Summary
Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.
Abstract
De DNA schade respons respondeert de reparatie van DNA letsels die spontaan optreden, worden veroorzaakt door genotoxische stress, of verschijnen in het kader van geprogrammeerde DNA-breuken in lymfocyten. De Ataxia-Telangiectasia Mutated Kinase (ATM), ATM- en Rad3-gerelateerde kinase (ATR) en de katalytische subeenheid van DNA-afhankelijke Protein Kinase (DNA-PKcs) behoren tot de eerste die geactiveerd worden bij inductie van DNA-schade en zijn Centrale regulatoren van een netwerk dat de reparatie van DNA, apoptose en celoverleving regelt. Als onderdeel van een tumoronderdrukkende weg activeert ATM en ATR p53 door fosforylering, waardoor de transcriptieve activiteit van p53 wordt geregeld. DNA schade resulteert ook in de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) die complexen van DNA schade sensor en reparatie eiwitten vertegenwoordigen die accumuleren op de sites van DNA schade, die worden weergegeven door fluorescentie microscopie. Co-lokalisatie van eiwitten in IRIF's impliceert echter niet noodzakelijkerwijs dIrect eiwit-eiwit interacties, aangezien de resolutie van fluorescentiemicroscopie beperkt is.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) is een nieuwe techniek die de directe visualisatie van eiwit-eiwit interacties in cellen en weefsels mogelijk maakt met ongekende specificiteit en gevoeligheid. Deze techniek is gebaseerd op de ruimtelijke nabijheid van specifieke antilichamen die binden aan de eiwitten van belang. Wanneer de ondervraagde eiwitten binnen de 40 nm liggen, wordt een amplificatiereactie geactiveerd door oligonucleotiden die zijn geconjugeerd aan de antilichamen en het amplificatieproduct wordt door fluorescerende etikettering weergegeven, waardoor een signaal komt dat overeenstemt met de subcellulaire locatie van de interactieproteïnen. Met behulp van de gevestigde functionele interactie tussen ATM en p53 als voorbeeld, wordt hier aangetoond hoe PLA kan worden gebruikt in suspensiecelculturen om de directe interacties tussen eiwitten die integrale delen van de DNA-schaderespons zijn te bestuderen.
Introduction
DNA schade leidt tot een zeer gereguleerde reeks gebeurtenissen waarbij eiwit-eiwit interacties en post-translationele modificaties betrokken zijn die de efficiënte en snelle reparatie van DNA waarborgen, waardoor de genomische integriteit 1 wordt gewaarborgd. Typisch wordt DNA reparatie bestudeerd in cellen blootgesteld aan ioniserende straling door de vorming van zogenaamde ioniserende straling geïnduceerde foci (IRIF) door (confocale) fluorescentiemicroscopie te monitoren. Veel DNA-reparatie en DNA-schadebepalende eiwitten vormen IRIF's, die eiwitcomplexen vertegenwoordigen die nucleïneeren op chromatineplaatsen die DNA-schade 2 , 3 onderhouden. De locatie en de oplossing van IRIF's over de tijd geeft belangrijk inzicht in de spatiotemporale organisatie van DNA-reparatie, en kan de betrokkenheid van verschillende DNA-reparatiewegen aanduiden. De aard van de DNA-schade en het celcyclus stadium waarin de schade wordt bereikt, bepaalt welk DNA herstelpad wordt geactiveerd. fo In de cellen die actief betrokken zijn bij DNA-replicatie (S-fase) is homologe recombinatie (HR) de dominante DNA-herstelweg, terwijl in de cellen in de G1- of G2 / M-fase van de celcyclus de niet- Homologe end-joining (NHEJ) reparatiebaan overheersen. Een van de vroegste gebeurtenissen na DNA-schade is de activatie van de DNA-schade-senserende kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutated Protein (ATM), die meestal actief is in de G1- en G2 / M-fasen van de celcyclus en NHEJ reguleert, En Ataxia Telangiectasia en Rad3-gerelateerde eiwitten (ATR), die in S-fase optreden door HR te activeren. Zowel ATM als ATR zijn zeer pleiotropische kinasen die veel proteïnen fosforyleren die betrokken zijn bij DNA-reparatie, celdood en overleving 4 . Beide kinasen zijn aangetoond dat het tumor-suppressor eiwit p53 fosforyleren en activeren na de blootstelling aan genotoxische stress, wat aangeeft dat deze kinasen stroomopwaartse mediators zijn van een zwenkende tumor onderdrukkende signaalas"Xref"> 5 , 6 .
