Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en Published: June 8, 2017 doi: 10.3791/55704
Automatic Translation
1,2,3, 1,4, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

Summary

Målet med denne protokollen er å demonstrere forberedelse, kultur, behandling og immunostaining av neonatale murine cochleære eksplanteringsstoffer. Teknikken kan benyttes som et in vitro- screeningsverktøy i høreforskning.

Abstract

Selv om det har vært bemerkelsesverdige fremskritt i å høre forskning de siste tiårene, er det fortsatt ingen kur for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), en tilstand som vanligvis involverer skade på eller tap av de delikate mekanosensoriske strukturer i det indre øret. Sofistikerte in vitro- og ex vivo- analyser har vist seg de siste årene, noe som muliggjør screening av et økende antall potensielt terapeutiske forbindelser samtidig som ressursene minimeres og akselerert arbeid for å utvikle botemidler for SNHL. Selv om homogene kulturer av bestemte celletyper fortsetter å spille en viktig rolle i dagens forskning, bygger mange forskere på mer komplekse organotypiske kulturer av murine indre ører, også kjent som cochleære eksplanteringsstoffer. Bevaringen av organiserte cellulære strukturer i det indre øre muliggjør in situ- evaluering av ulike komponenter i den cochleære infrastrukturen, inkludert indre og ytre hårceller, spiralganglionneuroner, neurItes og støttende celler. Her presenterer vi forberedelse, kultur, behandling og immunostaining av neonatal murine cochlear eksplanterende stoffer. Den forsiktige forberedelsen av disse eksplanterer muliggjør identifisering av mekanismer som bidrar til SNHL og utgjør et verdifullt verktøy for høreforskningsfellesskapet.

Introduction

Sensorineural Hearing Loss (SNHL) reflekterer skade på det indre øret eller stigende hørselsbane. Mens hørselstap er det vanligste sensoriske underskuddet hos mennesker 1 , finnes ikke kurative terapier 2 . Selv om cochleære eller auditive hjernestammeimplantater kan gjenopprette en viss grad av hørsel hos pasienter med alvorlig til dyp SNHL, er høreapparatet fra disse enhetene fortsatt svært forskjellig fra "naturlig" hørsel, spesielt under forsøk på å forstå tale i støy eller å høre på musikk.

Mens hårcelledegenerasjon lenge har vært ansett som den primære konsekvensen av traumatiske hørselshendelser (eksponering for høy lyd), er det voksende bevis på at synapsene som overfører informasjon fra hårceller til hørsnerven, er minst like utsatt for akustisk traume 3 , 4 , 5 > , 6 . Siden menneskelige audiometriske terskler, gjeldende gullstandard for evaluering av hørefunksjon, forutsier ikke spesifikk cellulær skade i det indre øret, er det behov for mer raffinerte verktøy for å oppdage cellulær degenerasjon så snart som mulig og å starte tilstrekkelig behandling 7 .

Lovende farmasøytiske behandlinger for hørselstap testes ofte på homogene cellekulturer in vitro , men slike systemer presiserer ikke nøyaktig det cochleære mikromiljøet. Kochleære celler er kjent for å utsette trofiske faktorer som påvirker andre celletyper i cochlea 8 , 9 , en viktig in vivo- prosess som går tapt når organet fra Corti 10 , 11 eller Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 dyrkes i isolasjon eller når Molekylære markører analyseresEf "> 13. Imidlertid krever in vivo studier som kan være nødvendige for validering av in vitro data for å etablere nye, personlig behandling for hørselstap i jakten på" presisjonsmedisin ", betydelige ressurser og tid. Dette er spesielt relevant når man vurderer Hvor mye innsats er nødvendig for å perfeksjonere og utføre mellomøre eller runde membraninnsprøytninger med hørselstester og den etterfølgende disseksjonen av cochlear hele mounts. Den effektive screeningen av lovende forbindelser i organotypiske ex vivo kulturer kjent som cochlear eksplanterer gir et økonomisk og pålitelig alternativ 14 , 15 , 16 , 17 .

