasmatisk Keap1 ( Figur 6C ), tillsammans med en ökning i både NAD (P) H-kinonoxidoreduktas 1 (NQO1) och Sulfiredoxin 1 (SRXN1), två Nrf2-mål enZymes 19 , 20 ( Figur 6D ).
Figur 6. Effekter av Rotenone på Nrf2 Nukleär Translokation, Keap1, SRXN1 och NQO1 proteinnivåer. (A) Kvantifiering av levande DAPI + -celler ( dvs icke-pyknotiska kärnor) vid 24 h behandling med 1, 10, 100 nM rotenon och normaliserad till obehandlade celler (Control, Ctr). (B) NF2-proteinkärntransplokation ( dvs. kärn / cytoplasmiska förhållanden) efter 24 timmars exponering för rotenon, bedömd genom mätningar av fluorescensintensitet med användning av HCI-analys. (C) Kvantificering av cytoplasmatiska Keapl-proteinnivåer vid rotenonbehandling, bedömd genom HCI-analys. (D) Kvantifiering av NAD (P) H-kinonoxidoreduktas 1 (NQOl) och SulfiRedoxin 1 (SRXN1) genom immunofluorescens och HCI efter 24 timmars behandling med rotenon. (E) Representativa bilder av Nrf2 protein lokalisering (grön). Alla värden visas som medelvärdet ± SEM av 3 biologiska replikat. * P <0,05, ** p <0,01; Figur ändrad från referens 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Vid dessa koncentrationer och behandlingstider framkallade rotenon också en koncentrationsberoende ökning av astroglial (GFAP + ) cellprocent ( Figur 7A och Figur 7B ), utan att påverka proportionerna av NSC (nestin + ) och neuroner (MAP2 + ) ( Figur 7B ). Genom att titta på proportionerna av specifika neuronella subtyper, behandlades rotenonbehandling (10 nM och 100 nM)Signifikant minskade antalet dopaminerga neuroner (TH + ) ( Figur 7C och D ), medan procenttalen av GABAergic (GABA + ) och glutamatergiska (VGlut1 + ) neuroner inte förändrades ( Figur 7D ). Analogt har tidigare in vivo och in vitro- studier beskrivit en rotenonberoende och selektiv dopaminerg neuronal celldöd 21 , 22 , 23 .
Figur 7. Effekter av Rotenone på Glialceller och Dopaminerga Neuroner. (A) Representativa bilder av GFAP + -celler (röd), med 40X förstoring i insatserna, obehandlade eller behandlade med 100 nM rotenon i 24 timmar. (B) kvantifiering Av nestin + , MAP2 + och GFAP + -celler, normaliserade till obehandlade celler (kontroll, Ctr). (C) Representativa bilder av dopaminerga TH + neuroner (grön), med 40X förstoring i insatserna, obehandlade eller behandlade med 100 nM rotenon i 24 timmar. (D) Kvantifiering av GABA + , VGlut1 + och TH + neuronala celler, normaliserade till obehandlade celler (Ctr). Alla värden visas som medelvärdet ± SEM av 3 biologiska replikat. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figur ändrad från referens 7. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Statistisk signifikans bedömdes av envägs ANOVA med Dunnetts multipla jämförelsetest som ett eftertest (jämför alla kolumner kontra kontrollkolumnen)Xref "> 24 eller med två-tailed unpaired eller paired t-test enligt analystypen. Alla data representerar genomsnittet av minst tre biologiska replikat ± medelvärdet av medelvärdet (SEM). En asterisk över en streck indikerar En signifikant skillnad med kontrollgruppen. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Bord 1.
Observera dissocierad rosetpläteringstäthet: om rosettfragment inte ser fullständigt dissocierat, för att nå en cellpläteringstäthet av ca 15 000 celler / cm2, kan dissocierade rosettesfragment som härrör från ca 50 EBs / 1 x 60 mm-skål resuspenderas i 50 ml komplett NRI-medium och pläterat enligt följande (beroende på plattformen):
| Multiwell plattor / MEA | Tillväxtområde (cm 2 | Volym av cellsuspension till platta per brunn (eller MEA-chip) | Maximalt antal plåtar som kan pläteras (med 50 ml cell suspension) |
| 96 brunnar | 0,3 | 100 ul | 5 |
| 48 brunnar | 0,7 | 220 ul | 4 |
| 24 brunnar | 2 | 625 ul | 3 |
| 12 brunnar | 4 | 1,25 ml | 3 |
| 6 brunnar | 10 | 3.125 ml | 2 |
| Singelbrunn MEA-chip | 3,5 | 1,1 ml | 45 |
Tabell 2: Godkännande kriterier
| Markör /Antikropp | Procentandel (på DAPI + (levande) celler) efter 28 DIV |
| B-III-tubulin (Tuj1) | 35-45% |
| MAP2 | 50-60% |
| NF200 | 45-55% |
| GFAP | 10-25% |
| nestin | 15-25% |
Discussion
Detta arbete beskriver ett robust och relativt snabbt protokoll för differentieringen av IMR90-hiPSCs i postmittotiska neuroner och glialceller. Tidigare publicerade neuronal differentieringsprotokoll baserade på hESCs och hiPSCs ger vanligtvis höga procenttal av neurala prekursorer 25 , 26 och ett signifikant antal neuronala målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt är det här beskrivna differentieringsprotokollet lämpligt att alstra heterogena kulturer av GABAergic, glutamatergiska och dopaminerga neuronala celler, tillsammans med glia och en diskret andel av nestin + -celler. Närvaron av glutamatergiska (~ 35-42%) och GABAergic (~ 15-20%) neurala celler föreslår attDenna kultur har förekomst, kortikaliknande egenskaper och närvaron av ett diskret antal dopaminerga neuroner (~ 13-20%) kan också indikera midbrainspecificitet. Dessutom kan permanentiteten hos en blygsam mängd nestin + -celler vara lämplig för studier av neurogenes och de möjliga effekterna av kemikalier på NSC, vilka huvudsakligen är begränsade till både hippocampus och subventrikulära zonen (SVZ) hos förkärnan 34 . Ytterligare immunocytokemiska och genuttrycksanalyser skulle bidra till att bättre definiera den regionala specificiteten hos de differentierade cellderivaten.
De två mest kritiska stegen i differentieringsprotokollet som beskrivs i detta dokument är: (i) skärning av hiPSC-kolonier i homogena fragment (vilket är kritiskt för generering av EB med homogena storlekar) och (ii) skärning av neuroektodermala strukturer (rosetter ) För NSC-differentiering, vilket kräver betydande manuell skicklighetOch precision för att undvika att samla mesodermala och endodermala celler som kan minska proportionerna av neuroner och glialceller erhållna vid differentiering.
Det är avgörande att karakterisera fenotyperna hos cellerna under expansionen (som odifferentierade kolonier eller NSC) och under alla differentieringssteg. I synnerhet bör gen- och proteinuttrycksprofilerna för neuronala / glialcellderivaten uppvisa uppreglering och aktivering av neuronrelaterade signalvägar, medan uttrycket av pluripotensmarkörer bör minskas.
Genereringen av EB och neuroektodermala derivat (rosetter) kan vara manuellt utmanande och benägen att variabilitet. Av detta skäl utvecklade vi ett protokoll för expansion av rosett-härledda NSC och deras ytterligare differentiering i neuronala / glialceller.
Eventuella begränsningar av detta differentieringsprotokoll är huvudsakligen (i) den relativt låga procenten av dIfferenterade glialderivat och (ii) bristen på mogna neuronala nätverksfunktioner (som visas genom brist på brister). Dessutom kan specifika subpopulationer av astrocyter fungera som primära progenitorer eller NSC 35 . Medan nestin / GFAP-dubbelpositiva celler inte observerades i denna differentierade cellodling (data ej visad) antas det att GFAP + -cellerna i dessa blandade kulturer är astrocytiska progenitorer och astrocyter. Det är rimligt att genom att förlänga tiden för differentiering kan antalet astrocyter öka, och deras morfologi kan bli mer mogen, vilket redan indikerats av tidigare arbeten från Zhangs grupp 36 , 37 .