De vorming en samenstelling van IRIF's wordt typisch beoordeeld door co-lokalisatie van verschillende eiwitten te bepalen met behulp van dubbelkleurige immunofluorescentie-kleuring en microscopie. Niet alle eiwitten die deel uitmaken van reparatie-eiwitcomplexen vormen IRIF's, die de toepasbaarheid van deze aanpak beperken. Bovendien wordt (confocale) immunofluorescentiemicroscopie beperkt door de diffractie-eigenschappen van licht, wat resulteert in een vrij slechte ruimtelijke resolutie van ongeveer 200-300 nm, die de grootte van de meeste subcellulaire structuren overschrijdt, die in wezen de directe ondervraging van eiwit-eiwitinteracties op Het moleculaire niveau Als zodanig is de co-lokalisatie van immunofluorescentiefleuringpatronen zoals gedetecteerd door (confocale) fluorescentiemicroscopie niet noodzakelijk indicatief voor directe eiwit-eiwitinteracties. Onlangs zijn nieuwe superresolutie technologieën ontwikkeld, zoals driedimensionale strucTured illumination microscopy (3D-SIM) 7 , die succesvol werd gebruikt om 53BP1- en BRCA1 IRIF-vorming op nano-schaaldetails te bestuderen, waarbij de ruimtelijke verdelingseigenschappen van deze eiwitten werden onthuld die niet door confocale laserscanningsmicroscopie 8 gedetecteerd werden.
Verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in vivo te detecteren, zoals co-immunoprecipitatie, aftrekmethoden en gist-tweehybride screeningsbenaderingen. Echter, deze technieken zijn nogal omslachtig, vereisen grote hoeveelheden cellen of eiwitten of betrekken overexpressie van eiwitten, die experimentele artefacten introducereert. Meer recent is een nieuwe techniek ontwikkeld die de visualisatie en kwantificering van eiwit-eiwitinteracties in situ mogelijk maakt ( dat wil zeggen in cellen en in weefsels), die wordt aangeduid als Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 . PrImary antilichamen die twee eiwitten van belang herkennen worden gedetecteerd door secundaire antilichamen die zijn geconjugeerd aan oligonucleotiden (zogenaamde PLA probes). Als de twee verschillende secundaire antilichamen dicht genoeg zijn door de interacties tussen de eiwitten die door de primaire antilichamen worden herkend, hybridiseren de geconjugeerde oligonucleotiden en kunnen zij gelaten worden om een gesloten circulaire DNA-substraat te vormen. Dit cirkelvormige substraat wordt vervolgens geamplificeerd door rollende cirkel amplificatie, en geconfigureerd met fluorochroom-geconjugeerde complementaire oligonucleotiden. Met behulp van PLA wordt de subcellulaire lokalisatie van de eiwit-eiwit-interactie bewaard, aangezien het fluorescently gemerkte rollende cirkel amplificatieproduct aan de PLA probes gehecht blijft. De resolutie van deze analyse is <50 nm, gebaseerd op de bevinding dat de diameter van een antilichaam ongeveer 7-10 nm is. Rolcirkel amplificatie kan alleen plaatsvinden in geval twee paren antilichamen (primaire + seconDary) fysiek interactie binnen de omtrek die door hun grootte wordt gedefinieerd (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm). De signaalversterkingstap verhoogt de gevoeligheid van de PLA-analyse en maakt het detecteren van interacties van nauwelijks uitgedrukte proteïnen mogelijk. PLA genereert punctate, foci-achtige signalen die kunnen worden gekwantificeerd op per celbasis, waardoor de intra- en intercellulaire variatie in eiwit-eiwitinteracties kan worden beoordeeld.
De vorming en samenstelling van DNA-reparatiecomplexen en IRIF's wordt meestal bestudeerd in aanhechtende cellijnen, zoals de menselijke bot osteosarcoma epitheliale cellijn U2OS, de menselijke embryonale niercel lijn HEK293 en de retinale pigment epitheliale cellijn RPE-1, die snel- Groeiend en makkelijk te transfecteren. Suspensiecelculturen zoals een lymfoïde en myeloïde cellijnen worden minder vaak gebruikt, aangezien deze minder vatbaar zijn voor transfectie en in het algemeen niet aan de deklijsten hechten, waardoor aanvullende / alternatieve stEps voor beeldvorming. De resolutie van DNA-schade is echter zeer relevant in het kader van lymfoïde en myeloïde maligniteiten, aangezien het DNA-schaderespons vaak wordt beïnvloed door genomische (bestuurder) aberraties in deze tumoren, een cruciale rol spelen bij de kwaadaardige transformatie van normale lymfoïde en myeloïde Stamvader) cellen 12 , 13 , 14 .
Dit protocol beschrijft hoe PLA kan worden gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te beoordelen en te kwantificeren na de inductie van DNA-schade in suspensiecellenculturen. Hier wordt PLA uitgevoerd om de interacties tussen ATM en p53 te bepalen en te visualiseren bij DNA-schade in humane B-cel leukemacellen die geïnduceerd zijn om een G1-fase celcyclus arrestatie te ondergaan. Opgelet, het hier gepresenteerde protocol is niet beperkt tot het bestuderen van ATM- en p53-interacties in G1-gearresteerde leukemacellen, maar kan ook gebruikt worden om andere eiwit-eiwit interac te visualiserenIn verschillende celsoorten en suspensiecelculturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandeling van cellen en DNA-inductie
- Cultuur de humane BCR-ABL + B-cel acute lymfoblastische cellijnen BV173 of SUP-B15 in IMDM aangevuld met 20% FCS, 50 μM p-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2. Tel cellen en plaat bij 2 x 106 cellen / ml in 6-putjes platen, bij 5 ml / putje.
OPMERKING: Optioneel kunnen suspensie cellijnen van verschillende oorsprong gebruikt worden. - Om de BCR-ABL + B-ALL cellen in de G1-fase van de celcyclus te arresteren, voeg 5 μM imatinib methaansulfonaat (STI571) toe en incubeer overnacht.
- Optioneel, laat deze stap weg tijdens het bestuderen van eiwit-eiwitinteracties gedurende de celcyclus of in BCR-ABL-negatieve celtypes.
- DNA-schade toebrengen door 50 ng / ml neocarzinostatine (NCS) toe te voegen aan de cultuur en gedurende 2 uur te incuberen.
- Alternatief,DNA-schade induceren door de cellen te bestralen met behulp van een radioactieve bron [ 137 Cs] bij 0,5 Gy / min, bij een dosis van 5 Gy. Na bestraling laat de cel gedurende 2 uur bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2 herstellen.
- Optioneel, om de betrokkenheid van ATM kinase activiteit in reactie op DNA schade te beoordelen, voeg 5 μM van de ATM kinase remmer KU55933 toe vóór toevoeging van NCS of de bestralingsbehandeling.
- Bereid 1x PBS + 10% BSA aan door 5 g fractie-V BSA op te leggen boven 50 ml 1x PBS in een beker of Erlenmeyer-fles, en laat zitten bij RT totdat BSA is opgelost. Schud niet of roer, aangezien dit schuimende schuim veroorzaakt. Filter langzaam door een 0,22 μm filter en houd ijs op.
- Oogstcellen en was twee keer met ijskoude 1x PBS. Tel de cellen en resuspendeer bij 2 x 10 6 / ml in 1x PBS + 10% BSA. Bewaar cellen op ijs.
2. Cytocentrifugatie, Fixatie en Permeabilisatie
- Bereid de4% paraformaldehyde oplossing in 1x PBS vers. Voeg 2 g PFA toe aan 50 ml 1x PBS en incubeer in een 55 ° C schudwaterbad tot de oplossing helder is. Filter de oplossing door een 0,22 μm filter en berg bij RT tot gebruik.
OPMERKING: Eventueel kan 4% PFA-fixatief worden opgeslagen bij -20 ° C. Na het bevriezen, ontdooien slechts één keer voor gebruik. Anders kan de 4% PFA oplossing in PBS direct worden gekocht. - Polijst 76 mm x 26 mm dia's met een lintvrij weefsel voorzichtig en ontvette ze door 5 minuten in 96% ethanol in een Coplin-pot te plaatsen. Laat de microscopie gedurende 10 minuten luchtdrogen glijden.
- Monteer de microscopische dia's in de cytospin / cytology trechters met een oppervlakte van 6 mm. Pre-coat glijbanen door 50 μl 1x PBS + 10% BSA in elke trechter te pipetteren en centrifuge gedurende 1 minuut bij 500 rpm.
- Voeg 100 μl van de celsuspensie (gelijk aan 0,2 x 106 cellen) aan elke trechter en centrifuge gedurende 5 minuten bij 500 rpm. Voor elke antilichaamcombinatie, bij leAst 4 preparaten zijn vereist (dubbel-antilichaam experiment, twee single-antilichaam controles, geen antilichamen controle).
- Demonteer de trechters voorzichtig en zorg ervoor dat u de vlekken niet aanraakt. Ga onmiddellijk naar de monsterfixatie.
- Optioneel laat de dia's gedurende 30 minuten luchtdrogen. Na luchtdrogen, schuif de glijbanen individueel in aluminiumfolie en opslaan bij -20 ° C tot aan het gebruik. Bij het gebruik van bevroren preparaten, zorg ervoor dat u de glijbanen verpakt in een handdoek om het openen van condensatie op de glijbanen te voorkomen, ontdooien.
- Teken een cirkel (ongeveer 15-20 mm diameter) rond de plaats met een PAP pen vloeistofblokker (5 mm tip).
- Voeg 50 μl 4% PFA-fixatieoplossing toe aan elke plek en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de cellen 3 keer gedurende 5 minuten met 1x PBS in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
- Droog de glijbanen rond de plekken met een lintvrij weefsel en verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een piHuisdier zonder aan te raken, of door de dia te kantelen. Voeg 50 μL 0,25% Triton-X in 1x PBS toe aan elke plek en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie.
- Was de glijbanen 3 keer gedurende 5 minuten in ~ 50-60 ml 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie. 10 slides kunnen tegelijkertijd op deze manier worden verwerkt.
3. Blokkering en primaire antilichaam incubatie
- Tap TBS-T af en droog de glijbanen rond de plekken met een pluisvrije weefsel. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een pipet zonder de plaats aan te raken, of door de dia te kantelen. Vortex de blokkerende oplossing kort en voeg een druppel (~ 40 μL) toe aan elke plek. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
- Bereid de antilichaamcocktail door het geiten-anti-ATM bij 1: 1000 en het konijn-anti-fosfo-Ser15-p53 bij 1: 100 in een commercieel antilichaam verdunningsmiddel, vortex antilichaam verdunningsmiddel voor gebruik te mengen. Voor controle experimentTs, verdunning van antilichamen die alleen de geiten-anti-ATM bevatten en alleen het konijn-anti-fosfo-Ser15-p53-antilichaam (enkel-antilichaam controles).
- Tap de blokkerende oplossing af, maar zorg ervoor dat de cellen niet drogen voordat de antilichaamverdunningen worden toegevoegd. Voeg 30 μl van elke antilichaamcocktailverdunning toe en incubeer in een bevochtigde kamer 's nachts bij 4 ° C.
- Bereid in situ Washbuffer A en Wasbuffer B door de inhoud van een zakje Buffer A en Buffer B-mengsel op te lossen in een uiteindelijk volume van 1.000 ml water.
- Alternatief, bereid de wasbuffer A op door 8,8 g NaCl op te lossen, 1,2 g Tris-base en 0,5 ml Tween-20 in 800 ml water. Pas de pH aan op 7,4 met behulp van HC1 en voeg toe aan een eindvolume van 1000 ml.
- Alternatief, bereide Wash Buffer B door 5,84 g NaCl, 4,24 van Tris-base en 26,0 g Tris-HCI in 500 ml water op te lossen. Pas de pH aan op 7,5 met behulp van HC1. Voeg water toe aan een eindvolume van 1000 ml.
- FilterBeide oplossingen via een 0,22 μm filter.
- Was de slides 2 keer gedurende 5 minuten met 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
4. PLA Probes, Ligation en Amplification
- Bereid PLA probes door het verdunnen van de anti-geiten PLUS en anti-konijn MINUS, beide 1: 5 in het commerciële antilichaam verdunningsmiddel. Tik 1x in situ wasbuffer A uit de glijbanen en voeg 30 μL van het PLA sonde-mengsel op elke plek. Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
OPMERKING: elke combinatie van secundaire antilichamen PLUS en MINUS PLA probes kan worden gebruikt (anti-muis, anti-konijn, anti-geiten), zolang de toegepaste primaire antilichamen in verschillende soorten worden verhoogd en de combinatie van PLA probes moet altijd Bevat een PLUS sonde en een MINUS sonde. - Was de slides 2 keer gedurende 5 minuten met ~ 50-60 ml 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie. </ Li>
- Bereid de Ligation-Ligase oplossing op ijs door 1 μL Ligase toe te voegen aan 39 μL Ligation oplossing en voeg 40 μL Ligation-Ligase oplossing op elke plek toe. Incubeer 30 min bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
- Was de dia's 2 keer gedurende 5 minuten met ~ 50-60 ml 1x in situ wasbuffer A in een Coplin pot bij RT met zachte agitatie.
- Bereid het Versterking-Polymerase mengsel op ijs door de Amplification stock oplossing 1: 5 in water te verdunnen. Voeg dan 0,5 μl polymerase toe aan 39,5 μl 1x versterkingsoplossing voor elke plek.
OPMERKING: De versterkingsreagentia zijn lichtgevoelig en moeten beschermd worden tegen directe blootstelling aan licht. Het versterkingsreagens komt in vier verschillende kleuren (RED: excitatie 594 nm, emissie 624 nm, FarRED: excitatie 644 nm, emissie 669 nm; ORANGE: excitatie 554 nm, emissie 576 nm; GREEN: excitatie 501 nm, emissie 523 nm) Zorg ervoor dat de beschikbare microscopie-instelling s heeftUitstekende excitatie eigenschappen en filters om deze kleuren af te beelden. - Tik 1x in situ wasbuffer A af en voeg 40 μL Amplification-Polymerase-mengsel per punt toe. Incubeer gedurende 100 minuten bij 37 ° C in een voorverwarmde bevochtigde kamer.
5. Montage en beeldvorming
- Bereid 0,01x in situ wasbuffer B door 1 ml 1x Wash Buffer B toe te voegen aan 99 mL water.
- Tap het Amplification-Polymerase-mengsel af en doe de slides 2 keer gedurende 10 minuten met 1x in situ wasbuffer B in een Coplin pot bij RT met zachte roering.
- Was de glijbanen 1 minuut in 0,01x wasbuffer B.
- Tap de overtollige 0,01x wasbuffer B af en droog de glijbanen rond de plekken met een pluisvrij weefsel. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof uit de plaats met behulp van een pipet zonder de plaats aan te raken, of door de dia te kantelen.
- Verdun DAPI-bevattende montage medium 1: 5 in montage medium zonder DAPI om te voorkomen dat de nuclei worden overschreden.
- Voeg 25-30 μL 1: 5 DAPI-houdend montagemedium toe aan een 24 mm x 24 mm deklaag en haal de afdekplaatje op met de glijbaan, gebruik een kleine druk om ervoor te zorgen dat er geen gevangen luchtbellen zijn. Verzegel de deklaag met nagellak en wacht minstens 15 minuten voor afbeeldingen.
- Analyseer de dia's met behulp van een (confocale) fluorescentiemicroscoop.
- Tel het aantal punctate PLA signalen per cel in ten minste 4 verworven beeldvelden (20x objectief, tel tenminste 20 cellen per conditie of antilichamencombinatie, op basis van een vermogensberekening met een verwachte gemiddelde van 7 ± 5 signalen in de behandelde cellen, En 2 ± 2 signalen in de onbehandelde cellen, met een kans op een type I fout van 0,05 en een vermogen van 80%, zoals eerder gemeld 15 ).
OPMERKING: De beste oplossing wordt bereikt door een Z-stack en deconvolutie te verkrijgen met behulp van softwarepakketten ( bijv . ImageJ, de Leica Acquisition Suite (LAS)). De signaIk zou duidelijk moeten worden herkend binnen de kernomtrek, zoals gedefinieerd door de DAPI-kleuring. - Tel geen signalen die duidelijk buiten de kernen voorkomen. Normaal gesproken resulteert NCS-behandeling of γ-bestraling in ongeveer 5-10 phosho-p53 / ATM PLA signalen per cel. De 'single-antilichaam' controles kunnen wat achtergrondsein geven, maar dit mag niet meer dan 1-2 PLA signalen per 1 uit elke 20 cellen overschrijden.
- Voor publicatie en presentatie doe je beelden op met een 40x of 63X onderdompeling olie doelstelling. Slides kunnen bij 4 ° C worden opgeslagen en beschermd tegen blootstelling aan licht.
- Tel het aantal punctate PLA signalen per cel in ten minste 4 verworven beeldvelden (20x objectief, tel tenminste 20 cellen per conditie of antilichamencombinatie, op basis van een vermogensberekening met een verwachte gemiddelde van 7 ± 5 signalen in de behandelde cellen, En 2 ± 2 signalen in de onbehandelde cellen, met een kans op een type I fout van 0,05 en een vermogen van 80%, zoals eerder gemeld 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fosforylering van p53 bij residu Ser15 bleek afhankelijk te zijn van ATM kinase activiteit 16 . Om de specificiteit van de PLA techniek op cytospinpreparaten van suspensiecelkweken te demonstreren en te bevestigen wordt aangetoond dat inductie van DNA-schade door 2 uur NCS-behandeling van BCR-ABL + B-ALL-cellen die in de G1-fase van de celcyclus gearresteerd werden Resulteerde in de specifieke interactie tussen ATM en fosfo-Ser15-p53, zoals verwacht. Punctale PLA signalen werden waargenomen in de kern van de meeste cellen behandeld met NCS ( Figuur 1B ), met een gemiddelde van 7 PLA signalen per cel 15 , terwijl deze signalen niet gedetecteerd werden in cellen die niet behandeld werden met NCS ( Figuur 1A ) . Voorbehandeling van de cellen met de specifieke ATM-kinaseremmer KU55933 voorafgaand aan de inductie van DNA-schade verminderde duidelijk het aantal PLA-signalen tot een gemiddelde van2 PLA signalen / cel ( Figuur 1C ). De ATM-fosfo-Ser15-p53 PLA-signalen werden, zoals verwacht, uitsluitend in de kern gedetecteerd. PLA experimenten waarin het geit-anti-ATM of het konijn-anti-fosfo-Ser15-p53-antilichaam is weggelaten ('single-antilichaam' controle) leverde geen specifieke PLA signalen op ( figuren 1D en 1E ). Kwantificering en statistische analyses van deze resultaten worden weergegeven in Figuur 1F (aangepast uit Ochodnicka et al., J. Immunol. 2016) 15 .
Figuur 1: In situ PLA voor ATM / fosfo-Ser15-p53-interacties in BV173 Humane BCR-ABL + cellen. ( A ) Cellen werden oornag behandeld met 5 μM imatinib (specifieke Abl kinase-remmer die een G1-fase-celcyclus veroorzaaktE-arrestatie in BCR-ABL + -cellen), met imatinib en 50 ng / ml NCS, die DNA-schade ( B ) veroorzaakte of met imatinib en vooraf behandeld met 5 μM van de specifieke ATM kinaseremmers KU55933 voorafgaand aan NCS-behandeling ( C ) . Single-antilichaam controle PLA experimenten voor de geit-anti-ATM (D) en konijn-anti-fosfo-Ser15-p53 antilichamen ( E ) worden getoond. Rood fluorescentie punctate signalen vertegenwoordigen in situ eiwit proximity (<50 nm) van ATM en fosfo-Ser15-p53 eiwitten. Schaalstaven = 5 μm (witte lijnen). ( F ) Kwantificering van het aantal PLA signalen in ten minste 20 cellen behandeld onder verschillende experimentele omstandigheden worden getoond. Horizontale lijnen vertegenwoordigen middelen; Statistische significansen werden bepaald door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA; *** p <0.001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport wordt aangetoond dat PLA kan worden gebruikt om de specifieke interactie tussen eiwitten in suspensiecelculturen te bepalen en te visualiseren. Opmerking, het hier beschreven protocol is niet beperkt tot de studie van DNA-reparatiecomplexen, maar is ook van toepassing op het visualiseren en kwantificeren van andere eiwit-eiwitinteracties in suspensiecelculturen. Er wordt aangetoond dat de ATM-kinase interfereert met gefosforyleerd p53 in G1-gearresteerde BCR-ABL + B-ALL-cellen wanneer blootgesteld aan een DNA-schade-inducerend middel. Vroeger werd de PLA-techniek gebruikt door ons om te laten zien dat ATM en de FOXO1 transcriptiefactor in BCR-ABL + B-ALL-cellen interactie hebben, maar deze interactie leidde waarschijnlijk niet tot de ATM-afhankelijke fosforylering van FOXO1. Ter ondersteuning van de PLA-gegevens werd bevestigd door immunoprecipitatie van endogene ATM / ATR-gefosforyleerde eiwitten die, in tegenstelling tot de gevestigde ATM-substraten p53 en NBS1, FOXO1 niet gefosforyleerd worden door ATM bij inductie van DNA schade 15 . Daarnaast werd de PLA-aanpak succesvol toegepast om de vorming van mismatchreparatiecomplexen te bestuderen (bijvoorbeeld de interactie tussen MSH2 en MSH6) interacties in diverse humane B-cellymfoma cellijnen (data niet getoond). In deze specifieke contexten leverde de PLA-techniek een alternatieve aanpak om onze bevindingen te ondersteunen. Er wordt aangetoond dat PLA de semi-kwantitatieve beoordeling van eiwit-eiwit interacties tussen experimentele omstandigheden toelaat en inzicht geeft in de variatie tussen cellen en cellen in deze interacties.
De analyse van specifieke eiwit-eiwit interacties in cellen (blootgesteld aan verschillende experimentele omstandigheden) is typisch uitdagend en is onderworpen aan experimentele artefacten. In het algemeen is eiwit co-immunoprecipitatie de gewenste keuze, maar vereist grote aantallen cellen en / of eiwitten, die in wezen de analyse van eiwit-eiwitinteracties in zeldzame cellen verbiedenSoorten of tussen eiwitten die op lage niveaus worden uitgedrukt. Bovendien leidt overexpressie van eiwitten in (irrelevante) cellijnmodellen vaak tot overexpressie artefacten, en resultaten kunnen zeer moeilijk zijn in vivo of in de betreffende celtypen te bevestigen / valideren. Co-immunoprecipitatie vereist ook lysis van cellen en solubilisatie van eiwitten, wat kan leiden tot verlies van signaal wanneer eiwit-eiwitinteracties zwak zijn. Belangrijk is dat eiwit co-immunoprecipitatie en gist-twee-hybride benaderingen niet in staat zijn om intra- en intercellulaire variatie in eiwit-eiwitinteracties te detecteren. De PLA techniek biedt een aantrekkelijk en makkelijk alternatief voor deze technieken, en biedt belangrijk extra inzicht. PLA kan gebruikt worden in een standaard (diagnostische) laboratoriuminstelling, aangezien het niet zeer gespecialiseerde vaardigheden nodig heeft die verder gaan dan immunohistochemie.
De ontwikkeling van superresolutiemicroscopie heeft de diepte mogelijk gemaaktAnalyse van de moleculaire architectuur van eiwitcomplexen. Deze techniek is echter niet beschikbaar en omvat een toegewijde onderzoeksinfrastructuur. PLA biedt een toegankelijke, eenvoudige en goedkope alternatieve aanpak voor de studie van eiwitcomplexvorming, met een vergelijkbare resolutie. Een duidelijke beperking van de PLA techniek is de beschikbaarheid van specifieke primaire antilichamen die in verschillende soorten worden opgewekt. Echter, meerdere bedrijven bieden nu toegewijde (en gevalideerde) antilichaam combinaties die het gebruik van de PLA techniek stroomlijnen.
Studies over de betrokkenheid van eiwitten bij DNA-schadeherstel en het DNA-schaderespons zijn sterk afhankelijk van de analyse van IRIF-vorming en samenstelling. Er moet echter op worden gewezen dat co-lokalisatie van eiwitten in IRIF's niet noodzakelijkerwijs directe eiwit-eiwitinteracties impliceert. De PLA-techniek biedt een unieke kans om DNA-reparatieproteïnen en de vorming van reparatiecomplexen in detail te bestuderen. De spAtiotemporale analyse van de vorming van dergelijke complexen kan meer gedetailleerd worden toegekend met behulp van PLA. Bovendien kunnen onderzoekers de vorming van reparatiecomplexen in weefsels en klinische specimens beoordelen van patiënten die zijn behandeld met DNA-schadelijke stoffen of therapieën, die een belangrijk inzicht kunnen geven in de werkzaamheid van deze behandelingsmodaliteiten en kan zelfs bij de selectie helpen Van de patiënten die het meeste van deze behandelingen zullen profiteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek in het laboratorium van Guikema wordt gefinancierd door het Innovatieve Onderzoeksincentiveschema van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (VIDI-subsidie 016126355) en de 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (project 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
