Summary
הנה, הוא הוכיח כיצד באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) ניתן להשתמש כדי לזהות ולחזות אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון בין כספומט p53 בתרביות תאים ההשעיה חשופים ללחץ genotoxic.
Abstract
תגובת הנזק לדנ"א מנצלת את תיקון נגעי הדנ"א המתרחשים באופן ספונטני, נגרמת על ידי לחץ גנוטוקסי, או מופיעים בהקשר של הפסקות DNA מתוכנות בלימפוציטים. הטכנולוגיות של קינאז מוטאקס (ATM-ATM) ו- Ataxia-Telangiectasia מוטציות (ATM), ATM ו- Rad3-Related קינאז (ATR) ומקטע קטליטי של פרוטאין קינאז (DNA-PKcs) תלויי DNA, הם בין הראשונים המופעלים על גבי אינדוקציה של נזק ל- DNA, והם רגולטורים מרכזיים של רשת השולטת בתיקון דנ"א, אפופטוזיס והישרדות תאים. במסגרת מסלול מדכא גידול, כספומט ו- ATR מפעילים את p53 דרך זרחון, ובכך מסדירים את הפעילות התעתיקית של p53. נזקי דנ"א גורמים גם להיווצרות של מוקדי קרינה מייננת (IRIF) המייצגים קומפלקסים של חיישן נזקי דנ"א וחלבוני תיקון המצטברים באתרים של נזק ל- DNA, אשר מדמיינים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שיתוף לוקליזציה של חלבונים ב- IRIFs, לעומת זאת, לא בהכרח אומר dאינטראקציה חלבונים אינטראקציה חלבון, כמו ברזולוציה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוגבל.
באתרו Proximity Ligation Assay (PLA) היא טכניקה חדשה המאפשרת הדמיה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים בתאים ורקמות עם סגוליות ורגישות חסרות תקדים. טכניקה זו מבוססת על הקרבה המרחבית של נוגדנים ספציפיים המחייבים את החלבונים המעניינים. כאשר החלבונים הנחקרים הם בתוך ~ 40 ננומטר תגובת הגברה מופעלת על ידי oligonucleotides כי הם מצומדות לנוגדנים, ואת המוצר הגברה הוא דמיינו על ידי תיוג פלורסנט, מניב אות המתאים למיקום subcellular של חלבונים אינטראקציה. באמצעות אינטראקציה תפקודית הוקמה בין כספומט p53 כדוגמה, הוא הוכיח כאן כיצד PLA ניתן להשתמש בתרבויות תא ההשעיה כדי לחקור את האינטראקציות הישירות בין חלבונים שהם חלקים בלתי נפרד של התגובה נזק DNA.
Introduction
נזק ל- DNA גורם לסדרת אירועים מבוקרת ביותר, הקשורים לאינטראקציות בין חלבונים לחלבון ולשינויים שלאחר טרנסלוציוניים המבטיחים תיקון יעיל ומהיר של ה- DNA, ובכך שומרים על שלמות גנומית. בדרך כלל, תיקון דנ"א נחקר בתאים שנחשפו לקרינה מיננת על ידי ניטור היווצרות של מה שמכונה קרינה מיננת- fuci המושרה (IRIF) על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תיקון DNA רבים ו DNA חישה חלבונים חישה IRIFs, המייצגים קומפלקסים חלבונים כי נוקלאט באתרי הכרומטין נזק DNA 2 , 3 . המיקום והרזולוציה של IRIFs לאורך זמן מעניקים תובנה חשובה לארגון spatiotemporal של תיקון DNA, ועשויים להצביע על מעורבותם של מסלולי תיקון דנ"א שונים. אופי הנזק לדנ"א ושלב מחזור התא שבו מתקבל הנזק קובע איזה מסלול תיקון דנ"א מופעל. Fo R), בתאים המעורבים באופן פעיל בשכפול דנ"א (S-phase), רקומבינציה הומולוגית (HR) היא מסלול תיקון דנ"א דומיננטי, ואילו בתאים בשלב G1 או G2 / M של מחזור התא, הומולוגיים end-joining (NHEJ) מסלול תיקון שולטת. אחד האירועים המוקדמים ביותר בעקבות נזק ל- DNA הוא ההפעלה של ה- DNA חישה נזק קינאזות Ataxia Telangiectasia- מוטציה חלבון (ATM), אשר פעיל בעיקר G1 ו- G2 / M- שלבי מחזור התא מסדיר NHEJ, ו Ataxia Telangiectasia ו Rad3 הקשורות חלבון (ATR), אשר פועל בשלב S על ידי הפעלת HR. שניהם ATM ו ATR הם קינאזות pleiotropic מאוד כי phosphorylate חלבונים רבים המעורבים תיקון דנ"א, מוות תאים הישרדות 4 . שני קינאזות הוכחו phosphorylate ולהפעיל את חלבון מדכאי הגידול p53 בעקבות החשיפה ללחץ genotoxic, המציין כי קינאזות אלה הם מתווכים במעלה של ציר מרכזי דיכוי איתות מדכא"Xref"> 5 , 6 .
היווצרות והרכב של IRIFs מוערכת בדרך כלל על ידי קביעת שיתוף לוקליזציה של חלבונים שונים באמצעות צבע כפול immunofluorescence מכתים מיקרוסקופיה, עם זאת, לא כל החלבונים שהם חלק ממתקני חלבון לתקן טופס IRIFs, אשר מגביל את תחולתה של גישה זו. יתר על כן, מיקרוסקופיה immunocalluorescence (confocal) immunofluorescence מוגבל על ידי תכונות עקיפה של האור, וכתוצאה מכך רזולוציה מרחבית גרועה למדי של כ 200-300 ננומטר, עולה על גודל של מבנים תת ביותר, אשר למעשה אוסר על חקירה ישירה של אינטראקציות חלבון חלבונים ב ברמה המולקולרית. ככזה, שיתוף לוקליזציה של דפוסים מכתים immunofluorescence כפי שזוהו על ידי (confocal) מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו בהכרח אינדיקציה אינטראקציות חלבונים ישיר. לאחרונה, פיתחו טכנולוגיות חדשות ברזולוציה גבוהה, כגון תלת מימדי struc(3D-SIM) 7 , אשר שימש בהצלחה ללמוד 53BP1 ו BRCA1 IRIF היווצרות בקנה מידה ננו בקנה מידה, חושפים את המאפיינים ההפצה המרחבית של חלבונים אלה שלא ניתן לזהות ידי מיקרוסקופ לייזר confocal 8 סריקה.
שיטות אחרות ניתן להשתמש כדי לזהות אינטראקציות חלבון חלבון in vivo , כגון שיתוף immunoprecipitation, משיכה שיטות ושמרים שתי היברידית גישות ההקרנה. עם זאת, טכניקות אלה הם מסורבלים למדי, דורשים כמויות גדולות של תאים או חלבונים או לערב overexpression של חלבונים, אשר מציג חפצים ניסיוניים. לאחרונה, פותחה טכניקה חדשה המאפשרת להדמיה וכימות של אינטראקציות חלבונים-חלבון באתרו ( כלומר בתאים וברקמות), אשר נקראת Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . יחסי ציבורנוגדנים אימריים המזהים שני חלבונים בעלי עניין מזוהים על ידי נוגדנים משניים המצמידים לאוליגונוקליוטידים (מה שמכונה בדיקות PLA). אם שני נוגדנים משני שונים קרובים מספיק בשל אינטראקציות בין החלבונים המוכרים על ידי נוגדנים ראשוניים, oligonucleotides מצומדות הכלאה יכול להיות ligated כדי ליצור מצע דנ"א סגור עגול. זה המצע העגול מוגבר לאחר מכן על ידי הגברה מעגל מתגלגל, ו דמיינו עם oligonucleotides fluorochrome- מצומדות מצומדות. באמצעות PLA, לוקליזציה subcellular של אינטראקציה חלבון חלבון נשמר כמו fluorescently שכותרתו מתגלגל מעגל הגברה המוצר נשאר מחובר בדיקות PLA. הפתרון של assay זה הוא <50 ננומטר, על פי הממצא כי קוטר של נוגדנים הוא כ 7-10 ננומטר 11 . הגברה מעגל מתגלגל יכול להתרחש רק במקרה שני זוגות של נוגדנים (ראשוני + seconDary) אינטראקציה פיזית בתוך ההיקף המוגדר על ידי גודלם (10 + 10 + 10 + 10 = 40 ננומטר). צעד הגברה האות מגביר את הרגישות של assay PLA ומאפשר זיהוי של אינטראקציות של חלבונים לידי ביטוי בקושי. PLA מייצר דפוסי אותות הדוקים, דמויי foci שניתן לכמת על בסיס לכל תא, שבאמצעותם ניתן להעריך את השונות בין-תאית ובין-תאית באינטראקציות בין חלבונים לחלבון.
היווצרות והרכב של מתחמי תיקון דנ"א ו- IRIFs נחקרת בעיקר בקווים תאיים חסידים כגון עצם העצם האוסטלית של העצם אוסטיארקומה U2OS, קו תאי הכליה האנושי HEK293 וקו תא אפיתל פיגמנט ברשתית RPE-1, גדל וקל transfect. ההשעיה תא תרבויות כגון לימפה וקווים תא מיאלואידי נמצאים בשימוש בתדירות נמוכה יותר, שכן אלה פחות מקובל transfection ובדרך כלל לא לדבוק coverslips, ובכך דורש רחוב נוסף / אלטרנטיביEps עבור הדמיה. עם זאת, הרזולוציה של הנזק לדנ"א היא רלוונטית מאוד בהקשר של לימפה ומיאלואיד ממאירות, שכן תגובת הנזק לדנ"א מושפעת לעיתים קרובות מהפרעות גנומיות (נהגים) בגידולים אלה, וממלא תפקיד מרכזי בהפיכה הממאירה של לימפואיד ומיאלואיד ( בת) 12 , 13 , 14 .
פרוטוקול זה מתאר כיצד PLA ניתן להשתמש כדי להעריך לכמת אינטראקציות חלבון חלבון בעקבות אינדוקציה של נזק דנ"א בתרביות תאים ההשעיה. כאן, PLA מבוצעת כדי לקבוע ולדמיין את האינטראקציות בין כספומט p53 על נזק ל- DNA בתאי לוקמיה תאי B תאים אנושיים, כי הם המושרה לעבור מעגל מחזור תא שלב G1. שים לב, הפרוטוקול המוצג כאן אינו מוגבל ללימוד אינטראקציות כספומט ו- p53 בתאים לוקמיה G1, אבל יכול לשמש גם כדי לדמיין אחרים חלבון חלבון interacTions סוגי תאים שונים ותרבויות תאים ההשעיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. טיפול בתאי הנזק של דנ"א
- תרבות האדם BCR-ABL + B- תאים תא תאים לימובלסטיים חריפים BV173 או SUP-B15 ב IMDM בתוספת FCS 20%, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 U / מ"ל פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2 . ספירת תאים צלחת ב 2 x 10 6 תא / מ"ל ב 6 בארות צלחות, ב 5 מ"ל / טוב.
הערה: אופציונלי, שורות תאים ההשעיה ממוצא שונים יכולים לשמש. - כדי לעצור את BCR-ABL + B-ALL תאים בשלב G1 של מחזור התא, להוסיף 5 מיקרומטר של imatinib methanesulfonate (STI571), ו דגירה לילה.
- לחלופין, להשמיט את הצעד הזה כאשר לומדים אינטראקציות חלבון חלבונים לאורך מחזור התא או סוגי תאים שליליים BCR-ABL.
- לעורר נזק ל- DNA על ידי הוספת 50 ng / mL neocarzinostatin (NCS) לתרבות, ו דגירה של 2 שעות.
- לחלופין,לגרום נזק לדנ"א על ידי הקרנת התאים באמצעות מקור רדיואקטיבי [ 137 Cs] ב 0.5 Gy / min, במינון של 5 Gy. לאחר הקרנה, לתת התא להתאושש במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO 2 .
- לחלופין, כדי להעריך את המעורבות של פעילות kinase כספומט בתגובה נזק DNA, להוסיף 5 מיקרומטר של מעכב kinase כספומט KU55933 לפני תוספת של NCS או טיפול הקרנה.
- הכן 1x PBS + 10% BSA ידי שכבת 5 גרם של VSA חלק V-V על גבי 50 מ"ל של 1x PBS בכוס או בקבוק Erlenmeyer, ולתת לשבת ב RT עד BSA הוא מומס. אין לנער או לעורר כמו זה יגרום קצף נרחב. לאט מסנן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר ולשמור על הקרח.
- קציר תאים לשטוף פעמיים עם קרח 1x קר PBS. ספירת התאים resuspend ב 2 x 10 6 / mL ב 1x PBS + 10% BSA. שמור תאים על הקרח.
2. Cytocentrifugugation, קיבוע Permeabilization
- הכן את4% paraformaldehyde פתרון 1x PBS טרי. הוסף 2 גרם של PFA ל 50 מ"ל של 1x PBS ו דגירה ב 55 מעלות צלזיוס רועד מים אמבטיה עד הפתרון ברור. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב- RT עד לשימוש.
הערה: לחלופין, 4% מקבע PFA ניתן לאחסן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר הקפאה, להפשיר רק פעם אחת לשימוש. אחרת, 4% PFA פתרון PBS ניתן לרכוש ישירות. - בזהירות ללטש 76 מ"מ x 26 מ"מ שקופיות מיקרוסקופ עם רקמה ללא מוך ו degrease אותם על ידי הנחת באתנול 96% בצנצנת קופלין במשך 5 דקות. בואו מיקרוסקופית שקופיות אוויר יבש במשך 10 דקות.
- להרכיב שקופיות מיקרוסקופית לתוך משפכי cytospin / cytology עם שטח של 6 מ"מ. מראש מעיל שקופיות ידי pipetting 50 μL של 1x PBS + 10% BSA לתוך משפך ו צנטריפוגות דקות 1 בסל"ד 500.
- הוסף 100 μL של ההשעיה התא (שווה 0.2 x 10 6 תאים) לכל משפך צנטריפוגה במשך 5 דקות בסל"ד 500. עבור כל שילוב נוגדנים, ב leיש צורך בהכנות ל -4 אסט (ניסוי כפול נוגדנים, שני בקרות של נוגדנים בודדים, ללא בקרת נוגדנים).
- בזהירות לפרק את המשפכים, ולוודא שלא לגעת כתמים. המשך לקביעת קיבוע מיד.
- לחלופין, תן שקופיות אוויר יבש במשך 30 דקות לפחות. לאחר ייבוש האוויר, גלישת גלישת בנפרד רדיד אלומיניום לאחסן ב -20 ° C עד השימוש. בעת שימוש בהכנות קפואות, הקפד להפשיר את השקופיות עטוף במגבת נייר כדי למנוע התעבות גלויה על השקופיות.
- צייר מעגל (קוטר משוער 15-20 מ"מ) סביב המקום באמצעות PAP עט נוזל חוסם (5 מ"מ קצה).
- הוסף 50 μL של פתרון קיבוע PFA 4% לכל נקודה ו דגירה במשך 30 דקות ב RT.
- שטפו את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות עם 1x PBS בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה.
- יבש את השקופיות סביב כתמים עם רקמה ללא מוך ולהסיר נוזל הרבה מן המקום ככל האפשר באמצעות piחיית המחמד בלי לגעת במקום, או על ידי הטיה של השקופית. הוסף 50 μL של 0.25% Triton-X ב 1x PBS לכל נקודה ו דגירה של 10 דקות ב RT ללא תסיסה.
- לשטוף את השקופיות 3 פעמים במשך 5 דקות ב ~ 50-60 מ"ל של 0.05% Tween-20 ב TBS (TBS-T) בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה. 10 שקפים ניתן לעבד בו זמנית באופן זה.
3. חסימת הדגירה נוגדן ראשוני
- הקש על TBS-T וייבש את השקופיות סביב הנקודות באמצעות רקמה נטולת מוך. הסר נוזלים רבים מן המקום ככל האפשר באמצעות פיפטה בלי לגעת במקום, או על ידי הטיית השקופית. בקרוב מערבולת פתרון חסימה ולהוסיף טיפה אחת (~ 40 μL) לכל נקודה. לדגור על 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס בחדר טרום humidified מראש.
- הכן את הקוקטייל נוגדנים על ידי ערבוב עז נגד כספומט ב 1: 1000 ואת ארנב נגד פוספו, Ser53-p53 ב 1: 100 בדילול נוגדן מסחרי, דיכאון נוגדנים מערבולת לפני השימוש. לניסויי בקרהTs, להכין דילולים נוגדנים המכילים רק את העז נגד כספומט רק את ארנב אנטי פוספו- Ser15-p53 נוגדן (בודד נוגדנים שולטת).
- הקש את הפתרון חסימה אבל להיזהר לא לתת לתאים להתייבש לפני הוספת דילולים נוגדן. הוסף 30 μL של דילול קוקטייל כל נוגדנים ו דגירה בחדר humidified לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- להתכונן באתרו לשטוף הצפת ולשטוף מאגר B על ידי המסת את התוכן של שקיק אחד של הצפת A ו B מאגר צרף בנפח סופי של 1,000 מ"ל של מים כל אחד.
- לחלופין, להכין לשטוף חיץ על ידי המסת 8.8 גרם של NaCl, 1.2 גרם של בסיס טריס 0.5 מ"ל של Tween-20 ב 800 מ"ל מים. התאמת pH 7.4 באמצעות HCl ולהוסיף נפח סופי של 1,000 מ"ל.
- לחלופין, להכין לשטוף את מאגר B על ידי המסת 5.84 גרם של NaCl, 4.24 של בסיס Tris ו 26.0 גרם של Tris-HCl ב 500 מ"ל של מים. התאמת pH 7.5 באמצעות HCl. מוסיפים מים לנפח סופי של 1,000 מ"ל.
- לְסַנֵןשני הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- שטפו את השקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם חיץ 1x לשטוף באתרה A בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה.
4. בדיקות PLA, קשירת והגברה
- הכינו בדיקות PLA על ידי דילול PLUS נגד עיזים נגד ארנב MINUS הן 1: 5 בדילול נוגדן מסחרי. הקש 1x לשטוף חיץ באתרו מן השקופיות ולהוסיף 30 μL של תערובת PLA תערובת לכל נקודה. דגירה 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס בחדר טרום humidified מראש.
הערה: כל שילוב של נוגדנים משניים PLUS ו- MINUS PLA יכול לשמש (אנטי עכבר, אנטי ארנב, אנטי עז), כל עוד הנוגדנים העיקריים מוחלטים במינים שונים, והשילוב של בדיקות PLA צריך תמיד להכיל בדיקה PLUS ו MINUS בדיקה. - לשטוף שקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם ~ 50-60 מ"ל 1x ב חיץ לשטוף באתרה בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה./ Li>
- הכן את הפתרון קשירת ליגאז על הקרח על ידי הוספת 1 μL של ליגאז ל 39 μL של פתרון קשירת ולהוסיף 40 μL של פתרון ליגאז ליגאז לכל נקודה. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחדר מחומם מראש humidified.
- לשטוף את השקופיות 2 פעמים במשך 5 דקות עם ~ 50-60 מ"ל 1x ב חיץ לשטוף באתרה A בצנצנת Coplin ב RT עם תסיסה עדינה.
- הכן את הגברה-פולימראז תערובת על הקרח על ידי דילול פתרון המניות הגברה 1: 5 במים. ואז להוסיף 0.5 μL של פולימראז ל 39.5 μL של פתרון הגברה 1x עבור כל נקודה.
הערה: ריאגנטים ההגברה הם רגישים לאור צריך להיות מוגן מפני חשיפה ישירה לאור. מגבר הגברה בארבעה צבעים שונים (אדום: עירור 594 ננומטר, פליטה 624 ננומטר, FarRED: עירור 644 ננומטר, פליטה 669 ננומטר, תפוזים: עירור 554 ננומטר, פליטה 576 ננומטר, ירוק: עירור 501 ננומטר, פליטה 523 ננומטר) ודא כי הגדרת מיקרוסקופ זמין יש sתכונות עירור ומסננים לתמונות אלה צבעים. - הקש את 1x לשטוף לשטוף באתרו ולהוסיף 40 μL של הגברה-פולימראז תערובת לכל נקודה. לדגור על 100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחדר מראש humidified מחומם.
5. הרכבה והדמיה
- הכן 0.01x באתרו לשטוף חיץ B על ידי הוספת 1 מ"ל של 1x לשטוף מאגר B ל 99 מ"ל של מים.
- הקש את תערובת הגברה-פולימראז לשטוף שקופיות 2 פעמים במשך 10 דקות עם 1x חיץ לשטוף באתרו B בצנצנת קופלין ב RT עם תסיסה עדינה.
- לשטוף את השקופיות 1 דקות ב 0.01x לשטוף חיץ ב.
- הקש על עודף 0.01x לשטוף חיץ B ויבש את השקופיות סביב כתמים עם רקמה ללא מוך. הסר נוזלים רבים מן המקום ככל האפשר באמצעות פיפטה בלי לגעת במקום, או על ידי הטיית השקופית.
- מדולל DAPI המכיל בינוני הרכבה 1: 5 במדיום הרכבה ללא DAPI, כדי למנוע overstaining של גרעינים.
- הוסף 25-30 μL של 1: 5 DAPI המכילים בינוני הרכבה על 24 מ"מ x 24 מ"מ coverslip ו להרים את להחליק להחליק עם השקופית, להפעיל לחץ קל כדי להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים. חותם את coverslip עם לק ציפור לחכות לפחות 15 דקות לפני הדמיה.
- לנתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (confocal).
- לספור את מספר אותות PLA לדקלם לכל תא לפחות 4 שדות תמונה שנרכשו (מטרה 20x, לספור לפחות 20 תאים לכל מצב או שילוב נוגדנים, בהתבסס על חישוב כוח באמצעות ממוצע הצפוי של 7 ± 5 אותות בתאים שטופלו, ו 2 ± 2 אותות בתאים מטופלים, עם הסתברות של טעות מסוג I של 0.05, וכוח של 80%, כפי שדווח בעבר 15 ).
הערה: הפתרון הטוב ביותר מושגת על ידי רכישת Z-stack ו deconvolution באמצעות חבילות תוכנה ( למשל , ImageJ, Leica רכישת Suite (LAS)). הסימןיש להבחין בקלות בתוך שטח הגרעין, כפי שהוגדר על ידי מכתים DAPI. - אין לספור אותות המופיעים בבירור מחוץ לגרעינים. בדרך כלל, טיפול NCS או γ- הקרנה תוצאות כ 5-10 phosho-p53 / ATM PLA אותות לכל תא. את 'נוגדנים בודדים' שולטת עשוי לתת קצת רקע, אבל זה לא צריך לחרוג 1-2 אותות PLA לכל 1 מתוך כל 20 תאים.
- למטרות פרסום והצגה, ללכוד תמונות באמצעות 40X או 63X שמן טבילה המטרה. שקופיות ניתן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס צריך להיות מוגן מפני חשיפה לאור.
- לספור את מספר אותות PLA לדקלם לכל תא לפחות 4 שדות תמונה שנרכשו (מטרה 20x, לספור לפחות 20 תאים לכל מצב או שילוב נוגדנים, בהתבסס על חישוב כוח באמצעות ממוצע הצפוי של 7 ± 5 אותות בתאים שטופלו, ו 2 ± 2 אותות בתאים מטופלים, עם הסתברות של טעות מסוג I של 0.05, וכוח של 80%, כפי שדווח בעבר 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זרחון של p53 ב שאריות Ser15 הוצגה להיות תלויה בפעילות כספומט כספומט 16 . כדי להדגים ולאשר את הספציפיות של טכניקת PLA על ההכנות cytospin של תרבויות תאים ההשעיה, הוא הראה כי אינדוקציה של נזק ל- DNA על ידי טיפול 2 שעות NCS של BCR-ABL + B- תאים ALL נעצר בשלב G1 של מחזור התא הביאו לאינטראקציה הספציפית בין כספומט ל- phospho-ser15-p53, כצפוי. איתותים PLA נצפו בגרעין של רוב התאים שטופלו NCS ( איור 1B ), עם ממוצע של 7 אותות PLA לכל תא 15 , ואילו אותות אלה לא זוהו בתאים שלא טופלו NCS ( איור 1 א ) . טרום טיפול של תאים עם מעכב kinase ספציפיים כספומט KU55933 לפני אינדוקציה של נזק ל- DNA בבירור פחתה מספר אותות PLA לממוצע של2 PLA אותות / תא ( איור 1 ג ). אותות ה- ATM-fospho-ser15-p53 PLA התגלו באופן בלעדי בגרעין, כצפוי. ניסויי PLA, שבהם לא נשאו נוגדנים נגד עיזים או אנטי-פוספו-סר 15-p53 (בקרת נוגדנים בודדים) לא הניבו שום אותות PLA ספציפיים ( תרשימים 1D ו- 1E ). ניתוחים כימות וסטטיסטיים של תוצאות אלו מוצגים בתרשים 1F (מותאמים מאוכודניקה ואח 'ג' אימונול).
איור 1: ב PLA באתרה עבור כספומט / phospho-ser15-p53 אינטראקציות BV173 BCR-ABL + תאים אנושיים. ( א ) תאים טופלו בן לילה עם 5 מיקרומטר imatinib (מעכב Abin קינאז ספציפי המעורר gyc שלב תא cyclE), עם imatinib ו 50 ng / mL NCS, אשר גרמה נזק ל- DNA ( B ), או עם imatinib ו טופלו מראש עם 5 מיקרומטר של מעכב kinase כספומט ספציפי KU55933 לפני הטיפול NCS ( ג ) . נוגדנים בודדים ניסויי PLA עבור נוגדנים נגד עזים (D) ו ארנב אנטי פוספו, Ser15-p53 ( E ) מוצגים. הקרינה של אותות הקרינה האדומים מייצגים קרבת חלבון באתרו (<50 ננומטר) של חלבונים מסוג ATM ו- phospho-ser15-p53. סולם ברים = 5 מיקרומטר (קווים לבנים). ( F ) כימות של מספר אותות PLA לפחות 20 תאים שטופלו בתנאים ניסויים שונים מוצגים. קווים אופקיים מייצגים אמצעים; המשמעויות הסטטיסטיות נקבעו על ידי ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA; *** p <0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדו"ח זה, הוא הוכיח כי PLA ניתן להשתמש כדי לקבוע לדמיין את האינטראקציה הספציפית בין חלבונים בתרבויות תא ההשעיה. ראוי לציין, הפרוטוקול המתואר כאן אינו מוגבל ללימוד מתחמי תיקון דנ"א, אלא גם חל על לדמיין לכמת אינטראקציות חלבונים אחרים חלבון בתרביות תאים ההשעיה. זה הוכח כי kinase כספומט אינטראקציה עם p53 phosphorylated ב G1, נעצר BCR-ABL + B-ALL תאים כאשר נחשף סוכן הנזק DNA- גורם. בעבר, הטכניקה PLA שימש אותנו להראות כי כספומט ו FOXO1 גורם שעתוק אינטראקציה ב BCR-ABL + B-ALL תאים, עם זאת, אינטראקציה זו ככל הנראה לא גרמו זירחון תלויי כספומט של FOXO1. בתמיכת הנתונים PLA, הוא אושר על ידי immunoprecipitation של חלבונים כספומט / ATR-phosphorylated אנדוגני, כי בניגוד למצבים כספומט הוקמה p53 ו NBS1, FOXO1 אינו phosphorylated על ידי כספומט על אינדוקציה של Dנזק ל- NA 15 . בנוסף, גישת PLA יושמה בהצלחה כדי לחקור את היווצרותם של מתחמי תיקון לא תואמים ( למשל אינטראקציה בין MSH2 ו- MSH6) אינטראקציות בקווים תאיים שונים של תאי B לימפומה בבני אדם (נתונים לא מוצגים). בהקשרים המסוימים הללו הציעה טכניקת ה- PLA גישה חלופית לתמיכה בממצאינו. זה הוכיח כי PLA מאפשר הערכה כמותית למחצה של אינטראקציות חלבון חלבונים בין תנאי הניסוי נותן תובנה וריאציה תא אל התא אינטראקציות אלה.
ניתוח אינטראקציות חלבונים ספציפיים בתאים (חשופים לתנאים ניסיוניים שונים) יש בדרך כלל מאתגר והוא כפוף חפצים מלאכותיים. בדרך כלל, חלבון שיתוף immunoprecipitation כבר השיטה של בחירה, אך דורש מספר רב של תאים ו / או חלבונים, למעשה אוסר על ניתוח של אינטראקציות חלבון חלבונים בתא נדירסוגים או בין חלבונים המבוטאים ברמות נמוכות. יתר על כן, overexpression של חלבונים במודלים קו תא (לא רלוונטי) לעתים קרובות מוביל חפצים overexpression, ותוצאות יכול להיות מאוד קשה לאשר / לאמת in vivo , או סוגי התא הרלוונטי. כמו כן, שיתוף immunoprecipitation דורש תמוגה של תאים solubilization של חלבונים, אשר יכול לגרום לאובדן כאשר אינטראקציות חלבון חלבונים חלשים. חשוב לציין, שיתוף חלבון שיתוף immunoprecipitation ושמרים, שתי גישות היברידיות אינם מסוגלים לזהות בין תוך וריאציה בין הסלולר אינטראקציות חלבון חלבונים. טכניקת PLA מציעה חלופה אטרקטיבית וקלה עבור טכניקות אלה, ומספק תובנה חשובה נוספת. PLA ניתן להשתמש במערך סטנדרטי (אבחון) המעבדה כפי שהוא אינו דורש מיומנויות מיוחדות מאוד מעבר ליכולת לבצע אימונוהיסטוכימיה.
הפיתוח של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה אפשרה את עומקניתוח של הארכיטקטורה המולקולרית של קומפלקסים חלבונים. טכניקה זו, לעומת זאת, אינו זמין בקלות וכוללת תשתית מחקר ייעודי. PLA מציעה גישה חלופית נגישה, פשוטה וזולה לחקר היווצרות חלבונים מורכבים, עם רזולוציה דומה. מגבלה ברורה של הטכניקה PLA היא הזמינות של נוגדנים ראשוניים ספציפיים שהועלו מינים שונים. עם זאת, מספר חברות מציעות כיום שילובים נוגדן ייעודי (ואומת) נוגדן כי לייעל את השימוש בטכניקה PLA.
מחקרים על מעורבותם של חלבונים בתיקון נזקי דנ"א ותגובת הנזק לדנ"א מסתמכים במידה רבה על ניתוח מבנה והרכב IRIF. עם זאת, יש לציין כי שיתוף לוקליזציה של חלבונים ב- IRIFs לא בהכרח אומר אינטראקציות חלבונים ישיר חלבון. טכניקת PLA מציעה הזדמנות ייחודית ללמוד חלבונים לתקן דנ"א ויצירת מתחמי תיקון בפירוט רב יותר. את spניתוח atiotemporal של היווצרות של קומפלקסים כאלה ניתן למפות בפירוט רב יותר באמצעות PLA. יתר על כן, היא תאפשר לחוקרים להעריך את היווצרותם של תסביכים לתיקון ברקמות ובדגימות קליניות של מטופלים שטופלו בחומרים עם נזק לדנ"א או בטיפולים, אשר עשויים לספק תובנה חשובה לגבי היעילות של שיטות טיפול אלו ואף לסייע בבחירה של חולים אשר ייהנו רוב הטיפולים האלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר במעבדה Guikema ממומן על ידי תוכנית תמריצים מחקר חדשני מארגון הולנד למחקר מדעי (VIDI מענק 016126355) ו 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (פרויקט 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
