Summary
Здесь показано, как анализ in situ Proximity Ligation Assay (PLA) может использоваться для обнаружения и визуализации прямых белково-белковых взаимодействий между АТМ и р53 в культурах суспензионных клеток, подверженных генотоксическому стрессу.
Abstract
Ответ на повреждение ДНК организует восстановление повреждений ДНК, которые происходят спонтанно, вызваны генотоксическим стрессом или появляются в контексте запрограммированных разрывов ДНК в лимфоцитах. К числу первых, которые активируются при индукции повреждения ДНК, относятся мутантная киназа Ataxia-Telangiectasia (ATM), ATM- и Rad3-родственная киназа (ATR) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой белковой киназы (DNA-PKcs). Центральные регуляторы сети, которые контролируют восстановление ДНК, апоптоз и выживаемость клеток. В рамках подавляющего опухоль пути АТМ и АТР активируют р53 через фосфорилирование, тем самым регулируя транскрипционную активность р53. Повреждение ДНК также приводит к образованию так называемых очагов, индуцированных ионизирующим излучением (IRIF), которые представляют собой комплексы датчика повреждения ДНК и восстанавливающие белки, которые накапливаются в местах повреждения ДНК, которые визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает dПрямое белково-белковое взаимодействие, поскольку разрешение флуоресцентной микроскопии ограничено.
In situ Proxyimity Ligation Assay (PLA) - это новый метод, который позволяет осуществлять непосредственную визуализацию белково-белковых взаимодействий в клетках и тканях с беспрецедентной специфичностью и чувствительностью. Этот метод основан на пространственной близости специфических антител, связывающихся с представляющими интерес белками. Когда опрошенные белки находятся в пределах ~ 40 нм, реакция амплификации инициируется олигонуклеотидами, которые конъюгированы с антителами, и продукт амплификации визуализируется флуоресцентной мечением, что дает сигнал, который соответствует субклеточному расположению взаимодействующих белков. Используя установленное функциональное взаимодействие между АТМ и р53 в качестве примера, здесь показано, как PLA можно использовать в культурах суспензионных клеток для изучения прямых взаимодействий между белками, которые являются неотъемлемыми частями ответа на повреждение ДНК.
Introduction
Ущерб ДНК вызывает высокорегулярную последовательность событий, включающих белково-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации, которые обеспечивают эффективный и быстрый ремонт ДНК, тем самым защищая геномную целостность 1 . Как правило, репарация ДНК изучается в клетках, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения, путем мониторинга образования так называемых ионизирующих излучений фокусов (IRIF) с помощью (конфокальной) флуоресцентной микроскопии. Многие репарации ДНК и ДНК, чувствительные к повреждениям ДНК, образуют IRIF, которые представляют собой белковые комплексы, которые зарождаются на участках хроматина, поддерживающих повреждение ДНК 2 , 3 . Расположение и разрешение IRIF со временем дают важное представление о пространственно-временной организации репарации ДНК и могут указывать на участие различных путей восстановления ДНК. Характер повреждения ДНК и стадии клеточного цикла, в которой достигается повреждение, определяет, какой путь восстановления ДНК активирован. Fo Например, в клетках, активно участвующих в репликации ДНК (S-фаза), гомологичная рекомбинация (HR) является доминирующим способом восстановления ДНК, тогда как в клетках в G1- или G2 / M-фазе клеточного цикла, Преобладает путь восстановления гомологичного концевого соединения (NHEJ). Одним из ранних событий после повреждения ДНК является активация ДНК-чувствительных киназ Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), которая в основном активна в G1- и G2 / M-фазах клеточного цикла и регулирует NHEJ, И Ataxia Telangiectasia и Rad3-родственный белок (ATR), который действует в S-фазе путем активации HR. Оба АТМ и АТР представляют собой плейотропные киназы, которые фосфорилируют многие белки, которые участвуют в репарации ДНК, гибели клеток и выживании 4 . Было показано, что обе киназы фосфорилируют и активируют белок-супрессор опухоли р53 после воздействия генотоксического стресса, указывая, что эти киназы являются предшественниками медиаторов основной оси подавления опухолей"Xref"> 5 , 6 .
Образование и состав IRIF обычно оценивают путем определения совместной локализации различных белков с использованием двухцветного иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии, однако не все белки, которые являются частью ремонтных белковых комплексов, образуют IRIF, что ограничивает применимость этого подхода. Кроме того, (конфокальная) иммунофлуоресцентная микроскопия ограничивается дифракционными свойствами света, что приводит к довольно плохим пространственным разрешением около 200-300 нм, превышающим размер большинства субклеточных структур, что существенно запрещает прямой опрос белково-белковых взаимодействий при Молекулярный уровень. Таким образом, совместная локализация образцов окраски иммунофлюоресценции, обнаруженная (конфокальной) флуоресцентной микроскопией, необязательно является показательной для прямых белково-белковых взаимодействий. Недавно были разработаны новые технологии с высоким разрешением, такие как трехмерные структуры(3D-SIM) 7 , который был успешно использован для изучения формирования IRIF 53BP1 и BRCA1 на наномасштабных деталях, выявляя характеристики пространственного распределения этих белков, которые не были обнаружены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 8 .
Для обнаружения белково-белковых взаимодействий in vivo можно использовать несколько других методов, таких как совместное иммунопреципитация, методы вытягивания и двухгибридные скрининг-дрожжи. Однако эти методы довольно громоздки, требуют больших количеств клеток или белков или включают избыточную экспрессию белков, которая вводит экспериментальные артефакты. Совсем недавно был разработан новый метод, который позволяет визуализировать и количественно определять белково-белковые взаимодействия in situ ( т.е. в клетках и в тканях), который называется анализом лигирования близости (PLA) 9 , 10 . PrИмариновые антитела, которые распознают два представляющих интерес белка, обнаруживаются вторичными антителами, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (так называемые PLA-зонды). Если два разных вторичных антитела достаточно близки из-за взаимодействий между белками, распознаваемыми первичными антителами, конъюгированные олигонуклеотиды гибридизуются и могут быть лигированы с образованием замкнутого кольцевого ДНК-субстрата. Этот круглый субстрат затем амплифицируют путем амплификации окружности качения и визуализируют с комплементарными флуорохромовыми комплементарными олигонуклеотидами. Используя PLA, субклеточная локализация белково-белкового взаимодействия сохраняется, так как флуоресцентно меченый продукт амплификации скользящего круга остается прикрепленным к PLA-зондам. Разрешение этого анализа составляет <50 нм, на основании нахождения, что диаметр антитела составляет приблизительно 7-10 нм 11 . Усиление прокатного круга может иметь место только в случае, если две пары антител (первичный + секонDary) физически взаимодействуют по периметру, который определяется их размером (10 + 10 + 10 + 10 = 40 нм). Шаг усиления сигнала увеличивает чувствительность анализа PLA и позволяет обнаруживать взаимодействия едва выраженных белков. PLA генерирует точечные фокусные сигналы, которые могут быть определены количественно на основе клеток, с помощью которых можно оценивать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях.
Образование и состав восстановительных комплексов ДНК и IRIFs в основном изучают в клеточных линиях клещей, таких как линия U2OS эпителиальных клеток костной остеосаркомы человека, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293 и линия эпителиальных клеток ретинального эпителия RPE-1, Растут и легко трансфицируются. Культуры клеток суспензии, такие как лимфоидные и миелоидные клеточные линии, используются реже, поскольку они менее подвержены трансфекции и обычно не прилипают к покровным, что требует дополнительной / альтернативной ст.Eps для визуализации. Однако разрешение повреждения ДНК очень важно в контексте лимфоидных и миелоидных злокачественных новообразований, так как ответ на повреждение ДНК часто зависит от геномных (драйверов) аберраций в этих опухолях, играя ключевую роль в злокачественной трансформации нормальных лимфоидных и миелоидных ( Предшественник) 12 , 13 , 14 .
Этот протокол описывает, как PLA может использоваться для оценки и количественного определения белково-белковых взаимодействий после индукции повреждения ДНК в культурах суспензионных клеток. Здесь выполняется PLA для определения и визуализации взаимодействий между ATM и p53 при повреждении ДНК в клетках лейкемии человека B-клеток, которые индуцируются для того, чтобы подвергнуться остановке клеточного цикла G1-фазы. Следует отметить, что представленный здесь протокол не ограничивается изучением взаимодействий ATM и p53 в клетках лейкемии, арестованных G1, но также может быть использован для визуализации другого белково-белкового взаимодействияВ различных типах клеток и в культурах суспензионных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лечение клеток и индукция повреждения ДНК
- Культивируют клеточные линии BCR-ABL + B-клеток человека BCR-ABL + BV173 или SUP-B15 в IMDM, дополненные 20% FCS, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 100 ед. / Мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Считайте клетки и планшеты при 2 × 10 6 клеток / мл в 6-луночных планшетах в 5 мл / лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно могут использоваться линии подвески различного происхождения. - Чтобы остановить клетки BCR-ABL + B-ALL в G1-фазе клеточного цикла, добавьте 5 мкМ метансульфоната иматиниба (STI571) и инкубируйте в течение ночи.
- Необязательно, опустите этот шаг при изучении белково-белковых взаимодействий в течение клеточного цикла или в типах BCR-ABL-отрицательных клеток.
- Вызывают повреждение ДНК путем добавления 50 нг / мл неокарзиностатина (NCS) к культуре и инкубируют в течение 2 часов.
- С другой стороны,Индуцируют повреждение ДНК путем облучения клеток с использованием радиоактивного источника [ 137 Cs] со скоростью 0,5 Гр / мин в дозе 5 Гр. После облучения клетки восстанавливают в течение 2 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 .
- Необязательно, чтобы оценить участие активности киназы АТМ в ответ на повреждение ДНК, добавить 5 мкМ ингибитора киназы АТМ KU55933 до добавления NCS или облучения.
- Подготовьте 1x PBS + 10% BSA путем наслаивания 5 г фракции-V BSA поверх 50 мл 1x PBS в стакане или колбе Эрленмейера и дайте сидеть при RT до растворения BSA. Не встряхивайте и не перемешивайте, так как это приведет к вспениванию. Медленно фильтруйте через фильтр 0,22 мкм и держите на льду.
- Убирайте клетки и дважды промывайте ледяным 1x PBS. Подсчитайте клетки и ресуспендируют при 2 × 10 6 / мл в 1x PBS + 10% BSA. Держите клетки на льду.
2. Цитоцентрифугирование, фиксация и пермеабилизация
- Подготовьте4% раствора параформальдегида в 1х PBS свеже. Добавить 2 г PFA в 50 мл 1x PBS и инкубировать в качающейся водяной бане с температурой 55 ° C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Фильтруют раствор через фильтр 0,22 мкм и хранят при комнатной температуре до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно, фиксатор PFA 4% можно хранить замороженным при -20 ° C. После замораживания оттаивайте только один раз для использования. В противном случае решение 4% PFA в PBS можно купить напрямую. - Осторожно отполируйте слайды с микроскопом размером 76 мм x 26 мм с безворсовой тканью и обезжирьте их, помещая в 96% этанол в банку Coplin в течение 5 минут. Позвольте микроскопии сместиться в воздухе на 10 минут.
- Собрать микроскопические слайды в цитоскопические / цитологические воронки с площадью 6 мм. Предварительно покрытые слайды путем пипетирования 50 мкл 1x PBS + 10% BSA в каждую воронку и центрифуги в течение 1 мин при 500 об / мин.
- Добавьте 100 мкл суспензии клеток (равную 0,2 × 10 6 клеток) в каждую воронку и центрифугируйте в течение 5 мин при 500 об / мин. Для каждой комбинации антител в leТребуются препараты ast 4 (эксперимент с двумя антителами, два контроля с одним антителом, без контроля антител).
- Осторожно разоберите воронки и не прикасайтесь к пятнам. Немедленно перейти к фиксации образца.
- При желании, разрежьте сушки на воздухе в течение как минимум 30 минут. После сушки на воздухе оберните отдельные листы в алюминиевой фольге и храните при -20 ° C до использования. При использовании замороженных препаратов обязательно протащите слайды, обернутые в бумажное полотенце, чтобы предотвратить открытую конденсацию на слайдах.
- Нарисуйте круг (приблизительный диаметр 15-20 мм) вокруг пятна с помощью блока фиксации пера PAP (наконечник 5 мм).
- Добавьте 50 мкл 4% раствора фиксации PFA к каждому пятну и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Промывают клетки 3 раза в течение 5 минут с помощью 1x PBS в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
- Высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса и удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пиЖивотное, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Добавьте 50 мкл 0,25% Triton-X в 1x PBS к каждому пятну и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания.
- Промойте слайды 3 раза в течение 5 минут в ~ 50-60 мл 0,05% Tween-20 в TBS (TBS-T) в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Таким образом можно обрабатывать 10 слайдов.
3. Блокировка и первичная интубация антител
- Удалите TBS-T и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Коротко встряхните блокирующий раствор и добавьте одну каплю (~ 40 мкл) в каждое пятно. Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C в предварительно разогретой увлажненной камере.
- Подготовьте коктейль с антителами, смешав козьим анти-АТМ с 1: 1000 и кролик-антифосфо-Ser15-p53 при 1: 100 в разбавителе коммерческого антитела, разбавителе вихревых антител перед использованием. Для контрольного экспериментаTs, готовят растворы антител, содержащие только козьим анти-АТМ, и только антитело кролика-антифосфо-Ser15-p53 (контроль с одним антителом).
- Удалите блокирующий раствор, но будьте осторожны, чтобы клетки не высушивались до добавления разведений антител. Добавьте 30 мкл каждого разбавителя для коктейлей антител и инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при 4 ° C.
- Подготовьте промывочный буфер A и промывочный буфер B на месте, растворяя содержимое одного мешка буфера A и буфера B в конечном объеме 1000 мл воды каждый.
- Альтернативно, подготовьте промывочный буфер А, растворяя 8,8 г NaCl, 1,2 г Трис-основания и 0,5 мл Tween-20 в 800 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl и добавьте до конечного объема 1000 мл.
- Альтернативно, подготовьте промывочный буфер B, растворяя 5,84 г NaCl, 4,24 трис-основания и 26,0 г Трис-HCl в 500 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,5, используя HCl. Добавить воду до конечного объема 1000 мл.
- ФильтрОба решения через фильтр 0,22 мкм.
- Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с 1x буфером для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
4. Зонды PLA, лигирование и амплификация
- Подготовьте PLA-зонды, разбавив анти-козьим PLUS и кроличьим MINUS как 1: 5 в коммерческом разбавителе антител. Удалите 1x бункер для промывки in situ A из слайдов и добавьте 30 мкл пробной смеси PLA к каждому пятну. Инкубируйте 1 час при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ. Любая комбинация зондов PLUS и MINUS PLA с вторичными антителами может быть использована (антимышина, против кролика, против коз), если применяемые первичные антитела возникают у разных видов, а комбинация PLA-зондов всегда должна быть Содержат зонд PLUS и зонд MINUS. - Вымойте слайды 2 раза в течение 5 минут с ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. </ Li>
- Подготовьте раствор лигирования-лигазы на льду, добавив 1 мкл лигазы к 39 мкл раствора лигирования и добавьте 40 мкл раствора лигирования-лигазы к каждому пятну. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
- Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с помощью ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
- Подготовьте смесь Amplification-Polymerase на льду путем разбавления исходного раствора Amplification 1: 5 в воде. Затем добавляют 0,5 мкл полимеразы к 39,5 мкл 1х раствора для амплификации для каждого пятна.
ПРИМЕЧАНИЕ. Реактивы амплификации чувствительны к свету и должны быть защищены от прямого воздействия света. Усилитель-реагент поставляется в четырех разных цветах (RED: возбуждение 594 нм, излучение 624 нм, FarRED: возбуждение 644 нм, излучение 669 нм, ORANGE: возбуждение 554 нм, излучение 576 нм, ЗЕЛЕНЫЙ: возбуждение 501 нм, излучение 523 нм) Убедитесь, что доступная установка микроскопии имеетПодходящие свойства возбуждения и фильтры для имитации этих цветов. - Отключите 1x буфер для промывки in situ A и добавьте 40 мкл смеси Amplification-Polymerase на одно место. Инкубируйте в течение 100 мин при 37 ° С в предварительно разогретой увлажненной камере.
5. Монтаж и обработка изображений
- Подготовьте 0,01x буфер для промывки in situ B, добавив 1 мл 1x промывочного буфера B в 99 мл воды.
- Отключите смесь Amplification-Polymerase и промойте слайды 2 раза в течение 10 минут с помощью 1x буфера для промывки in situ B в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
- Вымойте слайды 1 мин в 0,01-кратном буфере для промывки B.
- Удалите избыток 0,01x промывочного буфера B и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд.
- Развернуть DAPI-содержащий монтажный материал 1: 5 в монтажной среде без DAPI, чтобы избежать перенапряжения ядер.
- Добавьте 25-30 мкл монтажной среды, содержащей 1: 5 DAPI, к покровному стеклу 24 мм x 24 мм и поднимите крышку с помощью ползуна, слегка надавите на то, чтобы не было захваченных пузырьков воздуха. Запечатайте покровное лаком для ногтей и подождите не менее 15 минут до изображения.
- Проанализируйте слайды с использованием (конфокального) флуоресцентного микроскопа.
- Подсчитайте количество точечных PLA-сигналов на ячейку по меньшей мере в 4 полученных полях изображения (20x объектив, считая по меньшей мере 20 клеток на состояние или комбинацию антител, на основе расчета мощности с использованием ожидаемого среднего 7 ± 5 сигналов в обработанных клетках, И 2 ± 2 сигнала в необработанных клетках с вероятностью ошибки типа I 0,05 и мощностью 80%, как сообщалось ранее 15 ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Наилучшее разрешение достигается путем приобретения Z-стека и деконволюции с использованием пакетов программного обеспечения ( например , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). ЗнакДолжно быть легко видно в пределах ядерного периметра, как определено окрашиванием DAPI. - Не считайте сигналы, которые явно появляются за пределами ядер. Как правило, обработка NCS или γ-облучение приводит к приблизительно 5-10 сигналам PLA PHOSO-p53 / ATM на клетку. Элементы управления «одним антителом» могут давать некоторый фоновый сигнал, но это не должно превышать 1-2 PLA-сигналов на 1 из каждых 20 ячеек.
- Для публикации и презентаций, захватите изображения, используя цель погружения 40X или 63X. Слайды могут храниться при температуре 4 ° C и должны быть защищены от воздействия света.
- Подсчитайте количество точечных PLA-сигналов на ячейку по меньшей мере в 4 полученных полях изображения (20x объектив, считая по меньшей мере 20 клеток на состояние или комбинацию антител, на основе расчета мощности с использованием ожидаемого среднего 7 ± 5 сигналов в обработанных клетках, И 2 ± 2 сигнала в необработанных клетках с вероятностью ошибки типа I 0,05 и мощностью 80%, как сообщалось ранее 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Показано, что фосфорилирование р53 в остатке Ser15 зависит от активности киназы АТМ 16 . Чтобы продемонстрировать и подтвердить специфичность метода PLA на цитоспиновых препаратах культур суспензионных клеток, показано, что индукция повреждения ДНК через 2 часа NCS-обработка клеток BCR-ABL + B-ALL, арестованных в G1-фазе клеточного цикла Привели к специфическому взаимодействию между АТМ и фосфо-Ser15-p53, как и ожидалось. Пунктуальные сигналы PLA наблюдались в ядре большинства клеток, обработанных NCS ( рис. 1B ), со средним значением 7 PLA-сигналов на клетку 15 , тогда как эти сигналы не были обнаружены в клетках, которые не обрабатывались NCS ( фиг. 1A ) , Предварительная обработка клеток специфическим ингибитором АТМ-киназы KU55933 до индукции повреждения ДНК явно уменьшала количество сигналов PLA до среднего значения2 PLA сигналы / ячейка ( рис. 1C ). Сигналы PLA ATM-phospho-Ser15-p53 были обнаружены исключительно в ядре, как и ожидалось. Эксперименты с PLA, в которых отсутствовали либо антитела против коата-анти-АТМ, либо антитело кролика-антифосфо-Ser15-p53 (контроль «одного антитела»), не приводили к каким-либо конкретным сигналам PLA ( фиг.1D и 1E ). Количественная оценка и статистический анализ этих результатов представлены на рисунке 1F (адаптировано из Ochodnicka et al., J.Immunol., 2016). 15 .
Рисунок 1: PLA in situ для взаимодействия ATM / phospho-Ser15-p53 в BV173 человеческих BCR-ABL + клетках. ( А ) Клетки обрабатывали в течение ночи 5 мкМ иматиниба (специфический ингибитор аблкиназы, который провоцирует клеточно-циклический цикл G1В анамнезе BCR-ABL +), с иматинибом и 50 нг / мл NCS, которые индуцировали повреждение ДНК ( B ) или с иматинибом и предварительно обработали 5 мкМ специфического ингибитора киназы АТМ KU55933 до лечения NCS ( C ) , Показаны эксперименты с PLA с одним антителом для антител против коата-анти-АТМ (D) и кролика-антифосфо-Ser15-p53 ( E ). Красные флуоресцентные точечные сигналы представляют собой близость белка in situ (<50 нм) АТМ и белков фосфо-Ser15-p53. Шкала шкалы = 5 мкм (белые линии). ( F ) Показана количественная оценка количества сигналов PLA по меньшей мере в 20 клетках, обработанных в разных экспериментальных условиях. Горизонтальные линии представляют собой средства; Статистические значения были определены односторонним дисперсионным анализом (ANOVA; *** p <0,001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом отчете показано, что PLA может использоваться для определения и визуализации специфического взаимодействия между белками в культурах суспензионных клеток. Следует отметить, что описанный здесь протокол не ограничивается изучением комплексов восстановления ДНК, но также применяется для визуализации и количественного определения других белково-белковых взаимодействий в культурах суспензионных клеток. Показано, что киназа АТМ взаимодействует с фосфорилированным р53 в G1-арестованных клетках BCR-ABL + B-ALL при воздействии индуцирующего повреждения ДНК агента. Ранее метод PLA использовался нами, чтобы показать, что ATM и фактор транскрипции FOXO1 взаимодействуют в клетках BCR-ABL + B-ALL, однако это взаимодействие, скорее всего, не привело к зависящему от АТФ фосфорилированию FOXO1. В подтверждение данных PLA было подтверждено иммунопреципитация эндогенных АТФ / АТР-фосфорилированных белков, которые, в отличие от установленных субстратов Р53 и NBS1, FOXO1 не фосфорилируются банкоматом при индукции DПовреждение НС 15 . Кроме того, подход PLA был успешно применен для изучения образования комплексов восстановления несоответствия ( например , взаимодействия между MSH2 и MSH6) в различных клеточных линиях клеток лимфомы человека (данные не показаны). В этих конкретных контекстах метод PLA предложил альтернативный подход для поддержки наших результатов. Показано, что PLA позволяет полуколичественную оценку белково-белковых взаимодействий между экспериментальными условиями и дает представление об изменениях между клетками в этих взаимодействиях.
Анализ специфических белково-белковых взаимодействий в клетках (подверженных различным экспериментальным условиям), как правило, был сложным и подвержен экспериментальным артефактам. Как правило, белковая совместная иммунопреципитация была методом выбора, но требует большого количества клеток и / или белков, по существу запрещая анализ белково-белковых взаимодействий в редкой клеткеТипа или между белками, которые выражены на низких уровнях. Более того, сверхэкспрессия белков в (нерелевантных) моделях линий клеток часто приводит к артефактам сверхэкспрессии, и результаты могут быть очень трудными для подтверждения / подтверждения in vivo или в соответствующих типах клеток. Кроме того, совместное иммунопреципитация требует лизиса клеток и солюбилизации белков, что может привести к потере сигнала, когда белок-белковые взаимодействия слабы. Важно отметить, что совместное иммунопреципитация белков и дрожжево-двухгибридные подходы не способны обнаруживать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях. Техника PLA предлагает привлекательную и легкую альтернативу для этих методов и обеспечивает важную дополнительную информацию. PLA может использоваться в стандартной (диагностической) лабораторной обстановке, поскольку она не требует высокоспециализированных навыков, превышающих возможности проведения иммуногистохимии.
Разработка микроскопии с высоким разрешением позволилаАнализ молекулярной архитектуры белковых комплексов. Однако этот метод недоступен и включает специализированную исследовательскую инфраструктуру. PLA предлагает доступный, простой и дешевый альтернативный подход для изучения формирования белкового комплекса с сопоставимым разрешением. Очевидным ограничением метода PLA является наличие специфических первичных антител, выращенных у разных видов. Однако сейчас несколько компаний предлагают специальные (и проверенные) комбинации антител, которые упрощают использование метода PLA.
Исследования по вовлечению белков в восстановление повреждений ДНК и ответ на повреждение ДНК в значительной степени зависят от анализа формирования и состава IRIF. Однако следует отметить, что совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает прямые белок-белковые взаимодействия. Метод PLA предлагает уникальную возможность более детально изучить протеины для восстановления ДНК и образование ремонтных комплексов. SpАтиэтемпоральный анализ образования таких комплексов может быть отображен более подробно с использованием PLA. Более того, это позволит исследователям оценить образование ремонтных комплексов в тканях и клинических образцах пациентов, которые были обработаны повреждающими ДНК агентами или терапиями, которые могут дать важное представление об эффективности этих методов лечения и могут даже помочь в выборе Пациентов, которые получат наибольшую пользу от этих методов лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования в лаборатории Guikema финансируются за счет схемы инновационных исследовательских стимулов из Нидерландской организации по научным исследованиям (грант VIDI 016126355) и KiKA Stichting Kinderen Kankervrij '(проект 252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
