Summary
Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.
Abstract
Die DNA-Schadensreaktion orchestriert die Reparatur von DNA-Läsionen, die spontan auftreten, durch genotoxischen Stress verursacht werden oder im Zusammenhang mit programmierten DNA-Pausen in Lymphozyten auftreten. Die Ataxia-Telangiektasia-mutierte Kinase (ATM), ATM- und Rad3-verwandte Kinase (ATR) und die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs) gehören zu den ersten, die bei der Induktion von DNA-Schäden aktiviert werden und sind Zentrale Regulatoren eines Netzwerks, das DNA-Reparatur, Apoptose und Zellüberleben kontrolliert. Als Teil eines tumorsuppressiven Weges aktivieren ATM und ATR p53 durch Phosphorylierung, wodurch die Transkriptionsaktivität von p53 reguliert wird. DNA-Schädigung führt auch zur Bildung von sogenannten ionisierenden strahlungsinduzierten Herden (IRIF), die Komplexe von DNA-Schädigungssensoren darstellen und Proteine, die sich an den Stellen der DNA-Schädigung ansammeln, die durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, reparieren. Die Ko-Lokalisierung von Proteinen in IRIFs bedeutet jedoch nicht zwangsläufig dIrekte Protein-Protein-Wechselwirkungen, da die Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie begrenzt ist.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA) ist eine neuartige Technik, die die direkte Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen und Geweben mit beispielloser Spezifität und Empfindlichkeit ermöglicht. Diese Technik basiert auf der räumlichen Nähe von spezifischen Antikörpern, die an die interessierenden Proteine binden. Wenn die abgefragten Proteine innerhalb von ~ 40 nm liegen, wird eine Amplifikationsreaktion durch Oligonukleotide ausgelöst, die an die Antikörper konjugiert sind, und das Amplifikationsprodukt wird durch fluoreszierende Markierung sichtbar gemacht, was ein Signal ergibt, das der subzellulären Position der wechselwirkenden Proteine entspricht. Unter Verwendung der etablierten funktionalen Interaktion zwischen ATM und p53 als Beispiel wird hier gezeigt, wie PLA in Suspensionszellkulturen verwendet werden kann, um die direkten Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die integrale Bestandteile der DNA-Schadensreaktion sind, zu untersuchen.
Introduction
DNA-Schaden löst eine hochregulierte Reihe von Ereignissen mit Protein-Protein-Wechselwirkungen und posttranslationalen Modifikationen aus, die die effiziente und schnelle Reparatur von DNA sicherstellen und damit die genomische Integrität sichern. Typischerweise wird die DNA-Reparatur in Zellen untersucht, die ionisierender Strahlung ausgesetzt sind, indem sie die Bildung von sogenannten ionisierenden Strahlung induzierten Herden (IRIF) durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie überwachen. Viele DNA-Reparatur- und DNA-Schmerz-Sensing-Proteine bilden IRIFs, die Proteinkomplexe repräsentieren, die an Chromatinstellen anhalten, die DNA-Schäden 2 , 3 aufrechterhalten. Die Lage und Auflösung von IRIFs im Laufe der Zeit gibt einen wichtigen Einblick in die räumlich-zeitliche Organisation der DNA-Reparatur und kann auf die Beteiligung verschiedener DNA-Reparaturwege hindeuten. Die Art der DNA-Schädigung und die Zellzyklusstufe, in der der Schaden erreicht wird, bestimmt, welcher DNA-Reparaturweg aktiviert ist. Fo (OH) ist die dominante DNA-Reparaturbahn, während bei Zellen in der G1- oder G2 / M-Phase des Zellzyklus die nicht- Homologe Endverknüpfung (NHEJ) Reparaturpfad überwiegt. Eines der frühesten Ereignisse nach DNA-Schädigung ist die Aktivierung der DNA-Schmerz-Sensing-Kinasen Ataxia Telangiectasia-Mutiertes Protein (ATM), das meist in den G1- und G2 / M-Phasen des Zellzyklus aktiv ist und NHEJ reguliert, Und Ataxia Telangiectasia und Rad3-verwandtes Protein (ATR), das in der S-Phase durch Aktivierung von HR wirkt. Sowohl ATM als auch ATR sind sehr pleiotrope Kinasen, die viele Proteine phosphorylieren, die an der DNA-Reparatur, dem Zelltod und dem Überleben beteiligt sind 4 . Beide Kinasen haben gezeigt, dass sie das Tumorsuppressor-Protein p53 nach der Exposition gegenüber genotoxischem Stress phosphorylieren und aktivieren, was darauf hinweist, dass diese Kinasen stromaufwärts Vermittler einer schwenkbaren Tumorsuppressions-Signalisierungsachse sind"Xref"> 5 , 6
Die Bildung und Zusammensetzung von IRIFs wird typischerweise durch die Bestimmung der Co-Lokalisierung verschiedener Proteine unter Verwendung von zweifarbiger Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie bestimmt, wobei jedoch nicht alle Proteine, die Teil von Reparaturproteinkomplexen sind, IRIFs bilden, was die Anwendbarkeit dieses Ansatzes begrenzt. Darüber hinaus ist die (konfokale) Immunfluoreszenzmikroskopie durch die Beugungseigenschaften von Licht begrenzt, was zu einer eher schlechten räumlichen Auflösung von etwa 200-300 nm führt, die die Größe der meisten subzellulären Strukturen übersteigt, was im Wesentlichen die direkte Vernehmung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Das molekulare Niveau. Als solches ist die Co-Lokalisierung von Immunfluoreszenz-Färbemuster, wie sie durch (konfokale) Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden, nicht notwendigerweise für direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen indikativ. In letzter Zeit wurden neue Super-Resolution-Technologien entwickelt, wie zB dreidimensionale Strukturen(3D-SIM) 7 , die erfolgreich verwendet wurde, um die Bildung von 53BP1 und BRCA1 IRIF im nanoskaligen Detail zu untersuchen und die räumlichen Verteilungscharakteristiken dieser Proteine aufzudecken, die durch konfokale Laserscanningmikroskopie nicht erkannt werden konnten 8 .
Mehrere andere Verfahren können verwendet werden, um Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu detektieren, wie Co-Immunpräzipitation, Pull-Down-Verfahren und Hefe-Zwei-Hybrid-Screening-Ansätze. Allerdings sind diese Techniken eher umständlich, erfordern große Mengen an Zellen oder Proteinen oder beinhalten eine Überexpression von Proteinen, die experimentelle Artefakte einführt. In jüngster Zeit wurde eine neuartige Technik entwickelt, die die Visualisierung und Quantifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ ( dh in Zellen und in Geweben) ermöglicht, die als Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 bezeichnet wird . PrImary-Antikörper, die zwei interessierende Proteine erkennen, werden von sekundären Antikörpern erkannt, die an Oligonukleotide (sogenannte PLA-Sonden) konjugiert sind. Wenn die beiden verschiedenen sekundären Antikörper aufgrund von Wechselwirkungen zwischen den von den primären Antikörpern erkannten Proteinen ausreichend eng sind, hybridisieren die konjugierten Oligonukleotide und können ligiert werden, um ein geschlossenes kreisförmiges DNA-Substrat zu bilden. Dieses kreisförmige Substrat wird anschließend durch Walzkreisverstärkung amplifiziert und mit fluorchrom-konjugierten komplementären Oligonukleotiden sichtbar gemacht. Unter Verwendung von PLA wird die subzelluläre Lokalisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung bewahrt, da das fluoreszenzmarkierte Rollkreis-Amplifikationsprodukt an den PLA-Sonden gebunden bleibt. Die Auflösung dieses Assays beträgt <50 nm, basierend auf dem Ergebnis, dass der Durchmesser eines Antikörpers etwa 7-10 nm 11 beträgt. Die Walzkreisverstärkung kann nur stattfinden, wenn zwei Paare von Antikörpern (primär + sekDary) physisch interagieren innerhalb des Umfangs, der durch ihre Größe (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) definiert ist. Der Signalverstärkungsschritt erhöht die Empfindlichkeit des PLA-Assays und ermöglicht die Detektion von Wechselwirkungen von kaum exprimierten Proteinen. PLA erzeugt punktförmige, foci-ähnliche Signalmuster, die auf einer pro-Zell-Basis quantifiziert werden können, wodurch die intra- und interzelluläre Variation der Protein-Protein-Wechselwirkungen beurteilt werden kann.