Denne artikkelen beskriver en protokoll for å generere, vedlikeholde og evaluere behandlede cochleære eksplanteringsstoffer. Spesifikke bruksområder for denne modellen er understreket, inkludert bruken i skjermenAv potensielt terapeutiske forbindelser og den komparative evaluering av virale vektorer for genterapi. En eks vivo eksplosiv tilnærming tillater forskere å visualisere effektene av en gitt behandling på forskjellige cellepopulasjoner på stedet , forenkle identifiseringen av celletypespesifikke mekanismer og den etterfølgende forfining av målrettede terapeutiske midler.

Samlet gir denne teknikken en modell for å studere cochlea ex vivo mens du opprettholder viktig kryssprut mellom de svært forskjellige celletyper som eksisterer i cochlea.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studieprotokollen ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomite (IACUC) i Massachusetts Eye and Ear. Eksperimenter ble utført i henhold til etikkloven fra Verdens medisinske forening.

1. Forbered disseksjonen

  1. Forbereder kirurgisk bord
    1. Bruk 70% etanol til å desinfisere det kirurgiske bordet.
    2. Plasser to nonsterile prep pads ved siden av mikroskopet.
    3. Klargjør instrumentbrettet, inkludert varmsterilisert operasjonssaks, et skalpellhåndtak, en mikrokniv og tau (to hver av # 4 & # 55). Plasser instrumentbrettet og en 50 mm, klargjerd, glassbunnet petriskål på en ikke-steril pute.
    4. Skaff en steril # 15 skalpellblad; En tetningsbar plastpose eller beholder (for å avhende slaktene i tråd med institusjonelle retningslinjer); Is i en bøtte; Og kald, steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Plasser disse elementene påAndre ikke-sterile puten.
    5. Overfør HBSS i et 50 ml plastlaboratoriumrør og legg det på is.
  2. Forbereder kulturen
    1. Forbered alle materialer i en laminær hette. For hver fire prøver legger du fire autoklaverte 10 mm runde glassdeksler i de fire innleggene i 35 mm 4-brønns petriskålen.
    2. For hver 4 prøver, bland et totalt volum på 300 μL bestående av følgende i et mikrosentrifugerør: 10 μl vev lim, 285 μL NaHC03 og 5 μL NaOH.
    3. Sett 45 μL av den resulterende løsningen på hver deksel og la den være der i minst 20 min ved RT; Denne løsningen kan etterlates på dekslet i flere timer, men kan ikke etterlates O / N.
    4. Legg en eller to 35 mm 4-brønne petriskål i en 10 cm petriskål for å skape to barrierer mot forurensning.
    5. Forbered kulturmedium inneholdende 98% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 og 1% ampicillin (65 μl per brønn i et (mikro) sentrifugerør). Varm oppløsningen til 25 ° C før bruk.

