Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Protokol for differentieringen af ​​humane inducerede pluripotente stamceller i blandede kulturer af neuroner og glia til neurotoksicitetstestning

Published: June 9, 2017 doi: 10.3791/55702
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Directorate F - Health, Consumers and Reference Materials, Joint Research Centre

Summary

Humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) betragtes som et stærkt værktøj til lægemiddel- og kemisk screening og til udvikling af nye in vitro- modeller til toksicitetstestning, herunder neurotoksicitet. Her beskrives en detaljeret protokol for differentieringen af ​​hiPSC'er i neuroner og glia.

Abstract

Humane pluripotente stamceller kan differentiere i forskellige celletyper, som kan anvendes til humane-baserede in vitro toksicitetsanalyser. En stor fordel er, at omprogrammeringen af ​​somatiske celler til fremstilling af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) undgår de etiske og lovgivningsmæssige problemer i forbindelse med brugen af ​​humane embryonale stamceller (hESC'er). HiPSC'er kan udvides og effektivt differentieres til forskellige typer neuronale og glialceller, der tjener som testsystemer til toksicitetstestning og især til vurdering af forskellige veje involveret i neurotoksicitet. Dette værk beskriver en protokol til differentiering af hiPSC'er i blandede kulturer af neuronale og glialceller. Signalveje, der reguleres og / eller aktiveres ved neuronal differentiering, defineres. Disse oplysninger er kritiske for anvendelsen af ​​cellemodellen på det nye testparametre for toksicitet, hvor kemikalier vurderes ud fra deres evne til at peRturb biologiske veje. Som et bevis på konceptet blev rotenon, en inhibitor af mitokondriell respiratorisk kompleks I, anvendt til at vurdere aktiveringen af ​​Nrf2-signalvejen, en nøgleregulator af antioxidant-respons-elementet (ARE) -driven cellulær forsvarsmekanisme mod oxidativ stress .

Introduction

US National Research Council rapport 1 forestillede sig et nyt toksicitetsprøvningsparadigm, hvor reguleringstoksicitetsprøvning ville blive forskudt fra en tilgang baseret på fænotypiske ændringer observeret hos dyr til en tilgang, der fokuserede på mekanistiske in vitro- analyser ved anvendelse af humane celler. Pluripotente stamceller (PSC) derivater kan repræsentere alternativer til cancercellemodeller, da de opnåede celler kan ligner de fysiologiske betingelser af humane væv mere og tilvejebringe mere relevante værktøjer til at studere kemisk inducerede bivirkninger. De to hovedtyper af PSC-kulturer, der er mest lovende for toksicitetstestning, er humane embryonale stamceller (hESC'er) og humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er), som i øjeblikket er meget udbredt inden for grundforskning og regenerativ medicin 2 , 3 . Denne ekspertise kan nu udnyttes til udvikling af en ny klasse toxicoloGiske in vitro tests med det formål at identificere de forstyrrede fysiologiske veje involveret i udviklingen af ​​bivirkninger in vivo . Testmetoder for lovgivningsmæssige sikkerhedsvurderinger baseret på hESC'er vil sandsynligvis ikke blive accepteret af alle EU-medlemsstater og lande over hele verden på grund af mulige etiske bekymringer og forskellige nationale lovgivningspolitikker, der regulerer brugen af ​​embryonafledte celler.

HiPSC'er deler egenskaber svarende til hESCs 4 , 5 og har stort potentiale for in vitro- metoder, både til identifikation af terapeutiske mål samt for sikkerhedsvurderinger. Derudover mindsker hiPSC-teknologien begrænsningerne i en begrænset donorpulje og de etiske problemer forbundet med embryoafledte celler. En stor udfordring for hiPSC'er er demonstrationen om, at disse celler reproducerbart kan danne et signifikant udvalg af toksikologisk relevante cellederivater,Med karakteristika og reaktioner, der er typiske for humane væv. Predefinerede niveauer af de markerede markører anvendes generelt til at karakterisere cellepopulationer efter differentieringsprocessen og give indsigt i stabiliteten af ​​differentieringsprocessen.

Tidligere værker vurderede HiPSC'ernes egnethed til at generere blandede kulturer af neuronale og glialceller og for at vurdere virkningerne af rotenon, en inhibitor af mitokondrielle respiratoriske kompleks I, ved aktiveringen af ​​Nrf2-vejen, en nøgleregulator af antioxidantforsvarsmekanismer i Mange celletyper 6 , 7 .

Dette arbejde beskriver en protokol, der anvendes til differentiering af hiPSC'er i blandede neuronale og gliale kulturer, idet der gives detaljer om signalveje (gen- og proteinniveau), som aktiveres ved neuronal / glialdifferentiering. Derudover viser arbejdet repræsentative resultater, der viser, hvordan detteHiPSC-afledt neuronal og glialcellemodel kan anvendes til vurdering af Nrf2-signalaktivering induceret ved akut (24-h) behandling med rotenon, hvilket muliggør vurdering af oxidativ stressinduktion.

IMR90 fibroblaster blev omprogrammeret til hiPSC'er ved I-Stem (Frankrig) ved viral transduktion af 2 transkriptionsfaktorer (Oct4 og Sox2) ved anvendelse af pMIG-vektorer 6 . Analoge hiPSC-modeller kan også anvendes. De nedenfor beskrevne protokoller opsummerer alle stadier af differentiering af hiPSC'er til neurale stamceller (NSC'er) og yderligere i blandede kulturer af postmittotiske neuroner og gliaceller (trin 1 og 2, se også EURL ECVAM DBALM-webstedet for en detaljeret beskrivelse af Protokollen) 8 .

En yderligere protokol til isolering, ekspansion, kryopreservering og yderligere differentiering af NSC'er i blandede neuroner og glialceller er beskrevet i trin 3 og 4 (se også EURL ECVAM DBALM viBsite for en detaljeret beskrivelse af denne protokol) 9 . Trin 5 beskriver de analyser, der kan gøres for at vurdere cellernes fænotypiske identitet under de flere faser af engagement og differentiering.

Protocol

1. Human induceret pluripotent stamcelle (hiPSC) ekspansion

BEMÆRK: hiPSC'er kan dyrkes på et egnet proteinblandingssubstrat i nærværelse af mTeSR1-medium indeholdende mTeSR1 5x-supplerer (fremstillet efter producentens anvisninger; plade ~ 100 kolonifragmenter / 60 mm petriskål). Når hiPSC-kolonierne når en passende størrelse (se et eksempel på en koloni i figur 2A ), passage cellerne som beskrevet nedenfor (en gang om ugen).

  1. Belægningsskåle med hESC-kvalificeret kældermembranmatrix (herefter kaldet "kvalificeret matrix") eller ethvert andet egnet proteinsubstrat.
    1. Opbevar den kvalificerede matrix (se Materialetabellen ) ved -80 ° C i 200 μl alikvoter i kolde 1,5 ml rør og kolde 5 eller 10 ml pipetter.
    2. Tør 200 μL kvalificeret matrix på is inden passage.
    3. Fortynd 200 μL kvalificeret matrix i 20 mL DMEM / F12 medium (1: 100 fortynding).
    4. Coat 60 mm petriskåle med denne opløsning (5 ml / skål).
    5. Inkubér overtrukne retter ved 37 ° C i mindst 1 time.
  2. HiPSC-kolonifragment cryopreservering og optøning
    1. Efter at ha klippet hiPSC-kolonierne (se trin 1.3 for hiPSC-koloni-skæreproceduren) resuspenderes hiSHC-kolonifragmenterne forsigtigt og langsomt i stamcellefrysemedium, ~ 100 fragmenter / 250 μL (se Materialetabellen).
    2. Aliquot kolonifragmenterne i egnede hætteglas til kryopreservering (250 μl / hætteglas).
    3. Anbring hætteglassene i en beholder fyldt med 2-propanol, og anbring beholderen ved -80 ° C i mindst 2 timer og op til 2 uger.
    4. Overfør hætteglassene i dampfasen af ​​en flydende nitrogentank.
    5. For at genstarte kulturen, tina 1 frosset hætteglas i vandbad ved 37 ° C.
    6. Hent forsigtigt hiPSC-kolonifragmenterne i 7 ml forvarmet komplet hiPSCMedium (se Materialetabellen ) i et 15 ml rør under anvendelse af en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    7. Centrifuge hiPSC-kolonifragmenterne ved 130 xg i 3 minutter.
    8. Fjern supernatanten og forsigtigt resuspendere hiPSC-kolonifragmenterne i 1 ml komplet hiPSC-medium ved anvendelse af en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    9. Yderligere fortynd cellesuspensionen i 3 eller 4 ml komplet hiPSC medium.
    10. Plad hiPSC-kolonifragmenterne i en kvalificeret matrixbelagt 60 mm petriskål (~ 100 fragmenter / skål, belæg opskålene som beskrevet i trin 1.1).
    11. Inkuber hiPSC'erne ved 37 ° C og 5% CO 2 .
    12. Udfør en samlet mellemlang forandring hver dag.
  3. Passering af hiPSC-kolonierne
    BEMÆRK: Ikke-differentierede hiPSC'er skal være runde i form med store nukleoler og uden rigelig cytoplasma. Udifferentierede kolonier bør karakteriseres af en flad og tæt pakket morfologi. Kun udifferentierede kolonier (ca. 1 mm iN diameter) skal skæres til yderligere passage.
    1. Skær stamcellekolonierne i kvadrater på ca. 200 μm x 200 μm ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål eller andre kommercielt tilgængelige værktøjer (se Materialetabellen). Brug et stereoskopisk mikroskop ved 4x forstørrelse i et laminært flowskabe ved stuetemperatur.
    2. Løs kolonifragmenterne fra fadfladen ved hjælp af en pipette på 200 μl ved forsigtigt pipettering af mediet under for at løfte stykkerne.
    3. Overfør kolonifragmenterne (~ 100 stykker) til en kvalificeret matrix-DMEM / F12-belagt plade fyldt med 4 ml komplet hiPSC-medium (se Materialetabellen; belæg opskiven som beskrevet i trin 1.1).
    4. Inkuber den nye plade (r) ved 37 ° C og 5% CO 2 .
    5. Udfør en total medieændring hver dag og inspicer koloniernes morfologi ved hjælp af et fase-kontrastmikroskop ved 4X og 10X forstørrelser.

2. HiPSC DiffereNtiation i blandede neuroner og glia

BEMÆRK: Proceduren tager cirka 28 dage at fuldføre, med de vigtigste trin skitseret i Figur 1 (øverste del).

figur 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af neuronal differentieringsprotokol. (Øverste del) IMR90-hiPSC kolonier kan skæres i fragmenter for at danne embryoidlegemer (EBs). Efter 2 dage in vitro (DIV) kan EB'er pletteres på laminin- eller standardmatrix-coatede retter og dyrkes i nærvær af neuroepitelial induktions (NRI) medium til dannelse af neuroektodermale derivater (rosettes, her farvet til nestin (grøn) og β -III-tubulin (rød)). Rosetter kan dissocieres, opsamles, replikeres på laminin- eller standardmatrixbelagte retter og yderligere differentieres til modent neuronal (NF200, rød) og glial(GFAP, grønne) celler i nærvær af neuronal differentierings (ND) medium. (Nedre del) roset-afledte NSC'er (nestin, rød) kan udvides i nærvær af neuralt induktions (NI) medium, kryopreserveret eller yderligere differentieret i nærværelse af ND-medium til dannelse af blandet neuronalt (NF200, grønt) og glial GFAP, rød) kulturer. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Generering af embryoidlegemer (EBs) (Dage 0 → 1)
    BEMÆRK: Denne procedure kræver god manuel færdighed og præcision. HiPSC-kolonifragmenter bør være lige store for at opnå homogene embryoidlegemer (EB'er) i de næste trin. Morfologisk differentierede kolonier (med store cytoplasmiske fraktioner og små nukleoler) bør kasseres.
    1. Opdater hiPSC-mediet (3 ml / 60 mm petriskål) inden skæring af de udifferentierede hiPSC kolonier (ca. 1 mm i diameterEter, se figur 2A ) under sterile betingelser (som beskrevet i trin 1).
    2. Skær de udifferentierede kolonier (som vist i figur 2A og figur 2B ) i fragmenter på ca. 200 μm x 200 μm ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 30 G nål. Brug et stereoskopisk mikroskop ved 4X forstørrelse i et laminar flowskabe ved stuetemperatur.
    3. Løs kolonifragmenterne fra opvaskens overflade ved hjælp af en pipette på 200 μl ved forsigtigt pipetteringsmedium nedenunder for at løfte stykkerne.
    4. Overfør alle løsne fragmenter og mediet til et 15 ml rør ved hjælp af en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    5. Skyl parabol med 2 ml komplet hiPSC medium for at genvinde alle fragmenter.
    6. Centrifuge ved 112 xg i 1 min.
    7. Aspirer supernatanten og forsigtigt resuspender fragmenterne i 5 ml komplet hiPSC EB medium (se Materialetabellen ).
    8. Plate coLonyfragmenter i en 60 mm ultra-lav vedhæftning petriskål (5 ml / 60 mm petriskål).
    9. Inkubér petriskålen natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
    10. På den næste dag (dag 1) samles EB'erne og deres medium i et 15 ml rør ved hjælp af en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    11. Centrifug EB'erne ved 112 xg i 1 min.
    12. Sug forsigtigt supernatanten og forsigtigt resuspender EB'erne i 5 ml komplet hiPSC EB medium ved anvendelse af en 1, 2 eller 5 ml pipette.
    13. Udskift EB'erne på en ny 60 mm ultra-lav vedhæftning petriskål (5 ml / 60 mm petriskål).
    14. Inkubér petriskålen natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. På dag 1 belægge opvasken med kældermembranmatrix ( f.eks . Matrigel, herefter benævnt "standardmatrix") eller ethvert andet egnet proteinsubstrat ( f.eks . Laminin).
    1. Opbevar standardmatrixen (se Materialebordet ) ved -80 ° C200 μl alikvoter ved anvendelse af kolde 1,5 ml rør og kolde 5 eller 10 ml pipetter.
    2. Optø 200 μL standardmatrix på is.
    3. Fortynd 200 μl standardmatrix i 20 ml DMEM / F12-medium (1: 100 fortynding).
    4. Coat 60 mm petriskåle med denne opløsning (5 ml / skål).
    5. Inkubér de overtrukne retter ved 37 ° C natten over.
      BEMÆRK: Disse retter vil blive brugt til at plade EB'erne (ca. 50 EB'er / skål) og generere neuroepithelialaggregater (rosettes); Se trin 2.3.
  3. Generering af neuroepithelialaggregater (rosettes) (Dage 2 → 7)
    1. På dag 2 skal du fjerne standardmatrixbelægningsløsningen fra 60 mm petriskålene (behøver ikke at skylle pladerne) og fylde dem med 5 ml / skål af komplet neuroepithelial induktionsmedium (NRI); Se materialebordet .
    2. Overfør de flydende EB'er (fra trin 2.1.14) til coatede retter (~ 50 EB'er / skål) ved hjælp af en 200 μL pipette under en stereoskopisk miCroscope ved 4x forstørrelse og placeret i et laminært strømskab.
      BEMÆRK: Det er afgørende at vælge homogene mellemstore EB'er (~ 200-300 μm i diameter). For-små EB'er må muligvis ikke overleve godt under neuroektodermal differentiering, mens for store EB'er har tendens til at gennemgå kernenekrose.
    3. Inkubér opvasken ved 37 ° C og 5% CO 2 .
    4. Dagen efter (dag 3) kontrolleres tallerknerne under mikroskopet med 10x forstørrelse for at sikre, at EB'erne er vedhæftet.
    5. Forsigtig udføre en samlet mellemændring med komplet NRI-medium.
    6. Skift NRI-medium hver anden dag frem til dag 7, når neuroepithelialaggregater (rosetter) skal være synlige.
    7. På dag 7 blev standardmatrix (eller laminin), som beskrevet i trin 2.2, på et hvilket som helst ønsket plade eller skålformat: 96-brøndsplader (100 μl / brønd), 24 brøndsplader (250 μl / brønd), 12- Brøndplader (500 μl / brønd), MEA-chips (til elektrisk aktivitet, 1 mL / single-well chip) eller 60 mm Petri disheS (4 ml / skål).
    8. Inkubér de overtrukne plader / skåle i mindst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
  4. Rosette dissociation og neuronal differentiering (Dage 8 → 28)
    BEMÆRK: Denne procedure kræver god manuel færdighed og præcision. For at undgå at indsamle mesodermale og endodermale celler, bør kun ektoderm-rosetlignende strukturer dissocieres og opsamles.
    1. På dag 8 skærer de rosetlignende strukturer i fragmenter under et stereoskopisk mikroskop ved 10X forstørrelse i sterile forhold. Brug en 1 ml sprøjte med en 30 G nål. Bemærk, at rosetterne har tendens til nemt at løsne fra fadet, når de berøres med nålen.
    2. Udfør løsningen af ​​rosetfragmenterne ved hjælp af en 200 μl pipette.
    3. Overfør skålen under laminarstrømshætten og opsaml rosetfragmenterne og deres medium i et 15 ml konisk rør under anvendelse af en 1, 2 eller 5 ml pipette. Skyl skålen med 2 ml NRI-medium for at genvindeAlle fragmenter.
    4. Spin ned rosetfragmenterne ved 112 xg i 2 minutter.
    5. Aspirere supernatanten.
    6. Resuspender pelleten forsigtigt i 1 ml 1x DPBS (uden calcium og magnesium) og pipetter rosetfragmenterne forsigtigt op og ned ved hjælp af en 1000 μl pipette for delvist at dissociere dem.
    7. Tilsæt 4 ml komplet NRI-medium og tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og en automatiseret celletæller (se Materialetabellen )
      BEMÆRK: Fortynd 20 μl cellesuspension i 20 μl Trypan Blue. Dette trin kan udelades, hvis cellerne ikke kan bringes i en enkeltcellesuspension. Hvis rosetfragmenterne ikke ser helt dissocierede, kan rosettesfragmenter afledt fra ca. 50 EBs / 60 mm skål resuspenderes i 50 ml komplet NRI-medium og belægges som angivet i tabel 1 .
    8. Aspirer standardmatrix (eller laminin) belægningsopløsningen fra petriskålene, pladerne og / eller MEA-chipsene (fra trin 2.3.7). Lad dem ikke tørre.
    9. Plader cellerne i komplet NRI-medium ifølge studieplanen (ca. 15.000 celler / cm2, se tabel 1 for plating volumenindikationer).
    10. Inkubér pladerne natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
    11. På dag 10 udfører du en total mellemændring ved hjælp af komplet neuronal differentieringsmedium (ND); Se materialebordet.
    12. Opdater det komplette ND-medium to gange om ugen til dag 28.
    13. Karakteriserer neuronal / glialcellederivaterne som beskrevet i trin 5 (se tabel 2 for generelle acceptkriterier).

3. HiPSC-afledt neural stamcelle (NSC) Udvidelse og differentiering i blandede neuroner og Glia

BEMÆRK: NSC'er afledt af rosettefragmenter kan udvides og vedligeholdes efter proceduren beskrevet nedenfor ( Figur 1 , nederste del). Dette giver mulighed for at øge thE antal celler til differentiering og kemisk testning.

  1. Coat en 60 mm petriskål (eller en T-25 kolbe) med 5 ml standardmatrix DMEM / F12 belægningsløsning og inkuber den i mindst 2 timer ved 37 ° C og 5% CO2 (som beskrevet i trin 2.2).
  2. Spin ned rosetfragmenterne afledt fra trin 1-2 (se trin 2.4.) I et konisk 15 ml rør ved 112 xg i 2 minutter.
  3. Resuspender pelleten forsigtigt i 5 ml neuralt induktionsmedium (NI); Se materialebordet.
  4. Overfør cellerne på en standardmatrixcoated 60 mm petriskål (eller T-25 kolbe).
  5. Kultur-roset-afledte NSC'er i nærvær af NI-medium, forfriskende mediet hver anden dag, indtil cellerne når sammenflydelse.
  6. Når de er sammenflydende, passerer NSC'erne som beskrevet i de følgende trin.
    BEMÆRK: Passere NSC'erne omkring en gang om ugen; Overveje at bruge friskbelagte retter, kolber eller plader afhængigt af studieplanen.
  7. Fjern det komplette NI medium og gentlSkyl NSC'erne med DPBS (uden calcium og magnesium).
  8. Tilsæt 1,5 ml 0,05% trypsin-EDTA forvarmet til 37 ° C til 60 mm petriskålen (eller T-25 kolben) indeholdende cellerne og anbring den i inkubatoren i 1 minut.
  9. Tryk let på skålen (eller kolben) for at løsne cellerne.
  10. Tilsæt 1,5 ml trypsininhibitor forvarmet til 37 ° C og overfør cellerne til et 15 ml rør.
  11. Skyl petriskålen (eller T-25 kolben) med et lige stort volumen NI-medium (1,5 ml) og opsaml volumenet i det samme 15 ml rør.
  12. Centrifuger cellerne ved 130 xg i 3 minutter.
  13. Fjern supernatanten og resuspender cellerne forsigtigt i 1 ml komplet NI-medium ved anvendelse af en 1000 μl pipette.
  14. Yderligere fortynder cellesuspensionen i 3 eller 4 ml komplet NI-medium og tæller cellerne ved hjælp af trypanblåt og en automatiseret celletæller.
  15. Plad NSC'erne på 60 mm petriskålen (eller T-25 kolben) fra trin 3.1 ved en tæthed på ca. 50.000 celler / cm2.
  16. Karakteriserer cellerne for tilstedeværelsen af ​​neuronale / glialcellederivater som beskrevet i trin 5.
    BEMÆRK: NSC'er kan differentieres til blandede kulturer af neuroner og glia i komplet ND-medium (som beskrevet i trin 2.4.11-2.4.13), forfriskning af det komplette ND-medium to gange om ugen i 21 dage.

4. HiPSC-afledt NSC-kryopreservering og optøning

BEMÆRK: Ved passage kan NSC'er fryses og genoptøves efter denne procedure.

  1. Centrifuge passagerede NSC'er (fra trin 3.12) ved 130 xg i 3 min.
    BEMÆRK: Cellerne skal tælles i trin 3.14.
  2. Genanvælg forsigtigt og langsomt NSC'erne ved 3 x 10 6 / ml frysemedium (se Materialetabellen ).
  3. Aliquot cellerne i egnede hætteglas til cryopreservering (ca. 0,5 ml = 1,5 x 106 / hætteglas).
  4. Placer hætteglassene i en beholder fiFyldt med 2-propanol og anbring beholderen ved -80 ° C i mindst 2 timer og op til 2 uger.
  5. Overfør hætteglassene til dampfasen af ​​en flydende nitrogentank.
  6. For at genstarte cellekulturen, optøn 1 frosne hætteglas i et vandbad ved 37 ° C.
  7. Saml forsigtigt cellerne i 7 ml forvarmet komplet NI-medium i et 15 ml rør ved anvendelse af en 1000 μl pipette.
  8. Centrifuger cellerne ved 130 xg i 3 minutter.
  9. Fjern supernatanten og resuspender cellerne forsigtigt i 1 ml komplet NI-medium ved anvendelse af en 1000 μl pipette.
  10. Yderligere fortynder cellesuspensionen i 3 eller 4 ml komplet NI-medium og tæller cellerne ved hjælp af trypanblåt og en automatiseret celletæller (bemærk: fortynd 20 μl cellesuspension i 20 μL trypanblå, idet levedygtigheden efter optøning skal være ≥ 80 %).
  11. Plader NSC'erne i en belagt 60 mm petriskål (eller T25 kolbe) ved en tæthed på ca. 50.000 celler / cm2.

5. CharaCterisering af hiPSC-afledte neuronale og gliale celler

BEMÆRK: Ved differentiering kan neuronale og glialderivater karakteriseres ved anvendelse af forskellige teknikker, såsom dem, der er beskrevet i de følgende afsnit.

  1. Kvantitative real-time PCR (qPCR) analyser 10
    1. Spin ned hiPSC-kolonifragmenter, EB'er og / eller NSC'er ved 130 xg i 3 minutter.
    2. Resuspender cellepelleten i 100 μl kold RNA lysis buffer tilvejebragt i et egnet kit til RNA ekstraktion.
    3. Alternativt indsamler neuronale / glialderivater direkte fra pladerne ved at aspirere mediet og tilsætte kold RNA lysisbuffer til brøndene for at samle cellerne.
    4. Isolér RNA'en efter producentens anvisninger.
    5. Omvendt transkribe 500 ng af det totale RNA ved anvendelse af et egnet kit til RNA til cDNA retrotransskription.
    6. Kør qPCR reaktioner i to eksemplarer ved brug af passende master mix og primerSæt (se Materialetabellen ).
    7. Optag fluorescerende emission i realtid: 45 cykler med primere annealing ved 60 ° C.
    8. Normaliser de relative RNA-mængder til GAPDH og β-actin som referencegener og anvend ikke-differentierede hiPSC'er eller ubehandlede celler til kalibreringsbetingelserne (ΔΔCt-metode). Alternativt kan du bruge en anden egnet metode.
  2. Immunocytokemi og billeddannelse med høj indhold (HCI) 6 , 11
    1. Fastgør hiPSC kolonierne, NSC'er og / eller neuronale / glialderivater med kold 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
    2. Vask forsigtigt cellerne i 1X PBS og opbevar pladerne ved 4 ° C i op til 1 måned.
    3. Ved klar til farvning permeabiliseres cellerne i permeabiliseringsbuffer (1x DPBS indeholdende 0,1% triton-X-100 og 3% BSA) i 15 minutter ved stuetemperatur.
    4. Fjern permeabiliseringen buFfer og inkuber cellerne i blokerende buffer (3% BSA / 1X DPBS) i 15 min ved stuetemperatur for at forhindre den uspecifikke binding af antistoffer.
    5. Fjern blokeringsbufferen og inkuber cellerne natten over ved 4 ° C i blokeringsbuffer indeholdende egnede primære antistoffer (se Materialetabellen ).
    6. Vask cellerne 3 gange med 1x PBS.
    7. Inkubér cellerne i 45 minutter ved stuetemperatur i blokeringsbuffer indeholdende fluorokromkonjugerede sekundære antistoffer (se Materialetabellen ), der modvirker kernerne med DAPI-farvestof.
    8. Kvantificere den gennemsnitlige fluorescensintensitet og de relative procentsatser af celletyper ved hjælp af en egnet billeddannelsesplatform med høj indhold, hvis det foreligger (se Materialetabellen ).
      NOTER: For at bestemme intensitetsniveauet af den fluorescerende baggrund inkuberes nogle celler / brønde alene med sekundære antistoffer. Den flowcytometriske analyse af levende (ikke fast), undIfferentiated hiPSCs kan udføres for at vurdere ekspressionen af ​​PSC-specifikke markører, såsom SSEA4 (se Materialetabellen ). Ikke-differentierede hiPSC-kolonier kan analyseres for alkalisk phosphataseaktivitet ved anvendelse af kommercielt tilgængelige BCIP / NBT-kits efter fabrikantens anvisninger (se Materialetabellen ). Derudover kan assays og analyser af omvendt faseprotein (RPPA) udføres som beskrevet i reference 12 (for en liste over testede antistoffer, se Materialetabellen ).
  3. Elektrofysiologiske målinger 13
    1. Plad de dissocierede rosettefragmenter (efter 7 DIV) eller NSC'er afledt af rosettes på coatede multielektrode arrays (MEAs, se Materialetablet ) i komplet ND-medium (~ 1 x 10 5 celler / enkeltbrønd MEA-chip).
    2. Differentier cellerne i 3 uger i komplet ND medium, forfriskende thE medium to gange om ugen.
    3. Ved afslutningen af ​​differentieringen forsegles MEA-chipsene med en semipermeabel membran under en laminær strømningshætte for at holde kulturen steril til gentagne målinger.
    4. Udskift en af ​​elektroderne med en jordreference, hvilket giver mulighed for optagelser fra de resterende elektroder.
    5. Optag den gennemsnitlige brændhastighed (MFR; antal spidser / min) ved hjælp af en MEA forstærker med den integrerede temperatur processtyring justeret til 37 ° C og 5% CO2.
    6. Opdag toppe fra MEA rå data ved hjælp af tærskelgrænse på -4,7σ (σ repræsenterer standardafvigelsen for basalstøj).
    7. Behandle dataene efter optagelse med en passende software.

Representative Results

Karakterisering af udifferentierede hiPSC'er

For at vurdere fænotypen af ​​hiPSC'erne bør analysen af ​​koloni / cellemorfologi, bestemmelsen af ​​PSC-specifikke markører og undersøgelsen af ​​genekspression og alkalisk phosphataktivitet udføres. Ikke-differentierede hiPSC'er bør være runde, med store nukleoler og uden rigelig cytoplasma. Størstedelen af ​​kolonierne skal karakteriseres af en flad og tæt pakket morfologi, der tyder på en udifferentieret fænotype ( figur 2A og figur 2B ). Derudover bør over 80% af kolonierne være positive for farvning af alkalisk phosphataseaktivitet ( figur 2C ).

Ca. 80% af cellerne skal være positive for klassiske pluripotensrelaterede markører, såsom okt. 4, sSEA3, SSEA4 og Tra1-60 ( Figur 2D-H ) som vist ved immuncytokemi og flowcytometri, mens procentdele af nestin + og β-III-Tubulin + celler burde være signifikant lave (ca. 8% og 3% Som vist i figur 2H ). Disse resultater bør reproduceres over passager.

Figur 2
Figur 2. Karakterisering af ikke-differentierede IMR90-hiPSC'er. (A og B) Repræsentative fasekontrastbilleder (10X og 20X forstørrelser) af udifferentierede IMR90-hiPSC kolonier. (C) repræsentative billeder af alkaliske phosphatase-farvede kolonier (4X forstørrelse). (DF) Repræsentative immuncytokemiske billeder af (D) Oct4 (rød), (E) SSEA3 (grøn) og (F) TrA1-60 (grøn). (G) Repræsentativ punktplot af SSEA1 (CD15) og SSEA4 farvning, analyseret ved flowcytometri. (H) Stregdiagrammet viser procentsatserne Oct4 + (~ 75-80%), Tra1-60 + (~ 75-80%), SSEA3 + (~ 75-80%), nestin + (~ 10-15% ) Og β-III-tubulin + (~ 3-7%) celler modstrækkes med DAPI og kvantificeres ved HCI med et gennemsnit på 3 til 5 biologiske replikater ± SEM (graf modificeret fra reference 6). Klik her for at se en større version af denne figur.

Vurdering af pluripotens via EB-dannelse

HiPSC'er er pluripotente, hvilket betyder at de udtrykker tre kimlagrelaterede gener under passende betingelser. For at vurdere hiPSC pluripotency er det muligt at anvende en fællesTilgang baseret på spontan EB-dannelse, hvilket inducerer dannelsen af ​​de tre kimenlag 14 . Analyser af kimlagsspecifikke gener skal indikere en tidsafhængig forøgelse af endoderm (α-fetoprotein (AFP) og cytytatin 18 (KRT18)), ectoderm (Nestin, SRY-boks 1 (Sox1) og parret boks 6 (Pax6) ) Og mesoderm (natriuretisk peptid A (NPPA) og Brachyury-T) -relateret genekspression ( Figur 3A og Figur 3B ); Se materialebordet.

Figur 3
Figur 3. Vurdering af pluripotens ved EB-dannelse. (A) Repræsentativt fasekontrastbillede af EB'er på dag 1. (B) Stanggrafen viser qPCR-analyser af mesodermalt (NPPA og brachyury), ectodermalt (Pax6, Sox1 og nestin) og endodermalt (AFP og KRT18 ) Gener, normaliseret til referencegenerne, p-actin og GAPDH og kalibreret til udifferentierede celler (dag 0). Dette er ΔΔCt-metoden med et middel på 5 uafhængige analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf ændret fra Reference 6. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Induktion af neuronal og glial differentiering

IMR90-iPSC'er kan differentieres i blandede kulturer af postmittotiske neuroner og glialceller som følge af trinene opsummeret i figur 1 og i protokolafsnittene. 5-8 dage efter plating af EB'erne på standardmatrix- eller lamininbelagte retter i nærvær af komplet NRI-medium, bør rosetlignende strukturer begynde at blive synlige (= "Xfig"> Figur 4A). Rosetter er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​nestin + celler (neuronprecursorer, ~ 90%), med få β-III-tubulin + celler (engagerede neuronale celler, ~ 5 - 10%), sidstnævnte lokaliseres hovedsagelig i periferien af Rosettes ( figur 4B , rosettes på dag 12).

Ved rosette-dissociation og replikering på laminin- eller standardmatrix-coatede retter eller plader i nærvær af komplet ND-medium, begynder cellerne at differentiere sig i blandede kulturer af neuroner og glia, der progressivt danner klynger af neuronelle cellekropper forbundet med bundter af neuritter ( figur 4C og figur 4D ). Lignende resultater bør opnås ved analyse af neuronpopulationer opnået ved at udvide roset-afledte NSC'er og differentiere dem til neuroner og glia. NSC'er udvidet fra rosetter bør være nEstin + ( figur 4E , indsats, der viser nestin + celler).

Efter 21 dages differentiering bør cellerne være positive for P-III-tubulin; NF200; tau; Og MAP2, den senke markør for dendritter ( figur 4D , 4F og figur 4H) med mindst 10-15% af cellerne positive for glialfibrillærsyrproteinet (GFAP), en astroglial markør ( figur 4G og figur 4H) . Desuden bør ~ 20-30% af cellerne bibeholde ekspressionen af ​​nestin efter differentiering ( Figur 4H ). Det er vigtigt at overveje, at procentdelen af ​​hver celletype ( dvs. neuron, astrocyt, nestin + celler) kan variere over passager, og brugerafhængig variabilitet kan observeres.

Ved at analysere specifikke neuronale subpopulationer repræsenterer GABAergiske neuronerSendte ~ 15-20% af de totale celler, dopaminerge neuroner ~ 13-20% og glutamatergiske neuroner ~ 35-42% som vist ved immunfarvning for gamma-aminosmørsyre (GABA), tyrosinhydroxylase (TH) og vesikulært glutamat Transportør 1 (VGlut1) (se den repræsentative kvantificering i figur 4H ). Induktionen af ​​differentiering kan også vurderes ved analyse af pluripotensrelaterede markører ( fx Oct4, Tra1-60 og SSEA3), som skal nedjusteres betydeligt i differentierede celler versus udifferentierede hiPSC'er (ikke vist, se Reference 6). Dette kan også bekræftes ved analyse af genekspression ved qPCR, hvilket skulle indikere et fald i okt4 og nanog og opregulering af neuronale gener, såsom neurale celleadhæsionsmolekyle 1 (NCAM1) og mikrotubulærassocieret protein 2 (MAP2); Det presynaptiske gen, synaptophysin (SYP); Og det postsynaptiske gen, mikrotubulærassocieret protein tau (MAPT), som vist i < Stærk klasse = "xfig"> Figur 4I. Endvidere er dopaminerge (TH og NR4A1), noradrenerge (PHOX2A og PHOX2B), glutamatergiske (NARG2, GRIA1 og GAP43), GABAergic (GABRA1 og GABRA3), motorneuroner (ISL1 og LHX3) og cholinerge (SLC5A7 og SLC18A13) -relaterede gener Resulterer i opregulerede neuronceller sammenlignet med udifferentierede celler ( figur 4J ).

Analysen af ​​spontan elektrisk aktivitet ved hjælp af MEA er en værdifuld udlæsning for at vurdere funktionaliteten af ​​neuronalt netværk i differentierede hiPSC'er. Ved afslutningen af ​​differentieringsperioden karakteriseres neuronderivater generelt ved en gennemsnitlig brændhastighed (MFR) på mindst 60 spikes / min (se det repræsentative raster-plot i figur 4K ). Imidlertid observeres ikke udbrud.

55702fig4.jpg "/>
Figur 4. Differentiering af IMR90-hiPSC'er i blandede kulturer af neuroner og Glia. (A og B) Repræsentative billeder af rosetter efter 7 DIV (A) og efter 12 DIV (B) , farvet til nestin (grøn) og β-III-tubulin (rød)). (C og D) Repræsentative billeder af differentierede celler efter 22 DIV (C) og 28 DIV (D) farvet for P-III-tubulin (rød) og NF200 (grøn)). (E) Repræsentativt billede af NSC'er afledt af rosette dissociation og expansion (indsæt viser nestin + celler, rød). (F og G) Repræsentative billeder af neuronale celler ( F , farvet til NF200 (rød) og Tau (grøn)) og glialceller ( G , farvet til GFAP (rød)) differentieret fra NSC'er (efter 21 DIV). (H) Kvantificering af nestin, MAP2, GFAP, gamma-aminosmørsyre (GABA), vesikulær glutamattransportør 1 (VGlut1) og tyrosinhydroxylase (TH) -positive celler ved HCI, sammenligning af IMR90-hiPSC-derivater og celler differentieret fra IMR90-hiPSC-afledte NSC'er (graf modificeret fra reference 7). (I og J) Stregdiagrammer, der viser qPCR-analyser af pluripotensgener (Oct4 og Nanog) og neuronale gener (NCAM1, MAP2, SYP og MAPT) (I) og af dopaminerg (TH og NR4A1), noradrenerg (PHOX2A og PHOX2B) Glutamatergic (NARG2, GRIA1 og GAP43), GABAergic (GABRA1 og GABRA3), motor neuron (ISL1 og LHX3) og cholinerge (SLC5A7 og SLC18A13) -relaterede gener (J) . Alle analyser blev normaliseret til referencegenerne, β-actin og GAPDH og kalibreret til udifferentierede celler (grønne søjler). Dette er ΔΔCt-metoden, med et gennemsnit på 5 uafhængige analyser ± SEM * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Graferne i I og J blev modificeret fra Reference 6. (K) Representative raster-plot af IMR90-NSC-afledt neurOns (optagelsen blev udført i mindst 600 s, de vertikale stænger repræsenterer enkelte pigge). Klik her for at se en større version af denne figur.

En specifik signatur af neuronmarkører opreguleres i differentierede IMR90-hiPSC'er

I det nye testparametre for toksicitet er det vigtigt at definere de molekylære og cellulære hændelser, der opstår i en celle efter udsættelse for en given toksicitet. Derfor er det relevant at karakterisere hvilke signalveje der aktiveres og / eller opreguleres inden for den undersøgte cellulære model.

Kommercielt tilgængelige arrays til analyserne af proteinkinase-genekspression kan anvendes til at sammenligne udifferentierede hiPSC'er versus differentierede celler. differenTierede IMR90-hiPSC'er undergår opregulering af gener involveret i kontrollen af ​​neurotrofinreceptorer, axonvejledningsregulering, neurit vækstudstrømningsmodulation, glial-afledt neurotrofisk faktor (GDNF) receptorer, knoglemorfogenetisk protein (BMP) / TGF-beta pathway og blodplade- Afledte vækstfaktor (PDGF) receptorer ( Figur 5A og Figur 5B ).

Analysen af ​​RPPA viser opreguleringen af ​​en specifik neuronal signatur i differentierede IMR90-hiPSC'er. Isk / CREB, Akt / PDK1 / mTOR og Notch1 signalveje aktiveres især ved differentiering ( figur 5C ).

Figur 5
Figur 5. Differentierede neuronale og glialceller viser aktiveringen af ​​Neuron-relaterede veje. (ENOg B) Bargrafer rapporterer qPCR-analyserne af neuronrelaterede kinaser (A) og andre kinase-relaterede gener (B) . Gene-ekspressionsdata blev normaliseret til referencegenerne 18S og GAPDH (tilvejebragt i arrayet) og kalibreret til utifferentierede celler. Til disse analyser blev et gen anset for signifikant opreguleret, når dets ekspression var mindst 2x højere end i udifferentierede celler (2 -ΔΔCt ≥ 2); Middel af 3 uafhængige analyser ± SEM). (C) Søjlediagrammet viser de absolutte proteinkvantifikationer ved hjælp af RPPA-analyse, sammenligning af differentierede (røde søjler) og udifferentierede celler (grønne søjler). Proteinerne, der tilhører de samme signaleringsbanekaskader, grupperes sammen som følger: CREB / Erk / Akt, PDK1 / mTOR / Erk / Akt, Notch1, Shh og Wnt, SAPK / JNK og BMP / SMAD. Mean ± SEM af 4 uafhængige analyser. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Graf modificeret fRom Reference 6. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

IMR90-hiPSC-afledte neuronale / gliale kulturer kan anvendes til at vurdere virkningerne af rotenon

Rotenon, en inhibitor af kompleks I i mitokondriel respiratorisk kæde, er kendt for at forårsage oxidativ stress ved at udløse aktiveringen af ​​Nrf2-banen. Under hvile betingelser er Nrf2 forankret i cytoplasmaet af Keap1 (Kelch-lignende ECH-associeret protein 1), en Nrf2-repressor, som letter Nrf2 ubiquitination og proteolyse 15 . Ved induktion af oxidativ stress translaterer Nrf2 i kernen og aktiverer ekspressionen af ​​Nrf2-ARE målgener 16 .

IMR90-hiPSC-afledte neuroner anD glialceller kan bruges til at vurdere virkningerne af rotenon på Nrf2-aktivering ved at udsætte cellerne for forskellige koncentrationer af rotenon ( f.eks. 1, 10 og 100 nM) i 24 timer. Disse koncentrationer blev fastslået ifølge tidligere undersøgelser 17 , 18 .

Ved disse koncentrationer og eksponeringstidspunkter resulterede rotenon ikke i cytotoksicitet, som det fremgår af kvantificeringen af ​​levende DAPI + -cellekerner ( figur 6A ). Rotenon inducerede nrf2-nukleær translokation, især efter udsættelse af cellerne til 100 nM rotenon ( figur 6B og figur 6E ). Ved samme koncentration blev der observeret et signifikant fald i cytoplasmatisk Keap1 ( figur 6C ) sammen med en stigning i både NAD (P) H-quinonoxidoreduktase 1 (NQO1) og Sulfiredoxin 1 (SRXN1), to Nrf2-mål enZymes 19 , 20 ( figur 6D ).

Figur 6
Figur 6. Effekter af Rotenone på Nrf2-nukleær translokation, Keap1, SRXN1 og NQO1 protein niveauer. (A) Kvantificering af levende DAPI + -celler ( dvs. ikke-pyknotiske kerner) efter 24 timer behandling med 1, 10, 100 nM rotenon og normaliseret til ubehandlede celler (Control, Ctr). (B) Nuclear translokation nrf2 ( dvs. nukleare / cytoplasmiske forhold) efter 24 timers eksponering for rotenon, vurderet ved målinger af fluorescensintensitet ved anvendelse af HCI-analyse. (C) Kvantificering af cytoplasmatiske Keap1-proteinniveauer ved rotenonbehandling, vurderet ved HCI-analyse. (D) Kvantificering af NAD (P) H-quinonoxidoreduktase 1 (NQO1) og SulfiRedoxin 1 (SRXN1) ved hjælp af immunofluorescens og HCI efter 24 timers behandling med rotenon. (E) Repræsentative billeder af Nrf2 protein lokalisering (grøn). Alle værdier vises som middel ± SEM af 3 biologiske replikater. * P <0,05, ** p <0,01; Figur ændret fra Reference 7. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Ved disse koncentrationer og behandlingstider fremkaldte rotenon også en koncentrationafhængig forøgelse af astroglial (GFAP + ) celleprocent ( Figur 7A og Figur 7B ) uden at påvirke proportionerne af NSC'er (nestin + ) og neuroner (MAP2 + ) ( Figur 7B ). Ved at se på proportionerne af specifikke neuronale subtyper, blev rotenonbehandling (10 nM og 100 nM)Signifikant faldt antallet af dopaminerge neuroner (TH + ) ( figur 7C og D ), mens procentandelen af ​​GABAergic (GABA + ) og glutamatergiske (VGlut1 + ) neuroner ikke ændrede sig ( Figur 7D ). Analogt har tidligere in vivo og in vitro undersøgelser beskrevet en rotenonafhængig og selektiv dopaminerg neuronal celledød 21 , 22 , 23 .

Figur 7
Figur 7. Virkninger af Rotenone på Glialceller og Dopaminerge Neuroner. (A) Repræsentative billeder af GFAP + -celler (rød), med 40X forstørrelse i indsætningerne, ubehandlet eller behandlet med 100 nM rotenon i 24 timer. (B) kvantificering Af nestin + , MAP2 + og GFAP + celler, normaliseret til ubehandlede celler (kontrol, Ctr). (C) Repræsentative billeder af dopaminerge TH + neuroner (grøn), med 40X forstørrelse i indsætningerne, ubehandlet eller behandlet med 100 nM rotenon i 24 timer. (D) Kvantificering af GABA + , VGlut1 + og TH + neuronale celler, normaliseret til ubehandlede celler (Ctr). Alle værdier vises som middel ± SEM af 3 biologiske replikater. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; Figur ændret fra Reference 7. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Statistisk betydning blev vurderet ved envejs ANOVA med Dunnett's Multiple Comparison Test som en post-test (sammenligning af alle kolonner versus kontrol kolonnen)Xref "> 24 eller ved to-tailed unpaired eller paired t-test i henhold til typen af ​​analyse. Alle data repræsenterer gennemsnittet af mindst tre biologiske replikater ± standardfejl af middelværdien (SEM). En asterisk over en bar indikerer En signifikant forskel med kontrolgruppen. * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

Tabel 1.
Bemærkning om dissocieret rosetpletterdensitet: Hvis rosetfragmenter ikke ser fuldstændigt dissocieret, for at nå en cellepletteringstæthed på ca. 15.000 celler / cm2 kan dissocierede rosettesfragmenter, der hidrører fra ca. 50 EBs / 1 x 60 mm skål, resuspenderes i 50 ml komplet NRI-medium og belagt som følger (afhængigt af pladeformatet):

Multiwell plader / MEA Vækstområde (cm 2 Volumen af ​​cellesuspension til plade pr. Brønd (eller MEA-chip) Maksimalt antal plader, der kan pletteres (med 50 ml cellesuspension)
96 brønde 0,3 100 μl 5
48 brønde 0,7 220 ul 4
24 brønde 2 625 μl 3
12 brønde 4 1,25 ml 3
6 brønde 10 3.125 ml 2
Single well MEA chip 3.5 1,1 ml 45

Tabel 2: Acceptanskriterier

Marker /antistof Procentdel (på DAPI + (levende) celler) efter 28 DIV
B-III-tubulin (Tuj1) 35-45%
MAP2 50-60%
NF200 45-55%
GFAP 10-25%
nestin 15-25%

Discussion

Dette værk beskriver en robust og forholdsvis hurtig protokol til differentiering af IMR90-hiPSC'er i postmittotiske neuroner og glialceller. Tidligere offentliggjorte neuronal differentieringsprotokoller baseret på hESC'er og hiPSC'er giver sædvanligvis høje procentdele af neurale forstadier 25 , 26 og et signifikant antal neuronale målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt er den her beskrevne differentieringsprotokol egnet til at danne heterogene kulturer af GABAergic, glutamatergiske og dopaminerge neuronale celler sammen med glia og en diskret andel af nestin + -celler. Tilstedeværelsen af ​​glutamatergiske (~ 35-42%) og GABAergic (~ 15-20%) neurale celler antyder atDenne kultur besidder forebrain, cortical-lignende træk og tilstedeværelsen af ​​et diskret antal dopaminerge neuroner (~ 13-20%) kan også indikere midbrainspecificitet. Endvidere kan permanensen af ​​en beskeden andel af nestin + celler vise sig egnet til undersøgelsen af ​​neurogenese og de mulige virkninger af kemikalier på NSC'er, der primært er begrænset til både hippocampus og subventriculær zone (SVZ) hos forræderen 34 . Yderligere immunocytokemiske og genekspression analyser ville bidrage til bedre at definere de regionale specificiteter af de differentierede cellederivater.

De to mest kritiske trin i differentieringsprotokollen beskrevet i dette dokument er: (i) opskæring af hiPSC-kolonier i homogene fragmenter (hvilket er kritisk for dannelsen af ​​EB'er med homogene størrelser) og (ii) opskæring af neuroektodermale strukturer (rosetter ) Til NSC differentiering, hvilket kræver betydelig manuel færdighedOg præcision for at undgå at indsamle mesodermale og endodermale celler, som kan reducere proportionerne af neuroner og glialceller opnået ved differentiering.

Det er afgørende at karakterisere fænotyperne af cellerne under ekspansion (som udifferentierede kolonier eller NSC'er) og under alle differentieringsstrin. Navnlig bør gen- og proteinekspressionsprofilerne af neuronale / glialcellederivaterne vise opregulering og aktivering af neuronrelaterede signalveje, medens ekspressionen af ​​pluripotensmarkører skal nedsættes.

Genereringen af ​​EB'er og neuroektodermale derivater (rosettes) kan være manuelt udfordrende og udsat for variabilitet. Af denne grund udviklede vi en protokol til udvidelse af rosetteafledte NSC'er og deres yderligere differentiering i neuronale / glialceller.

Mulige begrænsninger af denne differentieringsprotokol er hovedsageligt (i) den relativt lave procentdel af dIfferentiated glialderivater og (ii) manglen på modne neuronale netværksfunktioner (som vist ved manglende udbrud). Desuden kan specifikke subpopulationer af astrocytter fungere som primære progenitorer eller NSC'er 35 . Mens nestin / GFAP dobbelt-positive celler ikke blev observeret i denne differentierede cellekultur (data ikke vist), er det hypotetiseret, at GFAP + -cellerne i disse blandede kulturer er astrocytiske stamceller og astrocytter. Det er plausibelt, at antallet af astrocytter kan øges, og at deres morfologi bliver mere moden, som allerede angivet ved tidligere værker fra Zhangs gruppe 36 , 37 ved at forlænge differentieringstiden.

I det nye testparametre for toksicitet er viden om kemisk inducerede forstyrrelser af biologiske veje yderst vigtig, når man vurderer kemisk modgang. Derfor bør in vitro testsystemer kunneRelaterer bivirkninger til forstyrrelser af signalveje, i henhold til begrebet negative bane (AOP). Som et bevis på konceptet kan rotenon bruges til at vurdere aktiveringen af ​​Nrf2-banen, som er involveret i det cellulære forsvar mod oxidativ eller elektrofil stress 38 , og oxidativ stress er en vigtig og fælles nøglebegivenhed i forskellige AOP'er, der er relevante for Udviklingsmæssige og voksne neurotoksicitet 39 .

Rotenon bør fremkalde aktiveringen af ​​Nrf2-vejen, hvilket kan påvises ved Nrf2-proteinkernetransplacering og øget ekspression af Nrf2-mål-enzymer, herunder NQO1 og SRXN1. Det har vist sig, at rotenon inducerer en dosisafhængig forøgelse af GFAP-proteinniveauer, hvilket indikerer astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon reducerer også antallet af dopaminerge (TH + ) celler, som er i overensstemmelse med previIn vitro og in vivo undersøgelser, der viser rotenonafhængig dopaminerge celledød, da denne type neuron er særligt følsom over for oxidativ stress 21 , 22 , 23 .

Som konklusion er denne hiPSC-afledte neuronale og glialcellekulturmodel et værdifuldt værktøj til at vurdere de neurotoksiske virkninger af kemikalier, som fremkalder oxidativt stress, der resulterer i Nrf2-pathwayaktivering. Da denne differentieringsprotokol tillader generering af blandede kulturer af neuronale celler (GABAergic, dopaminergic og glutamatergic neurons) og astrocytter, kan det vise sig egnet til at studere krydset mellem neuroner og glia i fysiologiske og patologiske tilstande, såsom i neurodegenerative sygdomme ( Fx Parkinsons sygdom). Endvidere kan tilstedeværelsen af ​​en betydelig andel af NSC'er bidrage til at vurdere de mulige virkninger af kemikalier på neurale progEnitors, som er kendt for at være det primære mål for kemisk inducerede mutationer eller virusinfektioner 42 .

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrig) for at give IMR90-hiPSC'erne; Dr. Giovanna Lazzari og Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italien); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr. Tiziana Santini (Italiensk Institut for Teknologi, Rom) for at give råd om immunfluorescensfarvningsevaluering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo og Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italien) for deres bidrag til RPPA-analysen og antistoffvalidering. Finansiering: Dette arbejde blev støttet af det EU-finansierede projekt "SCR & Tox" (tilskudsaftale nr. 266753).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium Stem Cell Technologies 05851 (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8 °C for up to 2 weeks. 5x Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20 °C. Use frozen aliquots within 3 months.
mTeSR1 5x Supplements Stem Cell Technologies 05852
Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium Stemgent 01-0013-50 Freeze ~ 100 fragments/250 μL/vial (Step 1.2.1)
Name Company Catalog Number Comments
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM Thermo-Fisher 10829-018 (Step 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR) Thermo-Fisher 10828-028 20% final concentration (Step 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 2.1.7)
β-Mercaptoethanol Thermo-Fisher 31350-010 50 µM final concentration (Step 2.1.7)
Name Company Catalog Number Comments
Complete neuroepithelial induction medium (NRI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 2.3.1)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 2.3.1)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 20 ng/mL final concentration added before use (Step 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 μL aliquots and store them in -80 °C. For coating, dilute 200 μL aliquot in 20 mL of cold DMEM/F12 medium.
Laminin Sigma-Aldrich L2020 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1x.
Name Company Catalog Number Comments
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium Thermo-Fisher 21103049 (Step 2.4.11)
B-27 Supplements (50x) Thermo-Fisher 17504044 (Step 2.4.11)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11)
GDNF Thermo-Fisher PHC7045 1 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
Name Company Catalog Number Comments
Neural induction medium (NI):
DMEM/F12 Thermo-Fisher 3133-038 (Step 3.3)
Non-Essential Amino Acids Thermo-Fisher 11140-035 (Step 3.3)
N2 Supplement Thermo-Fisher 17502-048 (Step 3.3)
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fisher 15140-122 50 U/mL final concentration (Step 3.3)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg Sigma-Aldrich H3149-100KU 2 µg/mL final concentration (Step 3.3)
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Thermo-Fisher 12587010 (Step 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution Thermo-Fisher 25030-081 2 mM final concentration (Step 3.3)
bFGF Thermo-Fisher 13256-029 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
EGF Thermo-Fisher PHG6045 10 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
BDNF Thermo-Fisher PHC7074 2.5 ng/mL final concentration. Added before use (Step 3.3)
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) Thermo-Fisher R007-100 Pre-warm at 37 °C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10)
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Thermo-Fisher 15400054 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37 °C (Step 3.8)
CryoStor cell cryopreservation medium Sigma-Aldrich C2874-100ML (Step 4.2)
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
Name Company Catalog Number Comments
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis:
RNAqueous-Micro kit Thermo-Fisher AM1931 (Step 5.1.6)
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits Thermo-Fisher 4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo-Fisher 4369016
GFAP Thermo-Fisher Hs00909233_m1
MAP2 Thermo-Fisher Hs00258900_m1
NQO1 Thermo-Fisher Hs02512143_s1
SRXN1 Thermo-Fisher Hs00607800_m1
HMOX1 Thermo-Fisher Hs01110250_m1
GSR Thermo-Fisher Hs00167317_m1
PAX6 Thermo-Fisher Hs01088112_m1
NES Thermo-Fisher Hs00707120_s1
GRIA1 Thermo-Fisher Hs00181348_m1
GAP43 Thermo-Fisher Hs00967138_m1
GABRA3 Thermo-Fisher Hs00968132_m1
GABRA1 Thermo-Fisher Hs00168058_m1
NR4A2 Thermo-Fisher Hs00428691_m1
TH Thermo-Fisher Hs00165941_m1
GAPDH Thermo-Fisher Hs02758991_g1
ACTB Thermo-Fisher Hs99999903_m1
MAPT Thermo-Fisher Hs00902194_m1
SYP Thermo-Fisher Hs00300531_m1
NANOG Thermo-Fisher Hs04260366_g1
POU5F1 (OCT4) Thermo-Fisher Hs04195369_s1
SOX1 Thermo-Fisher Hs01057642_s1
AFP Thermo-Fisher Hs00173490_m1
KRT18 Thermo-Fisher Hs01941416_g1
NPPA Thermo-Fisher Hs00383230_g1
T Thermo-Fisher Hs00610080_m1
NCAM1 Thermo-Fisher Hs00941821_m1
NR4A1 Thermo-Fisher Hs00374226_m1
PHOX2A Thermo-Fisher Hs00605931_mH
PHOX2B Thermo-Fisher Hs00243679_m1
NARG2 Thermo-Fisher Hs00973298_g1
SLC18A3 Thermo-Fisher Hs00268179_s1
SLC5A7 Thermo-Fisher Hs00222367_m1
ISL1 Thermo-Fisher Hs00158126_m1
LHX3 Thermo-Fisher Hs01033412_m1
TaqMan Human Protein Kinase Array Thermo-Fisher 4418721
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies and reagents for immunostaining:
B-III-tubulin (Tuj1) Covance MMS-435P 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used.
MAP2 Sigma Aldrich M4403 1:500
NF200 Sigma Aldrich N4142 1:1000
GFAP Acris Antibodies GmbH AP02002SU-N 1:500
Nestin Sigma-Aldrich N5413 1:200
synaptophysin (SYN) Abcam AB14692 1:200
Tau Thermo-Fisher MA5-12808 1:100
Nrf2 Abcam AB62352 1:200
Keap1 Abcam AB66620 1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1) Abcam AB92298 1:200
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) Abcam AB2346 1:200
OCT4 Millipore MAB4401 1:100
SSEA3 Millipore MAB4303 1:100
Tra1-60 Millipore MAB4360 1:250
Tyrosine hydroxylase (TH) Millipore AB152 1:200
Gamma-aminobutyric acid (GABA) Sigma-Aldrich A0310 1:100
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) Abcam AB72311 1:500
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G 4% (4% formaldehyde can also be used)
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo-Fisher 14190144
Triton-X-100 Solution Sigma-Aldrich 93443-100ML 0.1%
BSA 35% Sigma-Aldrich A7979-50ML 3.5%
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate Thermo-Fisher SA5-10040 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser.
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10166 1:500
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate Thermo-Fisher SA5-10086 1:500
DAPI Solution (1 mg/mL) Thermo-Fisher 62248 1:1000 (Step 5.2.7)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA):
4E-BP1 (S65) Abcam AB81297 1:250 (Note after step 5.2.8)
Akt (T308) Cell Signaling 9275 1:100
Akt (S473) Cell Signaling 9271 1:100
AMPKalpha (T172) Cell Signaling 2531 1:100
AMPKbeta1 (S108) Cell Signaling 4181 1:100
ATF-2 (T71) Cell Signaling 9221 1:100
c-Jun (S63) Cell Signaling 9261 1:200
c-Jun (S73) Cell Signaling 9164 1:200
c-Kit (Y719) Cell Signaling 3391 1:250
CREB (S133) Cell Signaling 9191 1:100
EGFR (Y1068) Cell Signaling 2234 1:50
ErbB2/HER2 (Y1248) Cell Signaling 2247 1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) Cell Signaling 9101 1:2000
GSK-3alpha (S21) Cell Signaling 9337 1:50
Jak1 (Y1022/1023) Cell Signaling 3331 1:100
Lck (Y505) Cell Signaling 2751 1:500
LKB1 (S428) Cell Signaling 3051 1:100
mTOR (S2448) Cell Signaling 5536 1:100
NFkB p65 (S536) Cell Signaling 3031 1:50
p70 S6 Kinase (T389) Cell Signaling 9205 1:200
PDK1 (S241) Cell Signaling 3061 1:100
PKA C (T197) Cell Signaling 4781 1:250
PRAS40 (T246) BioSource 44-1100 1:2000
PTEN (S380) Cell Signaling 9551 1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) Cell Signaling 9511 1:500
Src (Y527) Cell Signaling 2105 1:500
Src Family (Y416) Cell Signaling 2101 1:200
Stat1 (Y701) Cell Signaling 9171 1:200
Stat3 (S727) Cell Signaling 9134 1:200
Zap-70 (Y319) Enogene E011159 1:100
βCatenin (S33/37/T41) Cell Signaling 9561 1:250
CREB Upstate Biotechnologies 06-863 1:100
Fos B Cell Signaling 2251 1:200
GRB2 Cell Signaling 3972 1:2000
HSP70 Stressgen SPA-810 1:100
c-Jun Cell Signaling 9165 1:100
Kip1/p27 BD 610241 1:100
Lck Cell Signaling 2984 1:250
Mcl-1 Cell Signaling 4572 1:80
Musashi Cell Signaling 2154 1:100
NOTCH1 Cell Signaling 3439 1:100
PTEN Cell Signaling 9552 1:500
SGK1 Abnova PAB4590 1:250
Zap-70 Cell Signaling 2705 1:250
β-Catenin Abcam AB32572 1:1000
Dll4 Abcam AB7280 1:500
Shh Abcam AB53281 1:250
HIF-1α BD 610958 1:50
NUMB PAN-ISO Upstate Biotechnologies 07-207 1:400
NUMB-L Chemicon AB15145 1:750
Cyclin B BD 610220 1:75
c-Myc Calbiochem OP-10 1:100
BCIP/NBT Kit Thermo-Fisher 002209 (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used.
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies for Flow Cytometry:
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate Thermo-Fisher MHCD1528 1:100 (Note after step 5.2.8)
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 Thermo-Fisher SSEA421 1:100
Name Company Catalog number Comments
Specific instruments, tools and softwares:
Countess Automated Cell Counter Thermo-Fisher C10227 Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used.
MEA1060-Inv-BC Multichannel Systems MEA1060-Inv-BC (Step 5.3)
MEA1060-BC control software Multichannel Systems MEA1060-BC (Step 5.3)
NeuroExplorer Multichannel Systems NeuroExplorer (NE) (Step 5.3) For post-processing of MEA data
Multielectrode arrays (MEA) Multichannel Systems 60MEA100/10iR-Ti-gr (Step 5.3) Single-well MEA chip
ArrayScan XTI High Content Platform Thermo-Fisher ASN00002P (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition
7900HT Fast Real-Time PCR System Thermo-Fisher 4351405 (Step 5.1.6)
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) BD 328280 (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1)
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool ThermoFisher 23181010 This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1)
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) Corning 10010582 (Step 2.1.8) Also other brands can be used.
Mr. Frosty Freezing container Sigma-Aldrich C1562-1EA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. NRC. Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).
  2. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  3. Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges. Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).
  4. Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. Natural and artificial routes to pluripotency. Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).
  5. Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
  6. Pistollato, F., et al. Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition. Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).
  7. Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells. Neurochem Int. , (2016).
  8. Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570 (2016).
  9. Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from: https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571 (2016).
  10. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  11. Brien, P. J., et al. High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening. Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).
  12. Accordi, B., et al. Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL. PLoS One. 5 (10), e13552 (2010).
  13. Vassallo, A., et al. A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing. Neurotoxicology. , (2016).
  14. Shamblott, M. J., et al. Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).
  15. Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation. Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).
  16. Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease. Parkinsons Dis. , 314082 (2011).
  17. Kovac, S., et al. Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase. Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).
  18. Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons. J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).
  19. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).
  20. Li, L., et al. Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling. Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).
  21. Cannon, J. R., et al. A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).
  22. Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation. Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).
  23. Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures. Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).
  24. Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm (2017).
  25. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).
  26. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J Vis Exp. (96), e52495 (2015).
  27. Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells. Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).
  28. Parsons, X. H., et al. Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction. J Vis Exp. (56), e3273 (2011).
  29. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  30. Zeng, H., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5 (7), e11853 (2010).
  31. Zeng, X., et al. An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection. Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).
  32. Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  33. Almeida, S., et al. Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons. Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).
  34. Urbán, N., Guillemot, F. Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles. Front Cell Neurosci. 8, 396 (2014).
  35. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  36. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).
  37. Krencik, R., Zhang, S. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  38. Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress. J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).
  39. Bal-Price, A., et al. Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity. Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).
  40. Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone. Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).
  41. Swarnkar, S., et al. Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage. Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).
  42. Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).

Tags

Udviklingsbiologi udgave 124 humant induceret pluripotente stamceller differentiering neuroner glia neurotoksicitet Nrf2-pathway aktivering
Protokol for differentieringen af ​​humane inducerede pluripotente stamceller i blandede kulturer af neuroner og glia til neurotoksicitetstestning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pistollato, F., Canovas-Jorda, D.,… More

Pistollato, F., Canovas-Jorda, D., Zagoura, D., Price, A. Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing. J. Vis. Exp. (124), e55702, doi:10.3791/55702 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter