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Medicine

नवजात शिलालेख के रूप में कण्ट्रोलर स्पष्टीकरण तकनीक Published: June 8, 2017 doi: 10.3791/55704
Automatic Translation
1,2,3, 1,4, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि तैयारी, संस्कृति, उपचार, और नवजात शिशु कन्क्लेयर स्पष्टीकरण के प्रतिरक्षण को प्रदर्शित करना। इस तकनीक का उपयोग अनुसंधान सुनवाई में इन विट्रो स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में किया जा सकता है।

Abstract

पिछले कुछ दशकों में शोध सुनने में उल्लेखनीय प्रगति हुई है, फिर भी सेंसरिरिअरील हिअरिंग लॉस (एसएनएचएल) के लिए कोई इलाज नहीं है, एक ऐसी स्थिति है जिसमें आमतौर पर आंतरिक कान के नाजुक यंत्रोन्सास संरचनाओं को नुकसान पहुंचाता है या नुकसान होता है। हाल के वर्षों में इन विट्रो और पूर्व विवो assays में परिष्कृत, संभावित चिकित्सीय यौगिकों की बढ़ती संख्या की स्क्रीनिंग को सक्षम करते हुए संसाधनों को कम करते हुए और एसएनएचएल के लिए इलाज विकसित करने के प्रयासों में तेजी लाने के लिए। यद्यपि वर्तमान शोध में कुछ प्रकार की कोशिकाओं के समरूप संस्कृतियां एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती रहती हैं, अब कई वैज्ञानिक म्यूचिन इनर कानों के अधिक जटिल अंगटिपीक संस्कृतियों पर भरोसा करते हैं, जिसे कॉक्लियर स्पैंट्स भी कहा जाता है। आंतरिक कान के भीतर संगठित सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण में कोक्लाअर इंफ्रास्ट्रक्चर के विभिन्न घटकों के मद्देनजर की सुविधा होती है जिसमें आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाओं, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स, न्यूरआईटीएस, और सहायक कोशिकाओं। यहाँ हम तैयारी, संस्कृति, उपचार, और नवजात शिशु कन्क्लेयर स्पष्टीकरण के प्रतिरक्षण को प्रस्तुत करते हैं। इन explants की सावधान तैयारी एसएनएचएल में योगदान करने वाले श्रमिकों की पहचान की सुविधा प्रदान करते हैं और सुनवाई अनुसंधान समुदाय के लिए एक बहुमूल्य उपकरण बनाते हैं।

Introduction

संवेदी सुनवाई हानि (एसएनएचएल) आंतरिक कान या आरोही श्रवण पथ को नुकसान दर्शाती है। जबकि सुनवाई हानि मानव में सबसे सामान्य संवेदी घाटे है 1 , रोगाणुरोधक उपचार अभी तक मौजूद नहीं हैं 2 हालांकि कंचक या श्रवण मस्तिष्क प्रत्यारोपण, गहन एसएनएचएल से गंभीर रोगियों के लिए कुछ हद तक सुनवाई को बहाल कर सकते हैं, इन उपकरणों द्वारा दी गई सुनवाई अब भी "प्राकृतिक" सुनवाई से बहुत भिन्न है, खासकर शोर में भाषण को समझने या संगीत सुनने के प्रयासों के दौरान।

जबकि बाल कोशिका अध: पतन को लंबे समय तक दर्दनाक श्रवण घटनाओं का प्राथमिक परिणाम माना जाता है ( उदाहरण के लिए, जोर से शोर के संपर्क में), इस बात का सबूत बढ़ रहा है कि शल्यक्रिया तंत्रिका के लिए बाल कोशिकाओं से सूचना प्रेषण करने वाले संक्रमण कम से कम ध्वनिक आघात के लिए कमजोर होते हैं 3 , 4 , 5 > , 6 मानव ऑडिओमेट्रिक थ्रेसहोल्ड के बाद से, सुनवाई कार्य के मूल्यांकन के लिए वर्तमान सोने का मानक, आंतरिक कान में विशिष्ट सेलुलर क्षति की भविष्यवाणी नहीं करता है, जितनी जल्दी हो सके सेलुलर अध: पतन का पता लगाने और पर्याप्त उपचार शुरू करने के लिए अधिक परिष्कृत उपकरण आवश्यक हैं।

सुनवाई हानि के लिए फार्मास्यूटिकल उपचार का वादा अक्सर इन विट्रो में समरूप कोशिका संस्कृतियों पर परीक्षण किया जाता है, लेकिन ऐसी व्यवस्थाएं कॉक्लेयर माइक्रोएनेरेंचर को सही तरीके से पेश नहीं करती हैं। कोक्लीयर कोशिकाओं को ट्राफिक कारकों को छिपाने के लिए जाना जाता है जो कोक्ली 8 , 9 के भीतर अन्य कोशिका प्रकारों को प्रभावित करते हैं, जो कि vivo प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है जो कोरर्टी 10 , 11 या स्पायरल गंगलायन न्यूरॉन्स (एसजीएन) 12 के अंग अलगाव में सुसंस्कृत या जब खो जाता है आणविक मार्करों का विश्लेषण किया जाता है13 "हालांकि," विस्टो डेटा की वैधता के लिए आवश्यक " vivo अध्ययन" में आवश्यक हो सकता है कि "सटीक चिकित्सा" की खोज में सुनवाई हानि के लिए नए, व्यक्तिगत उपचार की आवश्यकता होती है, जो महत्वपूर्ण संसाधनों और समय की आवश्यकता होती है। सुनवाई परीक्षणों के साथ मध्य कान या गोल खिड़की के इंजेक्शन को पूरा करने और कन्क्लेयर पूर्ण-माउंट के बाद के विच्छेदन के लिए कितना प्रयास करने की आवश्यकता होती है। कॉंकलिअर एक्सप्लन्ट्स के रूप में जाना जाने वाला ऑर्गोटिपीक पूर्व विवो संस्कृतियों में होनहार यौगिकों का कुशल स्क्रीनिंग एक आर्थिक और विश्वसनीय विकल्प प्रदान करता है 14 , 15 , 16 , 17

यह आलेख एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है जिसके द्वारा उपचारित कॉक्लियर स्पैन्टर्स का निर्माण, रखरखाव और मूल्यांकन किया जाता है। इस मॉडल के लिए विशिष्ट अनुप्रयोगों पर जोर दिया गया है, जिसमें स्क्रीनिंग में इसका उपयोग शामिल हैसंभावित चिकित्सीय यौगिकों के और जीन थेरेपी के लिए वायरल वैक्टर के तुलनात्मक मूल्यांकन। एक पूर्व विवो स्पष्टीकरण दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को सेल सेल-विशिष्ट तंत्र की पहचान करने और लक्षित चिकित्सीयिकी के बाद के परिशोधन की सुविधा प्रदान करने के लिए, विभिन्न सेल आबादी पर दिए गए उपचार के प्रभाव को कल्पना करने की अनुमति देता है।

कुल मिलाकर, इस तकनीक ने कोक्लेअ एक्स विवो का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रदान किया है जबकि कोक्लेअ के भीतर मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण क्रॉस-टॉक को संरक्षित करते हुए।

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Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल मैसाचुसेट्स आई और कान की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्ल्ड मेडिकल एसोसिएशन के आचार संहिता के अनुसार प्रयोग किए गए थे।

1. विच्छेदन की तैयारी

  1. शल्य तालिका की तैयारी
    1. सर्जिकल तालिका कीटाणुरहित करने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
    2. माइक्रोस्कोप के बगल में दो गैर-प्रामाणिक पैड रखें।
    3. गर्मी रहित निष्पादन कैंची, एक स्केलपेल हैंडल, सूक्ष्म चाकू और संदंश (# 4 & # 55 में से दो) सहित उपकरण ट्रे तैयार करें। उपकरण ट्रे और एक गैर-बाँझ पैड पर 50 मिमी, साफ़-दीवार वाले, कांच के नीचे पेट्री डिश रखें।
    4. एक बाँझ # 15 स्केलपेल ब्लेड प्राप्त करें; एक सीलाबल प्लास्टिक बैग या कंटेनर (संस्थागत दिशानिर्देशों के साथ लाइन में शवों का निपटान करने के लिए); एक बाल्टी में बर्फ; और ठंड, बाँझ हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस)। इन वस्तुओं को इस पर रखेंअन्य नोस्टेराइल पैड
    5. एचबीएसएस को 50 एमएल प्लास्टिक प्रयोगशाला ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें।
  2. संस्कृति की तैयारी
    1. एक लामिना का प्रवाह हुड में सभी सामग्री तैयार करें हर चार नमूनों के लिए, 35 मिमी 4-अच्छी तरह से पेट्री डिश के चार इनलेज़ में चार आटोक्लेवइड 10 मिमी चौराहे का गिलास कवर फिसल जाता है।
    2. प्रत्येक 4 नमूनों के लिए, एक माइक्रोसेंटप्रूफ ट्यूब में 300 μL की कुल मात्रा को मिलाकर निम्न मात्रा में मिलाएं: 10 μL ऊतक चिपकने वाला, 285 μL का NaHCO 3 , और 5 μL का NaOH।
    3. हर कवर पर्ची पर परिणामी समाधान के 45 μL रखो और उसे आरटी पर कम से कम 20 मिनट के लिए छोड़ दें; यह समाधान कई घंटों के लिए कवरलिप पर छोड़ा जा सकता है लेकिन ओ / एन नहीं छोड़ा जा सकता है
    4. प्रदूषण के खिलाफ दो बाधाओं को बनाने के लिए एक 10 सेमी पेट्री डिश के अंदर एक या दो 35 मिमी 4-अच्छी पेट्री डिश (एसएएस) रखें।
    5. 98% डुल्बेके के संशोधित ईगल के मध्यम युक्त संस्कृति के माध्यम तैयार करें (डीएमईएम), 1% एन -2, और 1% एम्पीसिलीन (एक सूक्ष्म) अपकेंद्रित्र ट्यूब में अच्छी तरह से 65 μL)। उपयोग करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस से पहले का समाधान गर्म करें।

2. मरीन कोक्लेयर स्पष्टीकरण विच्छेदन

  1. नवजात माउस का नाश
    1. एक 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश प्राप्त करें और इसकी ढक्कन में 70% इथेनॉल स्प्रे करें ताकि सतह गीली हो।
    2. प्लास्टिक प्रयोगशाला ट्यूब से ठंडे एचबीएसएस को 60 मिमी प्लास्टिक के निचले हिस्से में और 50 मिमी साफ़-दीवार वाले, कांच के तले हुए पेट्री डिश में डालें। जब भी विच्छेदित नहीं किया जा रहा है तो ऊतक ठंड को रखने के लिए प्लास्टिक प्रयोगशाला ट्यूब और बर्फ पर दोनों पेट्री डिश स्टोर करें।
    3. लेटेक्स दस्ताने के कटऑफ उंगली में बर्फ पर एक पी 3 - पी 5-आयु वाले नवजात माउस रखें और हाइपोथर्मिया चेतना (लगभग 1-3 मिनट) के नुकसान के लिए प्रतीक्षा करें।
    4. संचालन कैंची के साथ जल्दी से माउस को दफ़र्त करें और सीलाबल प्लास्टिक बैग में शरीर का निपटान करें। में कटे नवजात प्रमुख रखो60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन में 70% इथेनॉल।
  2. अस्थायी अस्थि के मक्रोस्कोपिक विच्छेदन
    1. स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करते हुए पीछे की ओर (सीधे बाएं दांत के शीर्ष पर) से पूर्वकाल से एक सतही कटौती करके खोपड़ी की त्वचा निकालें।
    2. स्केलपेल ब्लेड के साथ दोनों बाहरी श्रवण नहरों को काट लें और पूरी तरह से क्रेनरी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा को अन्तराल कर दें।
      नोट: हालांकि इस चरण के लिए कोई विच्छेदन माइक्रोस्कोप आमतौर पर जरूरी नहीं है, लेकिन इसका उपयोग बेहतर दृश्यता के लिए किया जा सकता है।
    3. # 15 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करते हुए बाण के सिवनी के साथ क्रेनरी खोलें। कॉकैले के संपीड़न से बचने के लिए धीरे से ब्लेड को धीरे-धीरे आगे और नीचे पूर्वकाल से पीछे की ओर ले जाने के लिए क्रेनरी काटने का ध्यान रखें।
      नोट: इस उम्र में कपाल की मात्रा नहीं होना चाहिए और इसे आसानी से कट जाना चाहिए।
    4. # 15 स्केलपेल का उपयोग करके कक्षाओं के सीधे पीछे एक ऊर्ध्वाधर कट बनाकर निकालें और छोड़ देंब्लेड।
      नोट: खोपड़ी के पीछे के हिस्से में अभी भी मस्तिष्क और कोक्लेय शामिल होना चाहिए।
    5. # 4 संदंश के साथ कुंद विच्छेदन के माध्यम से अग्रमस्तिष्क, सेरेबेलम और ब्रेनस्टाइज का निपटारा करें।
  3. कोक्ले के सूक्ष्म निष्कर्षण
    1. गुंजाइश के तहत संदंश रखकर और रोशनी और फोकस को अनुकूलित करके माइक्रोस्कोप (6.5 एक्स बढ़ाई) और हल्का स्रोत समायोजित करें।
    2. ठंडे एचबीएसएस से भरा 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में क्रेन की दो हिस्सों को रखें।
    3. आसपास के स्टेपैडियल धमनी (अस्थायी हड्डी के भीतर एक गड़बड़ी धमनी) के आस-पास होने के रूप में कोक्लीए / ई का पूरी तरह से पता चलता है, और # 4 संदंश के उपयोग से अस्थायी हड्डी से स्पष्ट रूप से अंग अलग करता है।
    4. कोक्लीअ को 50 मिमी, स्पष्ट दीवार वाले, कांच के तले हुए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और सूक्ष्मदर्शी के नीचे डिश की स्थिति बनाएं।
    5. बर्फ पर कपाल की दूसरी छमाही के साथ 60 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश रखें। वेस्टिबुलर सिस्टम से कोक्लेय को निकालें और ध्यान से # 4 संदंश के साथ कोक्लेअर ऑटिक कैप्सूल (आमतौर पर इस उम्र में कार्टिलाजिअस) काटना करें। सभी आगे के कदमों के लिए # 55 संदंश का प्रयोग करें।
  4. टिशू प्रसंस्करण के अंतिम चरण
    1. कोर्ची के अंग के बाकी हिस्सों से सूक्ष्म चाकू या दो संदंशों का उपयोग करने के लिए सर्पिल अस्थिभंग को ध्यान से अलग करके कान के कान ऊतकों के प्रसंस्करण के साथ जारी रखें।
      1. सर्पिल अस्थिरता और बाल कोशिका क्षेत्र के बीच दरार पर गहरा, पारभासी वाले क्षेत्र में कटौती करें और सर्पिल अस्थिबंधन को बाद में हटाने के लिए इसे सबसे मूलभूत पहलू पर समझाएं और धीरे-धीरे इसे अन्तराल करके इसे खोलना।
    2. कंक्रीट के एक अनुदैर्ध्य, बाण के समान दृश्य प्राप्त करने के लिए नमूना रखें और सूक्ष्म चाकू का उपयोग करके कोक्ले को दो से तीन खंडों में कट कर, इन वर्गों को शिखर, (मध्य,) और बी के रूप में वर्गीकृत कर दें।आसल बदल जाता है पेटी डिश पर क्षैतिज रूप से लगाए जाने वाले कॉक्लियर स्पष्टीकरण टुकड़ा प्राप्त करने के लिए ऊतक को ऊपरी और बालों के कोशिकाओं और न्यूरिटियों की वास्तविक परत से नीचे निकालें।
      नोट: संस्कृति के डिब्बे में स्थिर आसंजन के लिए एक उचित आकार लगभग एक कोलकाली बारी है
    3. टेक्टोरियल झिल्ली को निकालें, एक बहुत ही पतली पारभासी परत जिसे कॉर्टी के अंग से बेहतर होता है, इसे धीरे-धीरे संदंश के साथ छीलने से।
    4. दोनों पक्षों पर संदंश के साथ छिड़कर और इसे छीलने के द्वारा, रीजनर की झिल्ली को तुरंत एसजीएन से बेहतर बनाएं।
      नोट: सूक्ष्म चाकू से उन्हें काटने के द्वारा किसी भी तरह से स्थित क्षतिग्रस्त बाल सेल क्षेत्रों को हटा दें।

3. संस्कृति प्लेट्स के लिए नमूने का स्थानांतरण

  1. चार कवर स्लिप्स से ऊतक चिपकने वाला समाधान के 45 μL निकालें। 50 μL बाँझ एच 2 ओ के साथ प्रत्येक कवर पर्ची को धोएं।
  2. 1 एमएल विंदुक उठाओ टिप के अंदर का पालन करने के नमूने को रोकने के लिए लगभग 120 μL डीएमईएम के साथ विंदुक टिप को गीला करें।
  3. नमूनों को व्यक्तिगत रूप से 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके स्थानांतरण करें। एचबीएसएस से भरे हुए, छोटे, स्पष्ट दीवार वाले, कांच के तले हुए पेट्री डिश से अधिकतम 70 μL पिपेट करें और 4-अच्छी तरह से पेट्री डिश में 4 इनले में एक (तरफ के साथ तैयार) तरल के साथ नमूना रखें ।
  4. सूक्ष्मदर्शी (50X बढ़ाई) के अंतर्गत जांचें कि नमूना सही अभिविन्यास में है। सुनिश्चित करें कि बाल कोशिकाओं का क्षेत्र जिसमें से टेक्टोरियल झिल्ली हटा दिया गया था, ऊपर की ओर चेहरे यह सुनिश्चित करें कि बेसिलर झिल्ली, एक साथ ट्रिमिड, बेसल भाग के साथ मोडिओलस, नीचे की तरफ आते हैं और कस्टलिप का पालन करते हैं।
    1. यदि नमूना निरीक्षण के ऊपर उल्टा है, तो एचबीएसएस जमा करें जो कि पिपेट टिप में जड़ना में रहता है और जब तक यह सही ढंग से उन्मुख नहीं है तब तक टुकड़े को फिर से रख दें।
      नहींते: यह बाल कोशिकाओं को संस्कृति के माध्यम से तैरने से रोकती है, बिना कंसलिप से संरचनात्मक सहायता के लिए, जो अधःपतन हो सकती है।
  5. 1 एमएल विंदुक का उपयोग कर अतिरिक्त एचबीएसएस की इच्छाशक्ति 15 एस के लिए प्रतीक्षा करें
  6. नमूना पर सीधे तैयार गर्म संस्कृति माध्यम (98% DMEM, 1% एन -2, और 1% एम्पीसिलीन) के 60 μL पिपेट करें। पिपेट के साथ नमूना को स्पर्श न करने की देखभाल करें आंतरिक और बाहरी पेट्री डिश कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते हैं।
  7. सभी स्टॉक समाधानों को अपने उचित स्थानों में वापस लाएं, शवों और अवशिष्ट कचरे का निपटान करें, संस्थागत दिशानिर्देशों ( जैसे, इथेनॉल या हाइपोक्लोराइट का उपयोग करके) के अनुसार सर्जिकल तालिका को नष्ट करना, साफ और आटोक्लेव करें, और उचित कंटेनर ।

4. अंतिम संस्कृति मीडिया और ब्याज की सामग्री को जोड़ना

नोट: कोक्लियर स्पष्टीकरण बाद में 10-16 एच उपयोग करने के लिए तैयार होंगे।

  1. एक मिक्टू तैयार करें97% डीएमईएम की पुनः, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% एन -2, और 1% एम्पीसिलीन (एक सूक्ष्मदर्शी ट्यूब में अच्छी तरह से 65 μL; उपयोग करने से पहले 25 डिग्री सेल्सियस का समाधान गर्म करें)
  2. संबंधित उपचार समूहों के समाधान के लिए ब्याज के अन्य पदार्थ जोड़ें। यदि फ्लोरोसेंट पदार्थों को जोड़ा जाता है ( जैसे, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -प्रभावित वायरस, हालिया प्रकाशन में, 10 10 जीसी एडिनो-एसोसिएटेड वायरस (एएवी) का एकाग्रता 48 घंटे 50 μL के लिए इस्तेमाल किया गया था) 18 रोशनी।
  3. इनक्यूबेटर से कॉक्रेलर स्पष्टीकरण युक्त पेट्री डिशें स्थानांतरित करें और उन्हें लामिना का प्रवाह हुड के नीचे रखें।
  4. इनलेज़ से विंदुक के साथ पुराने संस्कृति माध्यम (डब्ल्यू / ओ एफबीएस) की आकांक्षा।
  5. तैयार गर्म संस्कृति (उपचार) मध्यम (97% डीएमईएम, 1% एफबीएस, 1% एन -2, 1% एम्पीसिलीन, और ब्याज की मात्रा) के प्रति प्रति 60 μL जोड़ें।
  6. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में पेट्री डिश वापस रखें।
  7. आर देखेंसूक्ष्मदर्शी के तहत खनिज पदार्थ के लिए संदूषण, सेलुलर प्रवास या कुरसी स्पष्टीकरण के टुकड़े को पहचानने के लिए और अधिकतम 7 दिनों के बाद धुंधला हो जाना।

5. Immunofluorescence - 1 दिन

  1. अवरुद्ध समाधान तैयार करें (94% फॉस्फेट-बफरेड सलाइन (पीबीएस), 5% सामान्य बकरी या घोड़े सीरम (माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर एनजीएस / एनएचएस), और 1% गैर-ईओण सर्फटेक्ट (सामग्री की तालिका देखें) और स्टॉक तैयार करें एंटीबॉडी समाधान (98.6% पीबीएस, 1% एनएचएस, और 0.4% गैर एंटीबॉडी)।
    नोट: एंटीबॉडी में खरगोश विरोधी माइओ 7 ए में 1: 400+ (आंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाओं के लिए मायोसिन 7 ए) और माउस एंटी-टूजे 1 1: 200+ (एसजीएन के लिए β-tubulin) या माउस (आईजीजी 1) विरोधी -सीटीबीपी 2 1: 200+ (प्रो-एक्सपेंशन के लिए सी-टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन), माउस (आईजीजी 2 ए) एंटी-पीडीएमडी 1 1 50+ (पोस्टसीनप्टिक घनत्व, पोस्टसीनपैक्शन के लिए) और चिकन एंटी-एनएफ़-एच 1: 1000+ (न्यूरॉफिलामेंट, एसजीएन और तंत्रिका फाइबर के लिए) "+" मेआएनएस "या उच्चतर।"
  2. एक विंदुक के माध्यम से संस्कृति के माध्यम से महाप्राण। नमूना को छूने के लिए ध्यान रखें।
  3. लामिना का प्रवाह हुड के तहत, कुरकुरा स्पिन्टर्स को दो बार बाँझ पीबीएस के साथ कुल्ला, प्रत्येक वॉश के बाद 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर नमूनों को रखकर।
  4. ऊतक को 4% पैराफॉर्मालाइहाइड (पीएफए ​​- सावधानी) में टिशर पर 20 मिनट के लिए ठीक करें (हुड के नीचे)। पीएफए ​​की तरक्की करें
  5. कोकलेर एक्सप्रेटर में पीबीएस के 60 μL को लागू करें और 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें। पीबीएस की तरक्की करें 3x दोहराएं
  6. टकराने पर 30 मिनट के लिए तैयार अवरुद्ध समाधान (94% पीबीएस, 5% एनएचएस, और 1% गैर-ईओण सर्फटैंट) में कॉक्लियर स्पैन्टर्स रखें।
  7. संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ एक तैयार स्टॉक एंटीबॉडी समाधान (98.6% पीबीएस, 1% एनएचएस, और 0.4% गैर-ईओण सर्फटेंट) में कॉक्रेलर एक्सप्टाण्ट्स को आरटी पर एक काउंटर पर O / N के उपयोग में रखें।
    नोट: प्लास्टिक की चादर (या एल्यूमीनियम पन्नी में संलग्न नम पेपर तौलिये के साथ पेट्री डिश लपेटें यदि जोड़ा हलआयन में फ्लोरोसेंट सामग्री शामिल है जैसे कि जीएफपी-व्यक्त वायरस) बर्तन को नम रखने के लिए और एंटीबॉडी समाधान ओ / एन के वाष्पीकरण को रोकने के लिए

6. Immunofluorescence - दिन 2

  1. 4 ', 6-डायरीडिनो -2 फेनिलंडोल (डीएपीआई) दाग (300 एनएम) तैयार करें और चरण 5.1 में प्राथमिक एंटीबॉडी के पूरक, सही माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण प्राप्त करने के लिए स्टॉक एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करें। ( उदाहरण के लिए , बकरी विरोधी खरगोश 488 1: 200+ और बकरी एंटी-माउस 568 1: 200+ या बकरी एंटी-माउस (आईजीजी 1) 568 1: 1000+, बकरी एंटी-माउस (आईजीजी 2 ए) 488 1: 500+, और बकरी एंटी-चिकन 647 1: 200+ या फालोइडिन 568 1: 200+ (आंतरिक और बाहरी बालों के कोशिकाओं के लिए))।
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की आकांक्षा।
  3. कोकलेर एक्सप्रेटर में पीबीएस के 60 μL को लागू करें और 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें। पीबीएस की तरक्की करें 3x दोहराएं
  4. तैयार स्टॉक एंटीबॉडी समाधान (98.6% पीबीएस, 1% एनएचएस, और 0.4% गैर-ईओण सर्फट्रेंट) में कॉखलेर एक्सप्टान्ट्स रखें।एक काउंटर पर 1.5 घंटे के लिए पेक्टीक माध्यमिक एंटीबॉडी (उपयोग के पहले भंवर) और प्रकाश से बचाने के लिए।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान की आकांक्षा करें और डीएपीआई के दाग (1 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखकर और बाद में महाप्राण) के साथ कन्क्लेअर स्पैन्टर्स कुल्ला।
  6. कोकलेर एक्सप्रेटर में पीबीएस के 60 μL को लागू करें और 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें। पीबीएस की तरक्की करें 3x दोहराएं
  7. 4-अच्छी तरह से थाली से नमूनों के साथ कवरलाप हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें, उन्हें डिस्टिल्ड एच 2 ओ से भरे जाने वाले प्राप्तकर्ता में डुबकी, और पेपर तौलिये के संपर्क में उन्हें खड़ी करके कवच के टुकड़े को सुखा दें।
  8. सूक्ष्मदर्शी स्लाइड पर एंटीफाइड माउन्टिंग माध्यम की एक बूंद रखें और माध्यमों में नीचे की ओर वाले ऊतक को विसर्जित करने के लिए कवर लिप्स पलटना।
  9. कंधे को कांच के नीचे नमूना को कुचलने के बिना स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग करके कवरलेट को सील करें। 15 से 20 मिनट तक सूखा और वें के लिए एक कवर क्षेत्र में सपाट झलकें छोड़ेंएक बॉक्स में उन्हें जगह या confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत जांच
    नोट: फ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना 4 या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइडों को संग्रहीत करके सबसे अच्छा संरक्षित है

7. कन्फोकल इमेजिंग

  1. कोर्ति क्षेत्र के अंग के लिए एक सिंहावलोकन और जूम-इन चित्र प्राप्त करें, जिसमें न्यूरिट्स और एसजीएन शामिल हैं।
    नोट: इमेजिंग प्रक्रिया के लिए मानक सेटिंग: 1,024 x 1,024 पिक्सल का प्रारूप, 400 हर्ट्ज की गति, 3 के फ्रेम औसत, 20% समग्र लेजर तीव्रता, और आमतौर पर 20 एक्स और 63 एक्स लेंस के साथ तेल विसर्जन (संभावित रूप से 2 एक्स डिजिटल ज़ूम के साथ)। डीएपीआई, मायओ 7 ए और ट्यूए 1 स्टैनिंग प्रोटोकॉल के लिए चैनल सेटिंग्स ऊपर उल्लिखित हैं: 405 5% डीएपीआई, "स्मार्ट गेन" 766.8 वी, "स्मार्ट ऑफसेट" 0.0% - 488 15% फ्लोरोसिसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी), "स्मार्ट गेन" 622.2 वी , "स्मार्ट ऑफ़सेट" 0.0% - 561 13% टेट्रामिथिलोमोडाइन इसोइडोसाइनेट (टीआरआईटीसी), "स्मार्ट गेन" 562.4 वी, "स्मार्ट ऑफसेट" 0.0%।
  2. एक z-stack में चित्रों का उपयोग करके मर्ज करेंएक z- अक्ष प्रक्षेपण प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर

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Representative Results

हालांकि कई प्रोटोकॉल कोरती एक्सप्टाणेंट्स के अंग पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इस तकनीक एसजीएन सहित पूरे कॉच्लर मोड़ की शारीरिक रचना को संरक्षित करने का प्रयास करती है। इससे शोधकर्ताओं को कोर्ति के अंग के अतिरिक्त एसजीएन के न्यूरिट्स और सोमटा पर दिए गए उपचार के प्रभावों का विश्लेषण करने का अवसर मिलता है। जैसा कि वर्णित है, एक विच्छेदन modiolus के हिस्से को संरक्षित करते हैं, अकेले कोर्ती के अंग का स्पष्टीकरण देने की तुलना में अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, न्यूरेट और एसजीएन क्षेत्र महत्वपूर्ण है, क्योंकि इसी पद्धति 19 , 20 का उपयोग करते हुए वेस्टीबलुलर स्विनैनोमा स्राव ( चित्रा 1 ) और दो हालिया प्रकाशनों में बाह्य कोशिकाओं को लागू करने के बाद इस क्षेत्र में महत्वपूर्ण रोग प्रभाव देखा गया था। इस तरह के बदलावों को कोर्टी स्पष्टीकरण के अलग-अलग अंग का उपयोग करके पता नहीं चला जा सकता था।

गुआंतरिक और बाहरी बाल कोशिकाओं, सहायक कोशिकाओं, और एसजीएन के लिए क्षतिग्रस्त या जीएफपी-व्यक्त कोशिकाओं के ई मात्रा का ठहराव मैनुअल गिनती या एक स्वचालित प्रक्रिया के साथ किया जा सकता है, जैसे कि ImageJ प्लगइन न्यूरॉन जे में बनाया गया। कुल संख्या के साथ उनके संबंध की पुष्टि के बाद इन गिनती के लिए प्रतिनिधि क्षेत्रों की स्थापना की जा सकती है। एसजीएन के z- अक्ष अनुमानों में ओवरले प्रभाव को बाहर करने के लिए 3D पुनर्निर्माण विशेष रूप से उपयोगी हैं। फाइबर संगठन, प्रति क्षेत्र में एसजीएन की संख्या और एसजीएन सोमा क्षेत्र का मूल्यांकन किया जा सकता है। धुंधला हो जाना और सिंकैप्स, बाल कोशिकाओं और न्यूरिट्स की गणना चित्रा 2 में दर्शायी गयी है; एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग कॉक्लियर पूरे माउंट के लिए किया जा सकता है और इन उद्देश्यों 17 , 21 , 22 के लिए एक विश्वसनीय मॉडल दिखाया गया है। अन्य शोधकर्ताओं ने सुरुचिपूर्ण वैकल्पिक तरीकों की स्थापना की है जिन्हें प्रायोगिक मानदंडों में भी शामिल किया जा सकता है <23/ सुपर> , 24

संस्कृति की अधिकतम लंबाई सेलुलर प्रवासन की शुरुआत से सीमित होती है और संस्कृति माध्यम में एफबीएस की एकाग्रता पर निर्भर करती है। जब एफबीएस का अनुपात पांच प्रतिशत से घटाकर तीन प्रतिशत या एक प्रतिशत कम हो गया था, तो एनाटॉमिक रूप से अक्षुण्ण सहदेय स्पष्टीकरण को बनाए रखने के लिए समय लगभग एक हफ्ते ( चित्रा 3 ) तक बढ़ाया गया था।

चित्रा 4 चित्रा 4 48 घंटे 25 के लिए सिंथेटिक एडीनो-संबंधित वायरस वेक्टर एएनसी 80 के साथ पारगमन के बाद जीएफपी पॉजिटिव कॉक्लेअर स्पष्टीकरण कोशिकाओं को दर्शाता है। इनर बालों की कोशिकाओं, बाहरी बालों के कोशिकाओं और सहायक कोशिकाओं को इस दृश्य में मात्राबद्ध किया जा सकता है, जबकि एक 3D पुनर्निर्माण एसजीएन क्षेत्र में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं को मापने में मदद कर सकता है। विभिन्न वायरल सीरोटाइप की तुलना कुछ सीई में उनके पारगमन दक्षता के मामले में की जा सकती हैरेखांकित कार्यप्रणाली 18 का उपयोग करते हुए प्रकार

आकृति 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी 48 घंटे के लिए ग्रेट ऑर्क्युलर नसों या वेस्टिबुलर श्वान्नोमा से स्राक्रशन के साथ उष्मायन के बाद अप्पीक और बेसल क्षेत्र से कन्क्लेअर एक्सप्टेंस के चित्र । ( ए ) एक स्पष्टीकरण की अवलोकन छवि आयत करीब-अप चित्रों में क्षेत्र को चिह्नित करती है स्केल बार = 200 माइक्रोन ( बी - ई ) बाल कोशिकाओं और न्यूरेट्स के ज़ूम-इन दृश्य स्केल बार = 50 माइक्रोन ग्रीन = मायोसिन 7 ए (मायओ 7 ए), बाल कोशिकाओं के दाग; लाल = वर्ग III बीटा-ट्यूबिलिन (तुज 1), न्यूरॉनल संरचनाओं के दाग। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: कन्क्लियर एक्सप्लैंट हेयर सेल क्षेत्र की कन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवि ( ए ) बरकरार synapses प्रसंस्कृतिक (सी टर्मिनल बाध्यकारी प्रोटीन, लाल) और postsynaptic (postsynaptic घनत्व -95, हरा) प्रोटीन लेबल के साथ एक साथ neuronal संरचनाओं (neurofilament, नीला) के धुंधला के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। ओएचसी, बाह्य बाल कोशिकाएं; आईएचसी, आंतरिक बाल कोशिकाएं स्केल बार = 10 माइक्रोन ( बी ) आंतरिक बाल कोशिकाओं (लाल तीर) और न्यूरिटी (नीले तीर) की गिनती के साथ भीतरी बाल सेल क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें। न्यूरॉनल संरचनाओं के विच्छेदन के कारण, गिनती के दौरान आंतरिक बाल कोशिकाओं से दूरी को मानकीकृत करना महत्वपूर्ण होता है (सफेद फ़्रेम के साथ प्रकाश डाला जाता है, सीधे सिंकैप्स से जुड़ा) स्केल बार = 5 सुक्ष्ममापी ( सी ) अलग-अलग synapses (2 पूर्व- और पोस्ट एन्सेप्टिक जोड़े सफेद ऐरोहेड के साथ चिह्नित) के क्लोज-अप स्केल बार = 1 & # 181; मी। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: प्रतिनिधि कन्फोकल माइक्रोस्कोपी संस्कृति के 7 डी के बाद अपैक्सल और बेसल कन्क्लेअर स्पष्टीकरण के चित्र या तो 3% या 1% एफबीएस के साथ। ( ए और बी ) 3% एफबीएस में लगाए जाने वाले सेल 4 से 5 दिनों के बीच (बाल कोशिकाओं के लिए हल्के भूरे रंग के तीर, न्यूरियों के लिए लाल तीर), ( सी और डी ) 1% एफबीएस में एक्सपेंट्स 7 दिन तक संगठनात्मक अखंडता बनाए रखता है। हल्का भूरा: मायोसिन 7 ए (मायओ 7 ए), सभी बाल कोशिका दाग; लाल: कक्षा III बीटा-ट्यूबिलिन (टुज 1), न्यूरोनल संरचनाओं के दाग। ओएचसी, बाह्य बाल कोशिकाएं; आईएचसी, आंतरिक बाल कोशिकाएं स्केल बार = 100 माइक्रोन, सभी पैनलों पर लागूIles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: 48 घंटे के लिए सिंथेटिक एडिनो-जुड़े वायरस वेक्टर एन्क्यू 80 के एक्सपोजर के बाद कन्फ्लल माइक्रोस्कोपी की छवि कोक्लायर एक्सप्लोरर। ट्रांसडुल्ड कोशिकाओं को जीएफपी (हरा) व्यक्त करते हैं मायोसिन 7 ए (मायओ 7 ए, नीला) बाहरी बाल कोशिकाओं (ओएचसी) और इनर हेयर सेल (आईएचसी) दाग; कक्षा III बीटा-ट्यूबिलिन (टुज 1, लाल) स्नायेंश्न संरचनाओं। Supp .: Sox2 पॉजिटिव सहायक कोशिकाओं का क्षेत्र; एसजीएन, सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स स्केल बार: 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

शोधकर्ताओं ने कोक्लेअर स्पष्टीकरण से जुड़े प्रयोगों से पहले विच्छेदन तकनीक को सही करना होगा। सीखने की अवस्था में शुरू किए गए विच्छेदन के दौरान बाल कोशिकाओं को आमतौर पर क्षतिग्रस्त किया जाता है, और उनकी अखंडता के लिए एक विशेष रूप से समस्याग्रस्त क्षण, टेक्टोरियल झिल्ली को हटाने है, जिसके लिए स्थिर हाथ, उचित उपकरण और अनुभव की आवश्यकता होती है। समय और संसाधनों को बचाने के लिए, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक दृश्य नियंत्रण किया जाना चाहिए और संभावित क्षतिग्रस्त क्षेत्रों को नोट किया जाना चाहिए। महंगी प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के बजाय, प्रारंभिक प्रयोगों के लिए सफ़ेदी अभिकर्मकों जैसे फ़ेलोइडिन अधिक उपयुक्त हैं। थोड़ा क्षतिग्रस्त व्याख्यान संभवतः कुछ प्रयोगों में नियंत्रण के रूप में भी इस्तेमाल किए जा सकते हैं (उन वर्गों का विश्लेषण जो प्रभावित नहीं हुए हैं) या एंटीबॉडी के नए संयोजनों के परीक्षण के लिए।

नमूनों का स्थानांतरण भी विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि टुकड़ेऊपर की ओर उन्मुख नहीं हैं (लेपित कवरलिप के मार्गदर्शन के बिना अक्सर "अस्थायी" बाल कोशिकाओं को पतला होता है) कवरलेट पर एक केंद्रीय स्थिति सभी आगे pipetting कदम की सुविधा।

उपन्यास यौगिकों (जो स्पष्ट रूप से संस्कृति माध्यम में घुलनशील होना चाहिए) को नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के लिए, स्पष्टीकरण के लिए उपयुक्त वाहन को लागू करना और अनुपचारित व्याख्यानों पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, यदि एक व्यावसायिक दवा सक्रिय संघटक के अतिरिक्त सोडियम साइट्रेट भी शामिल है, तो सोडियम साइट्रेट को नकारात्मक नियंत्रण कॉक्लियर स्पष्टीकरण में जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि सोडियम साइट्रेट का प्रभाव हो सकता है।

कोक्लेअर स्पष्टीकरण के उपयोग की सीमाएं इस तथ्य को शामिल करती हैं कि ये ऑर्गोटीपिक संस्कृतियां आमतौर पर युवा पिल्ले से उत्पन्न होती हैं जो अभी भी जन्म के समय के विकास के बदलावों के दौर से गुजर रही हैं और स्पष्टीकरण के दौरान ईओणिक ढाल की कमी है, जो कि सामान्य के लिए आवश्यक हैविवो में सुनवाई हालांकि, एएवी 18 के संबंध में हालिया प्रकाशन में प्रोटोकॉल की उपयोगिता को मजबूती से दिखाया गया है। हालांकि वैक्टर का यह समूह पैकेजिंग क्षमता के बारे में 4.7 केबी तक सीमित है, लेकिन यह कई मानवीय सिंड्रोम 26 के उपचार के लिए एक महत्वपूर्ण स्रोत बन गया है। कॉच्लियर एक्सप्टाण्ट मॉडल का उपयोग करते हुए, उपर्युक्त प्रकाशन ने दिखाया कि एंक 80 वायरस ने बाल कोशिकाओं और एसजीएन सहित कई विभिन्न प्रकार के कोक्लेयर कोशिकाओं के पारगमन में परंपरागत एएवी सीरोटाइप को पीछे छोड़ दिया। इन विट्रो निष्कर्षों में इन्हों में सबसे बढ़िया उम्मीदवारों को इंजेक्शन के लिए गोल की खिड़की के माध्यम से माउस पिव्स में विवो में चुनकर पुष्टि की गई। पूर्व विवो मॉडल, कोक्लीए की शारीरिक रचना को सफलतापूर्वक दोहराते हुए, समय और संसाधनों को कम करने में मदद करता है जो कि vivo काम में संचालन के लिए आवश्यक है 27 ।

पूर्व वी के एक अन्य लाभIvo मॉडल एसएनएचएल में योगदान करने वाले विशिष्ट सेलुलर तंत्र के अध्ययन के लिए आवेदन करने की क्षमता है। ट्यूमर माइक्रोएनेरमेंट ( उदाहरण के लिए, मानव ट्यूमर स्राव) में स्पष्टीकरण करने वाले यौगिकों को लागू करने से, कोक्लेअन पर इन यौगिकों के प्रभाव को प्रत्यक्ष रूप से देखा जा सकता है और संभाव्य दवाइयों के मूल्यांकन की प्रभावकारिता या विषाक्तता का मूल्यांकन किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि मानव कोक्लेअ को बायोप्सीड नहीं किया जा सकता है, और इसके अंदर की कोशिकाओं को विवो में नहीं देखा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक हालिया प्रकाशन ने वेस्टिबुलर स्विनमानों से गुप्त प्रोटीनों की ओटोटॉक्सिक क्षमता की जांच की, जो इंट्राकैरेनियल ट्यूमर हैं जो वेस्टिबुलर नसों से उत्पन्न होते हैं और 95% रोगियों में सुनवाई का कारण बनते हैं। कोकलेअर एक्सप्टान्ट्स के लिए मानव ट्यूमर स्राव को लागू करने से, स्वस्थ मानव नसों के नियंत्रण से स्राव की तुलना में, कोक्ले 1 9 पर इन स्राव के विषाक्त प्रभावों की पुष्टि की। एक ही प्रयोग एक vivo में दोहराना मुश्किल होगामानव प्रोटीन के प्रति इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया के कारण मॉडल जो एक प्रतिरक्षी माउस में पैदा होगा।

संक्षेप में, यह पांडुलिपि एक ऐसी तकनीक को प्रस्तुत करता है जो एक पूर्व विवो मॉडल में कॉकलेअर बाल कोशिकाओं, सिनाप्सेस, न्यूरिट्स और न्यूरॉन्स के साथ-साथ अध्ययन को सक्षम करता है। यह मॉडल 1 9 , 20 के मानव स्रावों में कारकों सहित, कोक्लेअ 28 में नए अणुओं की कार्रवाई के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है, जबकि संभावित रूप से उम्मीदवार चिकित्सीय यौगिकों की स्क्रीनिंग को बढ़ाकर 18 में पहले उनके परीक्षण में पेश किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डैफ़नेस एंड अदर कम्युनिकेशन डिसऑर्डर ग्रांट आरएपीडीसी 015824 (केएमएस) और टी 32 डी सी 200038 (एसडी समर्थन करने वाला), रक्षा अनुदान W81XWH-15-1-0472 (केएमएस) विभाग, बर्टारेली फाउंडेशन (केएमएस) द्वारा समर्थित था नैन्सी साइल्स डे फाउंडेशन (केएमएस), और लाउर टिनिटस रिसर्च सेंटर (केएमएस)। हम पांडुलिपि पर व्यावहारिक टिप्पणियों के लिए जेसिका ई। सैपरर्स, बीए का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

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References

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Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

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