2. Murine Cochlear Explant Dissection

  1. Dekapitasjon av nyfødt mus
    1. Skaff en 60 mm plast petriskål og spray 70% etanol i lokket slik at overflaten er våt.
    2. Hell kald HBSS fra plastlaboratorrøret inn i bunnen av 60 mm plast og 50 mm klargjort, glassbunnet petriskål. Oppbevar plastlaboratorierøret og begge petriskålene på is for å holde vevet kaldt når det ikke blir dissekert.
    3. Plasser en P3 - P5-alderen nyfødt mus på is i en cutofffinger av en latexhanske og vent til hypotermien induserer bevissthetstab (ca. 1-3 min).
    4. Dekapitér musen raskt med operasjonssaks og kast bort kroppen i den forseglede plastposen. Sett det avskårne neonate hodet i70% etanol i lokket på 60 mm plast petriskålen.
  2. Makroskopisk disseksjon av temporal bein
    1. Fjern hodet på skallen ved å lage et overfladisk kutt fra fremre til bakre ende (direkte på toppen av sagittal sutur) ved hjelp av skalpellbladet.
    2. Kutt begge ytre hørekanaler med skalpellbladet og brett huden forover for å utsette hele kranen.
      MERK: Selv om det ikke er nødvendig med et disseksjonsmikroskop for dette trinnet, kan det brukes til forbedret visualisering.
    3. Åpne kranen langs sagittal suturen ved hjelp av # 15 skalpellbladet. Pass på å kutte kranen ved forsiktig å flytte bladet opp og ned fra fremre til bakre for å unngå kompresjon av cochleae.
      MERK: Kraniet bør ikke forringes i denne alderen og skal kutte enkelt.
    4. Fjern og kassér snuten ved å lage et vertikalt snitt direkte bakover i baneene ved hjelp av # 15 skalpelletblad.
      MERK: Den bakre delen av skallen skal fortsatt inneholde hjernen og cochleae.
    5. Kast forhjernen, cerebellum og hjernestammen gjennom stump disseksjon med # 4 tanger.
  3. Mikroskopisk ekstraksjon av cochleae
    1. Juster mikroskopet (6.5X forstørrelse) og lyskilden ved å plassere tang under omfanget og optimalisere belysning og fokus.
    2. Plasser de to halvdelene av kranen i 60 mm plast petriskålen fylt med kald HBSS.
    3. Fullstendig utsette cochlea / e, identifiserbar som å være tilstøtende til den omkringliggende stapediale arterien (en tortuøs arterie i det temporale beinet), og adskilt organet helt fra den tidsmessige bein ved hjelp av # 4 tang.
    4. Overfør cochlea inn i 50 mm, klargjort, glassbunnet petriskål og plasser parabolen under mikroskopet.
    5. Plasser 60 mm plast petriskålen med den andre halvdelen av kranen på is. Fjern cochlea fra vestibulært system og dissekter nøye den cochlear otic kapsel (vanligvis brusk i denne alderen) med # 4 tang. Bruk # 55 tang for alle videre trinn.
  4. Endelige trinn i vevsbehandling
    1. Fortsett med behandlingen av det indre ørevevet ved å forsiktig skille spiralbåndet festet til Corti-organet fra resten av cochlea og modiolus ved hjelp av mikrokniven eller to tang.
      1. Kutt inn i det mørkere, gjennomskinnelige området ved spalten mellom spiralbandet og hårcelleområdet og fortsett til den etterfølgende fjerning av spiralbandet ved å gripe det på det mest basale aspektet og forsiktig trekke det ned mens du beveger deg apikalt.
    2. Plasser prøven for å få en langsgående, sagittal syn på cochleaen og kut cochlea i to til tre seksjoner ved hjelp av mikrokniven, klassifisering av disse seksjonene som apikalt, (midtre) og bAsal svinger. Fjern vevet overlegen og dårligere enn det faktiske laget av hårceller og neuritter for å oppnå et cochlear eksplanterende stykke som kan ligge horisontalt på petriskålen.
      MERK: En passende størrelse for stabil vedheft til kulturretten er omtrent halvparten av en cochlear sving.
    3. Fjern tectorial membranen, et veldig tynt gjennomsiktig lag umiddelbart overlegent med Corti-organet, ved forsiktig å peeling det bort med tau.
    4. Fjern Reissner membran, umiddelbart overlegen SGNene, ved å berøre den med tau på begge sider og peeling den bort.
      MERK: Fjern eventuelle sideskjermede skadede hårcelleområder ved å kutte dem bort med mikrokniven.

3. Overføring av prøver til kulturplater

  1. Fjern 45 μL vev limemiddelløsning fra de fire dekselglassene. Vask hvert dekselglass med 50 μL sterilt H 2 O. Aspirer vannet.
  2. Plukk opp 1 ml pipetten. Våt pipettespissen med ca. 120 μL DMEM for å hindre at prøven festes til innsiden av spissen.
  3. Overfør prøvene enkeltvis ved hjelp av pipetten på 1 ml. Pipetter maksimalt 70 μL fra den HBSS-fulle, små, veggerede glassbunnede petriskålen, og plasser prøven sammen med væsken på en av de 4 innsatsene (tilberedt med dekselet) i 4-brønns petriskålen .
  4. Kontroller under mikroskopet (50X forstørrelse) at prøven er i riktig retning. Sørg for at området av hårceller som tectorial membranen ble fjernet vender oppover. Sørg for at basilamembranen, sammen med den trimmet, basale delen av modiolus, vender nedover og festes til dekselet.
    1. Hvis prøven er orientert opp og ned ved inspeksjon, legger du inn HBSS som forblir i pipettespissen i innlegget og plasserer stykket til det er riktig orientert.
      NEITE: Dette forhindrer at hårceller flyter i kulturmedium uten strukturell støtte fra dekslet, noe som kan føre til degenerasjon.
  5. Aspirer overskytende HBSS ved hjelp av 1 ml pipetten. Vent i 15 s.
  6. Pipetter 60 μl av det tilberedte varme dyrkningsmediet (98% DMEM, 1% N-2 og 1% ampicillin) direkte på prøven. Pass på at du ikke berører prøven med pipetten. Bytt de indre og ytre petriskåldekslene og inkuber O / N ved 37 ° C.
  7. Sett alle lagerløsninger tilbake på de riktige stedene, kast bort kadaver og restavfall, dekontaminerer kirurgisk bord i henhold til institusjonelle retningslinjer ( f.eks. Ved bruk av etanol eller hypokloritt), rengjør og autoklaver instrumentene og kast kuttene i riktig beholder .

4. Legge til endelig kulturmedia og interessestoffer

MERK: Cochlear eksplanterer vil være klare til bruk 10-16 timer senere.

  1. Lag en blandingRe 97% DMEM, 1% føtalt bovint serum (FBS), 1% N-2 og 1% ampicillin (65 μl per brønn i et mikrocentrifugerør, oppvarm oppløsningen til 25 ° C før bruk).
  2. Legg til andre stoffer av interesse for løsningene for de respektive behandlingsgruppene. Hvis fluorescerende stoffer blir tilsatt ( f.eks. Grønne fluorescerende protein (GFP) -uttrykkende virus, i en nyere publikasjon ble en konsentrasjon på 10 10 GC adeno-assosierte virus (AAVer) brukt i 48 timer i 50 μl) 18 , beskyttet mot lett.
  3. Overfør de cochleære eksplosjonsholdige petriskålene fra inkubatoren og plasser dem under laminarstrømshetten.
  4. Aspirer det gamle kultursmediet (uten FBS) med pipetten fra innleggene.
  5. Tilsett 60 μl per brønn av det preparerte varmkultur (behandlingsmedium) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillin og de aktuelle stoffene).
  6. Sett petriskålen tilbake i inkubatoren (37 ° C).
  7. Se rEgulært under mikroskopet for å identifisere tegn på forurensning, cellulær migrasjon eller frigjøring av cochlear explant og utføre farging etter maksimalt 7 dager.

5. Immunofluorescens - Dag 1

  1. Forbered blokkering (94% fosfatbuffert saltvann), 5% normalt geit- eller hesteserum (NGS / NHS, avhengig av sekundære antistoffer) og 1% ikke-ionisk overflateaktivt middel (se tabell over materialer ) Antistoffoppløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk overflateaktivt middel med de respektive antistoffer).
    MERK: Antistoffer inkluderer kanin anti-Myo7A i en konsentrasjon på 1: 400 + (myosin 7A, for indre og ytre hårceller) og anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulin, for SGNs) eller mus (IgG1) anti-TuJ1 -CtBP2 1: 200+ (postsynaptisk tetthet, for postsynapse) og kylling anti-NF-H 1: 1000+ (nevrofilament, For SGN og nervefibre). "+" MeaNs "eller høyere."
  2. Aspirer kulturmediet ved hjelp av en pipette. Pass på at du ikke berører prøven.
  3. Under den laminære hetteglasset skylles de cochlear eksplantert to ganger med sterilt PBS, og plasserer prøvene på en rister i 5 minutter etter hver vask.
  4. Fest vevet i 4% paraformaldehyd (PFA - FORSIKTIG) i 20 minutter på shakeren (under hetten). Aspirere PFA.
  5. Påfør 60 μL PBS på cochlear eksplanteringsmiddelene og legg petriskålen på en shaker i 5 minutter. Aspirere PBS. Gjenta 3x.
  6. Plasser de cochleære eksplanteringsmiddelene i preparert blokkeringsløsning (94% PBS, 5% NHS og 1% ikke-ionisk overflateaktivt middel) i 30 minutter på rister.
  7. Plasser de cochleære eksplanteringsmiddelene i en preparert lagerantistoffløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk overflateaktivt middel) med de respektive primære antistoffene (virvel før bruk) O / N på en teller ved RT.
    MERK: Wrap petri-tallerkene med fuktige papirhåndklær i plastfolie (eller aluminiumsfolie hvis den tilsatte løsningenIon inneholder fluorescerende materialer som GFP-uttrykkende virus) for å holde oppvaskene fuktige og for å forhindre fordampning av antistoffoppløsningen O / N.

6. Immunofluorescens - Dag 2

  1. Klargjør 4'-, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) flekken (300 nM) og bruk lagerantistoffoppløsningen for å oppnå de korrekte sekundære antistoffblandinger, komplementære til de primære antistoffene i trinn 5.1. ( F.eks . Geit-anti-kanin 488 1: 200+ og geit-anti-mus 568 1: 200+ eller geit-anti-mus (IgG1) 568 1: 1000+, geit-anti-mus (IgG2a) 488 1: 500+, Og geit-anti-kylling 647 1: 200+ OR Phalloidin 568 1: 200+ (for indre og ytre hårceller)).
  2. Aspirer den primære antistoffløsningen.
  3. Påfør 60 μL PBS på cochlear eksplanteringsmiddelene og legg petriskålen på en shaker i 5 minutter. Aspirere PBS. Gjenta 3x.
  4. Plasser de cochleære eksplanteringsmiddelene i preparert lagerantistoffløsning (98,6% PBS, 1% NHS og 0,4% ikke-ionisk overflateaktivt middel) med resningenPektive sekundære antistoffer (virvel før bruk) i 1,5 timer på en teller og beskytte mot lys.
  5. Aspirer den sekundære antistoffoppløsningen og skyll de cochleære eksplanteringsmedisinene med en DAPI-flekk (plasser på en shaker i 1 min og deretter aspirere).
  6. Påfør 60 μL PBS på cochlear eksplanteringsmiddelene og legg petriskålen på en shaker i 5 minutter. Aspirere PBS. Gjenta 3x.
  7. Bruk tanger for å fjerne dekselplater med prøver fra 4-brønnsplaten, dypp dem inn i en mottaker fylt med destillert H 2 O, og tørk dekslene ved å ta dem vertikalt i kontakt med papirhåndklær.
  8. Plasser en dråpe antifadmonteringsmedium på mikroskopdysen og vend dekselglassene inn for å senke nedovervendt vev i mediet.
  9. Forsegl dekselglasset ved bruk av klart neglelakk rundt kanten (uten å knuse prøven under glasset). La lysbildene ligge flatt i et overbygd område fra lys i 15 - 20 minutter til tørr og thOg plasser dem i en boks eller undersøk under konfokalmikroskopet.
    MERK: Fluorescerende farging er best bevart ved å lagre lysbildene ved 4 eller -20 ° C.

7. Confocal Imaging

  1. Få oversikt og innzoomsbilder for organet i Corti-regionen, inkludert neuritter og SGN-er.
    MERK: Standardinnstillinger for bildebehandlingsprosessen: Format på 1.024 x 1.024 piksler, hastighet på 400 Hz, ramme gjennomsnitt på 3, 20% generell laserintensitet, og vanligvis 20X og 63X objektiv med oljeoppslukning (potensielt kombinert med 2X digital zoom). Kanalinnstillinger for DAPI, Myo7A og TuJ1-fargerprotokollen er beskrevet ovenfor: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% fluorescein isothiocyanate (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% tetrametylrhomadinisotiocyanat (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Slett bildene i en z-stack ved hjelp avProgramvare for å oppnå en z-akse projeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mens mange protokoller fokuserer på organ av Corti-eksplanter, forsøker denne teknikken å bevare anatomien til hele cochlear-svinget, inkludert SGN-ene. Dette gir forskere muligheten til å analysere effektene av en gitt behandling på neuritter og somata av SGN i tillegg til organs Corti. Å utføre en disseksjon som bevarer en del av modiolus, som beskrevet her, er mer teknisk utfordrende enn å eksplantere Corti alene. Nevit og SGN-området er imidlertid viktig, fordi signifikante patologiske effekter ble observert i denne regionen etter anvendelse av vestibulære schwannom-sekresjoner ( Figur 1 ) og ekstracellulære vesikler i to nyere publikasjoner ved bruk av samme metode 19 , 20 . Slike endringer kunne ikke blitt avslørt ved å bruke isolert organ av Corti-eksplanteringsstoffer.

thE kvantifisering av skadede eller GFP-uttrykkende celler for indre og ytre hårceller, støttende celler og SGNer kan utføres ved manuell telling eller med en automatisert prosess, for eksempel den som er innebygd i ImageJ-pluginet NeuronJ. Representative områder for disse tallene kan etableres etter at de har bekreftet deres sammenheng med totale teller. 3D-rekonstruksjoner er spesielt nyttige for å utelukke overleggseffekter i z-akse-fremskrivninger av SGNer. Fiber organisasjon, antall SGNs per gitt område, og SGN soma område kan evalueres. Farging og telling av synapser, hårceller og neuritter er avbildet i figur 2 ; Den samme protokollen kan også brukes til cochlear hele fester og har vist seg å være en pålitelig modell for disse formål 17 , 21 , 22 . Andre forskere har etablert elegante alternative metoder som også kan inkorporeres i eksperimentelle paradigmer 23 </ Sup> , 24 .

Maksimal lengde av kulturen er vanligvis begrenset av starten av mobilmigrasjon og avhenger av konsentrasjonen av FBS i dyrkningsmediet. Når andelen FBS ble redusert fra fem prosent til tre prosent eller en prosent, ble tidsperioden for å opprettholde en anatomisk intakt cochlear eksplantert utvidet til ca. en uke ( figur 3 ).

Figur 4 demonstrerer GFP-positive cochleære eksplanterende celler etter transduksjon med den syntetiske adenoassosierte virusvektoren Anc80 i 48 timer 25 . Innerhårceller, ytre hårceller og støttende celler kan kvantifiseres i denne visningen, mens en 3D-rekonstruksjon kan bidra til å kvantifisere GFP-positive celler i SGN-området. Forskjellige virale serotyper kan sammenlignes med hensyn til transduksjonseffektivitet i visse cellerLl typer ved hjelp av den skisserte metoden 18 .

Figur 1
Figur 1: Representativ konfokalmikroskopi Bilder av koglebærende eksplosjoner fra apikale og basale regioner etter inkubasjon med sekresjoner fra store Auricular Nerves eller Vestibular Schwannomas i 48 timer . ( A ) Oversikt bilde av en explant. Rektangelet markerer området i nærbilder. Skalestang = 200 μm. ( B - E ) Zoom-in visninger av hårceller og neuritter. Skalbjelke = 50 μm. Grønn = Myosin 7A (Myo7A), flekker hårceller; Rød = klasse III beta-tubulin (Tuj1), flekker nevronstrukturer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Konfoktisk mikroskopi Bilde av den koglebærende eksplosive hårcellegruppen. ( A ) Inaktive synaps kan vurderes ved å merke presynaptisk (C-terminalt bindingsprotein, rødt) og postsynaptisk (postsynaptisk tetthet-95, grønt) proteiner sammen med farging av nevronstrukturer (nevrofilament, blå). OHC, ytre hårceller; IHC, indre hårceller. Skalbjelke = 10 μm. ( B ) Fokuser på den indre hårcelleregionen med antall indre hårceller (røde pilehoder) og neuritter (blå pilehoder). På grunn av forgreningen av nevronstrukturer, er det viktig å standardisere avstanden fra de indre hårcellene under telling (uthevet med den hvite rammen, som er direkte forbundet med synapsene). Skalbjelke = 5 μm. ( C ) Nærbilde av separate synapser (2 pre- og postsynaptiske par merket med hvite pilehoder). Skalbjelke = 1 & # 181; m. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Representative konfokale mikroskopi Bilder av apikale og basale cochleære eksplosiver etter 7 d i kultur med enten 3% eller 1% FBS. ( A og B ) Celler inkubert i 3% FBS begynner å migrere mellom 4 og 5 dager (lys grå piler for hårceller, røde piler for neuritter), ( C og D ) Explants i 1% FBS opprettholder organisatorisk integritet frem til dag 7. Lysegrå: Myosin 7A (Myo7A), flekker alle hårceller; Rød: klasse III beta-tubulin (Tuj1), flekker nevronstrukturer. OHC, ytre hårceller; IHC, indre hårceller. Skalbjelke = 100 μm, på alle paneler.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Konfokal mikroskopi Bilde av en cochlear eksplanter etter eksponering for den syntetiske adenoassosierte virusvektoren Anc80 i 48 timer. Transduserte celler uttrykker GFP (grønn). Myosin 7A (Myo7A, blå) flekker Ytre hårceller (OHC) og indre hårceller (IHC); Klasse III beta-tubulin (Tuj1, rød) flekker nevronstrukturer. Supp .: område av Sox2-positive støttende celler; SGN, spiral ganglion nevroner. Skalbjelke: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forskere må perfeksjonere disseksjonsteknikken før de utfører eksperimenter som involverer cochlear eksplantater. Hårceller blir ofte skadet under disseksjoner som utføres tidlig i læringskurven, og et spesielt problematisk øyeblikk for deres integritet er fjerning av tectorial membranen, som krever stabile hender, riktige verktøy og erfaring. For å spare tid og ressurser, bør en visuell kontroll utføres under disseksjonsmikroskopet og potensielt skadede områder bør noteres. I stedet for å bruke dyre primære og sekundære antistoffer, er billigere reagenser som phalloidin mer hensiktsmessige for foreløpige eksperimenter. Litt skadede eksplantater kan potensielt fortsatt brukes som kontroller i visse eksperimenter (analyse av seksjoner som ikke har blitt påvirket) eller for testing av nye antistoffkombinasjoner.

Overføring av prøvene er også spesielt viktig, fordi man må garantere at brikkeneEr ikke orientert opp-ned ("flytende" hårceller uten veiledning av det belagte dekselet ofte degenerert). En sentral posisjon på dekselglasset muliggjør alle videre pipetteringstrinn.

For negative kontrollforsøk som involverer nye forbindelser (som åpenbart må være oppløselige i kulturmediet), er det viktig å bruke passende kjøretøy til eksplantatene og ikke å fokusere utelukkende på ubehandlede eksplantater. For eksempel, hvis et kommersielt legemiddel inneholder natriumsitrat i tillegg til den aktive bestanddelen, bør natriumsitrat tilsettes til de negative kontrollkolleære eksplanteringene fordi natriumcitrat selv kan ha en effekt.

Begrensninger i bruken av cochleære eksplanteringsstoffer inkluderer det faktum at disse organotypiske kulturer vanligvis kommer fra unge valper som fortsatt gjennomgår postnatal utviklingsendringer, og at det mangler en ionisk gradient over eksplantanten, noe som er essensielt for normalHørsel in vivo . Imidlertid er bruken av protokollen overbevisende vist i en nylig publisert angående AAVs 18 . Mens denne vektorgruppen er begrenset til ca. 4,7 kb pakkingskapasitet, har den blitt en viktig ressurs for behandling av flere humane syndrom 26 . Ved hjelp av cochlear explant-modellen viste ovennevnte publikasjon at Anc80-viruset overgikk de tradisjonelle AAV-serotyper i transduksjonen av en rekke cochleære celler, inkludert hårceller og SGNer. Disse in vitro- funnene ble senere bekreftet ved å velge de mest lovende kandidatene til injeksjon gjennom rundevinduet i musepuppene in vivo . Ex vivo- modellen gir en måte å oppnå en vellykket rekapitulering av cochleaens anatomi, noe som reduserer tiden og ressursene som trengs for å utføre in vivo- arbeid 27 .

En annen fordel med ex vIvo-modellen er dens potensial for anvendelse til studier av spesifikke cellulære mekanismer som bidrar til SNHL. Ved å anvende forbindelser funnet i tumormikromiljøet ( f.eks. Humane svulstsekretjoner) til et eksplanteringsmiddel, kan effekten av disse forbindelsene på cochlea direkte visualiseres og effekten eller giftigheten av potensielle medikamentterapier vurderes. Dette er viktig fordi menneskelig cochlea ikke kan biopsieres, og cellene i den kan ikke visualiseres in vivo . For eksempel har en fersk publikasjon undersøkt det ototoksiske potensialet for proteiner utsatt for vestibulære schwannomer, som er intrakranielle svulster som oppstår fra vestibulære nerver og forårsaker hørselstap hos 95% av pasientene. Anvendelse av humane svulst sekretjoner til cochlear eksplanterende stoffer, sammenlignet med sekresjoner fra kontroll sunt humane nerver, bekreftet de toksiske effektene av disse sekresjonene på cochlea 19 . Det samme eksperimentet ville være vanskelig å replikere i en in vivoModell på grunn av den immunogene responsen mot humane proteiner som ville oppstå i en immunokompetent mus.

Sammendrag presenterer dette manuskriptet en teknikk som muliggjør samtidig studie av kochleære hårceller, synapser, neuritter og nevroner i en ex vivo- modell. Denne modellen kan bidra til å gi innsikt i virkningsmekanismene til molekyler som er nye til cochlea 28 , inkludert faktorer i humane sekresjoner 19 , 20 , mens potensielt akselerere screeningen av kandidat-terapeutiske forbindelser 18 før de testes in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Nasjonalt institutt for døvhet og andre kommunikasjonsforstyrrelser som gir R01DC015824 (KMS) og T32DC00038 (støtte SD), forsvarsdepartementet W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) og Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Vi takker Jessica E. Sagers, BA for innsiktige kommentarer på manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Tags

Medisin utgave 124 Murine cochlear explant organotypisk kultur indre øre ytre hårceller indre hårceller spiral ganglionneuroner auditiv synkaptopati adenoassosiert virus
Neonatal Murine Cochlear Explanting Technique som en<em&gt; I Vitro</em&gt; Screening Tool in Hearing Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landegger, L. D., Dilwali, S.,… More

Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter