Summary
Burada, genotoksik strese maruz kalan süspansiyon hücre kültürlerinde ATM ve p53 arasındaki doğrudan protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve görselleştirmek için in situ Proximity Ligation Assay (PLA) 'nın nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.
Abstract
DNA hasarına tepki, kendiliğinden oluşan, genotoksik stresin neden olduğu DNA lezyonlarının onarımını düzenler veya lenfositlerde programlanmış DNA kopmaları bağlamında görülür. Ataksi-Telenjiektazi Mutasyona uğramış kinaz (ATM), ATM ve Rad3-İlgili kinaz (ATR) ve DNA'ya bağlı Protein Kinaz'ın (DNA-PKcs) katalitik altbirimi DNA hasarının indüksiyonu üzerine aktive edilen ilk maddeler arasındadır ve DNA onarımını, apoptozu ve hücre sağkalımını kontrol eden bir ağın merkezi regülatörleri. Bir tümör baskılayıcı yolağın bir parçası olarak, ATM ve ATR p53'ü fosforilasyon yoluyla aktive ederek p53'ün transkripsiyonel aktivitesini düzenler. DNA hasarı da, DNA hasar alanındaki birikir DNA hasar sensörü ve onarım proteinlerinin komplekslerini temsil eden iyonize edici radyasyona neden olan odakların (IRIF) oluşumuyla sonuçlanır; bunlar, floresan mikroskobu ile görselleştirilir. Bununla birlikte, IRIF'lerdeki proteinlerin birlikte lokalizasyonu mutlaka dFloresan mikroskopisinin çözünürlüğü sınırlı olduğu için, protein-protein etkileşimlerini geliştirin.
In situ Proximity Ligation Assay (PLA), benzeri görülmemiş özgünlük ve duyarlılıkla hücrelerdeki ve dokulardaki protein-protein etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayan yeni bir tekniktir. Bu teknik ilgi proteinlerine spesifik antikorların uzaysal yakınlığına dayanır. Sorgulanan proteinler 40 nm'de olduğunda, bir amplifikasyon reaksiyonu, antikorlara konjuge edilmiş oligonükleotidler tarafından tetiklenir ve amplifikasyon ürünü, etkileşen proteinlerin subselüler konumuna karşılık gelen bir sinyal veren floresan etiketleme yoluyla görselleştirilir. Örnek olarak ATM ve p53 arasında kurulan işlevsel etkileşimi kullanarak burada PLA'nın DNA hasar yanıtının ayrılmaz parçaları olan proteinler arasındaki doğrudan etkileşimleri incelemek için süspansiyon hücre kültürlerinde nasıl kullanılabileceği gösterilmiştir.
Introduction
DNA hasarı, protein-protein etkileşimleri ve DNA'nın etkin ve hızlı onarımını sağlayan translasyon sonrası modifikasyonlar içeren ve genomik bütünlüğünü koruyan, oldukça düzenlenen bir dizi olayı tetikler. Tipik olarak, DNA onarımı (konfokal) flüoresan mikroskopisi ile iyonize edici radyasyona bağlı odakların (IRIF) oluşumunu izleyerek iyonize radyasyona maruz kalan hücrelerde incelenir. Birçok DNA onarımı ve DNA hasar algılayan proteinler, DNA hasarını sürdüren kromatin bölgelerinde çekirdekleşen protein komplekslerini temsil eden IRIF'leri oluşturur 2 , 3 . IRIF'lerin zaman içindeki yeri ve çözünümü, DNA onarımının spatiotemporal düzenlenmesi ile ilgili önemli bilgiler verir ve farklı DNA onarım yollarının katılımını gösterebilir. Hasar görülen DNA hasarının ve hücre döngüsünün evresi hangi DNA onarım yolunun aktive edildiğini belirler. fo R örneğinde aktif olarak DNA kopyalama (S fazı) yapan hücrelerde homolog rekombinasyon (HR) dominant DNA tamir yoludur, oysa hücre döngüsünün G1- veya G2 / M-fazındaki hücrelerde, Homolog son katılma (NHEJ) onarım yolu baskın. DNA hasarını takiben en erken olaylardan biri, çoğunlukla hücre döngüsünün G1 ve G2 / M fazlarında aktif olan ve NHEJ'i düzenleyen DNA hasar algılayan kinazların hareketsiz kılınması olan Ataksi Telenjiektazi Mutasyonlu protein (ATM) Ve Ataxia Telangiectasia ve HR'yi aktive ederek S fazında hareket eden Rad3 ile ilgili protein (ATR). Hem ATM hem de ATR, DNA onarımı, hücre ölümü ve hayatta kalma 4 ile ilgili birçok proteini fosforile eden çok pleiotropik kinazlardır. Her iki kinazın da genotoksik strese maruz kaldıktan sonra p53 tümör süpresör proteinini fosforile ettiği ve aktive ettiği gösterilmiştir; bu kinazlar, pivotal bir tümör baskılayıcı sinyal ekseni"Xref"> 5 , 6 .
IRIF'lerin oluşumu ve bileşimi tipik olarak, çift renkli immünofloresan boyama ve mikroskopi kullanılarak farklı proteinlerin birlikte lokalizasyonunun belirlenmesiyle değerlendirilir; bununla birlikte, onarım protein komplekslerinin bir parçası olan tüm proteinler, bu yaklaşımın uygulanabilirliğini sınırlayan IRIF'leri oluşturmaz. Dahası, (konfokal) immünofloresan mikroskopisi, ışığın kırınım özellikleri ile sınırlandırılır ve yaklaşık 200-300 nm'lik oldukça zayıf bir uzaysal çözünürlük ile sonuçlanır ve çoğu hücre içi yapının boyutunu aşar ve esasen protein-protein etkileşimlerinin doğrudan sorgulanmasını engeller Moleküler seviyesi. Bu nedenle, (konfokal) floresan mikroskopisi ile tespit edilen immünofloresan boyama modellerinin birlikte lokalizasyonu doğrudan protein-protein etkileşimleri için bir gösterge değildir. Son zamanlarda, üç boyutlu yapı gibi yeni süper çözünürlük teknolojileri geliştirildiKonfokal lazer taramalı mikroskopi 8 ile tespit edilemeyen bu proteinlerin mekansal dağılım özelliklerini ortaya çıkaran, 53BP1 ve BRCA1 IRIF oluşumunu nano ölçekli detaylı olarak incelemek için başarıyla kullanılan tüylü aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) 7'yi test etti.
İmmünopresipitasyon, çekme metodları ve maya iki hibrid tarama yaklaşımları gibi in vivo protein-protein etkileşimlerini saptamak için başka birçok yöntem kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler oldukça hantaldır, büyük miktarlarda hücre veya protein gerektirir veya deneysel eserler getiren proteinlerin aşırı ekspresyonunu içerir. Yakın bir zamanda, Proximity Ligation Assay (PLA) 9 , 10 olarak adlandırılan yerinde ( yani hücrelerde ve dokularda) protein-protein etkileşimlerinin görselleştirilmesini ve nicelenmesini sağlayan yeni bir teknik geliştirildi. PrIlgili iki proteini tanıyan immün antikorlar, oligonükleotidlere konjuge edilmiş ikincil antikorlar (PLA probları olarak adlandırılır) tarafından tespit edilir. İki farklı ikincil antikor, primer antikorlar tarafından tanınan proteinler arasındaki etkileşimler nedeniyle yeterince yakınsa, konjüge edilmiş oligonükleotidler hibridize olur ve bir kapalı dairesel DNA substratı oluşturmak üzere bağlanabilir. Bu dairesel substrat daha sonra yuvarlanan daire amplifikasyonu ile büyütülür ve florokrom-konjüge tamamlayıcı oligonükleotitler ile görselleştirilir. PLA kullanılarak, protein-protein etkileşiminin subselüler lokalizasyonu, floresan etiketli yuvarlanan daire yükseltme-ürünü PLA problarına bağlı kaldığı için korunur. Bu testin çözünürlüğü, bir antikor çapının yaklaşık 7-10 nm 11 olduğu bulgusuna dayanarak <50 nm'dir. Haddeleme dairesi amplifikasyonu ancak iki çift antikor (birincil + seconDary), boyutları (10 + 10 + 10 + 10 = 40 nm) ile tanımlanan çevre içerisinde fiziksel olarak etkileşime girer. Sinyal yükseltme basamağı, PLA tahlilinin duyarlılığını arttırır ve az miktarda eksprese edilen proteinlerin etkileşimlerinin saptanmasını sağlar. PLA, hücre bazında nicelleştirilebilen, protein-protein etkileşimlerindeki hücre içi ve hücreler arası değişimi değerlendirilebilecek noktasal, odaklar benzeri sinyal kalıpları üretir.