Die Bildung und Zusammensetzung von DNA-Reparaturkomplexen und IRIFs wird meist in adhärenten Zelllinien wie der humanen Knochenosteosarkom-Epithelzelllinie U2OS, der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293 und der retinalen Pigmentepithelzelllinie RPE-1 untersucht, Wachsen und leicht zu verwandeln. Suspensionszellkulturen wie lymphoide und myeloide Zelllinien werden seltener eingesetzt, da diese weniger der Transfektion zugänglich sind und sich im Allgemeinen nicht an Deckgläschen haften und somit zusätzliche / alternative StEps für die Bildgebung. Die Auflösung von DNA-Schäden ist jedoch im Zusammenhang mit lymphatischen und myeloischen Malignitäten sehr relevant, da die DNA-Schadensreaktion häufig von genomischen (Treiber-) Aberrationen in diesen Tumoren betroffen ist und eine entscheidende Rolle bei der bösartigen Transformation von normalem lymphatischen und myeloiden ( Vorläufer) Zellen 12 , 13 , 14 .
Dieses Protokoll beschreibt, wie PLA verwendet werden kann, um Protein-Protein-Wechselwirkungen nach der Induktion von DNA-Schäden in Suspensionszellkulturen zu bewerten und zu quantifizieren. Hier wird PLA durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 auf DNA-Schäden in menschlichen B-Zell-Leukämiezellen zu bestimmen und zu visualisieren, die induziert werden, um einem G1-Phasen-Zellzyklus-Arrest zu unterziehen. Bemerkenswert ist, dass das hier vorgestellte Protokoll nicht auf das Studium von ATM- und p53-Interaktionen in G1-arrogierten Leukämiezellen beschränkt ist, sondern auch zur Visualisierung anderer Protein-Protein-Interac verwendet werden kannIn verschiedenen Zelltypen und Suspensionszellkulturen.
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Protocol
1. Behandlung von Zellen und DNA-Schädigung Induktion
- Kultur die humanen BCR-ABL + B-Zell-akuten lymphoblastischen Zelllinien BV173 oder SUP-B15 im IMDM, ergänzt mit 20% FCS, 50 μM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 U / mL Penicillin und 100 μg / mL Streptomycin bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 . Zähle Zellen und Platte bei 2 x 10 & sup6; Zelle / ml in 6-Wells-Platten bei 5 ml / Vertiefung.
HINWEIS: Optional können Suspensionszelllinien verschiedener Herkunft verwendet werden. - Um die BCR-ABL + B-ALL-Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus zu stoppen, fügen Sie 5 μM Imatinib-methansulfonat (STI571) hinzu und inkubieren über Nacht.
- Gegebenenfalls lassen Sie diesen Schritt bei der Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen im gesamten Zellzyklus oder in BCR-ABL-negativen Zelltypen aus.
- Induzieren DNA-Schädigung durch Zugabe von 50 ng / ml Neocarzinostatin (NCS) zur Kultur und inkubieren für 2 h.
- Alternative,Induzieren DNA-Schäden durch Bestrahlung der Zellen unter Verwendung einer radioaktiven Quelle [ 137 Cs] bei 0,5 Gy / min bei einer Dosis von 5 Gy. Nach der Bestrahlung wird die Zelle für 2 h bei 37 ° C in einer Atmosphäre von 5% CO 2 gewonnen .
- Gegebenenfalls, um die Beteiligung der ATM-Kinase-Aktivität in Reaktion auf DNA-Schäden zu bewerten, fügen Sie 5 μM des ATM-Kinase-Inhibitors KU55933 vor der Zugabe von NCS oder der Bestrahlungsbehandlung hinzu.
- 4 PBS + 10% BSA zubereiten, indem man 5 g Fraktion-V BSA auf 50 ml 1x PBS in einem Becher- oder Erlenmeyerkolben schichtet und bei RT aufsetzt, bis BSA gelöst ist. Nicht schütteln oder rühren, da dies zu starkem Schäumen führt. Langsam durch einen 0,22 μm Filter filtrieren und auf Eis aufbewahren.
- Die Zellen zerkleinern und zweimal mit eiskaltem 1x PBS waschen. Zählen Sie die Zellen und resuspendieren bei 2 x 10 6 / ml in 1x PBS + 10% BSA. Halten Sie Zellen auf Eis.
2. Zytocentrifugation, Fixierung und Permeabilisierung
- Bereite das ... Vor4% Paraformaldehydlösung in 1x PBS frisch. 2 g PFA zu 50 ml 1x PBS zugeben und in einem 55 ° C Schüttelwasserbad inkubieren, bis die Lösung klar ist. Die Lösung wird durch ein 0,22 μm Filter filtriert und bei RT bis zur Verwendung aufbewahrt.
HINWEIS: Optional können 4% PFA-Fixiermittel bei -20 ° C gefroren gelagert werden. Nach dem Einfrieren nur einmal zum Gebrauch auftauen Ansonsten kann die 4% PFA-Lösung in PBS direkt erworben werden. - Polieren Sie 76 mm x 26 mm Mikroskopie-Folien mit fusselfreiem Gewebe und entfetten Sie sie, indem Sie in 96% Ethanol in ein Coplin-Gefäß für 5 min platzieren. Lassen Sie die Mikroskopie für 10 min lufttrocknen.
- Montieren Sie Mikroskopie-Objektträger in die Zytospin / Zytologie-Trichter mit einer Fläche von 6 mm. Vorbeschichtung von Folien durch Pipettieren von 50 μl 1x PBS + 10% BSA in jeden Trichter und zentrifugieren für 1 min bei 500 U / min.
- 100 μl der Zellsuspension (entspricht 0,2 x 10 6 Zellen) zu jedem Trichter geben und 5 min bei 500 U / min zentrifugieren. Für jede Antikörper-Kombination, bei leAst 4 Präparate sind erforderlich (Dual-Antikörper-Experiment, zwei Einzel-Antikörper-Kontrollen, keine Antikörper-Kontrolle).
- Die Trichter sorgfältig zerlegen und darauf achten, die Flecken nicht zu berühren. Gehen Sie zur Fixierung sofort vor.
- Gegebenenfalls lassen Sie die Schläuche für mindestens 30 min lufttrocknen. Nach dem Lufttrocknen die Folien einzeln in Aluminiumfolie einwickeln und bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren. Bei der Verwendung von gefrorenen Zubereitungen ist darauf zu achten, dass die Folien in ein Papiertuch eingehüllt werden, um eine offene Kondensation auf den Objektträgern zu verhindern.
- Zeichnen Sie einen Kreis (ungefährer Durchmesser 15-20 mm) um den Punkt mit einem PAP-Stift flüssigen Blocker (5 mm Spitze).
- Füge 50 μl 4% PFA-Fixierlösung zu jedem Punkt hinzu und inkubiere für 30 min bei RT.
- Die Zellen 3 mal für 5 min mit 1x PBS in einem Coplin-Gefäß bei RT unter leichtem Rühren waschen.
- Trocknen Sie die Schieber um die Flecken mit einem fusselfreien Gewebe und entfernen Sie so viel Flüssigkeit von der Stelle wie möglich mit einem piHaustier ohne Berührung der Stelle, oder durch Kippen der Folie. Füge 50 μl 0,25% Triton-X in 1x PBS zu jedem Punkt hinzu und inkubiere für 10 min bei RT ohne Rühren.
- Die Dias 3 mal für 5 min in ~ 50-60 ml von 0,05% Tween-20 in TBS (TBS-T) in einem Coplin-Gefäß bei RT unter leichtem Rühren waschen. 10 Folien können auf diese Weise gleichzeitig verarbeitet werden.
3. Blockierung und primäre Antikörper-Inkubation
- TBS-T abschneiden und die Folien mit einem fusselfreien Gewebe um die Flecken trocknen. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit von der Stelle wie möglich mit einer Pipette, ohne den Fleck zu berühren, oder durch Kippen der Folie. In kurzer Zeit die Sperrlösung vortexen und jedem Tropfen einen Tropfen (~ 40 μL) hinzufügen. 1 Stunde bei 37 ° C in einer vorgewärmten befeuchteten Kammer inkubieren.
- Bereiten Sie den Antikörper-Cocktail vor, indem Sie den Ziegen-Anti-ATM bei 1: 1000 und das Kaninchen-Anti-Phospho-Ser15-p53 bei 1: 100 im kommerziellen Antikörper-Verdünnungsmittel vorwischen. Für KontrollversucheTs, bereiten Antikörperverdünnungen vor, die nur den Ziegen-Anti-ATM und nur den Kaninchen-Anti-Phospho-Ser15-p53-Antikörper (Einzel-Antikörper-Kontrollen) enthalten.
- Klopfen Sie die Sperrlösung, aber achten Sie darauf, dass die Zellen nicht vor der Zugabe der Antikörperverdünnungen trocknen lassen. Fügen Sie 30 μl jeder Antikörper-Cocktail-Verdünnung hinzu und inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei 4 ° C.
- Vorbereitung in situ Waschpuffer A und Waschpuffer B durch Auflösen des Gehalts eines Beutels von Puffer A und Puffer B in einem Endvolumen von jeweils 1.000 ml Wasser.
- Alternativ wird der Waschpuffer A durch Auflösen von 8,8 g NaCl, 1,2 g Tris-Base und 0,5 ml Tween-20 in 800 ml Wasser hergestellt. Den pH-Wert auf 7,4 mit HCl einstellen und zu einem Endvolumen von 1.000 ml hinzufügen.
- Alternativ kann man Waschpuffer B durch Auflösen von 5,84 g NaCl, 4,24 Tris-Base und 26,0 g Tris-HCl in 500 ml Wasser aufbereiten. Den pH-Wert mit HCl auf 7,5 einstellen. Füge Wasser zu einem Endvolumen von 1.000 ml hinzu.
- FilterBeide Lösungen durch ein 0,22 μm Filter.
- Die Dias 2 mal für 5 min mit 1x in situ Waschpuffer A in einem Coplin-Gefäß bei RT unter leichtem Rühren waschen.
4. PLA Sonden, Ligation und Amplifikation
- Vorbereiten von PLA-Sonden durch Verdünnen des Anti-Ziegen-PLUS und Anti-Kaninchen MINUS sowohl 1: 5 im kommerziellen Antikörper-Verdünnungsmittel. Manipulieren Sie 1x in situ Waschpuffer A aus den Objektträgern und fügen Sie 30 μl des PLA-Sonden-Gemisches zu jedem Punkt hinzu. 1 h bei 37 ° C in einer vorgewärmten befeuchteten Kammer inkubieren.
HINWEIS: Jede Kombination von sekundären Antikörpern PLUS und MINUS PLA Sonden kann verwendet werden (Anti-Maus, Anti-Kaninchen, Anti-Ziege), solange die angewandten primären Antikörper in verschiedenen Spezies angehoben werden und die Kombination von PLA-Sonden sollte immer Eine PLUS-Sonde und eine MINUS-Sonde enthalten. - Waschen Sie die Objektträger 2 mal für 5 min mit ~ 50-60 ml 1x in situ Waschpuffer A in einem Coplin-Gefäß bei RT mit sanfter Bewegung/ Li>
- Die Ligations-Ligase-Lösung auf Eis durch Zugabe von 1 & mgr; l Ligase zu 39 & mgr; l Ligationslösung vorbereiten und 40 & mgr; l Ligations-Ligase-Lösung zu jedem Punkt hinzufügen. 30 min bei 37 ° C in einer vorgewärmten befeuchteten Kammer inkubieren.
- Die Dias 2 mal für 5 min mit ~ 50-60 ml 1x in situ Waschpuffer A in einem Coplin-Gefäß bei RT unter leichtem Rühren waschen.
- Das Amplifizierungs-Polymerase-Gemisch auf Eis durch Verdünnen der Amplifizierungs-Stammlösung 1: 5 in Wasser vorbereiten. Dann werden für jeden Punkt 0,5 μl Polymerase auf 39,5 μl 1x Amplifikationslösung gegeben.
HINWEIS: Die Amplifikationsreagenzien sind lichtempfindlich und sollten vor direkter Belichtung geschützt werden. Das Verstärkungsreagenz kommt in vier verschiedenen Farben (RED: Anregung 594 nm, Emission 624 nm, FarRED: Anregung 644 nm, Emission 669 nm, ORANGE: Anregung 554 nm, Emission 576 nm, GRÜN: Anregung 501 nm, Emission 523 nm) Stellen Sie sicher, dass das verfügbare Mikroskopie-Setup s hatEchte Erregungseigenschaften und Filter, um diese Farben abzubilden. - Manipulieren Sie 1x in situ Waschpuffer A und fügen Sie 40 μl Amplifikations-Polymerase-Mischung pro Spot hinzu. 100 min bei 37 ° C in einer vorgewärmten befeuchteten Kammer inkubieren.
5. Montage und Imaging
- 0,01x in situ Waschpuffer B durch Zugabe von 1 ml 1x Waschpuffer B auf 99 ml Wasser zubereiten.
- Die Amplifikations-Polymerase-Mischung abschneiden und 10-mal für 10 min mit 1x in situ Waschpuffer B in einem Coplin-Gefäß bei RT unter leichtem Rühren waschen.
- Waschen Sie die Objektträger 1 min in 0,01x Waschpuffer B.
- Abzapfen Sie überschüssigen 0,01x Waschpuffer B und trocknen Sie die Folien um die Flecken mit einem fusselfreien Gewebe. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit von der Stelle wie möglich mit einer Pipette, ohne den Fleck zu berühren, oder durch Kippen der Folie.
- DAPI-haltiges Montagemedium 1: 5 im Montagemedium ohne DAPI verdünnen, um eine Überfärbung der Kerne zu vermeiden.
- Fügen Sie 25-30 μl 1: 5 DAPI-haltiges Aufnahmemedium zu einem 24 mm x 24 mm Deckglas hinzu und heben Sie den Deckel mit dem Schlitten auf, wenden Sie leichten Druck an, um sicherzustellen, dass keine eingeschlossenen Luftblasen vorhanden sind. Das Deckglas mit Nagellack abdichten und mindestens 15 Minuten vor der Bildgebung warten.
- Analysieren Sie die Folien mit einem (konfokalen) Fluoreszenzmikroskop.
- Zähle die Anzahl der punktierten PLA-Signale pro Zelle in mindestens 4 erworbenen Bildfeldern (20x Objektiv, Zählen von mindestens 20 Zellen pro Bedingung oder Antikörper-Kombination, basierend auf einer Leistungsberechnung unter Verwendung eines erwarteten Mittels von 7 ± 5 Signalen in den behandelten Zellen, Und 2 ± 2 Signale in den unbehandelten Zellen, mit einer Wahrscheinlichkeit eines Typ-I-Fehlers von 0,05 und einer Leistung von 80%, wie bereits gemeldet 15 ).
HINWEIS: Die beste Auflösung wird durch die Erfassung eines Z-Stacks und der Dekonvolution mit Softwarepaketen erreicht ( zB ImageJ, die Leica Acquisition Suite (LAS)). Die signaLs sollte innerhalb des nuklearen Umfangs, wie durch die DAPI-Färbung definiert, leicht erkennbar sein. - Zählen Sie keine Signale, die deutlich außerhalb der Kerne erscheinen. Typischerweise führt die NCS-Behandlung oder die γ-Bestrahlung zu etwa 5-10 Phosho-p53 / ATM-PLA-Signalen pro Zelle. Die "Einzel-Antikörper" -Regler können etwas Hintergrundsignal geben, aber das sollte nicht 1-2 PLA-Signale pro 1 von 20 Zellen überschreiten.
- Für Veröffentlichungs- und Präsentationszwecke können Bilder mit einem 40X- oder 63X-Immersionsöl-Objektiv aufgenommen werden. Die Objektträger können bei 4 ° C gelagert und vor Lichteinwirkung geschützt werden.
- Zähle die Anzahl der punktierten PLA-Signale pro Zelle in mindestens 4 erworbenen Bildfeldern (20x Objektiv, Zählen von mindestens 20 Zellen pro Bedingung oder Antikörper-Kombination, basierend auf einer Leistungsberechnung unter Verwendung eines erwarteten Mittels von 7 ± 5 Signalen in den behandelten Zellen, Und 2 ± 2 Signale in den unbehandelten Zellen, mit einer Wahrscheinlichkeit eines Typ-I-Fehlers von 0,05 und einer Leistung von 80%, wie bereits gemeldet 15 ).
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Representative Results
Die Phosphorylierung von p53 am Rest Ser15 zeigte sich als abhängig von der ATM-Kinaseaktivität 16 . Um die Spezifität der PLA-Technik auf Zytospin-Präparationen von Suspensionszellkulturen zu demonstrieren und zu bestätigen, wird gezeigt, dass die Induktion von DNA-Schäden durch 2-h-NCS-Behandlung von BCR-ABL + B-ALL-Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus verhaftet wurde Führte zu einer spezifischen Wechselwirkung zwischen ATM und Phospho-Ser15-p53, wie erwartet. Punctate PLA-Signale wurden im Kern der Mehrheit der mit NCS behandelten Zellen (Abbildung 1B ) mit durchschnittlich 7 PLA-Signalen pro Zelle 15 beobachtet, während diese Signale nicht in Zellen nachgewiesen wurden, die nicht mit NCS behandelt wurden (Abbildung 1A ) . Die Vorbehandlung der Zellen mit dem spezifischen ATM-Kinase-Inhibitor KU55933 vor der Induktion von DNA-Schäden verminderte die Anzahl der PLA-Signale im Durchschnitt deutlich2 PLA Signale / Zelle ( Abbildung 1C ). Die ATM-Phospho-Ser15-p53-PLA-Signale wurden exklusiv im Kern detektiert, wie erwartet. PLA-Experimente, bei denen entweder der Ziegen-Anti-ATM oder der Kaninchen-Anti-Phospho-Ser15-p53-Antikörper weggelassen wurde (& ldquor; Einzel-Antikörper "-Steuerung) zeigten keine spezifischen PLA-Signale ( 1D und 1E ). Quantifizierung und statistische Analysen dieser Ergebnisse sind in Abbildung 1F dargestellt (angepasst von Ochodnicka et al., J.Immunol, 2016) 15 .
Abbildung 1: In situ PLA für ATM / Phospho-Ser15-p53 Wechselwirkungen in BV173 Human BCR-ABL + Zellen. ( A ) Die Zellen wurden über Nacht mit 5 & mgr; M Imatinib (spezifischer Abl-Kinase-Inhibitor, der einen G1-Phasen-Zellzyklus hervorruft, behandelt( B ) oder mit Imatinib und mit 5 μM des spezifischen ATM-Kinase-Inhibitors KU55933 vor der NCS-Behandlung ( C ) vorbehandelt, mit Imatinib und 50 ng / ml NCS, . Einzel-Antikörper-Kontrolle PLA-Experimente für die Ziegen-Anti-ATM (D) und Kaninchen-Anti-Phospho-Ser15-p53-Antikörper ( E ) sind gezeigt. Rote Fluoreszenz-Punctate-Signale repräsentieren in situ Protein-Näherung (<50 nm) von ATM- und Phospho-Ser15-p53-Proteinen. Maßstäbe = 5 μm (weiße Linien). ( F ) Die Quantifizierung der Anzahl der PLA-Signale in mindestens 20 Zellen, die unter verschiedenen experimentellen Bedingungen behandelt wurden, wird gezeigt. Horizontale Linien stellen Mittel dar; Statistische Bedeutungen wurden durch eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA; *** p <0,001) bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Bericht wird gezeigt, dass PLA verwendet werden kann, um die spezifische Wechselwirkung zwischen Proteinen in Suspensionszellkulturen zu bestimmen und zu visualisieren. Bemerkenswert ist, dass das hier beschriebene Protokoll nicht auf die Untersuchung von DNA-Reparaturkomplexen beschränkt ist, sondern auch für die Visualisierung und Quantifizierung anderer Protein-Protein-Wechselwirkungen in Suspensionszellkulturen gilt. Es wird gezeigt, dass die ATM-Kinase mit phosphoryliertem p53 in G1-verhafteten BCR-ABL + B-ALL-Zellen interagiert, wenn sie einem DNA-schadeninduzierenden Agens ausgesetzt wird. Bisher wurde die PLA-Technik von uns verwendet, um zu zeigen, dass ATM und der FOXO1-Transkriptionsfaktor in BCR-ABL + B-ALL-Zellen interagierten, diese Interaktion jedoch höchstwahrscheinlich nicht zu der ATM-abhängigen Phosphorylierung von FOXO1 führte. Zur Unterstützung der PLA-Daten wurde durch Immunpräzipitation von endogenen ATM / ATR-phosphorylierten Proteinen bestätigt, dass im Gegensatz zu den etablierten ATM-Substraten p53 und NBS1 FOXO1 bei der Induktion von D nicht durch ATM phosphoryliert wirdNA Schaden 15 . Darüber hinaus wurde der PLA-Ansatz erfolgreich angewendet, um die Bildung von Mismatch-Reparaturkomplexen ( z. B. die Wechselwirkung zwischen MSH2 und MSH6) -Interaktionen in verschiedenen menschlichen B-Zell-Lymphomzelllinien (Daten nicht gezeigt) zu untersuchen. In diesen konkreten Kontexten bot die PLA-Technik einen alternativen Ansatz zur Unterstützung unserer Ergebnisse an. Es wird gezeigt, dass PLA die semi-quantitative Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen experimentellen Bedingungen ermöglicht und einen Einblick in die Zell-zu-Zell-Variation in diesen Wechselwirkungen gibt.
Die Analyse spezifischer Protein-Protein-Wechselwirkungen in Zellen (die verschiedenen experimentellen Bedingungen ausgesetzt waren) war typischerweise herausfordernd und unterliegt experimentellen Artefakten. Im Allgemeinen ist die Protein-Co-Immunpräzipitation die Methode der Wahl, erfordert jedoch eine große Anzahl von Zellen und / oder Proteinen, die im Wesentlichen die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer seltenen Zelle verbietenTypen oder zwischen Proteinen, die auf niedrigem Niveau ausgedrückt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression von Proteinen in (irrelevanten) Zelllinienmodellen oft zu Überexpressionsartefakten, und die Ergebnisse können in vivo oder in den relevanten Zelltypen sehr schwer zu bestätigen / zu validieren sein. Auch die Co-Immunpräzipitation erfordert die Lyse von Zellen und die Solubilisierung von Proteinen, die zu einem Signalverlust führen können, wenn Protein-Protein-Wechselwirkungen schwach sind. Wichtig ist, dass Protein-Co-Immunpräzipitation und Hefe-Zwei-Hybrid-Ansätze nicht intra- und interzelluläre Variation in Protein-Protein-Wechselwirkungen nachweisen können. Die PLA-Technik bietet eine attraktive und einfache Alternative für diese Techniken und bietet wichtige zusätzliche Einblicke. PLA kann in einer Standard-Diagnostik-Labor-Einstellung verwendet werden, da es nicht erfordert hoch spezialisierte Fähigkeiten über die Fähigkeit, Immunhistochemie durchzuführen.
Die Entwicklung der Super-Auflösung-Mikroskopie hat die Tiefe erlaubtAnalyse der molekularen Architektur von Proteinkomplexen. Diese Technik ist jedoch nicht ohne weiteres verfügbar und beinhaltet eine eigene Forschungsinfrastruktur. PLA bietet einen zugänglichen, einfachen und kostengünstigen Alternativansatz für das Studium der Proteinkomplexbildung mit einer vergleichbaren Auflösung. Eine offensichtliche Beschränkung der PLA-Technik ist die Verfügbarkeit von spezifischen primären Antikörpern, die in verschiedenen Spezies aufgewachsen sind. Allerdings bieten mehrere Unternehmen nun dedizierte (und validierte) Antikörper-Kombinationen an, die den Einsatz der PLA-Technik optimieren.
Studien über die Beteiligung von Proteinen an der DNA-Schadensreparatur und der DNA-Schadensreaktion beruhen stark auf der Analyse der IRIF-Bildung und -Zusammensetzung. Allerdings ist zu beachten, dass die Co-Lokalisierung von Proteinen in IRIFs nicht notwendigerweise direkte Protein-Protein-Wechselwirkungen bedeutet. Die PLA-Technik bietet eine einmalige Gelegenheit, DNA-Reparaturproteine und die Bildung von Reparaturkomplexen detaillierter zu untersuchen. Die spDie atiotemporale Analyse der Bildung solcher Komplexe kann mit PLA näher dargestellt werden. Darüber hinaus wird es Forschern ermöglichen, die Bildung von Reparaturkomplexen in Geweben und klinischen Proben von Patienten zu beurteilen, die mit DNA-schädigenden Wirkstoffen oder Therapien behandelt wurden, die einen wichtigen Einblick in die Wirksamkeit dieser Behandlungsmodalitäten liefern und sogar bei der Auswahl helfen können Von Patienten, die am meisten von diesen Behandlungen profitieren werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Forschung im Guikema-Labor wird gefördert durch das Innovative Research Incentives Scheme der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (VIDI-Stipendium 016126355) und das "Stichting Kinderen Kankervrij" KiKA (Projekt 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