I det nya testmetoden för toxicitetstest är kunskap om kemiska inducerade störningar av biologiska vägar av yttersta vikt vid bedömning av kemisk motgång. Därför bör in vitro testsystem kunnaRelatera biverkningar till störningar av signalvägar, enligt begreppet biverkningsväg (AOP). Som ett bevis på konceptet kan rotenon användas för att bedöma aktiveringen av Nrf2-vägen, vilken är involverad i det cellulära försvaret mot oxidativ eller elektrofil stress 38 och oxidativ stress är en viktig och gemensam nyckelhändelse i olika AOPs relevanta för Utvecklings- och vuxen neurotoxicitet 39 .
Rotenon bör framkalla aktiveringen av Nrf2-vägen, som kan demonstreras genom Nrf2-proteinkärntransplokation och ökat uttryck av Nrf2-målenzymer, inklusive NQO1 och SRXN1. Det har visat sig att rotenon inducerar en dosberoende ökning av GFAP-proteinnivåer, vilket indikerar astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon minskar också antalet dopaminerga (TH + ) celler, vilket överensstämmer med previIn vitro och in vivo- studier som visar rotenonberoende dopaminergcelldöd, eftersom denna typ av neuron är särskilt känslig för oxidativ stress 21 , 22 , 23 .
Sammanfattningsvis är denna hiPSC-härledda neuron- och glialcellodlingsmodellen ett värdefullt verktyg för att bedöma de neurotoxiska effekterna av kemikalier som framkallar oxidativ stress vilket resulterar i Nrf2-vägens aktivering. Eftersom detta differentieringsprotokoll möjliggör generering av blandade kulturer av neuronala celler (GABAergic, dopaminerga och glutamatergiska neuroner) och astrocyter, kan det visa sig lämpligt för att studera crosstalk mellan neuroner och glia i fysiologiska och patologiska tillstånd, såsom i neurodegenerativa sjukdomar ( T.ex. Parkinsons sjukdom). Vidare kan förekomsten av en betydande andel av NSC-värdena bidra till att bedöma de möjliga effekterna av kemikalier på neurala progEnitors, som är kända för att vara huvudmålet för kemiskt inducerade mutationer eller virusinfektioner 42 .
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka doktor Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrike) för att tillhandahålla IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari och Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italien); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr Tiziana Santini (Italienska Tekniska Institutet, Rom), för att ge råd om immunfluorescensfärgningsutvärdering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo och Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italien), för deras bidrag till RPPA-analysen och antikroppsvalideringen. Finansiering: Detta arbete stöddes av det EU-finansierade projektet "SCR & Tox" (Grantavtal nr 266753).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete hiPSC medium: | |||
| mTeSR1 Basal Medium | Stem Cell Technologies | 05851 | (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8 °C for up to 2 weeks. 5x Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20 °C. Use frozen aliquots within 3 months. |
| mTeSR1 5x Supplements | Stem Cell Technologies | 05852 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of DMEM/F12 medium. |
| CryoStem Freezing Medium | Stemgent | 01-0013-50 | Freeze ~ 100 fragments/250 μL/vial (Step 1.2.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hiPSC EB medium: | |||
| Knockout DMEM | Thermo-Fisher | 10829-018 | (Step 2.1.7) |
| Knockout Serum Replacement (KOSR) | Thermo-Fisher | 10828-028 | 20% final concentration (Step 2.1.7) |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.1.7) |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7) |
| L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 2.1.7) |
| β-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 31350-010 | 50 µM final concentration (Step 2.1.7) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete neuroepithelial induction medium (NRI): | |||
| DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 2.3.1) |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.3.1) |
| N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.3.1) |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1) |
| Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/mL final concentration (Step 2.3.1) |
| bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 20 ng/mL final concentration added before use (Step 2.3.1) |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of cold DMEM/F12 medium. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1x. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Neuronal Differentiation medium (ND): | |||
| Neurobasal Medium | Thermo-Fisher | 21103049 | (Step 2.4.11) |
| B-27 Supplements (50x) | Thermo-Fisher | 17504044 | (Step 2.4.11) |
| N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.4.11) |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11) |
| GDNF | Thermo-Fisher | PHC7045 | 1 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
| BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural induction medium (NI): | |||
| DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 3.3) |
| Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 3.3) |
| N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 3.3) |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 3.3) |
| Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/mL final concentration (Step 3.3) |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Thermo-Fisher | 12587010 | (Step 3.3) |
| L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 3.3) |
| bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3) |
| EGF | Thermo-Fisher | PHG6045 | 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3) |
| BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3) |
| Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Thermo-Fisher | R007-100 | Pre-warm at 37 °C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10) |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo-Fisher | 15400054 | 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37 °C (Step 3.8) |
| CryoStor cell cryopreservation medium | Sigma-Aldrich | C2874-100ML | (Step 4.2) |
| Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis: | |||
| RNAqueous-Micro kit | Thermo-Fisher | AM1931 | (Step 5.1.6) |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits | Thermo-Fisher | 4368814 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo-Fisher | 4369016 | |
| GFAP | Thermo-Fisher | Hs00909233_m1 | |
| MAP2 | Thermo-Fisher | Hs00258900_m1 | |
| NQO1 | Thermo-Fisher | Hs02512143_s1 | |
| SRXN1 | Thermo-Fisher | Hs00607800_m1 | |
| HMOX1 | Thermo-Fisher | Hs01110250_m1 | |
| GSR | Thermo-Fisher | Hs00167317_m1 | |
| PAX6 | Thermo-Fisher | Hs01088112_m1 | |
| NES | Thermo-Fisher | Hs00707120_s1 | |
| GRIA1 | Thermo-Fisher | Hs00181348_m1 | |
| GAP43 | Thermo-Fisher | Hs00967138_m1 | |
| GABRA3 | Thermo-Fisher | Hs00968132_m1 | |
| GABRA1 | Thermo-Fisher | Hs00168058_m1 | |
| NR4A2 | Thermo-Fisher | Hs00428691_m1 | |
| TH | Thermo-Fisher | Hs00165941_m1 | |
| GAPDH | Thermo-Fisher | Hs02758991_g1 | |
| ACTB | Thermo-Fisher | Hs99999903_m1 | |
| MAPT | Thermo-Fisher | Hs00902194_m1 | |
| SYP | Thermo-Fisher | Hs00300531_m1 | |
| NANOG | Thermo-Fisher | Hs04260366_g1 | |
| POU5F1 (OCT4) | Thermo-Fisher | Hs04195369_s1 | |
| SOX1 | Thermo-Fisher | Hs01057642_s1 | |
| AFP | Thermo-Fisher | Hs00173490_m1 | |
| KRT18 | Thermo-Fisher | Hs01941416_g1 | |
| NPPA | Thermo-Fisher | Hs00383230_g1 | |
| T | Thermo-Fisher | Hs00610080_m1 | |
| NCAM1 | Thermo-Fisher | Hs00941821_m1 | |
| NR4A1 | Thermo-Fisher | Hs00374226_m1 | |
| PHOX2A | Thermo-Fisher | Hs00605931_mH | |
| PHOX2B | Thermo-Fisher | Hs00243679_m1 | |
| NARG2 | Thermo-Fisher | Hs00973298_g1 | |
| SLC18A3 | Thermo-Fisher | Hs00268179_s1 | |
| SLC5A7 | Thermo-Fisher | Hs00222367_m1 | |
| ISL1 | Thermo-Fisher | Hs00158126_m1 | |
| LHX3 | Thermo-Fisher | Hs01033412_m1 | |
| TaqMan Human Protein Kinase Array | Thermo-Fisher | 4418721 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies and reagents for immunostaining: | |||
| B-III-tubulin (Tuj1) | Covance | MMS-435P | 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used. |
| MAP2 | Sigma Aldrich | M4403 | 1:500 |
| NF200 | Sigma Aldrich | N4142 | 1:1000 |
| GFAP | Acris Antibodies GmbH | AP02002SU-N | 1:500 |
| Nestin | Sigma-Aldrich | N5413 | 1:200 |
| synaptophysin (SYN) | Abcam | AB14692 | 1:200 |
| Tau | Thermo-Fisher | MA5-12808 | 1:100 |
| Nrf2 | Abcam | AB62352 | 1:200 |
| Keap1 | Abcam | AB66620 | 1:200 |
| sulfiredoxin1 (SRXN1) | Abcam | AB92298 | 1:200 |
| NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) | Abcam | AB2346 | 1:200 |
| OCT4 | Millipore | MAB4401 | 1:100 |
| SSEA3 | Millipore | MAB4303 | 1:100 |
| Tra1-60 | Millipore | MAB4360 | 1:250 |
| Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | 1:200 |
| Gamma-aminobutyric acid (GABA) | Sigma-Aldrich | A0310 | 1:100 |
| Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) | Abcam | AB72311 | 1:500 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | 4% (4% formaldehyde can also be used) |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fisher | 14190144 | |
| Triton-X-100 Solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | 0.1% |
| BSA 35% | Sigma-Aldrich | A7979-50ML | 3.5% |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10040 | 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser. |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10166 | 1:500 |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10086 | 1:500 |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | Thermo-Fisher | 62248 | 1:1000 (Step 5.2.7) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA): | |||
| 4E-BP1 (S65) | Abcam | AB81297 | 1:250 (Note after step 5.2.8) |
| Akt (T308) | Cell Signaling | 9275 | 1:100 |
| Akt (S473) | Cell Signaling | 9271 | 1:100 |
| AMPKalpha (T172) | Cell Signaling | 2531 | 1:100 |
| AMPKbeta1 (S108) | Cell Signaling | 4181 | 1:100 |
| ATF-2 (T71) | Cell Signaling | 9221 | 1:100 |
| c-Jun (S63) | Cell Signaling | 9261 | 1:200 |
| c-Jun (S73) | Cell Signaling | 9164 | 1:200 |
| c-Kit (Y719) | Cell Signaling | 3391 | 1:250 |
| CREB (S133) | Cell Signaling | 9191 | 1:100 |
| EGFR (Y1068) | Cell Signaling | 2234 | 1:50 |
| ErbB2/HER2 (Y1248) | Cell Signaling | 2247 | 1:100 |
| ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) | Cell Signaling | 9101 | 1:2000 |
| GSK-3alpha (S21) | Cell Signaling | 9337 | 1:50 |
| Jak1 (Y1022/1023) | Cell Signaling | 3331 | 1:100 |
| Lck (Y505) | Cell Signaling | 2751 | 1:500 |
| LKB1 (S428) | Cell Signaling | 3051 | 1:100 |
| mTOR (S2448) | Cell Signaling | 5536 | 1:100 |
| NFkB p65 (S536) | Cell Signaling | 3031 | 1:50 |
| p70 S6 Kinase (T389) | Cell Signaling | 9205 | 1:200 |
| PDK1 (S241) | Cell Signaling | 3061 | 1:100 |
| PKA C (T197) | Cell Signaling | 4781 | 1:250 |
| PRAS40 (T246) | BioSource | 44-1100 | 1:2000 |
| PTEN (S380) | Cell Signaling | 9551 | 1:500 |
| Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) | Cell Signaling | 9511 | 1:500 |
| Src (Y527) | Cell Signaling | 2105 | 1:500 |
| Src Family (Y416) | Cell Signaling | 2101 | 1:200 |
| Stat1 (Y701) | Cell Signaling | 9171 | 1:200 |
| Stat3 (S727) | Cell Signaling | 9134 | 1:200 |
| Zap-70 (Y319) | Enogene | E011159 | 1:100 |
| βCatenin (S33/37/T41) | Cell Signaling | 9561 | 1:250 |
| CREB | Upstate Biotechnologies | 06-863 | 1:100 |
| Fos B | Cell Signaling | 2251 | 1:200 |
| GRB2 | Cell Signaling | 3972 | 1:2000 |
| HSP70 | Stressgen | SPA-810 | 1:100 |
| c-Jun | Cell Signaling | 9165 | 1:100 |
| Kip1/p27 | BD | 610241 | 1:100 |
| Lck | Cell Signaling | 2984 | 1:250 |
| Mcl-1 | Cell Signaling | 4572 | 1:80 |
| Musashi | Cell Signaling | 2154 | 1:100 |
| NOTCH1 | Cell Signaling | 3439 | 1:100 |
| PTEN | Cell Signaling | 9552 | 1:500 |
| SGK1 | Abnova | PAB4590 | 1:250 |
| Zap-70 | Cell Signaling | 2705 | 1:250 |
| β-Catenin | Abcam | AB32572 | 1:1000 |
| Dll4 | Abcam | AB7280 | 1:500 |
| Shh | Abcam | AB53281 | 1:250 |
| HIF-1α | BD | 610958 | 1:50 |
| NUMB PAN-ISO | Upstate Biotechnologies | 07-207 | 1:400 |
| NUMB-L | Chemicon | AB15145 | 1:750 |
| Cyclin B | BD | 610220 | 1:75 |
| c-Myc | Calbiochem | OP-10 | 1:100 |
| BCIP/NBT Kit | Thermo-Fisher | 002209 | (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies for Flow Cytometry: | |||
| SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate | Thermo-Fisher | MHCD1528 | 1:100 (Note after step 5.2.8) |
| SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | SSEA421 | 1:100 |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Specific instruments, tools and softwares: | |||
| Countess Automated Cell Counter | Thermo-Fisher | C10227 | Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used. |
| MEA1060-Inv-BC | Multichannel Systems | MEA1060-Inv-BC | (Step 5.3) |
| MEA1060-BC control software | Multichannel Systems | MEA1060-BC | (Step 5.3) |
| NeuroExplorer | Multichannel Systems | NeuroExplorer (NE) | (Step 5.3) For post-processing of MEA data |
| Multielectrode arrays (MEA) | Multichannel Systems | 60MEA100/10iR-Ti-gr | (Step 5.3) Single-well MEA chip |
| ArrayScan XTI High Content Platform | Thermo-Fisher | ASN00002P | (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo-Fisher | 4351405 | (Step 5.1.6) |
| BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) | BD | 328280 | (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1) |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | ThermoFisher | 23181010 | This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1) |
| Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) | Corning | 10010582 | (Step 2.1.8) Also other brands can be used. |
| Mr. Frosty Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562-1EA |
References
- NRC. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).
- Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
- Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges. Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).
- Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. Natural and artificial routes to pluripotency. Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Pistollato, F., et al. Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition. Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).
- Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells. Neurochem Int. , (2016).
- Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570 (2016).
- Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571 (2016).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Brien, P. J., et al. High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening. Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).
- Accordi, B., et al. Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL. PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).
- Vassallo, A., et al. A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing. Neurotoxicology. , (2016).
- Shamblott, M. J., et al. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).
- Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation. Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).
- Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease. Parkinsons Dis. , 314082 (2011).
- Kovac, S., et al. Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase. Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).
- Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons. J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).
- Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).
- Li, L., et al. Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling. Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).
- Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).
- Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation. Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).
- Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures. Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).
- Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm (2017).
- Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J Vis Exp. (96), e52495 (2015).
- Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells. Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).
- Parsons, X. H., et al. Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction. J Vis Exp. (56), e3273 (2011).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Zeng, H., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).
- Zeng, X., et al. An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Almeida, S., et al. Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons. Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).
- Urbán, N., Guillemot, F. Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles. Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).
- Krencik, R., Zhang, S. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
- Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).
- Bal-Price, A., et al. Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).
- Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone. Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).
- Swarnkar, S., et al. Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage. Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).
- Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).