DNA tamir kompleksleri ve IRIF'lerin oluşumu ve bileşimi, insan kemik osteosarkom epitel hücre hattı U2OS, insan embriyonik böbrek hücre hattı HEK293 ve retinal pigment epitelyal hücre hattı RPE-1 gibi hızlı yapışan hücre hatlarında, Büyümek ve transfekte etmek kolaydır. Süspansiyon hücre kültürleri böyle bir lenfoid ve miyeloid hücre dizisi daha az kullanılır, çünkü bunlar transfeksiyona daha az yatkındır ve genellikle lamelleri tutmaz, bu nedenle ek / alternatif st gerektirirGörüntüleme için eps. Ancak DNA hasarının cevabı lenfoid ve miyeloid maligniteler bağlamında çok önemlidir çünkü DNA hasar tepkisi, bu tümörlerde genomik (sürücü) sapmalar tarafından sıklıkla etkilenir ve normal lenfoid ve miyeloid malign transformasyonunda önemli bir rol oynamaktadır ( Progenitör) hücreler 12 , 13 , 14 .
Bu protokol, süspansiyon hücre kültürlerinde DNA hasarının indüklenmesinden sonra protein-protein etkileşimlerini değerlendirmek ve ölçmek için PLA'nın nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Burada, PLA, bir G1-fazlı hücre döngüsü tutuklanmasına neden olan insan B-hücresi lösemi hücrelerinde, DNA hasarı üzerine ATM ve p53 arasındaki etkileşimleri belirlemek ve görselleştirmek için gerçekleştirilir. Burada verilen protokol, G1 ile tutuklanan lösemi hücrelerinde ATM ve p53 etkileşimlerinin incelenmesi ile sınırlı değildir, ancak diğer protein-protein interaktılarını da görselleştirmek için kullanılabilirÇeşitli hücre tiplerinde ve süspansiyon hücre kültürlerinde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücrelerin ve DNA hasar indüksiyonunun tedavisi
- % 20 FCS, 50 uM β-merkaptoetanol, 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomis ile desteklenmiş IMDM'de insan BCR-ABL + B hücresi akut lenfoblastik hücre hatları BV173 veya SUP-B15 kültüründe 37 ° C'de% 5 C02 atmosferi altında karıştırın. Hücreleri ve plakaları 6 kuyucuklu plakalarda 5 mL / çukurlukta 2 x 106 hücre / mL'de sayın.
NOT: İsteğe bağlı olarak çeşitli kökenli süspansiyon hücre hatları kullanılabilir. - BCR-ABL + B-ALL hücrelerini hücre döngüsünün G1 fazında tutmak için 5 μM imatinib metansülfonat (STI571) ekleyin ve gece boyunca inkübe edin.
- İsteğe bağlı olarak, hücre döngüsü boyunca veya BCR-ABL-negatif hücre tiplerinde protein-protein etkileşimlerini incelerken bu adımı atlayın.
- Kültür 50 ng / mL neocarzinostatin (NCS) ekleyerek DNA hasarını indükleyin ve 2 saat inkübe edin.
- Alternatif olarak,0.5 Gy / dak'da bir radyoaktif kaynak [ 137 Cs] kullanarak 5 Gy'lik bir dozda hücrelere ışın saçarak DNA hasarını uyandırır. Işınlama sonrasında, hücrenin% 5 CO2'lik bir atmosferde 37 ° C'de 2 saat süreyle bekletilmesine izin verin.
- İsteğe bağlı olarak, DNA hasarına tepki olarak ATM kinaz aktivitesinin katılımını değerlendirmek için, NCS ilavesi veya ışınlama tedavisinden önce ATM kinaz inhibitörü KU55933'ü 5 uM ekleyin.
- Bir beher veya Erlenmeyer şişesi içinde 50 mL 1x PBS üzerine 5 g fraksiyon-V BSA katmanlayarak 1x PBS +% 10 BSA hazırlayın ve BSA çözünene kadar bekletin. Çalkalamayın ya da karıştırmayın, bunun nedeni geniş köpürmeye neden olacaktır. 0.22 μm'lik bir filtreden yavaşça filtre edin ve buzda tutun.
- Hücreleri hasat edin ve buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri sayın ve 1 x PBS +% 10 BSA içinde 2 x 10 6 / mL'de tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreleri buzda tutun.
2. Sitokentrifugasyon, fiksasyon ve permeabilizasyon
- Hazırla1x PBS içinde taze% 4 paraformaldehid solüsyonu. 50 mL 1x PBS'ye 2 g PFA ilave edin ve solüsyon berrak oluncaya kadar 55 ° C'lik bir çalkalama suyu banyosunda inkübe edin. Çözeltiyi 0.22 um'lik bir filtreden geçirin ve kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın.
NOT: İsteğe bağlı olarak,% 4 PFA sabitleyici, -20 ° C'de dondurulmuş olarak depolanabilir. Donduktan sonra, yalnızca bir kez çözülmeye başlayın. Aksi takdirde, PBS'deki% 4 PFA solüsyonu doğrudan satın alınabilir. - Tiftiksiz dokuyla 76 mm x 26 mm'lik mikroskopi slaytlarını dikkatlice cilalayın ve 5 dakika boyunca bir Coplin kavanozunda% 96 etanol koyarak yağdan arındırın. Mikroskopi 10 dakika boyunca hava ile kurutulsun.
- Mikroskopi slaytlarını 6 mm'lik bir alana sahip sitospin / sitoloji hunilerine yerleştirin. Prekat her huniye 50 μL 1x PBS +% 10 BSA pipetle ve 500 rpm'de 1 dakika santrifüj ederek kayar.
- Her huniye 100 uL hücre süspansiyonu (0.2 x 10 6 hücreye eşittir) ilave edin ve 500 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Her bir antikor kombinasyonu için,Ast 4 preparatları gereklidir (çift antikor deneyi; iki tek antikor kontrolü; antikor kontrolü yok).
- Hunileri dikkatli bir şekilde sökün ve lekelere dokunmamaya dikkat edin. Hemen örnek sabitlemeye devam edin.
- İsteğe bağlı olarak, slaytları en az 30 dakika boyunca hava ile kurutun. Hava ile kurutulduktan sonra, sarma aluminyum folyoya ayrı ayrı kaydırın ve kullanılıncaya kadar -20 ° C'de saklayın. Dondurulmuş müstahzarları kullanırken, slaytlara aşırı yoğunlaşmamasını sağlamak için kağıt havlu sarılı slaytları çözdüğünüzden emin olun.
- PAP kalemi bir sıvı bloke ediciyi kullanarak (5 mm uç) nokta etrafında bir daire çizin (yaklaşık 15-20 mm çapında).
- Her noktaya 50 μL% 4 PFA fiksasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Nazik bir çalkantı ile oda sıcaklığında Coplin kavanozunda 1x PBS ile 5 dakika boyunca hücreleri yıkayın.
- Slaytları lifsiz bir doku ile lekeler etrafında kurutun ve noktadan mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın.Noktaya dokunmadan veya slayt yatırmadan hayvan. Her bir noktaya 1x PBS 50 mcL% 0.25 Triton-X ekleyin ve ajitasyon olmadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Slaytları Coplin kavanozunda TBS (TBS-T) içinde ~ 50-60 mL% 0.05 Tween-20 içinde 5 dakika yavaşça ajitasyonla oda sıcaklığında 3 kez yıkayın. 10 slayt aynı anda bu şekilde işlenebilir.
3. Engelleme ve Birincil Antikor İnkübasyonu
- TBS-T'den dokunun ve slaytları tüysüz bir doku ile lekeler etrafında kurutun. Noktaya değmeden veya slaydı eğerek bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı alın. Kısa sürede engelleme solüsyonunu vorteksleyin ve her bir noktaya bir damla (~ 40 μL) ekleyin. 1 saat süreyle 37 ° C'de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- Antikor kokteylini, ticari antikor seyrelticisindeki 1: 100'de tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 ve tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53'ü kullanmadan önce vorteks antikor seyrelticisi ile karıştırarak keçi-anti-ATM'yi karıştırarak hazırlayın. Kontrol deneyi içinSadece keçi-anti-ATM ve sadece tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 antikoru (tek antikor kontrolleri) içeren antikor seyreltmeleri hazırlayın.
- Blokaj çözeltisinden dokunun ancak antikor seyreltiklerini ilave etmeden önce hücrelerin kurumasına izin vermeyin. Her antikor kokteyl seyreltme 30 mcL ekleyin ve gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de inkübe edin.
- Yerinde Yıkama Tamponu A ve Yıkama Tamponu B'yi, bir kutu Tampon A ve Tampon B karışımı içeriğini, her biri 1.000 mL suyun son hacminde eriterek hazırlayın.
- Alternatif olarak, 8.8 g NaCl, 1.2 g Tris-baz ve 0.5 mL Tween-20'nin 800 mL su içerisinde çözündürülmesi ile yıkama tamponu A hazırlanır. HCI kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın ve son 1000 mL'ye ekleyin.
- Alternatif olarak, 5.84 g NaCI, 4.24 Tris-baz ve 26.0 g Tris-HCl'yi 500 mL su içinde çözerek Yıkama Tamponu B'yi hazırlayın. HCI kullanarak pH'ı 7.5'e ayarlayın. 1.000 mL'lik bir son hacme su ilave edin.
- filtreHer iki çözüm de 0.22 um'lik bir filtreden geçirilir.
- Slaytları Coplin kavanozunda 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika 2 kez yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında yıkayın.
4. PLA Probları, Ligasyon ve Amplifikasyon
- Ticari antikor seyrelticisinde anti-keçi PLUS ve anti-tavşan MINUS'u 1: 5 seyrelterek PLA probları hazırlayın. Slaytlardan 1x yerinde yıkama tamponu A'ya dokunun ve her bir noktaya 30 uL PLA prob karışımı ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C'de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
NOT: Uygulanan birincil antikorlar farklı türlerde yetiştirildiği sürece PLUS ve MINUS PLA süpürgelerinin herhangi bir kombinasyonu (anti-fare, anti-tavşan, anti-keçi) kullanılabilir ve PLA probları kombinasyonu daima Bir PLUS probu ve bir MINUS probu içerir. - Slaytları, Coplin kavanozunda ~ 50-60 mL 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika 2 kez yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında yıkayın. </ Li>
- Ligasyon çözeltisinin 39 uL'sine 1 μL ligaz ekleyerek Ligasyon-Ligaz çözeltisini buz üzerinde hazırlayın ve her bir noktaya 40 μL Ligasyon-Ligaz çözeltisi ekleyin. 30 dakika 37 ° C'de önceden ısıtılmış nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- Slaytları, Coplin kavanozunda ~ 50-60 mL 1x yerinde yıkama tamponu A ile 5 dakika boyunca yavaşça çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında 2 kez yıkayın.
- Amplifikasyon polimeraz karışımını, suda Amplifikasyon stok solüsyonunu 1: 5 seyrelterek buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra, her bir nokta için 39.5 μL 1x Amplifikasyon solüsyonuna 0.5 μL polimeraz ekleyin.
NOT: Güçlendirme reaktifleri ışığa karşı duyarlıdır ve doğrudan ışığa maruz kalmaya karşı korunmalıdır. Güçlendirme reaktifi dört farklı renkte (RED: uyarma 594 nm, emisyon 624 nm; FarRED: uyarma 644 nm, emisyon 669 nm; ORANGE: uyarma 554 nm, emisyon 576 nm; YEŞİL: uyarılma 501 nm, emisyon 523 nm) Mevcut mikroskopik kurulumunUygun uyarılma özellikleri ve bu renkleri görüntüleme filtreleri. - 1x yerinde yıkama tamponu A'ya dokunun ve spot başına 40 μL Amplification-Polymerase karışımı ekleyin. Isıtılmış nemli bir odada 37 ° C'de 100 dakika inkübe edin.
5. Montaj ve Görüntüleme
- 99 mL suya 1 mL Yıkama Tamponu B ekleyerek 0.01x yerinde yıkama tamponu B hazırlayın.
- Amplification-Polimeraz karışımını hafifçe çalkalamak suretiyle oda sıcaklığında bir Coplin kavanozunda 1x yerinde yıkama tamponu B ile 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın.
- Slaytları 0.01x yıkama tamponu B'de 1 dakika yıkayın.
- Fazla 0.01x yıkama tamponu B'ye dokundurun ve slaytları tüy bırakmayan bir doku ile lekeler etrafında kurutun. Noktaya değmeden veya slaydı eğerek bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı alın.
- Çekirdeklerin aşırı boyanmasını önlemek için DAPI içermeyen montaj ortamında DAPI içeren montaj ortamı 1: 5 oranında seyreltilir.
- Bir 24 mm x 24 mm lamel 25-30 μL 1: 5 DAPI içeren montaj medyumu ekleyin ve kapak kayma slayt ile almak, sıkışmış hava kabarcığı olmadığından emin olmak için hafif basınç uygulanır. Lambayı oje ile mühürle ve görüntülemeden önce en az 15 dakika bekle.
- Slaytları bir (konfokal) floresan mikroskopu kullanarak analiz edin.
- İşlenen hücrelerde beklenen ortalama 7 ± 5 sinyali kullanarak bir güç hesaplamasına dayalı olarak, en az 4 çekim görüntü alanında (20x objektif, koşul veya antikor kombinasyonu başına en az 20 hücre sayan) hücre başına punktaki PLA sinyallerinin sayısını sayın, Ve işlenmemiş hücrelerde 2 ± 2 sinyal, 0.05'lik bir tip-hata olasılığı ve daha önce bildirildiği gibi% 80'lik bir güç ihtimali 15 ).
NOT: En iyi çözünürlük, yazılım paketleri kullanılarak bir Z-yığını ve dekonvolüsyonun edinilmesi ile elde edilir ( örneğin , ImageJ, Leica Edinme Paketi (LAS)). SignaDAPI boyama ile tanımlandığı gibi, nükleer çevre içinde kolayca tanınmalı olmalıyım. - Çekirdeklerin dışında açıkça görülen sinyalleri saymayın. Tipik olarak, NCS tedavisi veya γ-ışınlaması hücre başına yaklaşık 5-10 phosho-p53 / ATM PLA sinyali ile sonuçlanır. 'Tek antikorlu' kontroller bazı arka plan sinyali verebilir, ancak her 20 hücreden 1'inde 1-2 PLA sinyali geçmemelidir.
- Yayın ve sunum amacıyla, 40X veya 63X daldırma yağı objektifini kullanarak görüntü yakalayın. Slaytlar 4 ° C'de saklanabilir ve ışık maruziyetine karşı korunmalıdır.
- İşlenen hücrelerde beklenen ortalama 7 ± 5 sinyali kullanarak bir güç hesaplamasına dayalı olarak, en az 4 çekim görüntü alanında (20x objektif, koşul veya antikor kombinasyonu başına en az 20 hücre sayan) hücre başına punktaki PLA sinyallerinin sayısını sayın, Ve işlenmemiş hücrelerde 2 ± 2 sinyal, 0.05'lik bir tip-hata olasılığı ve daha önce bildirildiği gibi% 80'lik bir güç ihtimali 15 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Serum 15 kalıntısında p53'ün fosforilasyonunun ATM kinaz aktivitesine 16 bağlı olduğu gösterildi. Süspansiyon hücre kültürlerinin sitospin preparatlarında PLA tekniğinin özgüllüğünü göstermek ve doğrulamak için, hücre döngüsünün G1 fazında tutulan BCR-ABL + B-ALL hücrelerinin 2 saat boyunca NCS ile işleme tabi tutularak DNA hasarının indüklenmesinin gösterildiği Beklendiği gibi ATM ve fosfo-Ser15-p53 arasındaki spesifik etkileşim ile sonuçlandı. Nokta PLA sinyalleri, hücre başına ortalama 7 PLA sinyali ile NCS ile tedavi edilen hücrelerin çoğunluğunun ( Şekil 1B ) çekirdeğinde gözlenirken, bu sinyaller NCS ile tedavi edilmemiş hücrelerde tespit edilmedi ( Şekil 1A ) . DNA hasarının indüklenmesinden önce hücrelerin spesifik ATM kinaz inhibitörü KU55933 ile ön-muamelesi, PLA sinyallerinin sayısını açık bir şekilde2 PLA sinyal / hücre ( Şekil 1C ). ATM-fosfo-Ser15-p53 PLA sinyalleri, beklendiği gibi çekirdekte sadece tespit edildi. Ya keçi-anti-ATM ya da tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 antikorunun atlandığı (tek-antikor kontrolü) PLA deneyleri spesifik bir PLA sinyali vermedi ( Şekil 1D ve 1E ). Bu sonuçların niceleme ve istatistiksel analizleri Şekil 1F'de (Ochodnicka ve arkadaşları J. Immunol. 2016'dan uyarlanmıştır) sunulmuştur.
Şekil 1: BV173 İnsan BCR-ABL + Hücrelerinde ATM / fosfo-Ser15-p53 Etkileşimleri için in situ PLA. ( A ) Hücreler gece boyunca 5 uM imatinib (G1-fazlı bir hücre-siklusu provoke eden özel Abl kinaz inhibitörüDNA hasarını ( B ) indükleyen imatinib ve 50 ng / mL NCS ile veya imatinible ve NCS tedavisinden önce 5 μM spesifik ATM kinaz inhibitörü KU55933 ile önceden muamele edilmiş BCR-ABL + hücrelerinde tutuklandı ( C ) . Keçi-anti-ATM (D) ve tavşan-anti-fosfo-Ser15-p53 antikorları ( E ) için tek antikor kontrolü PLA deneyleri gösterilmiştir. Kırmızı floresans noktalı sinyalleri ATM ve fosfo-Ser15-p53 proteinlerinin in situ protein yakınlığını (<50 nm) temsil eder. Ölçek çubukları = 5 μm (beyaz çizgiler). ( F ) Farklı deneysel koşullar altında işleme tabi tutulmuş en az 20 hücre içindeki PLA sinyal sayısının nicelendirilmesi gösterilmiştir. Yatay çizgiler araç gösterir; Istatistiksel anlamlılıklar tek yönlü varyans analizi (ANOVA; *** p <0.001) ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, süspansiyon hücre kültürlerinde proteinler arasındaki spesifik etkileşimi belirlemek ve görselleştirmek için PLA'nın kullanılabileceği gösterilmiştir. Not burada, burada açıklanan protokol, DNA tamir kompleksleri çalışması ile sınırlı değildir, aynı zamanda süspansiyon hücre kültürlerinde diğer protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek için de geçerlidir. ATM kinazı, bir DNA hasarını tetikleyen ajana maruz bırakıldığında G1 ile tutuklanmış BCR-ABL + B-ALL hücrelerinde fosforile edilmiş p53'le etkileşime girdiği gösterilmiştir. Daha önce, ATM ve FOXO1 transkripsiyon faktörünün BCR-ABL + B-ALL hücrelerinde etkileşime girdiğini göstermek için PLA tekniği kullanıldı ancak bu etkileşim büyük olasılıkla FOXO1'in ATM'ye bağlı fosforilasyonuyla sonuçlanmadı. PLA verilerinin desteklenmesinde, endojen ATM / ATR-fosforile proteinlerin immüno-çökeltilmesi ile teyit edilmiştir; bu proteinler, p53 ve NBS1'in yerleşik ATM substratlarının aksine, FOXO1'in D indüksiyonu üzerine ATM ile fosforile edilmemiştirNA hasar 15 . Buna ek olarak, PLA yaklaşımı, çeşitli insan B hücresi lenfoma hücre çizgilerinde uyuşmazlık onarımı komplekslerinin ( örn . MSH2 ve MSH6 arasındaki etkileşim) oluşumunun incelenmesi için başarıyla uygulanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Bu belirli bağlamlarda, PLA tekniği bulgularımızı desteklemek için alternatif bir yaklaşım önerdi. PLA'nın deneysel koşullar arasındaki protein-protein etkileşimlerinin yarı niceliksel değerlendirmesine izin verdiği ve bu etkileşimlerde hücre-hücre varyasyonuna ilişkin bilgi verir.
Hücrelerdeki spesifik protein-protein etkileşimlerinin analizi (farklı deneysel koşullara maruz bırakılmıştır) tipik olarak zor olmuştur ve deneysel eserlere tabidir. Genellikle, protein ko-immüno çökeltme yöntemi seçme yöntemidir ancak çok sayıda hücre ve / veya protein gerektirir ve esasen nadir bulunan hücrelerdeki protein-protein etkileşimlerinin analizini yasaklarDüşük seviyelerde ifade edilen proteinler arasında veya türler arasında. Dahası, (ilgisiz) hücre dizisi modellerinde proteinlerin aşırı ekspresyonu çoğu zaman aşırı ekspresyon artifaktlarına yol açar ve sonuçlar, in vivo veya ilgili hücre tiplerinde doğrulamak / doğrulamak çok zor olabilir. Ayrıca, birlikte immüno çökeltme, proteinlerin protein etkileşimleri zayıf olduğunda sinyal kaybına neden olabilecek hücrelerin parçalanması ve proteinlerin çözünürlüğünü gerektirir. Önemlisi protein bağışıklık çökmesi ve maya-iki-hibrid yaklaşımlar, protein-protein etkileşimlerinin içindeki ve hücreler arası değişimi tespit edemez. PLA tekniği, bu teknikler için çekici ve kolay bir alternatif sunar ve önemli ek bilgiler sağlar. PLA, immünhistokimya yapma becerisinin ötesinde yüksek düzeyde uzmanlaşmış becerilere ihtiyaç duymadığı için standart (teşhis) laboratuar ortamında kullanılabilir.
Süper-çözünürlük mikroskobu geliştirilmesi derinlemesine izin verdiProtein komplekslerinin moleküler mimarisinin analizi. Bununla birlikte, bu teknik kolay erişilebilir değildir ve özel bir araştırma altyapısı içerir. PLA benzer bir çözünürlük ile protein kompleksi oluşumunun incelenmesi için erişilebilir, basit ve ucuz alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. PLA tekniğinin belirgin bir kısıtlılığı, farklı türlerde ortaya çıkan spesifik birincil antikorların bulunmasıdır. Bununla birlikte, şimdi birçok şirket PLA tekniğinin kullanımını düzene sokan (ve doğrulanmış) antikor kombinasyonlarını sunuyor.
Proteinlerin DNA hasar onarımına ve DNA hasar tepkisine katılmasıyla ilgili çalışmalar, irif oluşumu ve bileşiminin analizine büyük ölçüde güvenir. Bununla birlikte, IRIF'lerdeki proteinlerin ortak lokalizasyonu, doğrudan protein-protein etkileşimlerini gerektirmediğini belirtmek gerekir. PLA tekniği, DNA tamir proteinlerini ve tamir komplekslerinin oluşumunu daha ayrıntılı olarak incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. SpBu tür komplekslerin oluşumunun atiotemporal analizi, PLA kullanılarak daha ayrıntılı olarak eşleştirilebilir. Dahası, araştırmacılara DNA hasar ajanları veya terapileri ile tedavi edilen hastaların dokuları ve klinik örneklerinde onarım komplekslerinin oluşumunu değerlendirebilir ve bu tedavi yöntemlerinin etkinliği hakkında önemli bilgiler verebilir ve hatta seçime yardımcı olabilir Bu tedavilerden en fazla fayda sağlayacak olan hastalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Guikema laboratuarında yapılan araştırmalar, Hollanda Bilimsel Araştırmalar Örgütü (VIDI hibesi 016126355) ve 'Stichting Kinderen Kankervrij' KiKA (proje 252) 'nin Yenilikçi Araştırma Teşvik Planı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
References
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
- Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
- Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
- Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
- Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
- Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
- Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685 (2014).
- Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
- Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).
